El mecanismo molecular que subyace en el potencial

hepatoprotector de Moringa oleifera extracto de hojas

contra el acetaminofeno hepatotoxicidad inducida en
ratones
Reflejos
El mecanismo molecular de la hepato-proteccin por MO hojas se examin
extracto.
MO extracto de manera efectiva inhibi CYP 450 enzimas nivel en APAP
intoxicado ratones.
Tambin regulados hasta NRF-2 / sistema y enzimas antioxidantes hepticos
elevados estn.
Ellos efectivamente modulan el nivel de citoquinas hgado y frenan la
inflamacin heptica.
As, los ratones MO tratadas mostraron la arquitectura heptica bien
preservada.

Abstracto
Moringa oleifera (MO) es ubicuo en la naturaleza con un alto valor
nutricional y medicinal. Numerosos estudios han informado de su notable
actividad contra una serie de complicaciones clnicas, como
hepatotoxicidad, pero no hubo informes significativos sobre su mecanismo
de accin hepato-protectora. En este estudio, hemos evaluado y ha
establecido el mecanismo molecular subyacente de la actividad
hepatoprotectora del extracto de hojas de MO contra hepatotoxicidad
inducida por el acetaminofeno. A continuacin, se analiz el impacto de
las diferentes dosis de extracto de hojas de MO en CYP 450 isoenzimas,
sistema antioxidante NRF-2 / sus enzimas y citoquinas inflamatorias en el
tejido del hgado de los ratones Balb / c tratados con alta dosis de
APAP. El extracto de hojas de MO dependiente de la dosis se redujo el
nivel de CYP 450 isoenzimas y tambin regulada hasta el sistema
antioxidante NRF-2 y niveles debidamente elevados de las enzimas
antioxidantes en el hgado. Adems de su efecto modulador sobre los
Niveles citoquinas suprime activamente la inflamacin y exhibi un tejido
heptico bastante conservado.

Palabras clave
Enzima antioxidante ;
Elemento de respuesta antioxidante (ARE) ;
El citocromo P450 2E1 / 1A2 / 2A6 ;

 Las citoquinas inflamatorias ;

factor relacionado-2 factor de eritroide Nuclear 2 (Nrf2)

abreviaturas
MO , Moringa oleifera ;
APAP , acetaminofeno ;
GSH , glutatin ;
Nrf2 , factor nuclear eritroide 2 factor de 2 relacionado ;
CYP 450 , citocromo P450 ;
NAPQI , N-acetil-p-benzoquinoneimina ;
ARE , elemento de respuesta antioxidante ;
Nqo1 , NAD (P) H: quinona oxidorreductasa 1 ;
Ho-1 , hemo oxigenasa-1 ;
GCL M , cistena ligasa subunidades modificadoras gamma-glutamato ;
GSTA2 , glutatin S-transferasa alfa 2 ;
HMGB1 , caja de alta movilidad de grupo 1 ;
TLR , los receptores tipo toll

1. Introduccin
El acetaminofeno (APAP) sobredosis es la principal causa mundial de la
insuficiencia heptica aguda y hepatotoxicidad inducida por frmacos
( Fontana, 2008 ). APAP tiene un perfil de seguridad excelente en la dosis
teraputica y provoca hepatotoxicidad en sobredosis, ya sea debido al
abuso de drogas / terapia combinatoria ( FDA, 2014 ). La idea de un
mecanismo molecular APAP representa que en dosis teraputica normal,
la mayora del frmaco se glucuronizado o sulfatado y despus se excreta
a travs de la bilis. Una cantidad menor del frmaco se convierte en
metabolito txico que tambin se desintoxica fcilmente por conjugacin
con el glutatin (GSH) ( Nelson, 1990 ). En caso de sobredosis APAP, la
mayora del frmaco es convertido por el citocromo P450 (CYP 450)
enzimas para el metabolito txico reactivo, N-acetil- p -benzoquinoneimine
(NAPQI), que agota nivel GSH y de forma covalente se une a las otras
protenas celulares e inducir la muerte de los hepatocitos provocando as
las seales inflamatorias que se extienden ms all del insulto y da como
resultado la muerte celular necrtica / insuficiencia heptica aguda
( Dahlin y otros, 1984 y James et al, 2003 ) ( Fig. 1A ). Ha sido bien
documentado que las mltiples formas de CYP 450 enzimas, incluyendo
CYP1A2, CYP2E1, CYP2A6 han sido identificadas como las enzimas que
metabolizan APAP. Entre ellos CYP2E1 y CYP1A2 se informaron como las
principales enzimas implicadas en la bioactivacin APAP en los seres
humanos y roedores, despus de ms de la dosis ( Shayiq et al,
1999 , Yang et al, 2014 y Yao et al, 2015 ). Del mismo modo, CYP2A6

tambin fue demostrado estar involucrados en la oxidacin de APAP, a su

metabolito principal no txico (3-OH-APAP) y metabolito txico secundario
(NAPQI), donde se observ la tasa de formacin de 3-OH-APAP a ser de
3 veces ms rpido que NAPQI, por lo tanto representa indicativo el
importante papel de CYP2A6 en APAP sobredosis ( Chen et al,
1998 y Kalsi et al, 2011 ). Factor de transcripcin Por otro lado, como un
mecanismo de proteccin mediada la tensin factor nuclear eritroide 2
factor relacionado 2 (Nrf2) se une al elemento de respuesta antioxidante
(ARE) y activa la transcripcin de reguladas por genes diana tales como
NAD (P) H : quinona oxidorreductasa 1 (Nqo1), hemeoxygenase-1 (HO1), las subunidades de modificadores de cistena ligasa gamma-glutamato
(GCLM), glutatin S-transferasa alfa 2 (GSTA2), y por lo tanto ejerce una
influencia en varias etapas que incluyen ROS de lavado, homeostasis del
GSH, el estrs del sistema antioxidante, y metabolitos vas de flujo de
salida ( Aleksunes y Manautou, 2007 ). Actualmente, el tratamiento ms
eficaz para la sobredosis de acetaminofn es la N-acetilcistena (NAC), un
precursor de GSH ( Kanter, 2006 ). NAC repone nivel de glutatin y
mejora la recuperacin heptica. Sin embargo, NAC necesita ser
determinado dentro de 12 a 24 horas de la ingestin APAP, indicando de
este modo las limitaciones de tiempo despus de su aplicacin. Por otra
parte, la inversin del nivel de GSH tambin podra no ser suficiente para
detener el progreso de la hepatotoxicidad inducida por APAP (Dawson et
al, 1989 , Delanty, Fitzgerald, 1996 y Goldring y otros, 2004 ). Esto lleva
a los mdicos / industrias farmacuticas en la exploracin para una
terapia segura y eficaz alternativa frente a la toxicidad APAP.

