Mtodos de

anlisis a la leche
cruda.

MANUAL DE
CALIDAD
LACTEOS NACIONALES
S.A.
INTEGRANTES:
PAOLA AGUIRRE
ANA DUARTE
ALBERTO LPEZ
NOEL BREV

2 de diciembre 2014

TEGUCIGALPA, HONDURAS

2 DE

Introduccin
El siguiente Manual tiene como proposito presentaremos los diversos metodos
de analisis para determinar distintas propiedades de la Leche que
producimos en nuestra empresa basandonos en diversas referencias,
presentando el alcance del metodo, una descripcin de obeto a ensayar,
haciendo una correcta descripcin del mtodo y dando a conocer diferentes
parmetros que se deben tomar en cuenta antes de realizar el anlisis y las
medidas de seguridad a tomar para realizarlo correctamente. Tambin se
menciona el material de referencia en cuyas propiedades nos basamos para
nuestra leche.
Todo esto con el fin de conocer las condiciones en las cuales la leche es
entragada a nuestra empresa, para poder aprobar su uso o no.

Objetivos

Realizar diferentes mtodos de alisis que sean confiables, que nos

determines diferentes propiedades de nuestra Leche al momento de la
recepcin.
Obtener datos exactos y precisos, para poder realizar los anlisis
adecuados, y lograr un aseguramiento de la calidad exitoso.
Conocer la manera correcta en la cual se deben de realizar los anlisis
correspondientes, para obtener resultados correctos al final.

1. Determinacin de Nitrgenos totales: Mtodo de Kjeldahl

1.1.Alcance:
Leche Cruda de vaca
1.2.Descripcin del objeto a esayar:
Leche Cruda trada en un camin cisterna refrigerado
1.3.Parmetro a ser determinado:
Nitrgenos Totales expresado como % de Nitrgeno o, si se multiplica
por un factor, % de Protenas.
1.4.Fundamento terico:
La leche es digerida en H 2SO4, utilizando CuSO45H2O como catalizador
y K2SO4 como elevador del punto de ebullicin, para liberar el Nitrgeno
de las protenas y retenerlo como sales de amonio. Se agrega NaOH
concentrado para liberar NH3, que se destila, y se recolecta en H 3BO3,
para luego titular.

1.5.Interferencias posibles:
1.5.1. Presencia de Nitratos: El agua de pozo es ms pesada que el agua
potable de las tuberas, y algunas personas la prefieren para
adulterar la leche. Los nitratos del agua de pozo puede venir de
fertilizantes utilizados en los campos de cultivo. Esto genera
interferencias ya que los nitratos proveen nitrgeno y el resultado
final es ms alto de lo esperado.
1.6.Equipo y Reactivos necesarios:
1.6.1. Equipo:
1.6.1.1. Matraces
de
Digestin:
Matraces
Kjeldahl,
duros,
moderadamente gruesos, de vidrio bien templado.
1.6.1.2. Matraces para Destilacin: los mismos matraces de Kjeldahl
que en el inciso anterior. Utilice matraces Erlenmeyer de 500
mL para recolectar el destilado
1.6.1.3. Sistema de digestin/destilacin: Sistema tradicional para
destilacin con controles ajustables para matraces individuales.
1.6.1.4. Bureta para titulacin: Bureta tradicional de 50 mL
1.6.2. Reactivos:
1.6.2.1. Acido Sulfurico: 95-98% H2SO4, libre de nitrgeno
1.6.2.2. Solucion de catalizador de cobre: CuSO4.5H2O. Libre de
NItrogeno. Preparar una solucin 0.05g/mL en H 2O.
1.6.2.3. Sulfato de potasio. K2SO4. Libre de nitrgeno.
1.6.2.4. Solucin de Hidrxido de Sodio. 50% peso/peso libre de
nitratos NaOH.
1.6.2.5. Perlas de ebullicin. Granulos de alundum anfoterico de alta
pureza, planos.
1.6.2.6. Solucin de rojo de metilo/verde de bromocresol. Disolver
0.2 gramos de rojo de metilo en 100 mL de etanol al 95%.
Disolver 1 gramo de verde de bromocresol en 500 mL de etanol
al 95%. Mezclar 1 parte de solucin de rojo de metilo con 5
partes de verde de bromocresol.
1.6.2.7. Solucin de cido Borico. 4% con el indicador. Disolver 40
gramos de H3BO3 en 1 L de agua y agregar 3 mL de la solucin
de indicador. La solucin tendr un color naranja claro.
1.6.2.8. Solucin patrn de cido clorhdrico 0.1 N. Preparar la
solucin de HCl o utilizar una solucin prefabricada con un
intervalo de 0.0995-0.1005 N y utilizar 0.1 N para los clculos.
1.6.2.9. Sulfato de Amonio 99.99%-(NH4)2SO4
1.6.2.10. Triptofano o Lisina hidroclururo. 99%. C 11H12N2O2 o
C6H16ClN2O2.
1.6.2.11. Sacarosa. Libre de Nitrgeno
1.7.Materiales de Referencia:
Leche Entera Sula
1.8.Muestreo:

Para un anlisis usual recolecte una muestra de 250 a 500 mL de leche.

