INSTITUTO TECNOLGICO

SUPERIOR DE MISANTLA
INGENIERA BIOQUMICA
Cultivo micelial masivo de hongos del gnero
Ganoderma.
INFORME FINAL
QUE PRESENTA

EDITH GONZLEZ CRUZ

ASESORES EXTERNOS

Director: Dr. ngel R. Trigos Landa

Codirectores: Dr. Csar Espinoza Ramrez
Dr. Guillermo Mendoza Cervantes
ASESOR INTERNO

Dr. Gustavo Martnez Castellanos

MISANTLA, VERACRUZ.

ENERO DE 2014.

1. Resumen
Metabolitos derivados de los carpforos de Ganoderma recientemente han sido
obtenidos por tcnicas de cultivo micelial, ya que tanto los cultivos lquidos como slidos son
una alternativa para la produccin de estos compuestos.
El gnero Ganoderma posee una taxonoma compleja, debida al fenmeno de la
plasticidad fenotpica y que muchas de sus especies se encuentran parcial o
superficialmente descritas, por lo que la identificacin a nivel de especie es complicada.
En este trabajo, se llev a cabo la recoleccin de carpforos en las Ciudades de
Xalapa Enrquez, Las Vigas de Ramrez y Tlapacoyan, en el Estado de Veracruz de Ignacio
de la Llave y en base a la morfologa se determin cuales pertenecan a especies de
Ganoderma, se evalu en un inicio la produccin de biomasa de la cepas empleando cultivos
slidos, que fueron las tcnicas de cultivo en caja Petri utilizando medio de cultivo PDA.
Posteriormente se trabaj para preservar las cepas en tubos inclinados con el mismo medio
de cultivo y despus se utiliz medio lquido para llevar a cabo los preinculos e inculos de
las cepas obtenidas (Mendoza et al, 2011).
De lo anterior, el cultivo lquido empleando el medio de cultivo Fang y Zhong result
ser eficiente para la produccin de biomasa, con el que se realiz el cultivo masivo de las
cepas de Ganoderma.

2. ndice
1.

Resumen.......................................................................................................................... iii

2.

ndice............................................................................................................................... iv

3.

Introduccin...................................................................................................................... 7

4.

Justificacin...................................................................................................................... 8

5.

Objetivo General............................................................................................................... 9

6.

Objetivos Especficos....................................................................................................... 9

7.

Descripcin de la Empresa...............................................................................................9
7.1 Antecedentes Histricos.................................................................................................9
7.2 Macrolocalizacin.........................................................................................................10
7.3 Microlocalizacin..........................................................................................................11
7.4 LATEX, S.C.................................................................................................................. 12
7.4.1 Qu es LATEX, S.C...............................................................................................12
7.4.2 Misin, Visin, Objetivo y Poltica de Calidad........................................................12

8.

Diagnstico de la Situacin Actual..................................................................................13

9.

Problemtica................................................................................................................... 13

10. Alcances y Limitaciones..................................................................................................14

11. Marco Terico................................................................................................................. 14
11.1 Generalidades del gnero Ganoderma.......................................................................14
11.2 Biotecnologa de hongos............................................................................................17
11.3 Caractersticas de los hongos.....................................................................................18
11.4 Requerimientos nutrimentales....................................................................................19
11.5 Tipos de cultivo........................................................................................................... 20
11.6 Cintica de crecimiento..............................................................................................21
11.7 Metabolismo de los hongos........................................................................................22
11.8 Cultivo micelial de especies de Ganoderma...............................................................24
11.9 Metabolitos aislados del cultivo micelial de Ganoderma.............................................26
12. Definicin de la Metodologa............................................................................................28
12.1 Recoleccin de los ejemplares de Ganoderma..........................................................29
12.2 Aislamiento micelial de las cepas de Ganoderma.......................................................29
12.3 Cultivo en tubo inclinado............................................................................................29
12.4 Preparacin del preinculo.........................................................................................29
12.5 Preparacin del inculo..............................................................................................30
4

12.6 Cultivo masivo............................................................................................................ 30

13. Resultados...................................................................................................................... 30
13.1 Localizacin de los ejemplares de Ganoderma..........................................................30
13.3 Determinacin del medio y tipo de cultivo para la produccin de biomasa.................31
13.4 Cultivo micelial masivo de las cepas de Ganoderma..................................................38
14. Conclusiones y Recomendaciones.................................................................................40
15. Referencias Bibliogrficas..............................................................................................41
16. Apndice......................................................................................................................... 44
16.1 Medios de cultivo........................................................................................................44
16.1.1 Medio de Fang y Zhong (2002)............................................................................44
16.1.2 Medio agar papa dextrosa (PDA).........................................................................44
17. Anexos............................................................................................................................ 45

ndice de Figuras
Figura 1. Fotografa satelital de la Ciudad de Xalapa Enrquez, Veracruz.............................10
Figura 2. Acercamiento de la fotografa satelital de Xalapa Enrquez a la Zona de ubicacin
de LATEX, S. C...................................................................................................................... 11
Figura 3. Fotografa satelital de la ubicacin de LATEX, S.C.................................................11
Figura 4. Carpforos de Ganoderma: a) lacado, ntese la capa resinosa; b) no lacado........15
Figura 5. Metabolitos secundarios de hongos: a) penicilina G, b) ciclosporina A, c)
lovastatina, d) pravastatina,...................................................................................................18
Figura 6. Tipos de cultivo para desarrollo micelial de hongos. a) Cultivo lquido, b) Cultivo
slido..................................................................................................................................... 21
Figura 7. Cintica de crecimiento tpica de los microorganismos; a) fase de latencia o de
adaptacin; b) fase de crecimiento exponencial o logartmica; c) fase estacionaria; d) fase de
muerte celular........................................................................................................................ 22
Figura 8. Diagrama de los pasos a seguir para el cultivo micelial masivo de cepas de
Ganoderma............................................................................................................................ 28
Figura 9. Cepa GL-02. Carpforo, micelio en medio PDA y preinculo en medio lquido.......33
Figura 10. Cepa GL-03. Carpforo, micelio en medio PDA y preinculo en medio lquido.....33
Figura 11. Cepa GL-05. Carpforo, micelio en medio PDA y preinculo en medio lquido.....34
Figura 12. Cepa GL-06. Carpforo, micelio en medio PDA y preinculo en medio lquido.....34
5

Figura 13. Cepa GL-07. Carpforo, micelio en medio PDA....................................................34

Figura 14. Cepa GL-08. Carpforo, micelio en medio PDA y preinculo en medio lquido.....35
Figura 15. Cepa GL-09. Carpforo, micelio en medio PDA y preinculo en medio lquido.....35
Figura 16. Cepa GL-10. Carpforo, micelio en medio PDA y preinculo en medio lquido.....35
Figura 17. Cepa GL-12. Carpforo, micelio en medio PDA y preinculo en medio lquido.....36
Figura 18. Cepa GL-13. Carpforo, micelio en medio PDA y preinculo en medio lquido.....36
Figura 19. Cepa GL-14. Carpforo, micelio en medio PDA y preinculo en medio lquido.....36
Figura 20. Cepa GL-15. Carpforo, micelio en medio PDA y preinculo en medio lquido.....37
Figura 21. CepaGL-16. Carpforo, micelio en medio PDA y preinculo en medio lquido......37
Figura 22. Cepa GL-18. Carpforo, micelio en medio PDA y preinculo en medio lquido.....37
Figura 23. Cepa GL-19. Carpforo, micelio en medio PDA y preinculo en medio lquido.....38
Figura 24. Cepa GL-22. Carpforo, micelio en medio PDA y preinculo en medio lquido.....38
Figura 25. Cultivo micelial masivo de las cepas de Ganoderma en medio lquido a 7 das
(fase de agitacin)................................................................................................................. 39
Figura 26. Cultivo micelial masivo de las cepas de Ganoderma en medio lquido a 14 das
(fase esttica)........................................................................................................................ 39

ndice de Tablas
Tabla 1. Principales componentes de los medios de cultivos para hongos............................20
Tabla 2. Medios de cultivo utilizados para especies de Ganoderma......................................26
Tabla 3. Comparacin de los metabolitos identificados en carpforos y micelio de G. lucidum.
............................................................................................................................................... 27
Tabla 4. Cepas de Ganoderma aisladas y preservadas.........................................................32
Tabla 5. Composicin del medio de Fang y Zhong (2002).....................................................44
Tabla 6. Composicin del medio slido PDA..........................................................................44