Fig. 1.
Panel A: fases clave de hepatotoxicidad inducida APAP: elevacin de la actividad de las
enzimas del citocromo p450 conducen a la configuracin del metabolito txico reactiva
(NAPQI), GSH y el agotamiento antioxidante, la unin de los excedentes NAPQI con las
otras protenas celulares, alteracin de la funcin de los orgnulos celulares covalente,
conducen a la muerte celular necrtica, provocado la inflamacin, el desequilibrio del nivel
de ROS / RNS, elevado estrs oxidativo, la activacin de la NRF-2 / ARE sistema. Grupo
B : Los principales componentes bioactivos de Moringa oleifera hojas, sosteniendo altas
propiedades teraputicas que supuestamente actan contra la hepatotoxicidad inducida
APAP.
Figura opciones

Moringa oleifera Lam es un conocido especie ampliamente distribuida de

la familia Moringaceae, y tiene un alto valor nutricional y una notable
variedad de propiedades teraputicas. MO hojas se han notificado a ser
una rica fuente de micro y macronutrientes, alimentando de este modo
tanto animal como humana como un excelente complemento nutritivo
( Siddhuraju & Becker, 2003 ). Hojas MO se han utilizado duradera como
fuente medicinal tradicional y empleadas para el tratamiento de muchas
enfermedades, por lo tanto acuado como "el rbol de milagro." Est
enriquecido con muchos compuestos bioactivos tales como kaempferol,
ramnetina, quercitina, cido clorognico, rutina, apigenina ( Ezuruike,
Prieto, 2014 y Karthivashan et al, 2013 ) ( Fig. 1B ). A continuacin, las
hojas se han estudiado por sus diversas propiedades teraputicas, tales
como antimicrobianos, anti-inflamatorios, anti-cncer, efectos antidiabticos ( Anwar et al, 2007 y Coppin et al, 2013 ) y recientemente ha
sido evaluada por sus efectos hepatoprotector ( Das et al,
2012 y Sharifudin et al, 2012 ). Sin embargo, la mayor parte de los
estudios mencionados se han centrado en la evaluacin de su eficacia,
pero no a su mecanismo de accin a nivel molecular. As, en este estudio
se investig el efecto teraputico de MO se va contra la hepatotoxicidad
inducida APAP mediante la exploracin de su efecto modulador sobre las
enzimas del citocromo P450, NRF-2 / ARE sistema, enzimas antioxidantes
y citoquinas inflamatorias estableciendo as el mecanismo de accin
subyacente en su nivel molecular. Esto mejorara e iluminar el
conocimiento sobre el desarrollo de las hojas MO / sus candidatos
bioactivos en el campo de la investigacin clnica / translacional.

2. Materiales y mtodos
2.1. Productos qumicos y reactivos
El acetaminofn, la silimarina, leche en polvo descremada se adquirieron
de Sigma (St. Louis, MO, EE.UU.). Los anticuerpos primarios contra
CYP2E1, CYP1A2, -actina y HRP-conjugado con anticuerpos
secundarios apropiados se obtuvieron de Santa Cruz Biotechnology
(Dallas, TX, EE.UU.) y anti-CYP2A6 se obtuvo de Abcam (Cambridge,
MA, EE.UU.). reactivos de deteccin de transferencia Western ECL (kits) y
membrana de PVDF eran de Pierce Biotechnology, Inc. (Rockford, IL,
EE.UU.) y GE Healthcare Life Sciences (Pittsburgh, PA, EE.UU.),
respectivamente. Todos los kits de marcadores de la funcin heptica y
kits de ensayo de enzimas antioxidantes se compraron de Roche
Diagnostics (Mannheim, Baden-Wurttemberg, Alemania) y la I + D
(Minneapolis, MN, EE.UU.), respectivamente. tampn HEPES se obtuvo
de Nacalai Tesque (Nakagyo-ku, Kyoto, Japn). reactivo Trizol y
SsoAdvanced universal SYBR Green Supermix se obtuvieron de Life
Technologies (Carlsbad, CA, EE.UU.) y Bio-Rad (Hercules, CA, USA),
respectivamente. Los cebadores especficos de genes se obtuvieron a
partir AIT Biotech (Parque de las Ciencias, Singapur). Todos los dems