Coloque la muestra en un recipiente no absorbente, bien sellado y
mantenga la muestra refrigerada a 4C hasta que la vaya a analizar.
1.9.Preparacin del objeto a ensayar:
Agregue 15 gramos de K2SO4, 1mL de la solucin de catalizador, y 8 a
10 perlas de ebullucin en el matraz de digestin. Caliente la leche a
38 +-1C. Pese la leche caliente e inmediatamente virtala en el
matraz de destilacin. Agregue 25 mL de H 2SO4 lavando cualquier resto
de leche que haya quedado en el cuello del matraz. Digiera y destile un
blanco a diario.
1.10.
Verificaciones antes del proceso:
1.10.1.
Verificar que la balanza est debidamente calibrada
1.10.2.
Que la muestra est homognea.
1.10.3.
Que la temperatura de refrigeracin a la que estaba
guardad la muestra sea la correcta.
1.10.4.
Verificar que todo el material de laboratorio est limpio y
listo para su uso.
1.10.5.
Preparar la campana de gases para realizar la digestin
dentro de ella.
1.11.
Medidas de seguridad:
1.11.1.
Utilizar gabacha, guantes y lentes protectores.
1.11.2.
No permitir que el cido sulfrico entre en contacto con
agua.
1.11.3.
Realizar la digestin dentro de la campana de gases.
1.11.4.
Preparar con mucha precaucin la solucin de hidrxido de
sodio.
1.11.5.
Cargar el cido clorhdrico con precaucin en la bureta, sin
derramarlo.
1.11.6.
No dejar desatendida la estufa durante la digestin y la
destilacin.
1.12.
Medicin:
1.12.1.
Pesar 0.2g de Rojo de Metilo.
1.12.2.
Pesar 1.0 g de Verde de Bromocresol.
1.12.3.
Medir 100 y 500 mL de Etanol al 95 en dos buretas
separadas.
1.12.4.
Pesar 40 g de H3BO3.
1.12.5.
Pesar 15 g de K2SO4.
1.12.6.
Medir 25 mL de H2SO4.
1.13.
Procedimiento:
1.13.1.
Preparacin de la estufa de digestin: Realice la digestin
sobre una estufa que pueda ser ajustada para llevar 250 mL de H 2O
a 25C a ebullicin en 5 o 6 minutos. Para determinar la
configuracin para un calentamiento mximo, precaliente 10 min
( para una estufa de gas) o 30 min (para una estufa elctrica).

Agregue 3 a 4 perlas de ebullicin a 250 mL de H 2O a 25C y

coloque el matraz en la hornilla precalentada. Determine la
configuracin que lleva el agua a ebullicin en 5 o 6 min en cada
hornilla. Esta es la configuracin mxima de las hornillas que debe
ser usada en la digestin.
1.13.2.
Digestin: Coloque el matraz en una posicin inclinada con
el sistema de extraccin encendido. Empiece con la configuracin
de la estufa lo suficientemente baja para que la muestra no forme
espuma y suba por el cuello del matraz. Digiera durante 20 min o
hasta que aparezca humo blanco. Luego aumenta la configuracin
de la estufa a la mitad del mximo determinado en 1.16.1 y caliente
durante 15 mins. Luego aumenta hasta el mximo determinado en
1.16.1. Cuando la muestra se aclare (claro con un tono Verdi azul)
continue hasta ebullicin de 1 a 1.5 horas con la configuracin
mxima (tiempo total de digestin de 2 a 2.5 horas).
Al final de la digestin la muestra debe estar y libre de material sin
digerir. Enfre la muestra ya digerida a temperatura ambiente
(Aprox. 25 min). La muestra digerida debe ser liquida o liquida con
algunos cristales ( una gran cantidad de cristales antes de la adicin
de agua indica muy poco H2SO4 residual al final de la digestin y
puede resultar en valores bajos del anlisis). Una vez que la
muestra est a tempertura ambiente agregue 300 mL de H 2O al
matraz y agite para mezclar (para matraces de 800 mL agregue 400
mL de H2O). Cuando se adiciona el agua, se puede dar la formacin
de algunos cristales y luego disolverse, esto es normal. Deje que la
muestra se enfre a temperatura ambiente antes de destilar.
1.13.3.
Destilacin: Abra el flujo de agua hacia el condensador.
Agregue 50 mL de solucin de H3BO3 con indicador en un matraz
Erlenmeyer de 500 mL para titulaciones, y coloque el matraz debajo
de la punta del condensador para que asi, la punta del condensador
est bien sumergida en la solucin de H 3BO3. Cuidadosamente
agregeue 75 mL de solucin de NaOH a la muestra digerida,
haciendola bajar por todo el cuello del matraz Kjeldahl, sin agitar. El
NaOH forma una capa transparente debajo de la muestra digerida.
Inmediatamente conecte el matraz al sistema de destilacin. Agite
vigorosamente el matraz para mezclar bien su contenido.; caliente
hasta que todo el NH3 haya sido destilado ( mayor o igual a 150 mL,
mayor o igual a 200 mL de volumen total) . Baje el matraz y deje
que escurra todo el liquido de la punta. Apague la estufa. Titule el
H3BO3 con la solucin patrn de HCl hasta la primera sea de color
rosa.
1.14.
Clculos y resultados
Calcule los resultados de manera siguiente:
Nitrgeno,%= [1.4007x(Vs-Vb)xN]/W