3. Introduccin
El gnero Ganoderma es uno de los gneros con mayor nmero de especies del
orden de los Polyporales y con una taxonoma compleja, debido a que su clasificacin
tradicional est basada en las caractersticas del carpforo, morfologa de las hifas y tamao
de la basidioesporas, las cuales pueden variar bajo diferentes condiciones de crecimiento,
aunado a que hay varias especies que se encuentran parcial o superficialmente descritas,
por lo que la identificacin a nivel de especie es complicada y confusa (Utomo et al, 2005)
La importancia del gnero Ganoderma radica en que es fuente de productos
medicinales y nutricuticos. Por ello, extractos crudos de los carpforos de Ganoderma,
especie fngica de mayor inters y demanda comercial, han sido usados desde hace 2000
aos para el tratamiento de enfermedades crnicas como hepatopatas, hipertensin,
hipercolesteremia, gastritis, diabetes, bronquitis, artritis y neoplasias (Chen et al, 2010).
Actualmente, las investigaciones se enfocan en la elucidacin de los metabolitos
responsables de la bioactividad, destacando los triterpenoides tipo lanostano altamente
oxigenados, de los que hasta ahora han sido aislados ms de 200 a partir de miembros del
gnero Ganoderma. Entre estos triterpenos se encuentran los cidos ganodricos,
metabolitos secundarios que poseen importantes actividades farmacolgicas, que incluye
citotoxicidad, actividad antihistamnica, inhibicin de la sntesis de colesterol, estimulacin de
la agregacin plaquetaria, efectos antitumorales, anti VIH-1 e inhiben la actividad de la
proteasa del VIH-1 (Adams et al, 2010)
Aunque, la mayora de los estudios qumicos y farmacolgicos reportan haber
trabajado con carpforos de especies de Ganoderma, recientemente, se han incrementado
muchas investigaciones en su cultivo micelial, ya que en comparacin con el cultivo de los
carpforos, puede mejorar los proceso de calidad y eficiencia y ha sido visto como una
alternativa prometedora para la produccin de metabolitos, como los cidos ganodricos
(Park y Lee, 2010)
Se sabe, que todas las especies del gnero Ganoderma son productoras de
metabolitos de inters farmacolgico, en Mxico no existen estudios qumicos de estas
7

especies, por lo que el estudio qumico de algunos ejemplares de la regin, de los cual no se
encontraron reportes, nos permitir saber el tipo de metabolitos que producen.
Por todo lo anterior, el Objetivo General del siguiente trabajo fue: Recolectar y realizar
el cultivo micelial de cepas de hongos del gnero Ganoderma.

4. Justificacin
Muchos de los productos comerciales derivados de los carpforos de Ganoderma,
recientemente han sido obtenidos por tcnicas de cultivo micelial, ya que tanto los cultivos
lquidos como slidos son una alternativa para la produccin de metabolitos de hongos
superiores y tienen ventajas sobre el cultivo tradicional de los carpforos.
Entre las ventajas, tenemos el tiempo de obtencin de productos de inters que va de
2 a 3 semanas en cultivos miceliales a diferencia de los 3 a 5 meses que lleva el cultivo
tradicional de los carpforos, por otro lado, las tcnicas tradicionales no garantizan una
estandarizacin en los productos ya que la composicin del sustrato, puede afectar la
composicin de los carpforos, en cambio el cultivo micelial tiene la gran ventaja de
adicionar al cultivo diferentes nutrimentos y/o variar sus concentraciones, para optimizar su
crecimiento micelial y la obtencin de productos de inters (Xu et al, 2010).
Para llevar a cabo la produccin a nivel micelial de las 16 cepas identificadas
pertenecientes al gnero Ganoderma se trabaj con un proceso de cultivo en dos etapas, la
combinacin de la fermentacin agitada con una segunda etapa en el proceso de cultivo
esttico.
Debido a lo anterior, y aprovechando el apoyo que se tiene del Laboratorio de Alta
Tecnologa de Xalapa (LATEX, S.C.) y la experiencia que este tiene en el estudio de los
metabolitos de diferentes hongos (Trigos et al, 2011), se propone realizar un cepario de
hongos del gnero Ganoderma provenientes de la regin y llevar a cabo su cultivo micelial
masivo.

5. Objetivo General
Desarrollar el cultivo micelial masivo de hongos del gnero Ganoderma obtenidos de
la regin.

6. Objetivos Especficos
Recolectar carpforos de hongos Ganoderma en la regin.
Aislar y establecer cultivos de hongos del gnero Ganoderma.

7. Descripcin de la Empresa
Laboratorio de Alta Tecnologa de Xalapa, S.C.

7.1 Antecedentes Histricos

LATEX se fund en 1998, aunque los servicios acreditados se dieron a partir de 2001.
Hoy, al rebasar los 100 mil trabajos, representa ms de 12 mil 500 facturaciones para cerca
de 850 usuarios satisfechos, entre ellos se cuentan hoteles, restaurantes, agencias
aduanales, industrias de alimentos y agropecuaria, as como productores, lo que convierte a
Latex en una excelente herramienta que tiene a la mano la Direccin General de
Investigaciones de la UV para conectar la academia con los sectores productivo y de
servicios regionales y nacionales.
Uno de los logros considerables de Latex en el terreno de la investigacin, ha sido un
artculo que en 2007 result seleccionado por la Faculty One Thousand of Biology como uno
de los mejores mil artculos en biologa a nivel mundial. Por otra parte, se ha logrado un
singular reconocimiento por parte de la Cmara Nacional de la Industria Farmacutica,
gracias a un trabajo relacionado con la destruccin selectiva de hongos a partir de la
9

fotoxidacin del ergosterol. En otras palabras, es el logro del envejecimiento acelerado de

hongos mediante reacciones fotoqumicas.
Latex es un modelo concebido del todo en la UV donde se combinan tres esfuerzos
dismbolos en apariencia. Como sociedad civil, el socio mayoritario es la UV, con la
Asociacin Nacional de Universidades e Instituciones de Educacin Superior y la Asociacin
de Industriales del Estado de Veracruz. Semejante modelo no ha permeado otras
instituciones, tal vez por las complicaciones resultantes de la funcin de un centro privado en
una universidad pblica. Pero el buen manejo austero y responsable de los pocos recursos
le ha hecho merecedor de confianza.

7.2 Macrolocalizacin
LATEX se encuentra en Mxico en Xalapa Enrquez, la Capital del Estado de
Veracruz de Ignacio de la Llave.

Figura 1. Fotografa satelital de la Ciudad de Xalapa Enrquez, Veracruz.

10

Figura 2. Acercamiento de la fotografa satelital de Xalapa Enrquez a la Zona de ubicacin de LATEX, S. C.

