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GUA BSICA DE USO DEL

MICROSCOPIO CONFOCAL
LSM 5 DE ZEISS
Dra. Anglica Zepeda R.
Responsable Acadmico de la Unidad de Microscopa
Instituto de Investigaciones Biomdicas
Universidad Nacional Autnoma de Mxico
Fecha de elaboracin: Enero del 2009
1 revisin: Abril del 2010

Esta gua describe la operacin bsica del microscopio confocal LSM 5 para
observacin de tejido o clulas montadas en vidrio e inmunohistoqumicamente
procesadas (marcaje fluorescente de uno, dos y tres fluorforos).
Este manual pretende cubrir todos los aspectos bsicos de adquisicin de imgenes. Sin
embargo, si se requiere informacin mas precisa que no se incluya en la gua, se podr
solicitar asistencia tanto a la Tcnica, como al Investigador Acadmico responsable de
la Unidad para recibir asesora individual.
Contactos:

Tcnico Responsable LIIB. Miguel Tapia


Cubculo C003, Planta Baja, Torre C. Sede Circuito Exterior.
Tel. 5622-9185
Investigador Responsable Dra. Anglica Zepeda R.
Cubculo C211, 2 piso, Torre C. Sede Circuito Exterior.
Tel. 5622-8222 ext. 46811

SOFTWARE
El software LSM 5 PASCAL, Versin 2.8 controla el microscopio, los lseres, el
mdulo de escaneo, el proceso de adquisicin, las herramientas de adquisicin y el
despliegue de las imgenes.
El software del microscopio confocal cuenta con tres lseres de un fotn (Ar, HeNe
543 y HeNe 633) que permiten al usuario seleccionar entre longitudes de excitacin de
458, 488, 514, 543 y 633nm, y el software LSM (propio de Zeiss) provee diversas
funciones para la adquisicin de imgenes, que incluye la adquisicin con diferentes
resoluciones de imgenes en 2D y 3D (x, y, z).
El software se puede operar empleando el mouse y el teclado de la computadora y se
usan de la misma manera en la que opera WINDOWS.

MICROSCOPIO
El microscopio cuenta con los siguientes juegos de filtros para observar las muestras
empleando la lmpara de mercurio:
1) Filtro FITC
Pase de banda de excitacin: 450-490nm
Espejo Dicrico: FT 510
Emisin:
LP 515
2) Filtro DAPI (Las muestras marcadas con DAPI solo se podrn observar al
microscopio, no con el sistema confocal)
Pase de banda de excitacin: 365nm
Espejo Dicrico: FT 395
Emisin:
LP 397
3) Filtro Rodamina
Pase de banda de excitacin: 546nm
Espejo Dicrico: FT 580
Emisin:
LP 590

ENCENDIDO DEL EQUIPO

1. Prender el equipo (conformado por el CPU, monitor, lseres, microscopio y,


multi-punto) por medio de los 2 interruptores que se encuentran detrs de la
puerta de entrada del cuarto del microscopio (a la izquierda del microscopio).
Ambos interruptores debern estar en posicin I/ON.
2. En caso de que el microscopio se este en posicin de apagado, prenderlo por
medio del botn verde que se encuentra al lado derecho del estativo.
3. En caso de que la computadora est apagada, prender el CPU.
4. Una vez encendida la computadora, esperar a que inicie el sistema operativo
Windows.
a. Aparecer la ventana Begin logon. Presionar simultneamente la
combinacin de teclas Ctrl+Alt+Del
b. Aparecer la ventana Service Control Manager. Esta ventana no se
puede desplazar, solo presione ENTER
c. Aparecer la ventana Logon information. Presionar la tecla OK
cuando se le solicite el usename / password (no teclear nada en los
campos). El username predeterminado es: administrador
d. Aparecern dos ventanas simultaneas:
i. en Enter network password, ingresar la palabra confocal.123
seguido de la tecla Enter. Esta ventana reaparece, volver a
ingresar la palabra confocal.123 seguido de la tecla Enter.
ii. la segunda ventana desaparecer al ingresar el password anterior.
Con esto se actualizar la red interna del Instituto y podr guardar los datos
adquiridos en unidad de red correspondiente (X para la Sede de Circuito Escolar; W
para la Sede de Circuito Exterior) al trmino de la sesin.
5. Haga doble click en el cono PASCAL para iniciar el software que opera el
confocal y aparecer el panel de operacin LSM 5 Pascal Switchboard.
Presione el cono Online mode (en caso de que no est presionado) y despus
el botn Start. Si presiona Offline mode o trabaja en esta modalidad, las
funciones del sistema operativo no estarn disponibles y no podr hacer
adquisicin de imgenes.

6. Se abrir la ventana Hardware initialization. Espere a que el programa


reconozca todos los componentes del sistema.