Donde:
Vb y Vs = mL de HCl usados para la muestra y para el blanco,
respectivamente
N= normalidad del HCl
W= peso de la muestra, g
Multiplique el % de Nitrgeno por un factor de 6.38, para cacular el % de
proteina, Esta protena est en base a Nitrgenos totales.
Valor mximo recomendado para la diferencia con duplicados es de
0.03%.
1.15.
Referencias
1.15.1.
AOAC Official Method 991.20 Nitrogen (Total) in Milk
Kjeldahl Method
1.15.2.

AOAC Official Method 925.21 preparation of milk sample

2. Valoracin de la Acidez Titulable: Mtodo de Dornic

2.1.Alcance del mtodo
Este mtodo es til para determinar la acidez Titulable de la leche, en
muestras provenientes de laboratorios de pruebas rpidas de recibo de leche
en los Centros de Recoleccin de Leche (CREL).
Esta norma se aplica a los siguientes tipos de leche:
a) Leche fresca o cruda
b) Leche homogenizada (pasteurizada o esterilizada).
c) Leche descremada o semidescremada.
2.2. Descripcin del objeto a ensayar
Muestras de 20 gramos de leche, realizadas en un matraz erlenmeyer.

2.3.Parmetro a ser determinado

Acidez actual efectiva presente en una muestra del producto,
expresado en Grados Dornic (D), mediante una titulacin acido-base.
2.4.Fundamento terico
Acidez titulable de la leche, es la acidez de la leche, expresada
convencionalmente como contenido de cido lctico, y determinada
mediante procedimientos normalizados.
Descripcin del Mtodo:
Se titula la acidez con una solucin estandarizada de hidrxido de
sodio, usando fenolftalena como indicador.
La leche fresca es neutra al tornasol. Cuando envejece o est mal
conservada aumenta su acidez. La valoracin de la misma se

consigue agregando, gota a gota, solucin de hidrxido de sodio:

NaOH, de concentracin conocida, dentro de un volumen (en mL)
de leche hasta que la fenolftalena adquiera color rojo. Con los
mililitros gastados de la solucin se calculan los grados DORNIC.
La acidez normal es de 14 a 200 DORNIC. Leche con 250 DORNIC,
o ms, es inapta para el consumo.
2.5.Interferencias posibles
Los resultados pueden ser errneos si la leche de muestra contiene
algn tipo de adulteracin, como es el caso de conservantes o agua.

2.6.Aparatos, equipos, reactivos y su preparacin

2.6.1. Reactivos y/o materiales:
2.6.1.1. Solucin 0,1
estandarizada.

de

hidrxido

de

sodio,

debidamente

2.6.1.2. Solucin indicadora de fenolftalena. Disolver 0,5 g de

fenolftalena en 100 cm3 de alcohol etlico de 95 - 96 %(V/V).
2.6.1.3. Agua destilada, exenta de CO2 y fra.
2.6.2. Aparatos y equipo:
2.6.2.1. Balanza analtica. Sensible al 0,1 mg.
2.6.2.2. Matraz Erlenmeyer de 100 cm3
2.6.2.3. Matraz aforado de 500 cm3
2.6.2.4. Bureta de 25 cm3, con divisiones de 0,05 cm3 o de 0,1 cm3
2.6.2.5. Estufa, con regulador de temperatura, ajustada a 103
2C.
2.6.2.6. Desecador, con cloruro
deshidratante adecuado

de

calcio

anhidro

otro

2.6.3. Preservacin y conservacin de la muestra de ensayo: Ver

referencia 2001.191 del Manual Prcticas de Anlisis de Leche.