7.3 Microlocalizacin
Calle Mdicos No. 5. Col. Unidad del Bosque. Xalapa Enrquez, Veracruz. C.P. 91010

Figura 3. Fotografa satelital de la ubicacin de LATEX, S.C.

11

7.4 LATEX, S.C.

7.4.1 Qu es LATEX, S.C.
Es un centro de investigacin cientfica y tecnolgica, incluido en el Registro Nacional
de Instituciones y Empresas Cientficas y Tecnolgicas del CONACYT, que ofrece servicios y
apoyo al sector productivo y a la formacin de recursos humanos.
El laboratorio se encuentra acreditado ante la Entidad Mexicana de Acreditacin
(EMA) y aprobado ante la Secretara de Agricultura, Ganadera, Desarrollo Rural, Pesca y
Alimentacin (SAGARPA) en el rea de Fitosanidad.
7.4.2 Misin, Visin, Objetivo y Poltica de Calidad
Misin. Colaborar en la interaccin de la Direccin General de Investigaciones de la
Universidad Veracruzana con el sector productivo y de servicios, a travs de la generacin,
promocin y transferencia de servicios y conocimientos de calidad en las reas de recursos
naturales, ambiente y procesos biotecnolgicos.
Visin. Ser un organismo privado asociado a la Universidad Veracruzana, con
carcter empresarial dinmico, eficiente y competitivo en el rea de servicios y asesoras al
sector productivo, con una cultura de investigacin, gestin y extensin.
Objetivo. Ser una empresa con una filosofa de trabajo basada en la cultura de
investigacin aplicada, a travs de la vinculacin Acadmica-Sector Productivo y de
Servicios, en las reas de Fitosanidad e Inocuidad y Calidad Alimentaria. Conducido con
Independencia, Integridad e Imparcialidad de juicio.
Poltica de Calidad. LATEX S.C. opera bajo un Sistema de Gestin establecido
conforme a la NMX-EC-17025-IMNC-2006, comprometindose a llevar a cabo buenas
prcticas profesionales con calidad de los ensayos realizados para satisfacer los requisitos
del cliente, as como, mejorar de manera continua la efectividad del sistema.

12

8. Diagnstico de la Situacin Actual

El desarrollo de la etapa del proyecto aqu descrito se llev a cabo en el rea de
Estudios Especiales en el Laboratorio de Alta Tecnologa de Xalapa, S.C.
La funcin de LATEX, S. C. es coadyuvar a la vinculacin de la Direccin General de
Investigaciones de la Universidad Veracruzana con el sector productivo y de servicios, a
travs de la generacin, promocin y transferencia de conocimiento, en el rea de recursos
naturales y medio ambiente (agua, alimentos, estudios especiales, agroservicios, formacin
de recursos humanos, seguridad alimentaria y principalmente, diagnstico fitosanitario).
LATEX, S. C. es el primer laboratorio en el sureste que opera como laboratorio
integral de diagnstico fitosanitario.
LATEX, S. C., cuenta con un catlogo de servicios debidamente estructurado, en los
que se indican costos competitivos, tiempos de entrega y condiciones especficas.
Constituido por ms de 200 determinaciones diferentes, basado en un Sistema de Calidad,
regido por las normas ISO-9000 y la Acreditacin ante la EMA. Todo ello, brinda a los
usuarios una informacin adecuada y seguridad en la emisin de resultados.
Investigacin Aplicada: El modelo de LATEX S.C. brinda asesora a estudiantes de
Licenciatura y de Posgrado en las reas como Qumica Farmacutica Biolgica, Biologa,
Ingeniera Qumica, Ciencias Agrcolas, Qumica Clnica, Maestra en Ciencias Ambientales y
Doctorados en Biotecnologa y Ecologa y Ciencias Biomdicas. Motivando en cada uno de
ellos el inters por la Investigacin Cientfica y fomentando tambin el intercambio
acadmico.

9. Problemtica
Haciendo buen uso de las herramientas de LATEX, S.C., tanto materiales como
humanas, se trabaj para llevar a cabo el cultivo micelial de hongos del gnero Ganoderma
recolectados en la regin montaosa del Estado de Veracruz de Ignacio de la Llave,
optimizando los tiempos y medios de cultivo utilizados para la produccin a gran escala del
13

micelio de los carpforos ya que uno de los problemas que se han encontrado al trabajar con
este tipo de hongos en un cultivo tradicional es el tiempo en que se obtienen productos de
inters que va de los 3 a 5 meses por otro lado, las tcnicas utilizadas en este trabajo
minimizaron ese lapso a un periodo de 2 a 3 semanas en los cultivos obtenindose con gran
xito la produccin micelial de 16 cepas recolectadas.

10.

Alcances y Limitaciones

El desarrollo de la etapa correspondiente a este trabajo fue completamente viable, las

fuentes de informacin para poder llevar a cabo la identificacin y tcnicas para el cultivo de
las cepas de Ganoderma fueron dadas por LATEX, S.C. a la vez que se tuvo la asesora por
parte de los Doctores Csar Espinoza Ramrez y Guillermo Mendoza Cervantes, as como
todo el material y reactivos requeridos para llevar a cabo el proyecto, no se requiri de algn
financiamiento extra por parte del laboratorio y el rea de Estudios Especiales as como el
cuarto de mquinas, el cuarto estril y el cuarto de agitacin estuvieron disponibles durante
los 4 meses de trabajo.

11. Marco Terico

11.1 Generalidades del gnero Ganoderma
El estudio de la biodiversidad es de gran importancia para entender la estructura y
funcin de la vida en nuestro planeta; lamentablemente, en las ltimas dcadas la diversidad
biolgica se ha visto afectada profundamente, principalmente a travs de la prdida
acelerada de especies. En cuanto a hongos, la prdida de biodiversidad tambin es muy
grande, pero no evidente, debido al bajo nmero de especies descritas en relacin con las
que se calcula que existen (Hawksworth, 1991). Esta prdida, ha motivado a muchos
cientficos de diferentes reas a obtener ms informacin sobre estos organismos y reas
como la sistemtica y la gentica aportan tcnicas tiles para la obtencin de los datos
necesarios para el conocimiento de los distintos grupos de hongos. Uno de los gneros ms
variados del orden de los Polyporales y probablemente el ms complejo morfolgicamente
es Ganoderma ( = brillante, = piel).

14

El gnero Ganoderma se describi por primera vez por Karsten en 1881, basndose
en la presencia o ausencia de laca en la superficie de los carpforos (Figura 5), lo que ha
permitido diferenciar a sus miembros en dos sub-gneros: Ganoderma (lacado) y Elfvingia
(no lacado). Estos son hongos anuales, crecen en tocones, rboles viejos o muertos y se
encuentran ampliamente distribuidas en regiones tropicales y templadas (Ruey-Shyang et al,
1996).

a)

b)

Figura 4. Carpforos de Ganoderma: a) lacado, ntese la capa resinosa; b) no lacado.

