Los cambios diarios en los parmetros del metabolismo energtico en el

hgado, msculo blanco, y las branquias de la trucha arco iris: La

dependencia de la alimentacin
Introduccin
el tiempo y el ciclo luz / oscuridad de alimentacin son considerado como el
agentes de arrastre predominantes de los ritmos diarios en los peces (y Boujard
Leatherland, 1992b), que permiten el ajuste de la vida procesos a la ordenacin
cronolgica de lo externo mundo (De Pedro et al., 1998).
En los peces, la existencia de los cambios diarios en la alimentacin dependiente
se ha demostrado por varios metabolitos en plasma y. Hormonas (Pavlidis et al,
1999a, b; Figueroa et al, 2000;. De Pedro et al., 2005; Polakof et al., 2007). En los
mamferos, plasma concentracin de productos metablicos y hormonales
relacionados con balance de energa vara con una dinmica bien establecida,
dependiendo de si el organismo se alimenta, en ayunas o Starved (Escobar et al.,
1998). El ayuno es el de uso ms frecuente enfoque para estudiar si un ritmo en el
metabolismo energtico es independiente del efecto de la alimentacin desde los
ritmos diarios depende de la alimentacin debe desaparecer en los alimentos
privados Bioqumica y fisiologa comparativa, Parte A 147 (2007) 363-374
www.elsevier.com/locate/cbpa Abreviaturas: Asp-AT, aspartato aminotransferasa (..
EC 2.6.1.1); FBPasa, fructosa 1,6-bisfosfatasa (EC 3.1.3.11..); G3PDH, glicerofosfato deshidrogenasa (EC 1.1.1.8..); G6PDH, la glucosa 6-fosfato
deshidrogenasa (CE 1.1.1.49..); G6Pasa, glucosa 6-fosfatasa (EC 3.1.3.9..); GDH,
glutamato deshidrogenasa (EC 1.4.1.2..); GlDH, glucosa deshidrogenasa (CE
1.1.1.47..); HK-I, hexoquinasa I (EC 2.7.1.1..); HK-IV, la hexoquinasa o
glucoquinasa IV (CE. 2.7.1.1.); LDH-O, lactato deshidrogenasa-oxidasa (EC
1.1.1.27..); PK, piruvato quinasa (EC. 2.7.1.40.).
Autor correspondiente. Tel .: +34 986 812 564; Fax: +34 986 812 556.
Direccin de correo electrnico: jsoengas@uvigo.es (J. L. Soengas).
1095-6433 / $ - ver fronanimals. En el hgado de pescado, hay varios estudios que
evalan diariamente cambios en los parmetros metablicos de los peces
alimentados (Boujard y Leatherland, 1992a; De Pedro et al., 1998) con muy pocos
estudios llevado a cabo en el pescado ayunado y realimentado para evaluar si es
o no ritmos eran dependientes de la alimentacin. En un estudio preliminar
(Figueroa et al., 2000) se inform de la existencia de varios 24 h los cambios en el
metabolismo de la energa del hgado de la trucha arco iris que eran depende
aparentemente en la alimentacin tales como el aumento de la los niveles de
glucgeno
varias
horas
despus
de
la
alimentacin.
En los tejidos que no sean el hgado, los efectos de la restriccin de alimentos en
peces se han estudiado sobre todo en un momento del da, como la caso del

cerebro (Soengas et al, 1996, 1998;. Sangiao- Alvarellos et al, 2005b.; Polakof et
al., 2006a), el msculo blanco (Collins y Anderson, 1997;. Kirchner et al, 2005), las
branquias
y
. Rin (Kirchner et al, 2005; SANGIAO-Alvarellos et al, 2005b.;Polakof et al.,
2006a), y el intestino (Kirchner et al., 2005).Poca atencin, sin embargo, se ha
prestado a los efectos de los alimentos la privacin en 24 h cambios en esos
parmetros para evaluar su dependencia de la alimentacin. Slo en un estudio
previo
(Polakof
et
al.,
2007) se demostr la existencia de 24 h cambios en parmetros de metabolismo
de la energa en el plasma y el cerebro de trucha arco iris que eran dependientes
o
independientes
en
materia
de
alimentacin.
Por lo tanto, en el presente estudio, que tuvo como objetivo evaluar la existencia
de cambios diarios en varios parmetros metablicos marcadores de las
principales vas (metabolismo de la glucosa, lactato, cuerpos cetnicos, y
aminocidos) de metabolismo de la energa de cada tres diferentes tejidos de
trucha arco iris, como el hgado, el msculo blanco y branquias. Hemos
seleccionado aquellos tejidos en funcin de su importancia para los peces en
trminos de facturacin metablica (hgado), la masa (blanca muscular) y el
consumo energtico (branquias). En aquellos casos donde Existen 24 h cambios
en los peces alimentados, tambin hemos evaluado si no son dependientes de la
alimentacin
en
cuyo
caso
se
debe
desaparecer en el pescado ayunado y recuperarse en cuestin realimentado fish.t
2007 Elsevier Inc. Todos los derechos reservados.

materiales
y
mtodos
El pescado y el diseo experimental de este estudio son los mismo de las
descritas en un estudio previo (Polakof et al., 2007).
2.1.
Pescado
Inmadura trucha arco iris (Oncorhynchus mykiss Walbaum, 70 6 g de masa
corporal) se obtuvieron de un criadero (Souto Redondo, Noja, Espaa) y
trasladado al laboratorio de la Facultad de Biologa (Vigo, Espaa). Los peces se
aclimataron durante un mes en 120 tanques L en condiciones de laboratorio en
constante funcionamiento y el agua bien aireado. Durante los experimentos (junio
de 2005) de pescado se mantuvieron en 12:12 L: D (luces encendidas a las 08.00
h con una lux de intensidad 600) fotoperiodo y temperatura constante (15 C). Los
peces fueron alimentados una vez al da hasta la saciedad a las 11.00 h con
grnulos secos comerciales (Dibaq-Diprotg SA, Segovia, Espaa.; el anlisis de
alimentos prxima era: protena bruta 48%, 6% de carbohidratos, 25% de grasa
cruda, y el 15% de cenizas; 20,2 MJ / kg de pienso). los experimentos descritos
cumplen con las directrices de la Consejo de la Unin Europea (86/609 / UE) y el
espaol Gobierno (RD 1201/2005) para el uso de animales en investigacin
protocolo experimental Los tanques fueron asignados aleatoriamente a uno de los