2.7.Procedimiento
2.7.1. Lavar cuidadosamente y secar el matraz Erlenmeyer en la estufa a
103 2 durante 30 min.

2.7.2. Dejar enfriar en el desecador y pesar con aproximacin al 0,1 mg.

2.7.3. Verter, lentamente, tres o cuatro veces, la botella que contiene la
muestra preparada; inmediatamente, transferir al matraz
Erlenmeyer y pesar con aproximacin al 0,1 mg, aproximadamente
20 g de muestra.
2.7.4. Diluir el contenido del matraz con un volumen dos veces mayor de
agua destilada, y agregar 2 cm3de solucin indicadora de
fenolftalena.
2.7.5. Agregar, lentamente y con agitacin, la solucin 0,1 N de
hidrxido de sodio, justamente hasta conseguir un color rosado
persistente (fcilmente perceptible si se compara con una muestra
de leche diluida de acuerdo con lo indicado en el punto 5) que
desaparece lentamente.
2.7.6. Continuar agregando la solucin hasta que el color rosado persista
durante 30 s.
2.7.7. Leer en la bureta el volumen de solucin empleada, con
aproximacin a 0,05 cm3.
2.7.8. La determinacin se realiza por duplicado sobre la misma muestra
preparada.

2.8.Materiales de referencia
2.8.1. Patrn primario acido: ftalato cido de potasio
2.8.2. Leche Entera Sula

2.9.Muestreo
Se toma una muestra de aproximadamente 20 gramos de leche a 25 C.

2.10.
Preparacin del objeto a ensayar
2.10.1.
Llevar la muestra a una temperatura aproximada de 25C y
mezclarla mediante agitacin suave hasta que est homognea,
cuidando que no haya separacin de grasa por efecto de la
agitacin.
2.10.2.
Si se forman grumos de crema y stos no se dispersan,
calentar la muestra en bao Mara hasta 35 - 40C, mezclando
cuidadosamente e incorporando cualquier partcula de crema

adherida al recipiente; enfriar rpidamente hasta 20 - 25C. S

quedan partculas blancas o grumos de grasa adheridos a las
paredes del recipiente, la determinacin no dar resultados
exactos.

2.11.
Verificaciones antes del proceso
2.11.1.
Tanto el personal como la muestra deben cumplir con los
requisitos pertinentes de higiene y seguridad para evitar la
contaminacin de la muestra.
2.11.2.
La muestra de leche cruda debe ser representativa del lote
en recepcin de materias primas. La muestra debe ser homognea.
2.12.
Clculos y resultados
La acidez titulable de la leche se calcula mediante la ecuacin siguiente

A=0.090

V N
100
m1m

Siendo:
A = acidez titulable de la leche, en porcentaje en masa de cido lctico.
V = volumen de la solucin de hidrxido de sodio empleado en la
titulacin, en cm3
N = normalidad de la solucin de hidrxido de sodio.
m = masa del matraz Erlenmeyer vaco, en g.
m1 = masa del matraz Erlenmeyer con la leche, en g.

Nota: El porcentaje de acidez titulable debe calcularse con aproximacin

a milsimas.

2.12.1.

EXPRESIN DE LA ACIDEZ EN OTRAS UNIDADES

Si se desea calcular la acidez titulable de la leche en gramos de cido

lctico por cada 1 000 cm3de leche (g/1 000 cm3) deber aplicarse la
siguiente ecuacin:
Acidez en g/1 000 cm3= 10 .A.d
Donde:
d = densidad relativa de la leche.
A = acidez titulable de la leche, en porcentaje en masa de cido lctico.

 Si se desea calcular la acidez titulable de la leche en grados Dornic (0,1

g/1 000 cm3), debe dividirse por 10 la acidez titulable expresada en g/1
000 cm3

2.12.2.

INFORME DE RESULTADOS

2.12.2.1. Como resultado final, debe reportarse la media aritmtica

de los resultados de la determinacin, aproximada a
centsimas.
2.12.2.2. En el informe de resultados, debe indicarse el mtodo usado
y el resultado obtenido. Debe mencionarse, adems, cualquier
condicin no especificada en esta norma, o considerada como
opcional, as como cualquier circunstancia que pueda haber
influido sobre el resultado.
2.12.2.3.
Deben incluirse todos los detalles necesarios para la
completa identificacin de la muestra.

2.13.