Algunas de sus especies son de inters en fitopatologa, ya que son plagas de

rboles caducifolios como roble (Quercus), arce (Acer), castao (Castanea), Haya (Fagus),
fresno (Fraxinus), lamo (Populus), magnolia (Magnolia) y pino (Pinus), as como de cultivos
perennes como palma de aceite (Elaies guineensis), t (Camelia sinensis), vid (Vitis vinifera),
caucho (Hevea brasiliensis) y cacao (Theobroma cacao) (Adaskaveg et al, 1990).
Sin embargo, la clasificacin taxonmica que envuelve a Ganoderma, como a todos
los hongos ganodermataceous posee grandes problemas, debido a que hay varias especies
que se encuentran parcialmente o superficialmente descritas, ya que en algunas ocasiones
han sido estudiadas basndose en especmenes que estn en malas condiciones (Mendoza
et al, 2011).
Mediante una revisin en la literatura y en el Index Fungorum (http://www.index
fungorum.org/Names/Names.asp), Douanla-Meli y Langer (2009) encontraron cerca de 421
nombres especficos para Ganoderma, de los cuales slo una tercera parte son vlidos. Los
estudios en este gnero tropiezan con la plasticidad fenotpica, fenmeno documentado por
15

varios autores (Bazzalo y Wright, 1982); un ejemplo de ello, es la morfologa del basidioma
que puede variar de acuerdo con la regin geogrfica, el clima y los sustratos donde se
desarrolla.
Por lo que la clasificacin taxonmica tradicional del gnero basada principalmente
en la descripcin morfolgica de los carpforos y en el tamao de las esporas, as como en
el hospedero especfico y su distribucin geogrfica, ha resultado confusa y no
universalmente aceptada, lo que ha originado muchas sinonimias. Debido a ello, Ryvarden
(1991) describe al gnero en un estado de caos taxonmico (Douanla-Meli y Langer, 2009).
La alta plasticidad fenotpica observada en Ganoderma, indica que este gnero es
joven y que an no ha ocurrido una fuerte especiacin. Que las especies lacadas son de
reciente origen y que la mayora de ellas han sido descritas en los trpicos, lo que ha
permitido especular que los trpicos son bombas para generar taxones debido a que las
condiciones climticas mejoran la diversidad biolgica, por lo que algunos taxones pueden
tener un origen tropical (Ryvarden, 1991).
La clasificacin taxonmica del gnero es la siguiente (Aisworth et al, 1973):
Dominio: Eukarya
Reino: Fungi
Subreino: Dicarya
Filum: Basidiomycota
Clase: Agaricomycetes
Orden: Polyporales
Familia: Ganodermataceae
Gnero: Ganoderma
Subgnero: Ganoderma Elfvingia
Algunas caractersticas morfolgicas utilizadas para identificar a los miembros del
gnero son (Guzmn, 1980):
1. Presentan forma de repisa circular, con pie (estipe) o sin pie.
2. Superficie de sombrero (pleo) brillosa (resinosa) u opaca.
16

3. Consistencia dura, pesada y leosa.

4. En ocasiones formados por varios sombreros unidos en una gran masa o solitarios.
5. Tienen superficies contrastantes (castao opaco o laqueado en la parte superior y
blanca a amarillenta en la inferior) con el rea himenial repleta de pequeos poros.

11.2 Biotecnologa de hongos

La biotecnologa se define como la aplicacin de organismos vivos como por ejemplo
los hongos y sus componentes subcelulares, dentro de procesos tecnolgicos que puedan
ser empleados en servicios de manufacturacin industrial y desarrollo ambiental, entre otras
aplicaciones. El manejo exitoso de los procesos biotecnolgicos asociados con los hongos
es llevado a cabo a travs de la combinacin e integracin de un nmero de disciplinas
cientficas y tecnolgicas, que incluye la microbiologa, la bioqumica y la qumica.
As, los procesos biotecnolgicos, en donde se utilizan por ejemplo los hongos,
normalmente involucran la produccin exitosa de productos bioqumicos del metabolismo
intermedio tales como enzimas, vitaminas, aminocidos, alcoholes, purinas y pirimidinas,
lpidos, polisacridos, as como productos del metabolismo secundario (Figura 6), tales como
antibiticos como la a) penicilina G, agentes inmunosupresores como la b) ciclosporina A,
agentes hipocolestermicos como la c) lovastatin y d) pravastatina, agentes antitumorales
como el e) taxol, micotoxinas, pigmentos como la f) monascorubrina y g) rubropunctatina,
cidos grasos poliinsaturados como el h) cido araquidnico (Adrio y Demain, 2003).

a)

b)

c)

17

d)

e)

g)

f)

h)

Figura 5. Metabolitos secundarios de hongos: a) penicilina G, b) ciclosporina A, c) lovastatina, d) pravastatina,

e) taxol, f) monascorubrina, g) rubropunctatina, h) cido araquidnico.

11.3 Caractersticas de los hongos

Tradicionalmente, los hongos y otros eucariotas afines fueron clasificados como un
subreino dentro del reino Plantae, en las divisiones: Myxomycota (para las formas
plasmodiales) o Eumycota (para las formas miceliales); sin embargo, actualmente se sabe
que los hongos no slo no son vegetales sin clorofila (como se crea antes), sino que de
hecho son ms cercanos a los animales que a las plantas, y se les reconoce como parte de
un reino en s mismo (Zakaria et al, 2009).
Actualmente, se emplea el trmino hongo (lat. Fungus, del gr. Sphongos: esponja)
para designar un grupo vasto y variado de organismos que constituyen el reino Fungi, uno de
los seis reinos de organismos vivientes, introducido como tal por Jahn y Jahn en 1949 y
posteriormente por Whittaker en 1959 (Ryvarden y Gilbertson , 1993).
Estos organismos tienen las siguientes caractersticas (Chen, 1993):
18

1. Eucariontes.
2. Hetertrofos.
3. Reproduccin sexual o asexual.
4. La mayora de ellos son mesfilos (15 a 30 C).
5. Crecen en pH que van de 3 a 7.
6. Respiracin aerobia aunque pueden ser anaerobios facultativos.
Taxonmicamente, solo se considera como parte del reino Fungi a los organismos
incluidos dentro de las divisiones Ascomycota, Basidiomycota, Chytridiomycota y
Zygomycota, ya que las divisiones Myxomycota, Dictyosteliomycota y Oomycota, si bien
siguen siendo estudiadas por los miclogos, han sido excluidas del reino por tener distintos
orgenes filogenticos. Por su parte, la clasificacin de los hifomicetes (mal llamados hongos
imperfectos), en base al sistema de Saccardo, si bien se sigue utilizando a nivel tcnico, se
considera inadecuada desde el punto de vista taxonmico (Castaeda Ruz, 2001).
Se estima que existen cerca de 140 000 especies de hongos macroscpicos en
nuestro planeta, de las cuales apenas han sido estudiadas entre 14 000 y 22 000, es decir
aproximadamente el diez por ciento (Lindequist et al, 2005). De estas 14 000 especies
conocidas de hongos macroscpicos cerca de la mitad es comestible en diversos grados,
mientras que al menos 700 especies tienen propiedades farmacolgicas reconocidas (Lull et
al, 2005). La presencia de metabolitos tiles producidos por hongos macroscpicos se
encuentra ampliamente documentada (Wasser y Weis, 1999). Tan slo dentro del grupo de
los hongos Polyporales (previamente conocidos como aphylloporales o poliporceos, y al
cual pertenecen los hongos del gnero Ganoderma), el 75% de las especies estudiadas han
mostrado poseer actividad biolgica; ya sea antimicrobiana, antiviral, inmunomodulatoria,
analgsica, antidiabtica, antioxidante, citotxica y/o antineoplsica (Zjawiony, 2004).