tres grupos independientes: los peces alimentados, peces en ayunas durante 7

das, y peces ayunado durante 7 das y realimentado por 4 das. En el da de
muestreo, el pescado de alimentados y grupos realimentado se alimentaron a las
11.00 h. La misma fecha, todos los peces Se tomaron muestras de cada grupo de
tratamiento (alimentado, comida privada, y realimentado) usando el siguiente
horario: 14.00, 18.00, 21.00, 00.00, 04.00, 07.00, 10.00 y 14.00 h. El nmero de
pescado utilizado por tiempo de muestreo fue de once. Ocho de estos peces eran
utilizado para obtener muestras para la evaluacin de los niveles de metabolitos y
la actividad de las enzimas, mientras que los tres restantes eran peces utilizado
para la evaluacin de la expresin gnica.
Para ayudar en la toma de muestras durante el scotofase, una luz roja de baja
intensidad fue sola encendido durante todo el perodo del experimento.
2.3.
Muestreo
Los peces fueron anestesiados con MS-222 (50 mg L-1) tamponada a pH 7,4 con
bicarbonato de sodio, y se pesaron. peces eran sacrificado rpidamente por las
muestras de decapitacin y plasma fueron adquirido. El hgado, una parte del
msculo blanco (msculo hypaxial tomado anterior de la aleta dorsal), y filamentos
de las branquias fueron rpidamente retirado de cada pez, por congelacin sujeta
en nitrgeno lquido, yalmacenado a -80 C.
2.4. Evaluacin de los metabolitos y las actividades enzimticas
Los tejidos congelados rpidamente se picada en un plato de Petri enfriada a
pequeas piezas que (todava congelado) se dividieron en dos porciones
homogneas para evaluar las actividades enzimticas y metabolito niveles,
respectivamente. El tejido utilizado para la evaluacin de los niveles de
metabolitos se homogeneiz por la ruptura ultrasnica con 7,5 vols de cido
perclrico enfriado con hielo 6%, y se neutraliz (Usando 1 mol L-1 de bicarbonato
de potasio). El homogeneizado se centrifug (16.000 g durante 3 min), y el
sobrenadante se utiliza para ensayos. los niveles de glucgeno se evaluaron
utilizando
el
amiloglucosidasa
mtodo (Keppler y Decker, 1974). La glucosa obtenida despus de la ruptura de
glucgeno (despus de restar los niveles de glucosa gratuitas) se determin con
un kit comercial (Biomrieux, Espaa). Los niveles de lactato se determinaron
enzimticamente con un comercial kit de Spinreact (Espaa) adaptado para
microplacas. Protena se midi siguiendo el mtodo del cido bicinconnico (Smith,
1985) con albmina de suero bovino (Sigma-Aldrich, EE.UU.) como estndar.
cidos totales a-amino se evaluaron colorimtricamente utilizando el mtodo de
nynhydrin de Moore (1968) con modificaciones para adaptar el ensayo a un
formato de microplacas. acetoacetato Se determinaron los niveles por la
disminucin de la absorbancia de NADH a 340 nm despus de la incubacin de la
muestra con 0,1 mmol L-1 Na2HPO4 y NaH2PO4 (pH 7,0), 5 mmol L-1 NADH, y

0,2 U ml-1 -hidroxibutirato deshidrogenasa. El tejido utilizado para la evaluacin

de las actividades enzimticas era homogeneizado por la interrupcin de
ultrasonidos con 10 vols de hielo fro parar-tampn que contiene: 50 mmol L1imidazole-HCl
(pH
7,5), 1 mmol L-1 2-mercaptoetanol, 50 mmol L-1 NaF, 4 mmol L-1 EDTA, 120
mmol L-1 de sacarosa, y una proteasa cctel inhibidor (Sigma P-2714). El
homogeneizado wascentrifuged (16.000 g durante 3 min) y el sobrenadante usado
en ensayos enzimticos. Las actividades enzimticas se determinaron usando un
Spectrafluor lector de microplacas (Tecan, Grdig, Austria). Las velocidades de
reaccin de las enzimas se determinaron mediante el aumento o la disminucin de
la absorbancia de NAD (P) H a 340 nm. las reacciones se iniciaron por la adicin
de homogeneizados (15 mu l), a una preestablecida la concentracin de protenas,
omitiendo el sustrato en los pocillos de control (volumen final de 265 a 295 l), y
permitiendo que el reacciones para proceder a 20 C para tiempos
preestablecidos (3-10 minutos). Las actividades enzimticas se expresan en
trminos
de
mg
de
protena.
Los anlisis enzimticos fueron efectan a los tipos mximos, con las mezclas de
reaccin establecidas en las pruebas preliminares para rendir actividades ptimas.
Km actividades bajas (glucosa) HK y HK-IV eran estimado como se describe por
Panserat et al. (2000) por acoplamiento ribulosa-5-fosfato de formacin a partir de
glucosa 6- fosfato a la reduccin de NADP a 340 nm. HK-IV actividades fueron
corregidos para actividades GlDH. Por lo tanto, HK-IV la actividad se calcula como
la actividad total de HK menos baja Km (Glucosa) en la actividad de HK menos 1/3
de la actividad GlDH. los condiciones especficas para los ensayos de enzimas
restantes eran descrito previamente (SANGIAO-Alvarellos et al., 2003a, b,
2004, 2005a).
2.5. anlisis RT-PCR de HK-I y la expresin gnica HK-IV en
Hgado
ARN total fue extrado a partir de hgados congeladas usando TRI reactivo tal
como se recomienda por el fabricante (Sigma). los calidad y cantidad del ARN
aislado se evalu espectrofotomtricamente. El ARN total (2 mg) se transcribi de
forma inversa en ADNc de primera cadena cuando se ceba con 5'-pd (T) 12-18-3
'(Amersham Biosciences Barcelona, Espaa) utilizando M-MLV inversa
transcriptasa durante 1 hora a 37 C por mtodos recomendados por el fabricante
(Promega, Madison, WI, EE.UU.). Hemos evaluado la expresin de isoformas
individuales de dos genes diferentes: HK-I y HK-IV. Por lo tanto, HK-IV de ADNc se
Amplific por PCR utilizando cebadores especficos descritos en la trucha arco iris
por Panserat et al. (2000): 5'-TGATGTTGGTGAAGGTGGGG- 3 '(hacia delante) y
5'-TTCAGTAGGATGCCCTTGTC-3' (Hacia atrs), la amplificacin con estos
cebadores produjo una secuencia de 250 pb. HK-I cDNA se amplific por PCR
usando especfica cebadores descritos en la trucha arco iris por Soengas et al.
(2006): 5 ' GGCTTCTCAGAGAGGGGATT-3 '(hacia adelante) y 5'