Referencias
Norma Tcnica Ecuatoriana INEN 13 -Determinacin de la acidez
titulable.
Prcticas de Anlisis de Leche, Universidad Politcnica de Valencia

3. Determinacin del pH: Mtodo Potenciomtrico

3.1.Alcance del mtodo.
Este mtodo es utilizado para la determinacin del pH, aplicable
para leche cruda de vaca, de muestras provenientes de los laboratorios de
pruebas rpidas de recibo de leche en los Centros de Recoleccin de Leche
(CREL).

3.2.Descripcin del objeto a ensayar

Muestras de 10 mL de leche cruda, realizadas en un matraz
erlenmeyer.

3.3.Parmetro a ser determinado

Acidez actual efectiva presente en una muestra del producto,

expresado en concentracion de iones hidrogeno, mediante un
aparato medidor de pH (potencimetro).

3.4.Fundamento terico
Lo ms habitual en la prctica es conceder un valor absoluto a los
grados de acidez resultantes al aplicar los mtodos clsicos de
titulacin (Dornic o Soxhlet), pero en realidad solo una parte del
cido revelado por estos mtodos es acido activo (la otra parte
permanece ligada de diversas maneras).
La acidez actual efectiva es la concentracion de iones hidrogeno
contenidos en el lquido en cuestin y se mide con precisin
empleando un instrumento electrnico llamado potencimetro o pHmetro.
La acidez titulada es la concentracion total en hidrogeno
procedente de los cidos, es decir la concentracion en iones
hidrogeno de cidos disociados (acidez actual), ms la
concentracion en iones hidrogeno de los cidos no disociados
(acidez potencial)
La acidez actual se expresa en unidades de exponente de
hidrogeno negativo (pH). La leche de vaca debe presentar un pH
de 6,6, a 25C; el rango ms frecuente esta entre 6,5 y 6,7.
Cuanto ms bajo sea el pH (ms prximo a cero), ms fuerte ser
la acidez actual (activa); cuanto ms alto sea, por encima del 7,
ms considerable ser la alcalinidad actual.
Descripcin del Mtodo:
Por va instrumental, se determina el pH de una muestra de 10 mL
de leche depositada en un matraz erlenmeyer, mediante el
empleo del pH- metro.

3.5.Interferencias posibles
Los resultados pueden ser errneos si la leche de muestra contiene
algn tipo de adulteracin, como es el caso de conservantes o agua.

3.6.Aparatos, equipos, reactivos y su preparacin

3.6.1. Reactivos y/o materiales: Soluciones buffer para calibracin de pH
4y7
3.6.2. Aparatos y equipo : Potencimetro, Matraz Erlenmeyer de 100 cm 3

3.6.3. Preservacin y conservacin de la muestra de ensayo: Ver

subclusula 5.5 de la norma PFNHN 18: 2010, -Requisitos de leche
cruda.-

3.7.Procedimiento
3.7.1. Preparar el potencimetro de acuerdo con las instrucciones del
aparato y haciendo la calibracin con la solucin buffer de pH
conocido (4 y 7).
3.7.2. Ajustar el control de temperatura del aparato a la temperatura de
la muestra.
3.7.3. Introducir el aparato en la muestra de leche, realizar la lectura,
indicada en la pantalla digital del instrumento.
3.7.4. Anotar los resultados
3.7.5. Retirar y apagar el pH-metro, y luego enjuagar con agua destilada
para evitar la acumulacin de residuos de leche en el electrodo del
equipo.
Nota: El electrolito de referencia del electrodo est en contacto con la
disolucin de muestra a travs de un diafragma poroso, para establecer
el puente salino. Esta operacin se realiza con soluciones tampn de pH
conocido, que se adquieren habitualmente con la misma firma que
suministra el pH- metro. En lechera se utiliza el tampn pH 7 y 4.

3.8.Materiales de referencia
3.8.1. Soluciones tampn de pH 7 y 4
3.8.2. Leche Entera Sula

3.9.Muestreo
Se toma una muestra de 10 mL de leche cruda a 25 C.

3.10.

Preparacin del objeto a ensayar

Como
la
determinacin
de
pH
es
por
mtodo
potenciomtrico, no se incorpora ningn reactivo a la
muestra.

3.11.

Verificaciones antes del proceso

Tanto el personal como la muestra deben cumplir con los

requisitos pertinentes de higiene y seguridad para evitar la
contaminacin de la muestra.
La muestra de leche cruda debe ser representativa del lote
en recepcin de materias primas.

3.12.

Clculos y resultados
El potencimetro expresa directamente el resultado.

3.12.1.

INFORME DE RESULTADOS

El informe de ensayo debe contener:

1. El nmero de identificacin de la muestra
2. La identificacin del mtodo
3. Los resultados obtenidos
4. La fecha de ensayo

3.13.