11.4 Requerimientos nutrimentales

Los hongos como organismos quimiohetertrofos estrictos, son incapaces de
fotosintetizar y por consiguiente necesitan sustratos ricos en carbohidratos para alcanzar sus
requerimientos de energa y biomasa. Estos producen una amplia variedad de enzimas
extracelulares, principalmente oxidasas e hidrolasas que degradan la mayor parte de los
19

sustratos orgnicos que existen naturalmente, incluyendo la celulosa, la quitina, el almidn,

azcares, hemicelulosas y lignina (Wainwright, 1995).
Los hongos generalmente crecen en el laboratorio sobre medios definidos que
contienen azcares, como glucosa y sacarosa o sobre polmeros, como celulosa. El
nitrgeno inorgnico generalmente se suministra a los medios en forma de amonio, nitrato,
amidas o aminocidos. En algunos procesos de fermentacin industrial tambin pueden
utilizarse fuentes de nitrgeno orgnicas tales como extracto de levadura, peptona o casena
(Fang y Zhong, 2002). Otros nutrientes minerales importantes requeridos por los hongos
para un mximo rendimiento incluyen al Fsforo, Azufre, Potasio y Magnesio. Tambin son
necesarios para el funcionamiento de las enzimas en condiciones de crecimiento rpido,
nutrientes menores como el Zinc, Cobre, Molibdeno y vitaminas (Wainwright, 1995). Los
principales nutrimentos para los hongos se resumen y clasifican en la Tabla 1.
Tabla 1. Principales componentes de los medios de cultivos para hongos.

Macronutrientes
Carbono
Hidrgeno
Oxgeno
Nitrgeno
Fsforo
Azufre
Calcio
Hierro

Micronutrientes
Cromo
Cobalto
Cobre
Manganeso
Molibdeno
Nquel
Selenio
Tungsteno
Vanadio

Fuente: Mendoza, 2006

11.5 Tipos de cultivo

En el laboratorio los hongos se desarrollan en dos tipos de cultivo:
Cultivo lquido. Se puede definir como un cultivo de clulas microbianas dispersas
en forma homognea en un recipiente agitado que puede o no ser aireado por medios
mecnicos. El cultivo lquido ms usado en los laboratorios de investigacin es el matraz
agitado, cuyo desarrollo ha sido importante, debido a que ha permitido el cultivo de
organismos aerbicos en condiciones homogneas, con una densidad moderada de la
20

biomasa, lo que ha simplificado el estudio de la fisiologa de los organismos (Henzler y

Schedel, 1991).
Cultivo slido. Puede ser definido como un cultivo de microorganismos adheridos a
un soporte slido liso como el agar, o poroso y humedecido, en el cual el medio lquido est
extendido en una capa muy fina en contacto con una interfase area, como por ejemplo la
espuma de poliuretano (PUF, un material inerte), o sobre sustratos naturales como granos de
arroz, trigo, etc., (Romero, 2001).

a)

b)

Figura 6. Tipos de cultivo para desarrollo micelial de hongos. a) Cultivo lquido, b) Cultivo slido.

11.6 Cintica de crecimiento

El crecimiento, en un sentido estricto, puede ser definido como un incremento
balanceado en el nmero de clulas o formacin de biomasa con respecto al tiempo. La
cintica de crecimiento (Figura 8), es graficada como el logaritmo del nmero de clulas o
peso seco con respecto al tiempo. Conformada por una fase de latencia o de adaptacin,
seguida de una fase de crecimiento exponencial o logartmica, una fase estacionaria y una
fase de muerte celular. Esta cintica es tpica de un cultivo y se utiliza comnmente, ya que
reproduce las condiciones bajo las cuales varios hongos crecen (Deacon, 1998).

21

c)
d)
Log del nmero de clulas o Peso seco
b)

a)
Tiempo
Figura 7. Cintica de crecimiento tpica de los microorganismos; a) fase de latencia o de adaptacin; b) fase de
crecimiento exponencial o logartmica; c) fase estacionaria; d) fase de muerte celular.

Ahora bien, el crecimiento no solo trae como consecuencia la proliferacin celular

sino tambin una actividad metablica. Si se considera la actividad metablica de un cultivo
microbiano a lo largo de toda la curva de crecimiento, se observa la diferencia que existe
entre los procesos metablicos asociados al crecimiento celular y aquellos que tienen lugar
en la fase estacionaria (Espinoza, 2008). La fase en la cual el organismo crece recibe el
nombre de tropofase, mientras que aquella en la cual la produccin de metabolitos
secundarios es mayor, recibe el nombre de idiofase (Demain, 1986.).

11.7 Metabolismo de los hongos

El mayor factor asociado con el xito biolgico de los hongos es su metabolismo,
llevndose a dos niveles, el metabolismo primario y el metabolismo secundario (Len,
2005.).
Metabolismo primario. Es el conjunto de procesos qumicos que consiste en la
utilizacin de nutrimentos para la produccin de compuestos involucrados en la generacin
de energa y la construccin de partes de la estructura celular, as como su reproduccin y
funciones fisiolgicas, caracterizado por su amplia distribucin en todas las formas de vida.
En las clulas fngicas se producen algunos bloques biosintticos, los cuales estn
22

conformados por compuestos tales como la acetil CoA, la malonil CoA, el piruvato y el
acetoglutarato, as como ciertos cofactores, como ATP/ADP, NADH/NAD y NADPH/NADP.
Colectivamente, dichos compuestos intermediarios constituyen el sustrato para la vasta
diversidad de metabolitos secundarios (Turner, 1971).
Metabolismo secundario. Que implica la existencia de un proceso diferente y
distinto del primario, siendo ms activo cuando se restringe el crecimiento normal, es decir,
en la fase estacionaria. Estos compuestos no son necesarios para la biosntesis celular y no
tienen, por tanto, un papel directo en el metabolismo energtico y en consecuencia, no se
conoce con claridad la razn de su existencia, ni de su aparicin (Arora et al, 1992. ).
Cabe sealar que si bien en condiciones ideales la tropofase y la idiofase deberan
ocurrir en momentos separados de un cultivo en lotes, en la prctica es muy frecuente que el
final de la tropofase y el inicio de la idiofase ocurran simultneamente, por lo que no se
recomienda definir a un metabolito secundario exclusivamente en base a su momento de
produccin. Por otra parte, tampoco es posible distinguir a los metabolitos secundarios de los
primarios a partir de su estructura qumica u origen biosinttico (Croteau et al , 2000).
Los hongos pueden producir una extensa variedad de metabolitos secundarios, los
cuales se caracterizan por la complejidad y diversidad de sus estructuras; la mayor parte son
polimerizaciones de unidades simples de construccin, tales como acetato, azcares,
aminocidos, nucletidos o una combinacin de estos (Trigos, 2000). Las principales vas de
los metabolitos secundarios son (Turner, 1971):
a) Metabolitos secundarios derivados de intermediarios del cido tricarboxlico.
b) Metabolitos secundarios derivados de la intervencin de acetato.
c) Metabolitos secundarios derivados de cidos grasos.
d) Metabolitos secundarios derivados de aminocidos.
e) Polictidos.
f)

Terpenos y esteroides.

g) Miscelneos.