TTTCGAAAATGCCTCTGGTC-3 '(hacia atrs), la amplificacin con estos

cebadores produjo una secuencia de 245 pb. los limpieza de genes utilizado para
evaluar los niveles relativos de cDNA HK-I y HK-IV fue la trucha arco iris -actina.
En consecuencia, - actina cDNA se amplific por PCR usando cebadores
especficos:
5'-ACCCTCAGCTCGTTGTAGA-3
'(hacia
delante)
y
5'ACGGATCCGGTATGTGCAA-3 '(inverso) utilizando el denominado secuencia de
ARNm de -actina de la trucha arco iris descrito por Johnson et al. (Gen Banco
nmero
de
acceso
AJ438158).
La amplificacin con estos cebadores produjo una secuencia para - actina de 253
pb. La reaccin de PCR se llev a cabo utilizando un PTC-200 Peltier
termociclador (MJ Research Inc., Waltham, EE.UU.) en una final 364 S. Polakof et
al. / Bioqumica y Fisiologa Comparada, Parte A 147 (2007) 363-374 volumen de
20 l que contena 0,5 l de plantilla de ADNc, 1 x tampn (MM KCl 50, 20 mM TrisHCl y 0,1% de Triton X-100), dNTPs 0,2 mM, MgCl2 1,5 mM, 2 pmol de cada
cebador (Adelante y atrs), y 1 U de Taq polimerasa (Ecogen, Barcelona, Espaa).
El nmero ptimo de ciclos para la amplificacin se estableci (reacciones se
terminaron en la fase logartmica de la reaccin de PCR). La amplificacin de
cDNA se logr con una desnaturalizacin inicial a 94 C seguido de 20 (-actina)
35 (HK-I y HK-IV) ciclos de desnaturalizacin (94 C durante 30 s), recocido (60
C durante 30 s) y extensin (72 C durante 30 s); un perodo de extensin final
de 10 min ocurrido antes de la terminacin. Los controles negativos sin la
transcriptasa inversa o los ADNc se llevaron a cabo para asegurar bandas
observadas no eran resultado de la contaminacin. La PCR productos se
sometieron a electroforesis en 1,5% de agarosa gel. Tamao de los productos de
reaccin
de
PCR
se
estableci
por
en comparacin con una escalera de mano de ADN de 50 pb (Promega).
Semiquantification de productos de PCR se realiz por densitomtrico anlisis de
las bandas de inters usando el gel documentacin de electroforesis y sistema de
anlisis de EDAS 290 (Kodak) de las imgenes capturadas de UV transiluminados
bromuro de etidio geles teidos. Los resultados se muestran como arbitraria
unidades y son la razn entre HK-I / HK-IV y -actina expresin.

2.6.
Estadstica
Los datos se analizaron estadsticamente mediante una prueba de ANOVA de dos
vas en el que el tratamiento (alimentado, en ayunas, y realimentado) y el tiempo
de muestreo fueron los principales factores. Cuando se logtransformed necesarios
(ratios) de datos antes del anlisis estadstico. comparaciones post-hoc se hicieron
utilizando una prueba de Student-Newman-Keuls, con el las diferencias se
consideraron estadsticamente significativas a P <0,05.
3.

