UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS

FACULDADE DE ENGENHARIA DE ALIMENTOS

DEPARTAMENTO DE CINCIAS DE ALIMENTOS

TA- 918 Microbiologia e Fermentaes

PRTICA N 4/5:CARACTERIZAO E IDENTIFICAO DE BACTRIAS
INTRODUO
Aps o isolamento em cultura pura, os micro-organismos podem ser identificados no laboratrio.
Milhares de espcies bacterianas j foram isoladas e suas caractersticas descritas no Manual de
Bergey, uma referncia em qualquer estudo taxonmico de bacteriologia.
A identificao de bactrias pode ser realizada de diversas maneiras, atravs da observao
das caractersticas morfolgicas, como dimenso, forma, arranjo e estrutura das clulas; culturais, que
referem-se aparncia macroscpica em diferentes meios de cultura; fisiolgicas, relacionadas com a
capacidade dos microrganismos em sintetizar enzimas intra ou extracelulares, de assimilar diferentes
substratos ou gerar produtos metablicos especficos e genticas, por meio da identificao de regies
especificas do genoma da clula (16S).
O metabolismo celular compreende transformaes dos nutrientes por reaes qumicas
organizadas, catalisadas por enzimas. As enzimas so a expresso do potencial gentico da clula e a
avaliao da presena de um conjunto definido de enzimas pode auxiliar na identificao dos
microrganismos. Enzimas microbianas podem ser intra ou extracelulares. Enzimas extracelulares ou
ligadas parede exercem sua atividade cataltica fora da clula. Algumas transformam substratos de
elevado peso molecular em compostos menos, para serem transportados atravs da membrana e
metabolizados no interior da clula. Enzimas intracelulares so responsveis pela sntese das
estruturas celulares e pela produo de energia.
O metabolismo gera produtos que so excretados pela bactria no meio de cultura, e a
presena ou ausncia desses produtos tambm pode ser utilizada na sua identificao.
Numa rotina de identificao, os resultados de vrios testes so comparados aos de espcies
descritas no Manual de Bergey.
Objetivo : Identificar as reaes caractersticas dos testes bioqumicos.

PRINCPIOS DOS TESTES BIOQUMICOS

TESTE

PRINCPIO

Teste VoguesProskauer (VP)

Este teste utilizado para determinar a habilidade de alguns organismos

produzirem um composto neutro, a acetona (acetilmetilcarbinol), a partir da
fermentao da glicose. A deteco da acetona constitui a base da reao VP.
Em presena de oxignio, acetona forma diacetil que, ao reagir com KOH, forma
um complexo de cor rseo-avermelhada.

Teste do Vermelho Algumas bactrias fermentam a glicose com produo dos cidos frmico,
de Metila (VM)
actico, ltico, succnico e outros produtos. Esses cidos promovem uma
diminuio nos valores de pH do meio, em torno 4,3. Essas diferenas
metablicas podem ser evidenciadas pela adio de uma soluo de vermelho de
metila (indicador de pH) ao meio onde foi cultivado o microrganismo de interesse.
Teste de Citrato
Simmons

A assimilao do citrato indica a presena de citrato permease, que transporta o

citrato para o interior da clula. Do metabolismo do citrato produzido piruvato e
Co2. Este ltimo, ao reagir com o sdio presente no meio, forma carbonato de
sdio, elevando o pH. O meio Agar Citrato de Simmons (pH 7,3 verde) possui
citrato de sdio como nica fonte de carbono e azul de bromotimo como indicador
de pH. Assim a utilizao do citrato como fonte nica de carbono, resulta na
alcalinizao do meio.

Teste de Indol

A ao de triptofanases bacterianas sobre o aminocido triptofano, presente em

peptonas, gera um produto voltil denominado indol. A presena do indol pode ser
detectada pela adio do reativo de Kovacs, aps crescimento da cultura,
resultando na formao de uma colorao vermelha na superfcie do meio. A
ausncia da colorao vermelha indica que o triptofano no foi hidrolisado.

Teste TSI

Determinar a habilidade de 1 organismo para utilizar 1 carboidrato especfico

incorporado em 1 meio basal de crescimento, com ou sem a produo de gs,
juntamente com a possvel produo de H2S.

Teste da Catalase A deteco da produo da enzima catalase pela bactria se d atravs de

observao do desprendimento de bolhas (O2) quando gua oxigenada
adicionada cultura.
Teste de Oxidao- Determinar o metabolismo oxidativo ou fermentativo de um carboidrato ou a sua
Fermentao
no utilizao. Alguns microrganismos produzem cido somente quando crescem
aerobicamente.
Hidrlise do Amido Bactrias que utilizam o amido como fonte de carbono produzem amilase, enzima
extracelular capaz de hidrolisar o amido. Adicionando, aps o crescimento,
soluo saturada de iodo (Lugol) sobre o meio de cultura, o iodo reage com o
amido, formando um complexo de cor azul. Assim o teste permite determinar a
habilidade de produo de amilase pelo microrganismo.

1) Determinao das caractersticas bioqumicas dos micro-organismos.

Observe que alguns ensaios devero ser iniciados hoje e somente finalizados na
prxima aula.
Trazer o roteiro na prxima aula para a finalizao dos testes bioqumicos!
1.1 Teste da Catalase
S. aureus
Material
Procedimento

1 ala para a inoculao, 1 lmina e gua oxigenada 3%.

Com 1 ala, transferir um inculo da cultura de 24 h para 1 lmina. Adicione 1
gota de gua oxigenada 3%.