productos qumicos y reactivos utilizados se obtuvieron de Sigma a

menos que se indique lo contrario.
2.2. Las hojas de la cosecha y la extraccin
MO hojas se recogieron de Jardn-2, Universidad Putra Malasia y se han
confirmado lo mismo con la muestra de vales (SK 1561-08) que ha sido
depositado en la unidad de IBS Herbario. Las hojas se lavaron, se
secaron al aire a temperatura ambiente (24 C) durante 12 h y luego se
sec en estufa a 45 C durante 2 das consecutivos, tierra usando un
mezclador y se almacena en un recipiente hermtico para ms
procesos.Se prepar extracto hidro-etanlica (etanol: agua destilada,
90:10 [90%]), seguido de maceracin de M. oleifera hojas de polvo en una
botella aspiradora durante 3 das a temperatura ambiente con agitacin
continua. El residuo se filtr y se condens utilizando un evaporador
rotatorio a 40 C. El restante se liofiliz, se pes y se almacen a -20 C
para su posterior anlisis ( Karthivashan et al., 2013 ).
2.3. animales de experimentacin y diseo
Los ratones Balb / c macho, 10-12 semanas de edad (25-30 g) se
aclimataron durante 1 semana en una casa de animales (26 2 C) con
12 h programa de iluminacin diaria. Fueron alimentados con
excrementos de roedores estndar y se proporcion agua ad
libitum . Todos los experimentos con animales se realizaron con la
aprobacin (UPM / CICUAL / PUA-17/2013) y las directrices del IACUC
(Institucional Cuidado de Animales y el empleo) directrices ticas
estndar, Facultad de Medicina y Ciencias de la Salud, Universidad Putra
Malasia, Malasia.
En el da 8, despus de la aclimatacin, los ratones fueron separados al
azar en cinco grupos, con seis animales por grupo (n = 6). Grupos 2, 3, 4
y 5 recibieron una dosis txica de APAP (400 mg / kg de peso corporal por
disolucin en solucin salina caliente) seguido de la administracin de
solucin salina, la silimarina (100 mg / kg de peso corporal), MO deja
extractos (100 mg / kg y 200 mg / kg de peso corporal), respectivamente,
una hora despus de la administracin de la dosis letal de APAP. Grupo 1
se le administr solucin salina, tanto para las sesiones. Dado que la
administracin de APAP, los ratones se mantuvieron en ayunas durante 24
h para inducir toxicidad y se sacrificaron usando ter dietlico. Las
muestras de sangre se obtuvieron rpidamente por puncin cardaca y el
suero se prepar y se almacenan en -20 C. Se recogi el hgado, se
congelaron inmediatamente y se almacena a -80 C, y una parte de ellos
se fijaron en formalina al 10%.
2.4. Los anlisis bioqumicos sricos
Los marcadores de la funcin heptica, incluyendo la aspartato
aminotransferasa (AST), alanina aminotransferasa (ALT) y gamma-

glutamil transpeptidasa (GGT) en los niveles en suero se midieron

mediante kits comerciales de Roche Diagnostics acuerdo con los
protocolos del fabricante.
2.5. histologa heptica
El lbulo medio del hgado de cada grupo se retiraron y se fijaron en 10%
de formalina y embebidos en parafina, cortado en 5 micras de grosor y se
tieron con hematoxilina y eosina. Necrosis se puntu de 0 a 3 cuando
est presente en 0, 0-25, 25-50, o 50% y por encima del campo,
respectivamente. Al menos tres campos por seccin se examinaron bajo 4
de ampliacin y los datos se expresan como las puntuaciones medias por
grupo experimental. Otras modificaciones patolgicas tales como la
inflamacin, ncleos picnticos y la congestin sinusoidal, tambin se
observaron y notificados. Los cambios patolgicos en los tejidos del
hgado se examinaron y fotografiaron usando un microscopio Olympus
(BX-51; Olympus, Tokio, Japn).
2.6. Medicin del estrs oxidativo heptico y marcadores inflamatorios
El tejido de hgado congelado se descongel y se homogeneiz con
solucin salina enfriada en hielo y se centrifug, y los sobrenadantes se
ensayaron de acuerdo con las instrucciones del kit. kits Biovision de
investigacin (Milpitas, CA, EE.UU.) se utilizaron para cuantificar la
actividad de la peroxidasa lipdica sobre la base de la formacin de
aductos de MDA-TBA y la actividad de las enzimas antioxidantes del
Cayman Chemical Company (Ann Arbor, MI, EE.UU.) para la SOD, CAT y
GPx. Los niveles de hgado pro-inflamatorias (TNF-, IL-1, IL-6) y
citocinas antiinflamatorias (IL-10) en los homogeneizados de tejido
heptico se determinaron utilizando kits de ELISA disponibles en el
mercado, de acuerdo con las instrucciones de los fabricantes I + D.
2.7. La cuantificacin de protenas y Western Blot
Los tejidos del hgado congelados se descongelaron y se
homogeneizaron en tampn HEPES 20 mM, 10 s dos veces usando un
homogeneizador de mano Ruptor Tissue (Qiagen, Venlo, LI, Pases
Bajos). Adems los homogeneizados se centrifugan a 14.000 g durante
15 min a 4 C y se determin la concentracin de protenas utilizando
Pierce 660-nm kit de ensayo de protenas (Thermo Fisher Scientific,
Rockford, IL, EE.UU.). 30 g de protena lisados se realizaron en 10%
SDS-PAGE y se transfirieron por electroforesis a una membrana de PVDF
(GE Healthcare Life Sciences, Pittsburgh, PA, EE.UU.). Las membranas
se bloquearon a continuacin durante 1 h usando 5% de leche desnatada
en polvo (Sigma-Aldrich) en PBS y se sondaron durante la noche con
anticuerpos primarios dirigidos contra CYP2E1 (1: 1000), CYP1A2 (1:
2000), CYP2A6 (1: 1000) y el servicio de limpieza protena -actina (1:
2000) a 4 C, seguido de la incubacin con peroxidasa de rbano (HRP)