resultados

P-valores resultantes de la ANOVA de dos vas de todos parmetros analizados se

muestran
en
la
Tabla
1.
Los cambios observados en los niveles de metabolitos hepticos se muestran en
la
Higo. 1. Los niveles de glucosa (fig. 1A) no mostraron cambios diarios en
alimentado o pescado ayun mientras que disminuy en la noche en el pescado
realimentado;
valores de pescado realimentado eran ms altos que en los otros grupos de la
horas de luz. los niveles de glucgeno (fig. 1B) alcanz su punto mximo durante
la noche en los peces alimentados mientras que los niveles de peces en ayunas
eran inferiores a los de alimentados y peces volvieron a alimentar al momento de
cada muestreo. los niveles de aminocidos (Fig. 1D) en alimentado de pescado no
aparece ningn ritmo diario disminuy mientras que los niveles en la noche se dio
cuenta de los peces en ayunas y realimentado; los niveles en los peces en ayunas
eran siempre ms altos que en los peces alimentados. Los niveles de protena
(Fig. 1E) visualizar No ritmos diarios en cualquier grupo evaluaron mientras Los
valores en los peces en ayunas fueron siempre mayores que en los alimentados y
realimentado pescado. No hubo cambios significativos diarias y diferencias
menores entre Los tratamientos se observaron para el lactato (Fig. 1C) y
acetoacetato
niveles (Fig. 1F). actividades de las enzimas del hgado se muestran en la Fig. 2.
Baja Km (Glucosa) en la actividad de HK (Fig. 2A) en los peces alimentados
aumentaron en el a partir del perodo de la noche mientras que en los peces en
ayunas disminuy a las S. Polakof et al. / Bioqumica y Fisiologa Comparada,
Parte A 147 (2007) 363-374 365 el comienzo de la oscuridad y el aumento de 1 h
antes de luces encendidas en comparacin con los peces alimentados y
realimentado. actividad HK-IV (Fig. 2B) no aparecen los cambios diarios en la Fed
y peces en ayunas, mientras que en realimentado pescado aument de 18.00 a la
las 10.00 h durante el cual la actividad fue mayor que la de los peces alimentados
y en ayunas; la actividad en los peces en ayunas fue siempre inferior a la de los
peces alimentados y realimentado. la actividad PK (Fig. 2C) muestran un aumento
diario en la noche en que los peces alimentados desaparecido en el pescado
realimentado pero no en peces en ayunas; actividad en realimentado pescado era
superior a la de alimentacin y de ayuno peces a travs de la mayor parte tiempos
de muestreo. actividad de la LDH-O (Fig. 2D) en los peces alimentados disminuy
durante todo el da, mientras que aument en los peces de ayuno en la noche
perodo y no hay cambios diarios se observaron para los peces realimentado;
actividad de pescado realimentado fue mayor que la de los peces alimentados
desde la medianoche adelante. G6Pasa actividad (Fig. 2E) de los peces
alimentados con una muestra disminucin nocturna que tambin se observ en los
peces en realimentado contrastar con el aumento observado en los peces en
ayunas; actividad de peces en ayunas fue mayor y la de los peces realimentado
bajo que el de alimentados con peces desde la medianoche hasta las primeras

horas del da siguiente. G6PDH actividad (Fig. 2F) en los peces alimentados
aparece ninguna significativa diariacambios mientras que en ayunas y los valores
de pescado realimentado tendan a sermayor durante la noche; la actividad de los
peces alimentados fue mayor que la de Fed y realimentado peces en la mayora
de los tiempos de muestreo. actividad FBPasa (Fig. 2G) en los peces alimentados
muestran los valores de aumento en el principio y el final del perodo de la noche;
este ritmo cambiado en los peces en ayunas que mostraron valores ms bajos por
la noche y desapareci en el pescado realimentado. actividad G3PDH (Fig. 2H)
est representada en los peces alimentados con un aumento en el 18.00 h
mientras que en los peces en ayunas no se observaron cambios diarios, y en los
peces volvieron a alimentar un incremento se observ en el perodo nocturno;
actividades de peces en ayunas y realimentado eran casi siempre mayor
que las de los peces alimentados. la actividad GDH (Fig. 2I) de los peces
alimentados se muestra un aumento antes del perodo de la noche mientras que
en ayunas y se observaron valores ms altos de pescado realimentado por la
noche; actividades de peces en ayunas y realimentado fueron generalmente
mayores que los de Fed pescado. actividad Asp-AT (Fig. 2J) est representada en
los peces alimentados con mayor Los valores a las 14.00 horas, mientras que en
la volvieron a alimentar peces en ayunas y aument los valores se observaron en
el comienzo del perodo de la noche que fueron ms altos que los de los peces
alimentados.
Los cambios en los niveles de metabolitos en el msculo blanco son se muestra
en la Fig. 3. Los niveles de glucosa (Fig. 3A) no mostraron diaria cambios en la
Fed y los peces volvieron a alimentar peces en ayunas, mientras que en los
niveles ms bajos
se observaron en la noche que estaban tambin inferiores a los de alimentado y
peces realimentado. los niveles de glucgeno (Fig. 3B) muestran cambios diarios
en los peces alimentados y en ayunas mientras que un aumento en 04.00 h era
observado en los peces realimentado. los niveles de aminocidos (Fig. 3C) que se
muestran no los cambios diarios en los peces alimentados mientras que en
realimentado y ayunaron reduce peces niveles se observaron en la noche; valores
de peces en ayunas fueron siempre inferiores a los de los peces y los valores de
los peces alimentados y realimentado realimentado tambin eran generalmente
inferiores a los de los peces alimentados. No significativo cambios se observaron
para los niveles de protena (Fig. 3D). Los cambios en las actividades de las
enzimas musculares blancas son que se muestra en la Fig. 4. Bajo Km (glucosa)
en la actividad de HK (Fig. 4A) y HK-IV (Fig. 4B) muestra ninguna actividad diaria
importante los cambios y las diferencias entre los tratamientos. PK (Fig. 4C) y
LDH-O (Fig. 4D) las actividades de los peces alimentados muestra picos en el
principio y despus del final del perodo de la noche mientras que no diaria los
cambios se observaron en los peces en ayunas, y el ritmo recuperadas en
realimentado peces; la actividad de los peces en ayunas era generalmente ms
alta que la de los peces alimentados y realimentado en el perodo nocturno.
actividad G3PDH (Fig. 4E) en los peces alimentados y realimentado muestran