Referencias

3.13.1.

Norma Hondurea OHN 18:2010 Leche cruda Requisitos

3.13.2.
Manual de procedimientos para anlisis de calidad de la
leche, Cuenta Reto del Milenio, Nicaragua.
4. Determinacin de Grasa en leche: Mtodo Roese-Goettlib

4.1.Alcance del mtodo.

Este mtodo nos permite determinar el contenido de grasa en una
muestra de leche.

4.2.Descripcin del objeto a ensayar.

Muestras de 10 mg de leche realizadas en un matraz o tubo de ensayo.

4.3.Parmetro a ser determinado.

Contenido de grasa presente en una muestra de leche seleccionada.

Expresado en g de grasa/gramos de producto

4.4.Fundamento terico.
De acuerdo a este mtodo, la separacin de la grasa es lograda por
amoniaco y etanol con un posterior efecto de deshidratacin sobre los
fosfolpidos. La grasa es disuelta en ter recin destilado y se aade algo
de petrleo de tal suerte que se separen algunos compuestos no
lipdicos que se puedan encontrar en la fase etrea. Esta mezcla es
completamente inmiscible en agua de manera que mediante una
extraccin adecuada es simple dejar la grasa en la fase etrea y el
residuo graso es pesado, sedimentndose posteriormente y separndose
la fase etrea por una destilacin. Finalmente se seca la muestra en un
horno obtenindose el contenido de grasa de la muestra deseada.

4.5.Interferencias posibles.
Posibles salpicaduras si no se controla la temperatura a la que se ebulle
los solventes luego de la extraccin.

4.6.Aparatos, equipos y reactivos

4.6.1. Reactivos.
4.6.1.1.1.

ter etlico

Es un buen disolvente de las grasas. Tiene aplicaciones

industriales c
omo disolvente
4.6.1.2. ter de petrleo.
Tambin conocido como bencina, nafta de petrleo, es
una mezcla lquida de diversos compuestos voltiles,
muy inflamables, de la serie homloga de los hidrocarburos
saturados o alcanos, y no a la serie de los teres como
errneamente indica su nombre. Se emplea principalmente
como disolvente no polar, en este caso las grasas.
4.6.1.3. Alcohol.
Separa la grasa de la muestra y provoca una deshidratacin sobre
los fosfolpidos.
4.6.2. Aparatos y equipos

4.6.2.1. Erlenmeyer o tubo de ensayo.

Utilizado para contener la muestra y lugar donde se hace la
extraccin.
4.6.2.2. Pipeta
Pipeta de 25 ml, empleada para agregar las soluciones de ter y
alcohol.
Pipeta de 2 ml, para medir 1.25 ml de NH 4OH
4.6.2.3. Centrifugadora
Acelera la decantacin o sedimentacin de la fase de
mayor densidad.
4.6.2.4.Horno
Utilizada para Secar una muestra completamente, en este
anlisis se emplea luego de la evaporacin de la fase
liquida presente en la extraccin.
4.6.2.5. Balanza analtica
Utilizada para obtener la masa de una muestra, en este
caso la muestra i nicial de 10 g de leche Y la muestra final en la
que se mide la grasa total.

4.7.Materiales de referencia.
Leche entera Sula

4.8.Muestreo.
Se toma una muestra de 10 gramos de leche cruda a 20 C.

4.9.

Preparacin del objeto a ensayar.

4.9.1. Luego de tomar la muestra de 10 gramos de leche cruda
se agregan los respectivos reactivos.
4.9.2. Agregar 1.25 ml de NH4OH y mezclarlo.
4.9.3. Agregar 10 ml de alcohol y mezclarlo.
4.9.4. Agregar 25 ml de ter etlico, taparlo con un corcho o un
material inerte a los solventes y mezclarlo vigorosamente
durante un minuto.

4.9.5. Agregar 25 ml de ter de petrleo (cuyo punto de

ebullicin este en el rango de 30-60 C), mezclarlo bien.

4.10. Verificaciones antes del proceso.

Que al tomar la muestra de leche est homognea, en caso de que no lo
est incluso moviendo la muestra, realizar un bao mara a 38 C y
homogenizarlo.

4.11. Procedimiento.
4.11.1.
Tomar una muestra de leche cruda de 10 mg a 20
C, dentro de un tubo de ensayo o matraz, luego
homogenizar la muestra.
4.11.2.

Agregar 1.25 ml de NH4OH y mezclarlo.

4.11.3.

Agregar 10 ml de alcohol y mezclarlo.