conjugado con anticuerpos anti-conejo o anti-ratn de 1 h a temperatura

ambiente. Las seales se detectaron por reactivos de deteccin ECL que
fueron escaneados con el analizador ChemiDoc Sistema MP bioformacin de imgenes (Bio-Rad) y las densidades pticas relativas se
cuantificaron utilizando el software Image-J. Todos los grupos de
tratamiento se cuantificaron en relacin con el grupo de control, como el
estndar (con el valor de 1,0) y se transportan como expresin veces en
relacin.
2.8. Extraccin de ARN total y el anlisis RT-PCR cuantitativa
ARN total fue extrado a partir de ratones hgado recogidos de diferentes
grupos usando el reactivo Trizol (Life Technologies) segn las
instrucciones del fabricante. La concentracin y pureza del ARN extrado
se midieron por BioSpectrometer (Eppendorf, Hamburgo, Alemania), y el
ADNc se sintetiz posteriormente de 1 g de ARN total usando la alta
capacidad de cDNA Synthesis Kit con cebadores aleatorios (Life
Technologies). La transcripcin inversa se llev a cabo de acuerdo con el
siguiente protocolo: 25 C durante 10 min, 37 C durante 60 min y 85 C
durante 5 min.
Cuantitativa en tiempo real PCR se llev a cabo utilizando cebadores
especficos del gen (AIT Biotech, Singapur) y SsoAdvanced universal
SYBR Green Supermix (Bio-Rad). Todos los cebadores utilizados en este
estudio se enumeran en la Tabla 1 -PCR en tiempo real se realiz
utilizando el CFX 96 Real-Time Sistema de Deteccin de PCR (Bio-Rad)
con los siguientes pasos:. 95 C durante 2 min, 40 ciclos de 95 C
durante 10 s, 60C durante 45 s y adquisicin de seal fluorescente. La
especificidad de la PCR en tiempo real fue confirmada por electroforesis
en gel de agarosa (dirigido PCR tamao del producto) y derretir anlisis
de la curva (pico de fusin nico). La curva de fusin se realiz
inmediatamente despus de la finalizacin de PCR en tiempo real con el
incremento gradual de la temperatura desde 70 C a 95 C; cada
incremento se mantuvo durante 5 s, seguido de adquisicin de seal
fluorescente. Tres repeticiones biolgica de cada grupo y 3 repeticiones
tcnica para cada muestra de hgado se realizaron en PCR en tiempo
real.
Tabla 1.
Las secuencias de cebadores usados en la cuantitativa en tiempo real PCR para el anlisis
de la expresin gnica.
secuencia de cebador (5'-3 ')
PCR
tamao
del
producto
Gene
Adelante
Marcha atrs
(pb)
NRF-2
AGGACATGGAGCAAGTTTGG
TTCTTTTTCCAGCGAGGAGA
176
NQO1
GGTAGCGGCTCCATGTACTC
CATCCTTCCAGGATCTGCAT
173
HO-1
CACAGATGGCGTCACTTCGTC
GTGAGGACCCACTGGAGGAG
130

secuencia de cebador (5'-3 ')

Gene
GCLM
GSTA2
actina

Adelante
AATCAGCCCCGATTTAGTCAGG
CGCCACCAAATATGACCTCT
TCCTTCCTGGGCATGGAG

Marcha atrs
CCAGCTGTGCAACTCCAAGGAC
CCTGTTGCCCACAAGGTAGT
AGGAGGAGCAATGATCTTGATCTT

PCR
tamao
del
producto
(pb)
197
232
207

opciones de la tabla

Curva estndar para cada gen ( Tabla 1 ) se gener para asegurar la

eficiencia de la PCR optimizada del ensayo. La expresin de los genes
diana en el grupo de los grupos de tratamiento y de control se normaliz
el uso de la casa de mantenimiento de genes -actina y el pliegue del
cambio en la expresin de cada gen diana se calcul por el 3.0 del
software CFX Manager (Bio-Rad) utilizando la eficacia -Corregido mtodo.
2.9. anlisis estadstico
Los resultados se expresan como media SEM. El anlisis estadstico se
realiz mediante el uso de una prueba t de Student independiente, el
anlisis de la varianza (ANOVA) con la prueba de Tukey post hoc segn el
caso. Un P -valor inferior a 0,05 fue considerado estadsticamente
significativo.

3. resultados
3.1. MO deja hepatotoxicidad inducida por el extracto de atenuar APAP en
ratones
Despus de la administracin de acetaminofeno, los ratones haban
demostrado niveles elevados significativos de AST, ALT y GGT que
indican el deterioro de las funciones del hgado y la incidencia de
hepatotoxicidad ( Fig. 2A-C ). Esto se representa claramente en las
fotografas histolgicas de acetaminofeno ratones intoxicados con
hepatocitos del hgado grave dao necrtico alrededor de la zona
perivenular y la congestin sinusoidal ( fig. 3B 1 ). Sin embargo, el
tratamiento de ratones con extracto MO tiene significativamente ( P <
0,05) redujo el nivel de AST, ALT y GGT en comparacin con los grupos
que no se trataron con MO y se encontr que la disminucin es
dependiente de la dosis. Entre las diferentes dosis, los ratones tratados
con la dosis ms alta de MO extracto de hojas (200 mg / kg de peso
corporal) exhibi significativa ( P < disminucin 0,05) de la AST en suero,
niveles de ALT y GGT y prxima a los efectos de la silimarina tratada
(control positivo ) grupo. De conformidad, las fotografas histolgicas de
MO ratones tratados hgado a una dosis de 100 mg / kg de peso corporal
muestran un grado de reduccin de rea necrtica y declin infraccin
( Fig. 3C 1 ). Sin embargo, a una dosis mayor de 200 mg / kg de peso
corporal ( Fig. 3D 1 ), MO conserva la arquitectura de hepatocitos

centrolobulillar como iguales que el control positivo ( Fig. 3E 1 ) grupo y se

parece
mucho
al
grupo
de
tratamiento
simulado
( Fig.
3A 1 ) . Posteriormente, la puntuacin histologa muestra un rea reducida
de manera significativa necrtica en MO (200 mg / kg de peso corporal)
los ratones tratados en comparacin con los ratones de APAP solamente
administrados ( Fig. 3F 1 ). Estos resultados representan la forma
indicativa papel hepatoprotector de hojas MO.