cambios diarios claras mientras que en los peces en ayunas disminuy se

observaron valores en la noche. la actividad GDH (Fig. 4F) en los peces
alimentados muestra un aumento en la prxima maana, mientras que una
disminucin en el perodo de la noche se dio cuenta de peces en ayunas y no hay
cambios se observaron claras para los peces realimentado. Por ltimo, la actividad
Asp-AT (Fig. 4G) est representada en alimentado y realimentado pescado
aument los valores antes y despus del perodo de la noche mientras que no hay
cambios diarios se observaron claras para los peces en ayunas; actividad de
peces en ayunas era generalmente ms alta que la de los peces alimentados y
realimentado.
Los niveles de metabolitos en las branquias se describen en la Fig. 5. La glucosa
niveles (Fig. 5A) de los peces alimentados no muestra grandes cambios diarios
mientras que los niveles en los peces en ayunas y realimentado eran ms bajos
que los peces alimentados al final del perodo de la noche (en los peces en
ayunas un pico fue tambin Higo. 1. Efecto de la alimentacin (), la privacin de
alimentos (, 7 das) y la realimentacin (, 7 das ayunando, 4 das de
realimentacin) sobre los cambios diarios en los niveles hepticos de glucosa (A),
el glucgeno (B), lactato (C), a-aminocidos totales (D), la protena (E), y
acetoacetato de (F), en la trucha arco iris. La Fed y grupos realimentado se les dio
una sola comida a las 11.00 h. Todos los grupos eran muestrea el mismo da
despus de 7 das de privacin de alimentos (en ayuno), y 7 das de privacin de
alimentos seguido de 4 das de alimentacin (realimentado). Las barras negras en
la parte inferior de grficos que representan el horario de da y noche. ,
significativamente diferentes (P <0,05) del grupo alimentado al mismo tiempo. #,
Significativamente diferente del grupo realimentado al mismo hora. notado a las
00.00 h). los niveles de glucgeno (Fig. 5B) describen sin claros cambios diarios,
mientras que en los niveles de peces en ayunas fueron inferiores a las de los
peces alimentados y realimentado al final del perodo nocturno. lactato niveles
(Fig. 5C) no presentaban cambios diarios en claros alimentados y No se
observaron peces realimentado mientras que en los niveles de aumento de peces
en ayunas Por la noche. los niveles de aminocidos (Fig. 5D) muestran el mismo
ritmo en todos los grupos de peces con una disminucin en la noche. No
significativo Se observaron cambios de los niveles de protena (Fig. 5E). Las
actividades de las enzimas de enmalle se muestran en la Fig. 6. Baja Km
(Glucosa) HK (Fig. 6A) no mostr cambios significativos diarias mientras que los
valores de peces en ayunas fueron siempre inferiores a los de alimentados y
peces realimentado. actividad HK-IV (Fig. 6B) muestra ningn diaria cambios en
los peces alimentados mientras que en los peces en ayunas, se observ un pico
en el final del periodo de la noche, y en el pescado realimentado un aumento era
notado por la noche; durante las actividades perodo nocturno en ayunas y
realimentado peces fueron ms altos que los de los peces alimentados. actividad
PK (Fig. 6C) de los peces alimentados y en ayunas se muestra una disminucin

en la noche, mientras la respuesta inversa se produjo en el pescado realimentado.

actividad de la LDH-O (Fig. 6D) en los peces alimentados aument desde el final
del perodo nocturno mientras que en adelante no hay grandes cambios diarios
fueron notados por peces en ayunas, y una disminucin se observ para los peces
realimentado al 00.0 h; valores de peces en ayunas fueron generalmente inferiores
a los de alimentado y peces realimentado. la actividad de G6PDH (Fig. 6E de los
peces alimentados y realimentado se muestra un pico a media noche que
desapareci en los peces en ayunas. actividad Asp-AT (Fig. 6F) se describe en los
peces alimentados con un pico antes y otro despus del perodo de la noche
mientras que en los peces realimentado Se observaron mayores niveles en la
noche, y no todos los das claroscambios se observaron para los peces en
ayunas. Finalmente,. Actividad GDH (Fig6G) no mostr cambios diarios en los
peces alimentados mientras que en la noche Se observ una disminucin periodo
y un aumento de ayuno y realimentado peces, respectivamente. Por ltimo, los
cambios en la expresin de HK-IV en el hgado de los peces muestreados a 21.00
h y las 00:00 h se puede observar en la Fig. 7 que describe una disminucin en los
peces en ayunas y un aumento en el pescado realimentado en comparacin con
los peces alimentados. No hay cambios significativos se observaron para
expresin HK-I (datos no mostrados) en los hgados de los mismos peces.
4. Discusin
4.1. Hgado
Dado que la expresin de genes evaluados por RT-PCR convencional es
no es estrictamente cuantitativa, la expresin de mRNA en el hgado inform
en la Fig. 7 deben interpretarse con cautela Higo. 2. Efecto de la alimentacin (),
la privacin de alimentos (, 7 das) y la realimentacin (, 7 das ayunando, 4
das volvieron a alimentar) sobre los cambios diarios en las actividades de hgado
de baja Km (glucosa) HK (A), HK-IV (B), PK (C), LDH-O (D), G6Pase (E), G6PDH
(F), la FBPasa (G), G3PDH (H), GDH (I), y Asp-AT (J) en la trucha arco iris. Ms
detalles sobre como en leyenda de la figura.
El mantenimiento de la homeostasis de la energa durante la comida la privacin
en el pescado est directamente relacionada con la capacidad del hgado
movilizacin de las reservas de energa, tales como lpidos y glucgeno, en por lo
menos durante las etapas iniciales de ayuno, y tambin depende de la posterior
activacin de la gluconeognesis heptica y la reduccin de la tasa de utilizacin
de la glucosa (Sheridan y Mommsen, 1991; Navarro y Gutirrez, 1995). En
consecuencia, En el presente estudio, la privacin de alimentos result en
cambios globales en varios parmetros del metabolismo energtico en heptica
acuerdo con otros estudios en los que se obtuvieron muestras en un tiempo de
muestreo, tales como i) el aumento de la glucogenolisis potencial (Soengas et al,
1996;. Kirchner et al, 2005;. Polakof
et al, 2006a.; Soengas et al., 2006), ii) el aumento de la gluconeognesis

potencial (Kirchner et al, 2005;.. Soengas et al, 2006), iii)