23

11.8 Cultivo micelial de especies de Ganoderma

Muchos de los productos comerciales derivados de los carpforos de Ganoderma,
recientemente han sido obtenidos por tcnicas de cultivo micelial, ya que tanto los cultivos
lquidos como slidos son una alternativa para la produccin de metabolitos de hongos
superiores y tienen ventajas sobre el cultivo tradicional de los carpforos. Entre las ventajas,
tenemos el tiempo de obtencin de productos de inters que va de 2 a 3 semanas en cultivos
miceliales a diferencia de los 3 a 5 meses que lleva el cultivo tradicional de los carpforos,
por otro lado, las tcnicas tradicionales no garantizan una estandarizacin en los productos
ya que la composicin del sustrato, puede afectar la composicin de los carpforos, en
cambio el cultivo micelial tiene la gran ventaja de adicionar al cultivo diferentes nutrimentos
y/o variar sus concentraciones, para optimizar su crecimiento micelial y la obtencin de
productos de inters (Russell y Paterson, 2006).
Al igual que en el caso de los estudios qumicos y farmacolgicos, la mayor parte de
las investigaciones acerca del cultivo de los carpforos y del cultivo micelial lquido y slido
de hongos del gnero Ganoderma reportan haber trabajado con G. lucidum (Yang y Liau,
1998).
En los cultivos slidos para la obtencin de carpforos generalmente se emplean
granos, aserrn o madera y pueden ser suplementados con salvado de arroz, cscara de
arroz, fibra de coco, cscara de man, maz, sorgo y bagazo de caa de azcar (Hafiz et al,
2007). La composicin indefinida de estos sustratos hacen que la composicin qumica de
los carpforos vare dependiendo del sustrato empleado para su cultivo (Peksen y
Yakupoglu, 2009).
En el caso del cultivo lquido diversos trabajos han abordado el estudio de las
distintas condiciones en la produccin de biomasa, cidos ganodricos o polisacridos. Entre
las investigaciones ms relevantes al respecto, podemos destacar los siguientes: la de Yang
y Liau (1998) que estudiaron el efecto de la temperatura, el pH y la agitacin en el
crecimiento micelial de un cultivo sumergido en lotes, de una cepa de G. lucidum.
De acuerdo con estos autores, la mxima concentracin micelial (aproximadamente
350mg/ 100 ml), se alcanz a una temperatura de entre 30C y 35C, a un pH de 4 y a una
24

agitacin de 100 rpm. Por otro lado, Tang y Zhong (2002) estudiaron la produccin de
exopolisacridos en un cultivo de G. lucidum en un biorreactor por lotes alimentados,
empleando lactosa como fuente de carbono. El uso de lactosa, indujo la actividad galactosidadasa y -fosfoglucomutasa de los extractos celulares frescos del hongo. El
mximo de densidad celular alcanzado en este estudio fue de 22 g/L, mientras que la
produccin de exopolisacridos lleg a ser de 1.25 g/L. As, Fang y Zhong (2002),
desarrollaron una tcnica de cultivo lquido de G. lucidum, para incrementar la produccin de
derivados oxigenados del lanosterol, la cual es considerada hasta el da de hoy como el
mejor mtodo de produccin de cidos ganodricos (Xu et al, 2010). Dicho proceso consiste
en cultivar el micelio en matraces Erlenmeyer en agitacin rotatoria durante cuatro das y
posteriormente dejar el cultivo esttico durante ocho das ms, lo cual disminuye el oxgeno
disuelto en el caldo de cultivo, incrementa el tamao de pellet del hongo y produce una
cantidad hasta tres veces mayor de cidos ganodricos que el cultivo con agitacin continua
(Fang y Zhong, 2002).
Yang y colaboradores (2004), demostraron que la adicin de etanol al 1.5% (v/v)
aumentaba el crecimiento micelial de una cepa de G. lucidum, mientras que la adicin de
etanol al 2%, incrementaba su produccin de polisacridos. Por su parte, Liu y Zhang (2007),
mejoraron la produccin tanto de biomasa como de polisacridos, agregando el extracto en
acetato de etilo de los insectos medicinales Eupolyphaga sinensis y Catharsius molossus. La
produccin de biomasa y exopolisacridos tambin demostr ser afectada positivamente por
la adicin de aceite de maz al 2%, alcanzando 12.9 g/L 130 y 1.038 g/L respectivamente,
durante 13 das de cultivo sumergido (Huang et al, 2008).
Los estudios de cultivo micelial son realizados tanto en matraces Erlenmeyer como
en birreactores, todos ellos con diferentes objetivos, como lo es la produccin de biomasa,
maximizar la produccin de cidos ganodricos o polisacridos.
En la Tabla 2 se muestran algunos de los medios ms empleados en el cultivo de
especies de Ganoderma.

25

Tabla 2. Medios de cultivo utilizados para especies de Ganoderma

Especie
G. australe
G. adspersum

G. lucidum

G. lucidum

G. lucidum

G. lucidum

Nutrimentos
Extracto de malta
2%
Peptona de soya
0.5%
Glucosa
Peptona
KH2PO4
MgSO47H2O
Extr. Levadura
Glucosa
Peptona
KH2PO4
MgSO47H2O
Extr. Maz
Suero de leche

10 g/L
2 g/L
0.8 g/L
0.25 g/L
1 g/L
10 g/L
3 g/L
1 g/L
0.25 g/L
2 g/L
57.1 g/L

Sacarosa
Peptona
Extr. Levadura
KH2PO4
MgSO47H2O
Vitamina B1
Glucosa
KH2PO4
KH2PO4
MgSO47H2O
Extr. Levadura
NH4Cl

35 g/L
5 g/L
2.5 g/L
1 g/L
0.5 g/L
0.05 g/L
50 g/L
0.5 g/L
0.5 g/L
0.5 g/L
1 g/L
4 g/L

Condiciones
M. Erlenmeyer
27C
15 das
M. Erlenmeyer
pH 6.0
26C
140 rpm
14 das
M. Erlenmeyer
pH 4.0-6.0
25-30C
100 rpm
8 das
Fermentador
pH 4.2
28.3 C
168 horas
M. Erlenmeyer
pH 5.5
30 C
120 rpm
12 das
M. Erlenmeyer
pH 4.0
30-35 C
100 rpm
14 das

Metabolitos
Lacasa
Lacasa

Polisacridos

Polisacridos

cidos
ganodricos

Biomasa

Fuente: Mendoza, 2006

11.9 Metabolitos aislados del cultivo micelial de Ganoderma

Cabe hacer notar que las distintas especies del gnero Ganoderma, cada cepa en
particular produce distintos metabolitos (Shiao, 1989). Lo que es ms, los triterpenos
producidos en cultivos miceliales no suelen ser los mismos que se producen en los
carpforos (Lorenzen y Anke, 1998), lo cual sugiere la importancia de estudiar la produccin
de metabolitos en ambas fases del desarrollo del hongo. En Tabla 3, se compara la
produccin de triterpenos en carpforos y micelio de G. lucidum.

26

Tabla 3. Comparacin de los metabolitos identificados en carpforos y micelio de G. lucidum.

Carpforos

Micelio

1. cido ganodrico (cido 7,15-dihidroxi3,11,23-trioxo-5-lanost-8-en-26-ico)

2. cido ganodrico B
3. cido ganodrico C1 (cido 7-hidroxi3,11,15,23-tetraoxo-5-lanost-8-en-26-ico)

1. cido ganodrico Ma (cido 3,7diacetoxi-15-lanosta-8,24E--dien-26-ico)

2. cido ganodrico Mb (cido 3,15,22triacetoxi-7-hidroxi-5-lanosta-8,24E--dien26-ico)

4. cido ganodrico C2 (cido 3,7,15trihidroxi - 11, 23 dioxo - 5 lanost 8 en

-26- ico)
5. cido ganodrico D (cido 7,12, dihidroxi3,11,15,23- tetraoxo-5- lanost-8- en- 26 - ico)
6. cido ganodrico F (cido 3,7,11,15,23pentaoxo 12 acetoxi - 5 lanost 8 en
-26-ico)
7. cido ganodrico H (cido 3-hidroxi7,11,15,23-tetraoxo-12-acetoxi-5-lanost-8en-26-ico)
8. cido ganodrico J
9. cido ganodrico K (cido 3,15-dihidroxi7,11,23-trioxo-5-lanost-8-en-26-ico)
10. cido ganodrico L (cido 3,7,15,20tetrahidroxi-11,23-dioxo-5-lanost-8-en-26ico)
11. Compuesto B8 (cido 7,15-dihidroxi3,11,23-trioxo-5-lanost-8-en-26-ico)
12. Compuesto B9 (cido 3,7,15- trihidroxi11, 23 dioxo - 5 lanost 8 en 26 ico)
13. cido ganodrico M (cido 7,12dihidroxi-3,11,15,23-tetraoxo-5-lanost-8-en26-ico)
14. cido ganodrico N (cido 7, 20dihidroxi-3,11,15,23-tetraoxo-5-lanost-8-en26-ico)
15. cido ganodrico O (cido 20-hidroxi3,7,11,15,23-pentaoxo-5-lanost-8-en-26-ico)
16. Ganoderiol A (5-lanost-7,9(11)-dien3,24,25,25-tetraol)
17. cido ganodrico Y (cido 3-hidroxi-5lanost-7,9(11),24-tien-26-ico)
18. Ganoderiol B (15,26,27-trihidroxi-5lanost-7,9(11),24-trien-3-ona)
19. Ganoderiol C
20. Ganoderiol D
21. Ganoderiol E
22. Ganoderiol F
23. Ganoderiol G
24. Ganoderiol H