Fig. 2.
Moringa oleifera hojas se deterioraron el efecto de la hepatotoxicidad inducida APAP. (A-C)
representa el nivel de los marcadores bioqumicos sricos - AST, ALT y GGT. Western blot
de los niveles de CYP2E1, CYP2A6 y CYP1A2 a partir de los homogeneizados de hgado
de tratar; Moringa oleifera extracto de hojas [100 mg / kg y 200 mg / kg] y la silimarina
tratados APAP ratones intoxicados. (A 1 ) Las masas moleculares aparentes indicadas de
CYP2E1, CYP2A6 y CYP1A2 y -actina (control interno) fueron de 64, 49, 54 y 43 kDa,
respectivamente. (B 2 ) Su expresin veces en relacin Tambin se demostr. Los
resultados son la media SEM de seis ratones. * P <0,05 comparado con el grupo
control, $, #, P <0,05 comparado con el grupo administrado APAP.
Figura opciones

Fig. 3.
(A 1 -E 1 ) fotomicrografas representativas (20 ) y (a 2 -E 2 ) fotomicrografas
representativas (40 ) de H & E-manchado secciones de hgado de ratones Balb / c que
fueron: A 1, A 2 - sin tratar muestra Normal arquitectura histolgica de la vena central (CV),
la trada portal (PT), sinusoide normal de la sangre (S), hepatocitos (H), el ncleo
(N); B 1, B 2 - APAP administrado que muestra necrosis perivenular (PN) con infiltracin
inflamatoria (lneas de largo de puntos) asociado con la congestin sinusoidal (SC),
ncleos picnticos (PK),-de regenerativo (flecha) y cromatinas condensados con
hepatocitos agrandados (diamante ) se observaron; C 1, C 2 - tratado con Moringa
oleifera extracto de hojas de 100 mg / kg mostrando pocos ncleos picnticos (PK),
hepatocitos-de regenerativa (flecha), infiltracin inflamatoria (lneas largas de puntos),
congestin sinusoidal moderada (SC) y los hepatocitos binucleares regenerativas (flecha
de puntos);D 1, D 2 - tratado con Moringa oleifera extracto de hojas de 200 mg / kg que
muestra la arquitectura lbulo heptico justo, hepatocitos ms binucleares (flecha de
puntos) en su fase regenerativa con el cambio heptica limitada incluyendo ncleos
picnticos (PK) y la congestin sinusoidal escasa; E 1, E 2 , - silimarina tratado mostrando
conserva la estructura lbulo heptico, hepatocitos maduros y hepatocitos binucleares
mittico (BN); F 1 - La puntuacin de necrosis histologa de los grupos mencionados
anteriormente tambin se obtuvieron. Los valores se expresan como la media SEM de n
= 6 ratones en cada grupo. * P <0,05 comparado con el grupo control, $, #, P <0,05
comparado con el grupo administrado APAP.
Figura opciones

3.2. MO extracto de hojas suprime la actividad del citocromo P450 en

ratones indujo APAP hepatotxicos
Para examinar el impacto del extracto de hojas de MO en fase I (CYP
450) enzimas, los cambios en las expresiones de nivel de protena de
CYP2E1, CYP2A6 y se obtuvieron CYP1A2 y ejemplifican en la Fig. 2A 1 y
la expresin relativa pliegue de protenas de los grupos tratados se
compararon con el grupo de control como punto de referencia (valor de
1,0) y se muestran en la Fig. 2B 2 . En coherencia con los resultados de
los biomarcadores sricos elevados, APAP hgados de ratones

intoxicados mostraron alta expresin de todas las tres isoformas CYP 450
y as explican su importante papel en la regulacin de la hepatotoxicidad
inducida APAP.
De la Fig. 2B 2 , estaba claro que los hgados de ratones tratados
mostraron extractos MO reduccin dependiente de la dosis en la
expresin de CYP2E1, CYP2A6 y CYP1A2. A la dosis de 100 mg / kg de
peso corporal, grupo tratado MO exhibi menor de una supresin pliegue
de todas las isoformas, mientras que a una dosis mayor de 200 mg / kg
de peso corporal, grupo tratado MO exhibi mayor que 2 a 4 veces mayor
de supresin todas las isoformas en comparacin con APAP intoxicados
ratones. As, los resultados indican la naturaleza del CYP 450 inhibidor del
extracto de hojas de MO.La silimarina (control positivo) grupo tratado
tambin exhibi aproximadamente 2-4 veces la supresin de todas las
isoformas, en comparacin con ratones intoxicados APAP. As, el extracto
de hojas de MO suprime de manera efectiva la actividad del CYP450 en
dosis ms alta y exhibe una actividad similar a la del grupo de control
positivo.
3.3. MO extracto de hojas mejora la expresin heptica de genes que
regulan y restaurar su estado antioxidante, en APAP inducida ratones
hepatotxicos
La influencia del extracto de hojas de MO en el nivel de enzimas
antioxidantes en los hgados de APAP administrado y se evalu los
ratones tratados MO. Las actividades de MDA, SOD, CAT y GP X en los
tejidos del hgado de ratones administrados APAP se muestran en
la Fig. 4A-D . Los ratones administrados con APAP mostr una elevacin
significativa en el nivel de MDA con 1,20 0,12 nmol / mg de tejido en
comparacin con el grupo control, que es 0,95 0,19 nmol / mg de tejido,
mientras que, MO (200 mg / kg de peso corporal) y silimarina grupos
tratados mostraron una disminucin significativa (P <0,05) en el nivel de
MDA con los valores que van alrededor de 0,98 0,13 nmol / mg de
tejido. Los hgados obtenidos de los ratones intoxicados con APAP
mostraron disminucin significativa en la SOD (54,70 3,01 U / mg), CAT
(66,67 1,91 nmol / min / mg de protena) y GP X (3,39 2,09 nmol / min /
mg de protena ) en comparacin con grupos de control que muestra los
valores de 66,33 7,02 U / mg, 84,93 3,41 y 5,09 2,41 nmol / min / mg
de protena, respectivamente (P <0,05). Por el contrario, la SOD, CAT y
GP X actividades de los grupos tratados con el extracto de hojas de MO se
han incrementado de forma dependiente de dosis como se muestra en la
figura. 4B-D . A la dosis ms alta (200 mg / kg de peso corporal), MO deja
valores de extracto exhibido de 106,16 7,01 U / mg, 77,47 9,20 y 9,33
3,20 nmol / min / mg de protena de GP SOD, CAT y X actividades
respectivamente, que fueron significativamente (P <0,05) ms alta que la
APAP intoxicado ratones hgado. La silimarina (control positivo) mostraron
grupo tratado con SOD y GP X actividad de 89,50 5,01 U / mg y 6,79
4,01 nmol / min / mg de protena, respectivamente. Sin embargo, a partir

de la Fig. 4B y D , estaba claro que el extracto de hojas de MO

notablemente superado el nivel de SOD y GP Xactividad contra el grupo
tratado silimarina. Estos resultados indican que los extractos de hojas de
MO restaurar eficazmente el estado antioxidante de APAP ratones
intoxicados hgado.