Higo. 3. Efecto de la alimentacin (), la privacin de alimentos (, 7 das) y la
realimentacin (, 7 das de ayuno, 4 das volvieron a alimentar) sobre los
cambios diarios en los niveles musculares blancas de la glucosa (A),glucgeno
(B), a-aminocidos totales (C), y la protena (D) en la trucha arco iris. Ms detalles
sobre como en la leyenda de la figura. 1.disminucin de la capacidad para el uso
de glucosa exgena (Kirchner et al., 2005; Soengas et al., 2006), y iv) el
mejoramiento de la capacidad de hgado para la exportacin de la glucosa
(SANGIAO-Alvarellos et al, 2005b.; Polakof et al., 2006a). Por otra parte, los
parmetros de peces realimentado generalmente recuperado los valores de los
peces alimentados de acuerdo con otra estudios en la literatura (Soengas et al,
1996;. Collins y Anderson, 1997) tambin refleja el aumento de la ingesta de
alimentos normalmente que ocurre despus de la realimentacin peces en
ayunas. En cuanto a 24 h cambios, los niveles de glucgeno de hgado fueron
superiores durante el scotofase, varias horas despus de la alimentacin, y
disminuido durante el fotoperiodo de acuerdo con otra
estudios llevados a cabo en la trucha arco iris (Laidley y Leatherland,
1988; Figueroa et al., 2000) y otros telesteos (Prez et al., 1988). Sin embargo,
no hay evidencias de un ritmo tal en el hgado glucgeno se haba observado en
otros estudios en los telesteos alimentados en la maana (Reddy y Leatherland,
1994;. De Pedro et al, 1998; Figueiredo-Garutti et al., 2002). Esos aumento de los
niveles post-alimentacin refleja que al menos parte del aumento de plasma los
niveles de glucosa observaron simultneamente (Polakof et al., 2007) fueron
dirigidas en el hgado que se almacena en forma de glucgeno. Este
comportamiento es similar a la encontrada en los mamferos, donde un pico de
glucgeno heptico por la noche se produce en los animales alimentados mientras
que los niveles en animales en ayunas fueron siempre inferiores a los de los
animales alimentados con ningn diaria
cambios (Escobar et al., 1998). Km (glucosa) en actividades de baja HK y HK-IV
se incrementaron en Los peces alimentados a las 21.00 h, es decir, en el mismo
perodo de tiempo en el que la ms altos niveles de glucosa en plasma estaban
disponibles (Polakof et al., 2007) reforzando el modelo de hgado de hacer frente a
la pico postprandial de la glucosa plasmtica. Se observ una disminucin al
mismo tiempo en ambas actividades en los peces en ayunas. En los peces
realimentado, baja actividad km (glucosa) de Hong Kong volvi a los valores de los
peces alimentados mientras un fuerte aumento probablemente relacionada, al
menos en parte, al aumento la ingesta de alimentos en los peces realimentado se
produjo en HK-IVactivity de peces realimentado. Las alteraciones de las
actividades de baja Km (glucosa) HK y HK-IV se haba observado previamente en
la trucha arco iris en ayunas y realimentado muestreada slo por la tarde
(Soengas et al., 2006). En esto
estudio, hemos demostrado claramente la existencia de un cambio diario en HKIVactivity de peces realimentado con niveles ms altos despus de la
alimentacin. A ms cambios de apoyo en las actividades enzimticas, tambin
tenemos evaluaron los cambios en HK-I y HK-IVexpression en dos muestras veces
(21.00 a 00.00 h) obtener para HK-IV expresin de una respuesta similar a la
encontrada para la actividad mientras que no significativa Se observaron

diferencias para HK-I de la expresin. El aumento de la actividad HK-IV puede

tambin relacionado con mayores niveles de glucgeno tambin se observ en los
peces realimentado. Una relacin similar entre ambos parmetros se haba
observado en mamferos (Escobar et al., 1998), as como en la trucha arco iris
realimentado muestreada slo en un momento del da (Soengas et al., 2006).
Todos aquelloS resultados apoyan la existencia de cambios diarios dependiente
alimentacin en el uso de la glucosa en el hgado de la trucha arco iris. Otros
cambios interesantes notado en los peces fueron el realimentado aumento en el
potencial glucoltico (basado en los cambios mostrados por PK y las actividades
de G3PDH) que fue mayor que la de alimentado y peces en ayunas en la mayora
de los tiempos de muestreo evalu. Un aumento similar en el potencial glucoltico
en los hgados de los peces haba sido realimentado observadas en la trucha arco
iris muestreada slo por la tarde (Soengas et al., 2006).
El catabolismo de los aminocidos en los peces alimentados es aparentemente
disminucin en la noche sobre la base de la actividad disminuida de Asp-AT y
GDH en los peces alimentados. Esos ritmos aparentemente dependan de la
alimentacin, ya que desaparecieron en los peces en ayunas, y puede ser tambin
relacionada con la activacin del potencial de la gluconeognesis en ayunas en
comparacin con los peces alimentados desde los aminocidos son una de las
precursores de la gluconeognesis heptica (disponibles en la Luna y Foster,
Higo. 4. Efecto de la alimentacin (), la privacin de alimentos (, 7 das) y la
realimentacin (, 7 das ayunando, 4 das de realimentacin) sobre los cambios
diarios en actividades musculares blancas de baja Km (Glucosa) HK (A), HK-IV
(B), PK (C), LDH-O (D), G3PDH (E), GDH (F), y Asp-AT (G) en la trucha arco iris.
Ms detalles sobre como en la leyenda de la figura. 1. 1995). Por lo tanto, la
actividad FBPasa en los peces en ayunas est representada ms bajo
Los valores ms altos en la noche y durante el da, mientras que en los peces
alimentados con dos se observaron picos al principio y el final de la noche
perodo. Parece que en los peces en ayunas la necesidad de sintetizar
la glucosa es menor durante el perodo de la noche lo que puede ser asociado
con la actividad diurna de esta especie (Snchez-Vzquez y Tabata, 1998), y con
el hecho de que en ese momento es cuando el plasma los niveles de glucosa se
ven reforzadas (Polakof et al., 2007) y se utilizan para almacenar unidades de
glicosilo en forma de glucgeno. Un razonamiento similar puede ser aplicada a la
actividad G6Pasa que muestra los valores disminuyeron en noche en peces
alimentados con lo que indica que no hay necesidad para la liberacin glucosa a
partir de hgado cuando la entrada de glucosa (aument HK-IV actividad) y la
tienda de glucgeno se maximizan. Adems, el aumento observado en la noche
en peces en ayunas puede reflejar la reduccin de la disponibilidad de la glucosa
en el plasma y la necesidad de
exportacin de la glucosa en plasma tanto de la glucogenolisis heptica y la
gluconeognesis.
4.2. msculo blanco