Interpretao (+): borbulhamento imediato

dos resultados

(-): sem presena de

bolha

1.2 Teste de hidrlise do amido

Bacillus cereus
Materiais

Placa com meio de amido, lugol.

Procedimento

Inocule por estria no centro da placa contendo meio de amido.

Incube por 24-48 hrs. Aps esse tempo acrescente lugol na placa.

interpretao dos resultados

(+):
formao
de
halo (-): no formao de halo.
transparente ao redor da cultura.

1.3 Teste de Oxidao-Fermentao

Pseudomonas fluorescens
Escherichia coli
Material

1 agulha de , 4 tubos contendo meio OF e gar 2%

Procedimento

Inocular em picada os tubos com de meio OF (oxidao-fermentao) com as

culturas de P. fluorescens e E. coli, sendo dois tubos para cada cultura.
Um tubo de cada cultura dever ser vedada com gar 2% ou vaspar e os outros
dois tubos permanecer apenas com tampa. Incube a de 35C/48h.

Interpretao
Metabolismo
dos resultados oxidativo (O)

Tubo aberto

Tubo fechado

Amarelo

verde/roxo

fermentativo (F)-anaerognico

Amarelo

amarelo

fermentativo (F)-aerognico

amarelo com gs

amarelo com gs

oxidativo ou fermentativo (OF)

amarelo ou amarelo c/gs

amarelo c/ gs

Inerte

verde / azul / roxo

verde/ roxo

1.4 Teste de Indol (caldo triptona 1%)

Escherichia coli/Enterobacter aerogenes
Material

1 ala de inoculao e 1 tubo com Caldo triptona 1% (Indol)

Procedimento Transferir uma alada do inoculo, para o tubo com Caldo Triptona 1% e incubar nas
temperaturas de 35C/24 h. Adicionar 0,2 a 0,3 mL do Reagente de Kovacs para
cada 4,0 a 5,0 mL de cultura em Caldo Triptona e agitar levemente. Observar.
interpretao (+):desenvolvimento de 1 anel vermelho- (-):anel permanece amarelado, cor do
dos
violeta na superfcie do meio de cultura reagente de Kovacs (teste -)
resultados
(teste +)

1.5.Teste do Vermelho de Metila (VM)

Escherichia coli/Enterobacter aerogenes
Material
Procedimento

1 ala de inoculao e 1 tubo com meio MR VM

Inocule uma alada da cultura em meio MR VM e incube a temperatura de 35C/
24-48 h. Adicione cerca de 5 gotas de soluo alcolica de vermelho de metila
10% ao tubo de ensaio.

Interpretao (+): colorao vermelha do meio

dos resultados

(-): colorao amarela

1.6 Teste Voges-Proskauer (VP)

Escherichia coli/Enterobacter aerogenes
Material

1 ala de inoculao e 1 tubo com meio MR VP

Procedimento Inocule uma alada da cultura em meio MR VP e incube a temperatura de 35C/

24-48 h. Adicione ao tubo de ensaio 1ml do reagente A (-naftol 5% (p/v)) e 0,4 ml
do reagente B (KOH 40% (p/v)), nesta ordem. Agite levemente o tubo e deixe em
repouso por meia hora.
Interpretao (+): desenvolvimento de uma cor (-): permanncia do meio na cor do
dos
vermelha ou rsea no meio de cultura reagente (amarela ou mbar ou ligeiramente
resultados
esverdeada)

1.7 Teste de Citrato Simmons

Escherichia coli/Enterobacter aerogenes
Material

1 ala de inoculao e 1 tubo com meio citrato

Procedimento Transferir uma alada do inculo sobre a superfcie do tubo inclinado de gar citrato
de Simmons e incubar a na temperatura de 35C/ 48 h.
Interpretao (+): alterao da cor do meio de verde para (-): sem crescimento e sem
dos
alterao da cor do meio (verde)
azul crescimento com viragem alcalina
resultados

1.8 Teste de crescimento em gar Trplice Acar Ferro (TSI)

Escherichia coli/Enterobacter aerogenes
Material

1 agulha de inoculao e 1 tubo com TSI

Procedimento Inocular por picada at o fundo e estrias na superfcie do meio TSI. Incubar nas
temperaturas de crescimento/24 h, com as tampas afrouxadas, e observar as
caractersticas de crescimento.
Interpretao (+): rampa alcalina (vermelho) e fundo cido (amarelo), c/ ou s/ H2S Samonella
dos
sp.
resultados
rampa e fundo cidos (amarelo), s/ H2S E. coli, Enterobacter aerogenes
alcalinizao do meio (vermelho) P. fluorescens

2. Crescimento em EBM ( Agar eosina azul de metileno)

Escherichia coli/Enterobacter aerogenes
Material
Procedimento
Interpretao
dos resultados

1 ala de inoculao, uma placa de EMB.

Fazer estrias da cultura (esgotamento) em Agar EMB. Incube a de 35C/48h.
E. coli - Colnias pequenas brilhantes verde metlico.
E. aerogenes - Colnias grandes, cor rosa escuro.

TESTES

Escherichia coli

Enterobacter aerogenes

Salmonella sp

Gram

Bastonete, G negativo

Bastonete, G negativo

Bastonete, G negativo

Indol

VM

VP

Citrato

EMB

Colnias pequenas
brilhantes verde metlico

Colnias grandes, cor rosa

escuro

Colnias pequenas
transparentes