Fig. 4.
Efecto dependiente de la dosis de Moringa oleifera (MO) extracto de hojas contra APAP
ratones intoxicados hgado: [A] la actividad de la peroxidacin lipdica (MDA); los niveles de
enzimas antioxidantes endgenos ([B] -SOD, [C] -CAT y [D] -GPx). E - Efectos de Moringa
oleifera (MO) extracto de hojas en la expresin de genes hepticas relacionadas con genes
antioxidantes mediadas NRF-2 en la hepatotoxicidad inducida por paracetamol en ratones
hgado. La expresin de los genes diana se normaliz a -actina y el grupo tratado con

APAP que sirvi como se muestra control para la comparacin como la media SEM; * P
<0,05 en comparacin con el grupo control, $, #, P <0,05 comparado con el grupo APAP.
Figura opciones

Para investigar el mecanismo molecular implicado en los efectos

antioxidantes del extracto de hojas de MO en el APAP ratones intoxicados
hgado, la expresin de genes de las enzimas antioxidantes NRF-2,
NQO1, HO-1, GCLM, Gsta2 fueron evaluados por QRT-PCR. Los
resultados en la Fig. 4E mostr que los hgados de ratones tratados con
una dosis mayor de MO extracto de hojas significativamente (P <0.05)
expresa la expresin gnica elevada de NQO1, HO-1, Gsta2, GCLM ms
o menos de cuatro a seis aproximadamente ocho veces los aumentos de
plegado y NRF-2 en comparacin con APAP intoxicado hgados de
ratones. Como se prevea el efecto incremental de la MO extracto de
hojas fue dosis dependiente. As, estos resultados representan indicativo,
que MO extracto de hojas eficazmente restaura el estado antioxidante en
el hgado a travs de la activacin de la va Nrf2-SE de sealizacin y por
lo tanto frena la gravedad del dao heptico inducido por APAP.
3.4. MO extracto de hojas modula citoquinas pro / anti-inflamatorias y
revela el papel hepatoprotector contra APAP inducida ratones
hepatotxicos
Ms conocimiento sobre el mecanismo de accin de MO extracto de hojas
contra los ratones intoxicado APAP se llev a cabo mediante la evaluacin
de su impacto en la alteracin de las citoquinas inflamatorias de
nivel Fig. 5A-D y mediante la obtencin de fotomicrografas histolgicas
de los cambios asociados en los tejidos del hgado ( Fig. 3A 2 -E 2 ). Los
ratones APAP administrados mostraron una disminucin significativa (P
<0,05) Aumento en el nivel de citoquinas proinflamatorias TNF-a, IL-1, IL6 con los valores de 451,25 33,57, 299,27 7,18, 347,21 55,42 ng /
mg de protenas, respectivamente, y la supresin en el nivel de citoquina
antiinflamatoria IL-10 con el valor de 58,49 4,32 ng / mg. Esto se
observa claramente en las fotomicrografas de histologa ( Fig. 3B 2 ) con
congestin sinusoidal (SC), necrosis perivenular y la inflamacin, ncleos
picnticos (PK), los hepatocitos-de regenerativa. Por el contrario, MO deja
dosis dependiente extracto modula el nivel de los marcadores
inflamatorios.Grupo Precisamente, a la dosis de 200 mg / kg de peso
corporal, MO tratada significativamente (P <0,05) suprimi el nivel de
TNF-, IL-1, IL-6 con los valores de 324,16 103,47, 84,27 11,85,
187,51 52,51 ng / mg de protena, respectivamente, y mejorado el nivel
de IL-10 con el valor de 151,98 40,29 ng / mg de protena. De la Fig.5AD , estaba claro que el grupo tratado MO super los efectos de la
silimarina (control positivo) grupo tratado, que mostraba el nivel de TNF-,
IL-1, IL-6 con los valores de 274.58 33.57, 97.88 32.12 , 198,72
45,67 ng / mg de protena, respectivamente, y el nivel de citoquina
antiinflamatoria IL-10 con un valor de 114,36 36,17 ng / mg de
protena. De acuerdo, las microfotografas de MO (200 mg / kg de peso
corporal) tratadas y silimarina (control positivo) hgados de los ratones

tratados, mostraron una arquitectura histolgica bien conservada de la

vena central (CV), sinusoides sanguneos normales y hepatocitos ms
binucleares en su regenerativa se observaron fase.