Dado que no hay expresin de HK-IV se ha observado en blanco muscular

(Soengas et al., 2006, este estudio) la actividad HK-IV descrito en las Figs. 4 y 6
deben interpretarse con cautela.Hay pocos estudios disponibles en la literatura
con respecto a la efectos de la privacin de alimentos en el metabolismo
energtico muscular. Todo esos estudios se llevaron a cabo por muestreo en un
solo momento de la presentacin de informes da, de una manera similar a la
observada en el presente estudio, la disminucin de los niveles de glucgeno y la
glucosa (Blasco et al., 1992; Kieffer y Tufts, 1998), aumentaron glicoltica potencial
(Martnez et al., 2003) o la ausencia de cambios en el potencial para el uso de la
glucosa como combustible (Kirchner et al., 2005). En Por el contrario, otros
hallazgos del presente documento proporcionan nueva evidencias de cambios
metablicos durante la privacin de alimentos en muscular, como el aumento del
catabolismo de los aminocidos basa en la disminucin de los niveles de
aminocidos y el aumento de Asp-AT Fig. 5. Effect of feeding (), food deprivation
(, 7 days) and refeeding (, 7 days fasted, 4 days refed) on daily changes in gills
levels of glucose (A), glycogen (B),
lactate (C), total -amino acids (D), and protein (E) in rainbow trout. Further details
as in legend of Fig. 1. actividad. El aumento del catabolismo de los aminocidos
en blanco msculo sera tambin de acuerdo con el aumento de la cantidad de
aminocidos observadas en el plasma de los peces en ayunas simultneamente
(Polakof et al., 2007). Adems, un aumento tambin se observ en la actividad de
la LDH-O en los peces en ayunas que sugiere un aumento importancia de la
oxidacin de lactato en el msculo blanco, que puede ser en relacin con los
niveles ms bajos de lactato en plasma registrados simultneamente (Polakof et
al., 2007). No hay estudios disponibles con respecto a la existencia de 24 h
cambios en los parmetros de metabolismo de la energa en el msculo blanco
como as como su posible dependencia de la alimentacin. En este estudio, los
niveles de glucosa y aminocidos de peces en ayunas muestran ritmos de valores
ms bajos en la noche que no se observaron en Fed peces, por lo que dependen
parecer sobre la alimentacin. UN dependencia similar sobre la alimentacin fue
notado por la LDH-O y actividades Asp-AT, que muestran actividades bajas en la
noche mientras que en las actividades de los peces alimentados eran ms altas
antes de la noche perodo. Dado que estas enzimas estn involucradas en el uso
de lactato y aminocidos como combustibles Esto puede sugerir que su necesidad
es mayor al comienzo del perodo de la noche en los peces alimentados en
acuerdo con los resultados del aumento de la actividad locomotora trucha arco iris
en la oscuridad antes de que el descenso nocturno (Snchez- Vzquez y Tabata,
1998; Cooke et al., 2000). En los peces en ayunas, esos cambios reflejan
probablemente el aumento de la necesidad de combustible en comparacin con
los peces alimentados (actividades son generalmente ms altos que en Fed
pescado) y una actividad locomotora nocturna reducida. Un similar
comportamiento se puede observar en el potencial glucoltico que aumento en los
peces alimentados antes de la noche sobre la base de los cambios mostrada por
las actividades PK y G3PDH. PK actividad en ayunas pescado permaneci
superior a la de los peces alimentados sin mostrar los cambios diarios que indican
una clara diferencia con el ritmo depende de la alimentacin de los peces
alimentados. Por lo tanto, la necesidad de el aumento de la utilizacin de glucosa

exgena en el msculo de los peces alimentados al parecer no est presente en

los peces en ayunas, que por lo tanto al parecer, se basa ms en otros
combustibles, tales como aminocidos y lactato.
4.3. branquias
Hay pocas referencias en la literatura con respecto a los cambios en metabolismo
energtico de las branquias de los peces durante la privacin de alimentos. los
Los resultados obtenidos en el presente estudio son, en algunos casos similares a
los observados anteriormente en los mismos y otras especies de peces
muestreada en una sola vez de la voz como la disminucin de baja Km (Glucosa)
la actividad HK (Soengas et al., 2006) o disminucin capacidad para la oxidacin
de lactato (SANGIAO-Alvarellos et al., 2005b; Polakof et al., 2006a). Sin embargo,
otros cambios tales como disminucin de los niveles de glucgeno y el aumento
de HK-IVactivity no tena Fig. 6. Effect of feeding (), food deprivation (, 7 days)
and refeeding (, 7 days fasted, 4 days refed) on daily changes in white muscle
activities of low Km(glucose) HK (A), HK-IV (B), PK (C), LDH-O (D), G6PDH (E),
Asp-AT (F), and GDH (G) in rainbow trout. Further details as in legend of Fig. 1.
ha observado antes en la trucha arco iris (Soengas et al., 2006) o la dorada
besugo (SANGIAO-Alvarellos et al, 2005b;. Polakof et al., 2006a). En general, los
efectos de la privacin de alimentos eran escasos en comparacin con los
observados en el hgado y el msculo blanco. Teniendo en cuenta el papel
osmoregulatoria de las branquias, parece lgico que su funcin est ms
preservada de la energa consecuencias de la privacin de alimentos que en otros
tejidos como msculo blanco, a pesar de una disminucin de las necesidades de
energa no puede ser excluidos. Como en el caso del msculo blanco, no existen
Las referencias en la literatura alrededor de 24 h cambios en los parmetros de
metabolismo de la energa en este tejido y su posible dependencia sobre la
alimentacin.
Los niveles de glucosa en los peces alimentados no mostraron cambios 24 h
aunque los niveles de glucgeno se incrementaron al comienzo y al final del
perodo nocturno, probablemente reflejando un incremento en el uso de glucosa
exgena. Sin embargo, no se observaron cambios importantes ya sea en bajas
Km (glucosa) en HK o HK-IV en actividades Fed pescado. En realidad, la actividad
HK-IV disminuy en el perodo nocturno en Los peces alimentados. Por el
contrario, en los peces en ayunas, disminucin de baja Km (Glucosa) en la
actividad de HK y el aumento de la actividad HK-IV eran notado en comparacin
con los peces alimentados, e incluso al final de la perodo nocturno el incremento
se observ en ambos enzima ocupaciones. El aumento de la disponibilidad de la
glucosa en las branquias de peces en ayunas pueden tambin ser transmitidos por
el aumento de la gliclisis capacidad que se observa al final del perodo de la
noche. Dado que en el mismo tiempo aument la capacidad del hgado para
sintetizar y glucosa exportadora tambin se observ en los peces en ayunas
podemos la hiptesis de que al menos parte de que la glucosa se utiliza en
branquias para proporcionar energa en los peces en ayunas. los niveles de
aminocidos en las branquias muestran claramente las 24 h cambios