4.11.4.
Agregar 25 ml de ter etlico, taparlo con un corcho o
un material inerte a los solventes y mezclarlo
vigorosamente durante un minuto.
4.11.5.
Agregar 25 ml de ter de petrleo (cuyo punto de
ebullicin este en el rango de 30-60 C), mezclarlo bien.
4.11.6.
Centrifugar el matraz a 600 rpm hasta que el lquido
superior este prcticamente claro.
4.11.7.

Decantar la solucin de ter a un matraz limpio.

4.11.8.
Lavar la parte superior y el tapn del matraz (donde
se realiz la extraccin) con una mezcla de partes iguales
de los 2 teres y aadir los lavados al frasco donde se
decant.
4.11.9.
Repetir la extraccin de lquido restante del matraz
dos veces, usando 15 ml de cada solvente cada vez y
aadiendo agua si es necesario. Pero omitir el aclarado
con disolventes mixtos despus de la extraccin final.
4.11.10.
Evaporar solventes por completo a temperatura que
no se produzca salpicaduras.
4.11.11.
Secar a peso constante en un horno a 102 C 2 o a
70-75 C a presin inferior a 6.7 Kpa.
4.11.12.

Pesar el matraz o plato frio.

4.11.13.
Remover la grasa completamente agregando 15-25
ml con ter de petrleo, secarlo y pesarlo como se hizo
anteriormente. El peso perdido= peso de grasa, corregir
el peso por una determinacin en blanco con todos los
reactivos dados.
4.11.14.
La diferencia entre determinaciones duplicadas por el
mismo analista debe ser 0.03 g de grasa/100 g de
producto.

4.12. Clculos y resultados

% de grasa = Gramos de grasa/gramos de producto

4.13. Referencias.
4.13.1.
AOAC Official Method 905.02 Fat in milk RoeseGottlieb Method
4.13.2.
AOAC Official Method 925.21 preparation of milk
sample

5. Calidad Microbiolgica

5.1 Alcance del mtodo

Este mtodo nos permite recuento total de microorganismos aerobio
mesfilos viables
(ufc/ml).

5.2 Descripcin del objeto a ensayar

Tomar una muestra de 5 ml de leche en un beaker o tubo de
ensayo.

5.3 Parmetro a ser determinado

Recuento total de microorganismos aerobio mesfilos viables
(ufc/ml).

5.4 Fundamento Terico

Este mtodo se basa en la presuncin de que cada clula
bacteriana puede crecer en un medio de cultivo slido formando
colonias. De acuerdo con este criterio en nmero de colonias
desarrolladas en un medio de cultivo slido puede corresponder al
nmero de clulas bacterianas viables presentes en una cantidad
determinada de muestra que haya sido inoculada.
El nmero de bacterias aerobias mesfilas encontrado en los
alimentos es uno de los indicadores microbianos de calidad de los
mismos Este ndice no es vlido para alimentos fermentados:
queso, leches fermentadas, yogur, manteca.

5.5 Interferencia posible

EL sistema de limpieza y desinfeccin no sea eficiente.

5.6 Equipo y reactivos

5.6.1 Equipo
5.6.1.1 Equipamiento para mezclas:
5.6.1.2 mezcladores rotativos
5.6.1.3 mixer
Trabaja bajo el principio de rotacin excntrica del
contenido de los tubos
5.6.1.4 frascos o botellas
Con capacidad suficiente para contener los 90 ml
del diluyente de la dilucin inicial.
5.6.1.5 Placas de Petri (100 x 15 mm).
5.6.1.6 Pipetas bacteriolgicas de 1 ml, 5 ml y 10 ml
5.6.1.7 Estufa de cultivo regulada a 35 - 37C.
5.6.1.8 Contador de colonias.

5.6.2 Reactivos

5.6.2.1 Agar nutritivo

Es un medio de cultivo usado normalmente como
rutina para todo tipo de bacteria
5.6.2.2 Solucin de Peptona
Es el diluyente ms comn a utilizar

5.7 Materiales de referencia.

Leche entera sula.

5.8 Muestreo
Se toma una muestra de 5ml de leche a temperatura ambiente

5.9 Preparacin del objeto a ensayar

Agitar la muestra invirtindola 25 veces en forma rpida de
manera que los microorganismos estn uniformemente
distribuidos en la misma.

5.10 Verificaciones antes del proceso

Averiguar la temperatura a que fueron sometidos los alimentos
durante los procesos de tratamiento industrial, transporte y
almacenamiento.
5.11 Medidas de seguridad
5.11.1 evitar el contacto de la pipeta con el diluyente.
5.11.2 Para cada dilucin se debe usar una nueva pipeta.
5.11.3 No pipetea con la boca.

5.11.4 controlar cuidadosamente la temperatura para evitar

accidentes
5.11.5 Usar proteccin, cabacha.