Fig. 5.
Efecto modulador de Moringa oleifera (MO) extracto de hojas contra APAP intoxicado
hgado citoquinas inflamatorias - [A] de TNF-; [B] IL-1; [C] IL-6; [D] IL-10. Los resultados
se muestran como la media SEM; * P <0,05 en comparacin con el grupo control, $, #, P
<0,05 comparado con el grupo PCM.
Figura opciones

4. Discusin
Hepatotoxicidad inducida APAP es la principal causa de insuficiencia
heptica aguda inducida por frmacos (ALF), incluso en los pases
desarrollados. El antdoto actualmente existente, N-acetil cistena es
eficaz cuando son tratados en una fase temprana (limitacin de tiempo),
ya que restaura el agotamiento de GSH, un marcador clave inicial de
toxicidad APAP. Sin embargo, el mecanismo molecular de APAP
hepatotoxicidad implica varios otros marcadores clave, a travs del cual la
complicacin puede limitarse eficazmente. Nuestro estudio anterior ha
demostrado que la MO extracto de hojas de APAP hepatotoxicidad
inducida aliviado con xito a travs de su naturaleza anti-oxidante y
restauracin de nivel de GSH ( Fakurazi et al, 2008 y Sharifudin et al,
2012 ), y tambin inform de los compuestos bioactivos responsables de
su
actividad
antioxidante
enriquecido
( Karthivashan
et
al,
2015 y Karthivashan et al, 2013 ). Hasta la fecha, no existen informes
definitivas sobre el mecanismo molecular de MO extracto de hojas contra
APAP hepatotoxicidad. Por lo tanto, este estudio pretende demostrar la
actividad hepatoprotectora del extracto de hojas de MO contra la toxicidad

inducida por la APAP, y para explicar el mecanismo molecular subyacente

de la accin responsable de sus efectos. En este estudio, la
administracin de una dosis letal de APAP a ratones evidentemente
inducidas dao heptico que fue confirmada a travs de elevada
expresin de CYP 450 enzimas, el agotamiento de los antioxidantes
endgenos, el estrs oxidativo, la inflamacin mediada y necrosis
heptica. Para declarar el deterioro inducido por APAP, el nivel de los
marcadores bioqumicos del suero tales como las aminotransferasas (AST
y ALT) y gamma-glutamil transferasa (GGT) se analiz. El elevado nivel
de AST / ALT y GGT se produce debido a los daos del citoplasma /
mitocondria y el aumento de la permeabilidad de la membrana de los
hepatocitos, que indica un deterioro grave del hgado ( Ozer, Ratner,
Shaw, Bailey, y Schomaker de 2008 ). De acuerdo, los grupos de ratones
intoxicados APAP exhibieron elevado nivel de suero de AST / ALT y
GGT. Los resultados de los ratones MO tratado indicaron que MO extracto
de hojas de forma efectiva y dependiente de la dosis disminuye la
gravedad de los daos del hgado inducida por APAP, que se evidencia
por los bajos niveles de AST, ALT y GGT en el suero de MO ratones
tratados, lo que indica reducida dao heptico. Ha sido bien documentado
que las enzimas del citocromo P450 son las enzimas ms predominantes
que metabolizan frmacos en el hgado y estn implicadas en la
biotransformacin oxidativa de acetaminofeno a reactivo metabolito txico
(NAPQI), que se form en abundancia durante APAP sobredosis
( Aleksunes, Manautou de 2007 y Lynch , Precio, 2007 ). Entre las
diversas isoformas de las enzimas P450, CYP2E1 y CYP1A2 (en APAP
dosis txica), y CYP2A6 (en APAP dosis aguda txico) son las principales
isoenzimas que intervienen en bio-activacin de APAP y la posterior
produccin de radicales libres ( Chen et al, 1998 , Tonge et al,
1998 y Zaher et al, 1998 ). Informes recientes del estudio revelaron la
actividad contencin de flavonoides, como la apigenina, kaempferol y
quercetina, contra el mecanismo de CYP450 inhibiendo el transporte de
drogas a travs de polipptido heptica orgnica transportador de aniones
(OATP) ( Mandery et al, 2010 y Priyadarsini, Nagini de 2012) . De
conformidad, los datos de este estudio demostraron que el flavonoide
constituyentes enriquecido de MO hojas, eficazmente y dependiente de la
dosis disminuy los niveles de protena de todas las tres isoformas de las
enzimas CYP450 supuestamente mediante la inhibicin de la actividad de
transporte de OATPs hepticas, con lo que subjetivamente la disminucin
de la formacin de NAPQI y relativamente reducir NAPQI mediada por el
estrs oxidativo.
Para analizar la produccin de ROS intracelular, niveles y actividades de
las enzimas antioxidantes peroxidacin lipdica (MDA) (SOD, CAT, GPx y
GST) se midieron.Durante APAP sobredosis, se produce un desequilibrio
entre las formaciones de especies reactivas de oxgeno (ROS) y su
mecanismo de barrido a travs del sistema antioxidante endgeno
( Kalyanaraman, 2013 ). Esto hace que el estrs oxidativo ambiente y se
somete a la formacin de dao celular mediada por radicales peroxilo,