independiente sobre la alimentacin, ya que eran evidentes en los tres grupos

evaluados, donde los niveles se redujeron a la medianoche. Un similar
Higo. 7. Efecto de la alimentacin, la privacin de alimentos (7 das) y la
realimentacin (7 das de ayuno, 4 das realimentar) sobre la abundancia relativa
de HK IV-mRNA en el hgado del arco iris trucha tomaron muestras a las 21.00 h y
24.00 h. anlisis de densidad ptica de reaccin de PCR productos se presentan
en unidades arbitrarias como la media SEM de cuatro peces por grupo y es la
relacin entre HK-IV y la expresin -actina. Letras diferentes indican diferencias
significativas entre los grupos (ANOVA de una va, P <0,05). la reduccin se
observ en la actividad GDH y Asp-AT de la Fed y ayunado pescado a la
medianoche. Esto es, probablemente, lo que sugiere una disminucin de la
demanda de los aminocidos durante el perodo nocturno que tambin coincide
con niveles reducidos de aminocidos en plasma de todos, grupos evaluados por
la noche (Polakof et al., 2007). Los niveles de lactato no mostraron grandes
cambios diarios en los peces alimentados, en contraste con el aumento observado
en la actividad de LDH-O en la noche y despus del perodo de la noche. Esta es,
probablemente, lo que sugiere que 20 h despus de la alimentacin en adelante (a
partir de las 07.00 h en adelante) Las necesidades de la de combustible de las
branquias se cubren probablemente al menos en parte por la oxidacin,de lactato.
El uso de lactato como combustible en telesteos branquias ha sido ya se ha
demostrado (Mommsen, 1984) y a ser cada vez importante durante la aclimatacin
salinidad (SANGIAO-Alvarellos et al., 2003b, 2005c). El cambio en la actividad
LDH-O fue evidente en realimentado pero no en ayunas peces apoyando que se
trataba de un cambio depende de la alimentacin. En contraste, no hay cambios
diarios eran notado en los peces en ayunas, lo que probablemente estn utilizando
el incrementaron cantidades de glucosa disponible en peces en ayunas, debido a
la mayor la gluconeognesis heptica se ha descrito anteriormente. Finalmente,
un cambio muy interesante depende de la alimentacin era dado cuenta de la
actividad de G6PDH que alcanz su punto mximo en la Fed y realimentado
pescado en noche y para los que no hay cambios diarios se observaron en los
peces en ayunas. Parece que en los peces alimentados con el tejido branquial es
ms capaz de llevar a cabo reacciones anablicas que necesitan por lo tanto el
poder reductor proporcionada por la va de las pentosas fosfato.
4.4. conclusiones
En resumen, hemos demostrado en el hgado, msculo blanco y las branquias de
trucha arco iris de la existencia de los cambios diarios en muchos parmetros
implicados en el metabolismo de energa que pueden ser correlacionada con los
abordados previamente en el plasma y en el cerebro (Polakof et al., 2007). En el
hgado, hubo un claro efecto de los alimentos la privacin, y la mayora de los
parmetros evaluados muestran los cambios diarios que eran dependientes de la
alimentacin. En blanco muscular, los efectos de la privacin de alimentos fueron
menos claros, y 24 h todos los cambios en los parmetros eran dependientes de la
alimentacin generalmente se presentan mximos en la oscuridad, que puede ser
asociado con el aumento de la actividad locomotora en el mismo perodo de

tiempo (Snchez-Vzquez y Tabata, 1998; Cooke et al,. 2000). En las branquias,

los efectos de la privacin de alimentos son ms bajos que en los otros tejidos que
exhiben patrones de 24 h tanto arrastrado y no arrastrado por la alimentacin.
Parmetros arrastrado por la alimentacin generalmente estn relacionados con
altos niveles de actividades / de noche o en el perodo de encendido / apagado la
luz, mientras que los parmetros no arrastrado por la alimentacin se caracteriza
por la reduccin de los niveles / actividades en noche. En comparacin con los
cambios observados previamente en el cerebro, la mayora de las 24 h cambios
en los parmetros metablicos evaluados en el hgado, msculo blanco y
branquias eran dependientes de la alimentacin, que Parece razonable teniendo
en cuenta las funciones metablicas de los tejidos.
Expresiones de gratitud
Este estudio fue apoyado por becas AGL2004-08137-c0403 / ACU (Ministerio de Educacin y Ciencia y FEDER,
Espaa), y PGIDIT05PXIC31202PN (Xunta de Galicia,
Espaa). S. P. fue beneficiario de una beca predoctoral de la
Xunta de Galicia