3. cido ganodrico Mc (cido 3,7,22triacetoxi-15-hidroxi-5-lanosta-8,24E--dien26-ico)

4. cido ganodrico Md (cido 3,22-diacetoxi7-metoxi-5-lanosta-8,24E--dien-26-ico)
5. cido ganodrico Me (cido 3,15diacetoxi-5-lanosta-7,9(11),24E--trien-26-ico)
6. cido ganodrico Mf (cido 3-acetoxi-15hidroxi-5-lanosta-7,9(11),24E--trien-26-ico)
7. cido ganodrico Mg (cido 3.22-diacetoxi15-hidroxi-7-metoxi-5-lanosta-8,24E--trien26-ico)
8. cido ganodrico Mh (cido 3,22-diacetoxi7,15-hidroxi-5-lanosta-8,24E--trien-26-ico)
9. cido ganodrico Mi (cido 3-acetoxi-7metoxi-5-lanosta-8,24E--dien-26-ico)
10. cido ganodrico Mj (cido 22-acetoxi-3hidroxi-7-metoxi-5-lanosta-8,24E--dien-26ico)
11. cido ganodrico Mk (cido 3,22diacetoxi-15-hidroxi-5-lanosta-7,9(11),24E-trien-26-ico)
12. cido ganodrico R (cido (22S,24E)3,22-diacetoxi-5-lanosta-7,9(11),24E--trien26-ico)
13. cido ganodrico S (cido (22S,24E)-22acetoxi-3-hidroxi-5-lanosta-7,9(11),24E-trien-26-ico)
14. cido ganodrico T (cido (22S,24E)3,15,22-triacetoxi-5-lanosta-7,9(11),24-trien-26-ico)
15. cido ganodrico U
16. cido ganodrico W
17. cido ganodrico Z
18. cido ganodrico R (cido lanosta7,9(11),24-tien-3,15-diacetoxi-26-ico)

27

25. Ganoderiol I
Fuente: Cole y Schweikert, 2003.

12. Definicin de la Metodologa

A continuacin se muestra el diagrama de flujo con los pasos de la estrategia
experimental a seguir para llevar a cabo el cultivo micelial masivo de las cepas de
Ganoderma.

Colecta de muestras

Identificacin taxonmica de la cepa

Aislamiento micelial en PDA

Aislamiento micelial en tubo inclinado

Condiciones del cultivo micelial masivo

Cultivo micelial masivo

Figura 8. Diagrama de los pasos a seguir para el cultivo micelial masivo de cepas de Ganoderma.

12.1 Recoleccin de los ejemplares de Ganoderma

Los carpforos se recolectaron en la regin central montaosa del estado de
Veracruz y se llevaron a LATEX, S.C., en el rea de Estudios Especiales se llev a cabo su
anlisis morfolgico y as determinar si correspondan al gnero Ganoderma. Posteriormente
se les asign una clave compuesta de dos letras: G (que indica el gnero Ganoderma) y L
28

(que indica el nombre de LATEX), as como un nmero que corresponde al orden en que se
reciba el carpforo.

12.2 Aislamiento micelial de las cepas de Ganoderma

Los carpforos se lavaron con agua destilada y se realizaron secciones delgadas con
navajas estriles en lminas de aproximadamente 1 mm de grosor, que fueron desinfectadas
con hipoclorito de sodio al 2 % y agua destilada y colocados en cajas Petri con agar papa
dextrosa (PDA). Los cultivos se incubaron a 28 C durante 10 das para inducir el desarrollo
micelial. Las cepas se resguardaron en el cepario de LATEX.

12.3 Cultivo en tubo inclinado

Una vez que se tuvo el cultivo micelial en caja Petri utilizando medio PDA se procedi
al cultivo de las cepas en tubo inclinado utilizando el mismo medio de cultivo, esto se realiz
con la finalidad de tener un resguardo seguro en el cepario de LATEX de cada una de las
muestras recolectadas, cada cepa de Ganoderma se sembr en tubo inclinado por triplicado
y se incubaron a 28 C durante el tiempo necesario para el desarrollo micelial y hasta su uso
se mantuvieron en refrigeracin.

12.4 Preparacin del preinculo

Transcurrido el periodo de incubacin se cortaron con una aguja de diseccin cuadros
de agar con micelio de aproximadamente 1 cm 2, con los que se inocularon dos matraces
Erlenmeyer de 250 ml por cada cepa, conteniendo cada uno 50 ml de medio Fang y Zhong
(Ver apndice 13.1.1.). Los matraces fueron incubados en un agitador de matraces (Marca:
LABLINE, Modelo: 2527) a una temperatura de 28 C 2 a 115 rpm durante 10 das. El
cuarto de agitacin se mantuvo en ausencia de luz.

12.5 Preparacin del inculo

Concluido el periodo de incubacin de los preinculos, se fragment el micelio del
hongo con un homogeneizador manual y la suspensin micelial resultante se utiliz para
inocular los distintos cultivos.
29

12.6 Cultivo masivo

Para cada cepa se trabaj con un total de 11 matraces Erlenmeyer de 1000 ml,
conteniendo cada uno 100 ml de medio, los matraces fueron inoculados con 3 ml de
suspensin del preinculo correspondiente Se incubaron a 28 2 C, los primeros 7 das en
agitacin a 115 rpm en un agitador de matraces y el resto del cultivo fue esttico en ausencia
de luz.

13. Resultados
Para llevar a cabo este proyecto se recolectaron 22 carpforos en la regin
montaosa del Estado de Veracruz, de estos slo se pudo tener cultivo micelial en medio
PDA de 16 cepas con las cuales se trabaj para tener su cultivo en tubo inclinado,
preinculos e inculos.
Las 6 que no se pudieron cultivar se descartaron por completo del trabajo, ya que
debido a problemas de contaminacin bacteriana o nulo crecimiento no se pudieron aislar.

13.1 Localizacin de los ejemplares de Ganoderma

Los carpforos de las especies de Ganoderma en estudio se colectaron durante los
meses de septiembre, octubre y noviembre de 2013, de troncos y races superficiales de
rboles tanto vivos como muertos localizados en los Municipios de Xalapa Enrquez, Las
Vigas de Ramrez y Tlapacoyan, Veracruz.