que adems se reorganice a travs de un proceso de ciclacin de

endoperxidos, y produce malondialdehdo (MDA) como el producto final
( Yin, Xu, y Porter, 2011 ). En este estudio se observ que los ratones
intoxicados APAP mejoradas significativamente la peroxidacin lipdica y
agota las enzimas antioxidantes endgenos en el hgado. Sin embargo
ratones MO tratadas eficazmente restauraron las enzimas antioxidantes
endgenos mejorando de este modo el mecanismo de eliminacin contra
las especies de oxgeno reactivas (ROS), que se observ claramente
como en el agotamiento de los niveles de MDA en el hgado de ratones
tratados.
Para ampliar an ms la investigacin a nivel molecular en el sistema
antioxidante endgeno, se evalu la modulacin de la expresin gentica
de los genes antioxidantes a travs del sistema NRF-2 / ARE. Activado
NRF-2 por la disociacin de Kelch-como la protena epiclorhidrinaasociado 1 (Keap1), se transloca al ncleo y se une al elemento de
respuesta antioxidante (ARE) en la regin promotora y transcribe una
gran batera de genes antioxidantes ( Gum, Cho, 2013 y Lee, Pan,
2013 ).Informes de los estudios llevados a cabo han demostrado el hecho
de que NRF-2 mediada por la regulacin de genes participa efectivamente
en la actividad hepatoprotectora contra acetaminofeno. Accin resistiva de
ratones nulos KEAP1 y la responsabilidad de los ratones nulos Nrf2 a
hepatotoxicidad acetaminofeno, evidentemente, demostraron el papel
fundamental de los genes mediadas por Nrf2 en hepatoproteccin
( Klaassen, Reisman 2010 y Reisman y otros, 2009 ). Nuestros
resultados indican que los ratones tratados aumentaron MO eficazmente
la expresin NRF-2 y contrarrestan la toxicidad APAP por la activacin de
la expresin del gen diana antioxidante aguas abajo. Esto se observ
claramente como en el hgado extirpado de APAP tratados ratones que
muestra disminuyeron GCLM, GSTa2, NQO1 y HO-1 de expresin, que
fue significativamente mayor en los extractos de hoja MO ratones
administrados. Recientemente se ha informado de que los flavonoides
como la quercetina, kaempferol de la baya de forma sinrgica activan la
va Nrf2-SE sealizacin y exhiben estrs actividad anti-oxidante ( Sierra
et al., 2014 ). De acuerdo, los flavonoides, como la apigenina, kaempferol
y quercetina presente en MO extracto de hojas estn supuestamente
implicados en la induccin de resistencia sinrgica de APAP
hepatotoxicidad en ratones mediante la activacin de la NRF-2-SE va de
desintoxicacin y reduciendo el efecto perjudicial de ROS por lo tanto .
A pesar de que estaba bien establecido que la hepatotoxicidad inducida
por sobredosis de APAP fue iniciada por la formacin de NAPQI, los
ltimos informes de los estudios sugieren fuertemente el papel de las
respuestas inflamatorias en la progresin de la lesin heptica ( Liu et al,
2004 y Liu et al, 2006 ). Modulacin de la produccin de citoquinas
inflamatorias juega un papel fundamental en el potencial teraputico para
el tratamiento de la progresin del dao heptico ( Jaeschke,
2005 y Song et al, 2014 ). Los NAPQI mediada hepatocitos necrticos
liberan diversos (hmedos) molculas patrn molecular daos asociados,

tales como caja de alta movilidad de grupo 1 (HMGB1), que se une a los
receptores de tipo Toll (TLR) en los macrfagos y activa la infiltracin de
clulas inmunes, provocando as la liberacin de citoquinas proinflamatorias tales como TNF-, IL-1, IL-6 ( Schwabe, Seki, y Brenner,
2006 ), que estn involucrados en la infiltracin heptica masiva de
leucocitos que de este modo inducir ambiente inflamatorio estril que
adems exagerar el dao heptico. Un estudio reciente inform Bazhen
decoccin exhibi actividad antiinflamatoria eficaz basada en sus
actividades inhibidoras contra la expresin de citocinas pro-inflamatorias
tales como TNF-, IL-1, IL-6 en ratones intoxicado APAP (Song et al.,
2014 ) . De conformidad, los resultados de nuestro estudio mostraron
elevado nivel de TNF-, IL-1, IL-6 en los ratones administrados APAP,
que ha sido suprimida significativamente por el extracto de hojas de
MO. Sin embargo, para neutralizar este efecto deterioro, las citoquinas
anti-inflamatorias tales como IL-10 tambin fueron producidos por las
clulas de Kupffer en el sitio de la inflamacin heptica. Bourdi et
al. (2002) informaron que los ratones IL-10 knockout haban aumentado
transcritos de ARNm de las citoquinas pro-inflamatorias (TNF-a, IL-1)
que presenta de este modo la toxicidad elevado al acetaminofeno en
comparacin con el tipo salvaje. Consistentemente, nuestro resultado
indica supresin significativa de la IL-10 de citoquinas en ratones
intoxicados APAP, que ha sido eficazmente restaurada por MO hojas de
dosis de extracto de forma dependiente. As MO extracto de hojas modula
significativamente la expresin pro y citoquinas anti-inflamatorias,
protegiendo as la exacerbacin mediada inflamatoria de dao heptico
en APAP intoxicado ratones. El mecanismo de accin general de MO
extracto de hojas de APAP en contra va de hepatotoxicidad inducida ha
sido claramente dilucidado en la Fig. 6 .

Fig. 6.

Mecanismo de accin de MO extracto de hojas de APAP en contra va de hepatotoxicidad

inducida: Los componentes activos de extracto de hojas de MO con xito inhibir la
actividad del CYP 450 reduciendo de esta manera la formacin de NAPQI (metabolito
txico); exhibiendo efecto perjudicial contra el estrs oxidativo por NRF-2 / SE elevacin de
los niveles de enzimas antioxidantes endgenas mediada; la inhibicin de la cascada
inflamatoria extensa por la modulacin eficaz de citoquinas inflamatorias. Estas acciones,
evidentemente proyectan MO extracto de hojas como agente hepatoprotector xito.
Figura opciones

5. Conclusin
En resumen, hemos establecido de manera concluyente que el extracto
de hojas de MO, enriquecida con componentes bioactivos, efectivamente
protege el hgado de APAP intoxicacin travs de la supresin de 450
CYP isoenzimas y decremento de la produccin NAPQI
supone; regulacin de Nrf2 / ARE sistema de elevacin de las enzimas
antioxidantes mediada nivel para el combate contra el medio ambiente
ROS;y la modulacin de las citoquinas inflamatorias que impiden de este
modo la ms exacerbacin de dao heptico-necrtico. Estos resultados,
evidentemente, sugieren que la MO extracto de hojas puede estar
implicado como un antdoto eficaz contra APAP intoxicacin, ya que
obstaculiza / suprime / modula varios biomarcadores clave involucrados
en la va de hepatotoxicidad APAP que implicaban a varios puntos de
tiempo despus de la administracin de APAP, que perdura como una
limitacin de corriente antdoto existente (NAC). Adems MO extracto de
hojas puede tambin ser co-administrado como suplemento con los
frmacos que inducen hepatotoxicidad, que se mantiene como un
obstculo importante para muchas industrias farmacuticas para limpiar a
travs de las evaluaciones clnicas. Por lo tanto, an ms extensa
investigacin traslacional sobre los componentes activos del extracto de
hojas de MO abre el camino para el surgimiento de un antdoto eficaz
contra la APAP hepatotoxicidad.