OBSERVACION DE LA MUESTRA AL MICROSCOPIO


Asegrese de que el deslizante plateado que se encuentra al lado derecho del
microscopio est en posicin VIS (metido hasta el fondo). Para ubicar el campo
de inters a analizar en su muestra, emplee el campo claro. Para ello, se deber
presionar el botn HAL ubicado al lado derecho del estativo del microscopio (el
foco correspondiente se enciende en color verde). Se puede regular la cantidad de
luz por medio de la perilla que se encuentra al lado del botn de encendido.
Nota: Antes de analizar una muestra en el confocal, se pide que los usuarios hayan
revisado que sus muestras efectivamente presentan el marcaje de fluorescencia
esperado, ya que el uso de la lmpara de fluorescencia asociada al microscopio
confocal estar restringido. En caso de no contar con un microscopio de

fluorescencia, los usuarios podrn emplear los microscopios de fluorescencia que


sen encuentran a su disposicin en la Unidad de Microscopa.
1. Seleccin del objetivo: El revolver de los objetivos NO se mueve manualmente.
Para evaluar su muestra: Coloque la laminilla en la platina con el cubreobjetos
hacia arriba; seleccione el objetivo 10x presionado alguno de los 2 botones en
arreglo horizontal marcados con puntas de flecha negras que se encuentran del
lado derecho en la base del estativo debajo del tornillo micromtrico; enfoque la
preparacin y siga los siguientes pasos para obtener una iluminacin de campo
claro uniforme (Iluminacin Khler).
a. Revise que el disco horizontal localizado debajo de la platina, que indica
el tipo de iluminacin a emplear, est en la posicin I/H. De no ser as,
gire el disco manualmente hasta dejarlo en esa posicin.
b. Suba el condensador hasta el tope superior girando el tornillo negro
mediano que se encuentra debajo de la platina
c. Gire el disco pequeo vertical que se encuentra en el lado derecho de la
base del estativo (diafragma de campo) y cierre el campo visual hasta
que solo se vea la parte central de la muestra (que quede iluminada
aproximadamente 1/3 de la muestra)
d. Enfoque los bordes del diafragma ajustando la altura del condensador
hasta que los bordes del octgono aparezcan ntidos.
e. Abra el diafragma de campo hasta que los bordes desparezcan del
campo visual
ADQUISICIN DE IMGENES
1. Prender los lseres que se vayan a emplear por medio de los interruptores
correspondientes:
f. Encender el o los lseres He/Ne que se vayan a emplear girando hacia la
derecha la llave correspondiente. La fuente de alimentacin del lser
marcada con el No. inventario UNAM 1050375 genera luz verde de
543 nm (se usa para detectar fluorforos como ioduro de propidio,
Rodamina, Texas Red, CY3, Alexa Fluor 546, etc) mientras que la
fuente de alimentacin del lser marcada el No. inventario UNAM
1050376 , genera luz roja de 633 nm (se usa para detectar fluorforos
como Alexa Fluor 633, BODIPY, CY5, etc) . El foco rojo en cada caja
significa que el lser est prendido.
g. Encender el lser Ar que genera luz azul-verde de longitudes de onda
de 458, 488 y 514 nm. Colocar el interruptor (botn con la leyenda
power enable) en la posicin I y posteriormente girar la llave a la
posicin I. Cuando este lser se enciende, se observa una luz
naranja debajo del ventilador y solo cuando la luz se torna morada,
el lser estar listo para usarse (Aprox. 5 min. despus de haber sido
encendido).
2. Mueva el deslizante plateado ubicado al lado derecho del estativo del
microscopio a la posicin LSM y asegrese de que el obturador (shutter)
ubicado del lado derecho en la parte superior del estativo (entre los dos
deslizantes ubicados con las letras F A) est completamente metido

3. Presione el botn Micro que aparece en el submen de la ventana LSM 5


Pascal. La ventana Axioplan control aparecer en la pantalla.

4. Seleccione el objetivo 40X presionando en la zona blanca de la ventana que


indica Objective
5. Cierre la ventana Axioplan control

6. Presione con un solo click el botn Acquire en la barra del men principal
que aparece en la pantalla de la computadora

7. Presione el botn Config. Aparecer la ventana Configuration Control.


8. Presione el botn Single Track si desea evaluar un solo fluorocromo o
Multi Track si desea evaluar dos o ms flurocromos.
9. Si usa Multi Track se recomienda que por cada canal pase una sola lnea de
laser para evitar sangrado (bleeding) de los canales (ver pasos siguientes).

10. Presione el botn Store/Apply en el panel Track. Se abrir la ventana


Track Configurations.

11. Al presionar la flecha, usted encontrar configuraciones predeterminadas para la


deteccin diferentes fluorforos.
12. Escoja la combinacin de fluorforos de su muestra y presione el botn
Apply.