13.2 Aislamiento micelial delas cepas de Ganoderma

La propagacin de las 16 cepas in vitro, permiti el desarrollo micelial de los
Ganoderma, con formacin de micelio de color blanco, superficial, de consistencia dura y
apariencia seca, que conforme se desarrolla adquiere tonos amarillos y ausente de
clamidosporas (Bazzalo y Wright, 1982).
30

13.3 Determinacin del medio y tipo de cultivo para la produccin de biomasa

La mayor produccin de biomasa se obtuvo en los cultivos lquidos en comparacin
con los slidos, destacando de manera importante cuando se emple el medio lquido de
Fang y Zhong (2002) comparado con el medio agar papa dextrosa (PDA). Este medio en
cultivo lquido de dos etapas desarrollado por estos mismos autores fue un gran productor de
biomasa. Cabe mencionar que este procedimiento es la tcnica de eleccin para la
produccin de cidos ganodricos.
En el desarrollo del cultivo ocurrieron dos etapas, la primera con agitacin que
permiti la formacin de pellets y la segunda esttica que increment el tamao del pellet y
ocasion la formacin de una capa gruesa de micelio en la superficie lquida.
En trminos generales, se considera que el incremento en el tamao del pellet y la
formacin de una capa gruesa de micelio en la superficie lquida son limitantes de oxgeno
en el cultivo lo que promueve la sntesis de cidos ganodricos (Wagner et al, 2003).
Aparentemente, el incremento en la produccin de cidos ganodricos durante el
cultivo esttico, se debe al efecto de la limitacin de oxgeno sobre la expresin de la enzima
escualeno sintetasa (Xu et al, 2009).
En la Tabla 4 se resume un listado de las cepas de Ganoderma aisladas as como se
muestra a detalle su origen y las tcnicas aplicadas para su conservacin.

Tabla 4. Cepas de Ganoderma aisladas y preservadas.

Cepa
GL-02
GL-03

Origen
Xalapa Enrquez,
Ver.
Xalapa Enrquez,
Ver.

Sustrato
Tocn*
Pinus
sylvestris

Cultivo
PDA
(Caja
Petri)

Cultivo
PDA (tubo
inclinado)

Pre
inculo

Inculo

31

GL-05
GL-06
GL-07
GL-08
GL-09
GL-10
GL-12
GL-13
GL-14
GL-15
GL-16
GL-18
GL-19
GL-22

El Encanto,
Tlapacoyan, Ver.
El Encanto,
Tlapacoyan, Ver.
El Encanto,
Tlapacoyan, Ver.
Las Vigas de
Ramrez, Ver.
Las Vigas de
Ramrez, Ver.
Las Vigas de
Ramrez, Ver.
El Encanto,
Tlapacoyan, Ver.
El Encanto,
Tlapacoyan, Ver.
Las Vigas de
Ramrez, Ver.
Xalapa Enrquez,
Ver.
Xalapa Enrquez,
Ver.
Xalapa Enrquez,
Ver.
Xalapa Enrquez,
Ver.
Xalapa Enrquez,
Ver.

Tocn
Tocn
Gliricidia
sepium
Tocn
Delonix regia
Pinus
sylvestris
Tocn
Tocn
Tocn
Tocn
Pinus
sylvestris
Tocn
Tocn
Tocn

* Parte del tronco de un rbol que queda unida a la raz cuando lo cortan por el pie, en este caso se usa para
referirse a un rbol muerto.

A continuacin se muestra una serie de fotografas de las 16 cepas de Ganoderma

aisladas. La primera imagen corresponde al carpforo al ser encontrado por el analista en su
hbitat natural y antes de ser extrado para llevarlo a LATEX, la segunda imagen pertenece a
la cepa en medio PDA en caja Petri con crecimiento micelial, la tercera es el cultivo en medio
PDA pero en tubo inclinado para la conservacin de las cepas y la cuarta imagen es el
preinculo de cada cepa.

32

Figura 9. Cepa GL-02. Carpforo, micelio en medio PDA y preinculo en medio lquido.

Figura 10. Cepa GL-03. Carpforo, micelio en medio PDA y preinculo en medio lquido.

33

Figura 11. Cepa GL-05. Carpforo, micelio en medio PDA y preinculo en medio lquido.

Figura 12. Cepa GL-06. Carpforo, micelio en medio PDA y preinculo en medio lquido.

Figura 13. Cepa GL-07. Carpforo, micelio en medio PDA.

La cepa GL-07 slo se tiene en cultivo slido PDA debido a que su crecimiento
micelial ha sido muy lento comparado con el de los dems carpforos.

34

Figura 14. Cepa GL-08. Carpforo, micelio en medio PDA y preinculo en medio lquido.

Figura 15. Cepa GL-09. Carpforo, micelio en medio PDA y preinculo en medio lquido.

Figura 16. Cepa GL-10. Carpforo, micelio en medio PDA y preinculo en medio lquido.

35

Figura 17. Cepa GL-12. Carpforo, micelio en medio PDA y preinculo en medio lquido.

Figura 18. Cepa GL-13. Carpforo, micelio en medio PDA y preinculo en medio lquido.

Figura 19. Cepa GL-14. Carpforo, micelio en medio PDA y preinculo en medio lquido.

36

Figura 20. Cepa GL-15. Carpforo, micelio en medio PDA y preinculo en medio lquido.

Figura 21. CepaGL-16. Carpforo, micelio en medio PDA y preinculo en medio lquido.

Figura 22. Cepa GL-18. Carpforo, micelio en medio PDA y preinculo en medio lquido.

37

Figura 23. Cepa GL-19. Carpforo, micelio en medio PDA y preinculo en medio lquido.

Figura 24. Cepa GL-22. Carpforo, micelio en medio PDA y preinculo en medio lquido.

13.4 Cultivo micelial masivo de las cepas de Ganoderma

Con todos los datos anteriores se realiz el cultivo micelial masivo de las cepas de
Ganoderma, el cual fue en cultivo lquido, empleando 1.1 L de medio de Fang y Zhong
(2002) (por cada cepa) a 14 das de incubacin (7 en agitacin a 115 rpm y 7 esttico) a 28
2C, en completa oscuridad.

38

Figura 25. Cultivo micelial masivo de las cepas de Ganoderma en medio lquido a 7 das (fase de agitacin).

Figura 26. Cultivo micelial masivo de las cepas de Ganoderma en medio lquido a 14 das (fase esttica).

39

14. Conclusiones y Recomendaciones

Con este trabajo no se pretende justificar la depredacin de hongos Ganoderma, sino
dar a conocer, sus posibles aplicaciones teraputicas para un futuro aprovechamiento
racional. No obstante, el manejo biotecnolgico, a travs del cultivo micelial, mostr nuevas
posibilidades al encontrar diferencias sutiles entre micelios procedentes de los carpforos
cultivados lo cual supone tambin la obtencin de metabolitos secundarios diversos. Dichas
diferencias podran ampliar el espectro de accin de Ganoderma, para el tratamiento de
diversas enfermedades. Por lo que se tienen las siguientes recomendaciones:
En primer lugar, ser de sumo inters realizar un estudio ecolgico y taxonmico
profundo a fin de conocer los diferentes tipos de Ganoderma existentes en Mxico.
Adems, ser necesario continuar con estudios biolgicos, farmacolgicos y
toxicolgicos de los metabolitos que se aislarn para su utilizacin nutracutica y medicinal.
Por ltimo, se recomienda, realizar otros estudios qumico-biolgicos, tanto de los
carpforos como del cultivo micelial de las especies encontradas.

40

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16.Apndice
16.1 Medios de cultivo
16.1.1 Medio de Fang y Zhong (2002)
Tabla 5. Composicin del medio de Fang y Zhong (2002)

Aditivos
Sacarosa
Peptona
Extracto de levadura
KH2PO4H2O
MgSO47H2O
Vitamina B1 (Tiamina)

Concentracin
35 g/L
5 g/L
2.5 g/L
1 g/L
0.5 g/L
0.05 g/L

16.1.2 Medio agar papa dextrosa (PDA)

Tabla 6. Composicin del medio slido PDA

Aditivos
PDA

Concentracin
39 g/L
44

17.Anexos

45

46

47

48