5.12 procedimiento

5.12.1 Agitar la muestra invirtindola 25 veces en forma rpida de

manera que los microorganismos estn uniformemente distribuidos
en la misma.
El intervalo entre la mezcla y la toma de porcin de
muestra no debe exceder los 3 minutos .Tomar 1 ml de
muestra y agregarlo a 9 ml del diluyente a utilizar. El ms
adecuado es la solucin de peptona 0,1%, (se pueden
utilizar otros diluyentes como: peptona/sol. salina, sol.
Ringer concentrada al cuarto, sol. Buffer de fosfato), 10 ml
de muestra a 90 ml de diluyente o 11 ml de la muestra a
5.12. 99 ml de diluyente.
2
Agitar esta primera dilucin (por ej. 25 veces durante 10
seg.). Es as obtenida
la dilucin 1/10.

5.12.
3

Diluciones decimales siguientes:

Transferir por medio de una nueva pipeta 1 ml de la
primera dilucin a otro tubo de 9 ml de diluyente evitando
el contacto de la pipeta con el diluyente.
Para cada dilucin se debe usar una nueva pipeta.
Mezclar cuidadosamente, aspirando 10 veces con una
nueva pipeta o usando un agitador mecnico por 5 o 10
seg. Para obtener la dilucin 1/100.
Repetir las operaciones usando la dilucin 1/100 para
obtener diluciones 1/1000. 1/10000, etc. hasta obtener el
nmero adecuado de microorganismos.

5.12.
4

5.12.
5

Duracin del procedimiento:

El tiempo transcurrido entre la medicin inicial de la
muestra o el final de la preparacin del sol. Primaria y el
mezclado de las diluciones no debe ser mayor que 15
minutos
Siembra en placas de Petri:

Pipetear por duplicado a placas de Petri estriles alcuotas

de 1 ml a partir de dilucin 1/10, 1/100, 1/1000, 1/10000 y
1/100000. Se sugiere esta serie de diluciones cuando no se
conoce el rango aproximado del nmero de bacterias.
5.12.
6

Agregado del medio de cultivo:

Licuar el agar de recuento (agar nutritivo, Plate Count) en
un bao de vapor o de agua hirviente, sin exponerlo a tal
calentamiento por un perodo prolongado.

5.12.6
.1

Templar el agar a 44 - 46C y controlar cuidadosamente la

temperatura para evitar la muerte de las bacterias en la
muestra diluida.

5.12.6
.2

Agregar rpidamente a las placas el agar licuado y

templado de manera de obtener una capa de 3 o 4 mm de
5.12. espesor.
Mezclar cuidadosamente las alcuotas con el agar mediante
7
movimientos de vaivn y de rotacin de las placas de Petri
(en favor y en contra de las agujas del reloj y en cruz) con el
5.12. objeto de obtener las colonias uniformemente dispersas
despus de la incubacin.
8
Para control de esterilidad, adicionar a placas de Petri, agar
sin inocular y agar inoculado con el diluyente.
5.12. Mantener las placas sobre una superficie horizontal y limpia
hasta que el medio se solidifique, luego invertirlas y llevarlas
9
a estufa de cultivo durante 48 3 horas.
5.12.10 Recuento de colonias en placas:
Seleccionar dos placas correspondientes a una dilucin
que contenga entre 30 y 300 colonias.

5.13 Clculos
Tomar la media aritmtica de los 2 recuentos y multiplicar por
el factor de dilucin (recproco de la dilucin utilizada).
Informar segn el caso, el resultado como nmero de
microorganismos aerobios mesfilos por ml o gramo.
Ejemplo: dilucin 1/100.
Placa 1: 72 colonias x 100 = 7200 y placa 2: 77 colonias
x 100 = 7700

Se promedia:

7450

Se informa 7450 colonias /g o ml

5.13 Referencias

El Cdigo Alimentario Argentino en el art. 558 inciso A, establece

las exigencias microbiolgicas para la leche de consumo:
Leche Entera Pasteurizada, exige que el Recuento total en placa sea
menor de 50.000 UFC/ml (desde abril a septiembre inclusive) y
menor de 100. 000 UFC/ml (desde octubre a marzo inclusive).
Resulta importante aclarar que las exigencias establecidas en el CAA
para este parmetro se encuentran totalmente desfasadas de la
realidad:
Las Usinas consideran que una LECHE CRUDA es de buena calidad,
cuando los recuentos en placa son < de 25.000 (UFC/ml). Valores
entre 50.000 y 100.000 UFC/ml se los considera elevados y son
castigados o no bonificados al momento del pago de leche por
calidad.

Recordar:
El valor normal/ esperado para LECHE CRUDA, es de
25.000 (UFC/ml)