Nota importante: El botn Store solo se usa para guardar configuraciones con
parmetros que el usuario ha establecido para sus propios experimentos. Si lo presiona por
error, la configuracin predeterminada se guardar con nuevos parmetros y podra dejar
de funcionar ptimamente para el resto de los usuarios.

Debido a que las configuraciones que aparecen en este men han sido
estructuradas por cada usuario, la configuracin puede no representar lo que

usted desea evaluar. As lo ms recomendable es que usted defina los


prametros para la configuracin de sus fluorocromos basndose en la Tabla
de Configuraciones que se encuentra anexo al final de este manual.
Cada parmetro se puede cambiar dando 1 click en la figura de los espejos,
los filtros y el crculo de color que representa el color de su fluorforo.

Para evaluar ms de 1 fluorforo, configrelos en la opcin Multi track pero


cada fluorforo por separado como se indica en la seccin Un solo
fotomultiplicador de la tabla de configuraciones anexa al final de este manual.
Para aadir tracks al evaluar fluorforos mltiples, presione botn Add
track en la ventana configuration control y configrelo con respecto a los
datos proporcionados en la tabla de configuraciones anexa al manual. Para
nombrar el track, de 1 click, espere 2 segundos y de otro click, la ventana se
activar para que usted escriba.

13. Presione el botn Scan que aparece en el submen en la ventana LSM 5


Pascal.

14. Aparecer la ventana Scan Control.


15. Presione el botn Mode

Para iniciar su sesin, se recomienda que,


a. En el panel Objective lens and Image Size escoja:
Frame Size: x: 512 y: 512 (A medida que este nmero aumenta,
tambin aumenta la resolucin espacial)
b. En el panel Speed escoja Scan Speed: 8 (velocidad mxima,
mientras mayor sea la velocidad de escaneo menor ser la resolucin
del barrido de la muestra.)
c. En el panel Pixel Depth... escoja los siguientes parmetros:
i. Data Depth: 8 bit
ii. Scan direction: Flecha unidireccional
iii. Mode: Frame
iv. Method: Mean
v. Number: 1 (A medida que este nmero incrementa, tambin
aumenta la proporcin seal/ruido y se obtiene mayor resolucin.
Sin embargo, la adquisicin de la imagen se lentifica y la muestra
se blanquea mas rpidamente)
d. En el panel Zoom, Rotation & Offset escoja: zoom 1 y rotacin 0. (Si
aumenta el valor en la opcin Zoom puede hacer un acercamiento
ptico de la imagen que est adquiriendo).
La opcin Offset le permite mover su muestra en el plano XY, sin
necesidad de emplear los tornillos del microscopio
NOTA: Estos son los valores que se recomiendan para iniciar la sesin. Sin
embargo, una vez que inicie la adquisicin de la imagen, el usuario podr ir
determinando los parmetros ptimos para disminuir el ruido de fondo y aumentar
la ganancia en su muestra a medida que vaya explorando diferentes planos focales
empleando para ello el tornillo micromtrico (ver inciso 21a). Asimismo, podr
cambiar de objetivo dependiendo de sus necesidades como se describe en el paso 1
de la seccin Adquisicin de imgenes; los objetivos 40x y 100x son de inmersin
en aceite (el aceite se los proporcionar el Tcnico acadmico de la Unidad).
El aceite se deber poner sobre la muestra mientras no haya objetivos
posicionados sobre la muestra. Para poner el revolver de los objetivos en posicin
sin objetivo, presione alguno de los 2 botones marcados con puntas de flecha

negras que se encuentran en la base del estativo debajo del tornillo micromtrico.
Una vez que coloc la gota de aceite, regrese al objetivo a emplear asegurndose de
pasar por los objetivos de aire, NO por el resto de los objetivos de aceite.
Se recomienda dejar abierta la ventana Scan control con el objeto de
modificar los parmetros que se requieran a lo largo del experimento.
16. Presione el botn Channels de la ventana Scan control y se desplegar un
panel que permitir establecer los parmetros de los canales a usar (Channel
settings) as como determinar las lneas de excitacin del/los lseres a usar
(Excitation of Track).
17. En el panel Channel Settings, aparecen los parmetros del Pinhole (apertura
confocal). Presione el botn marcado con el nmero 1. Esta es la apertura
ptima que el sistema genera automticamente para el objetivo que se est
empelando.
18. En el panel Excitation of Track la configuracin predeterminada debe
mostrar marcadas con palomita las lneas de lser propias de la configuracin
que usted eligi en los pasos 11-12 de la seccin Adquisicin de Imgenes.
De no ser as, mrquelas manualmente presionando sobre la ventana cuadrada
que aparece a la izquierda de cada lser y palomee nicamente las lneas de lser
que utilizar.
Nota importante: Si usted est usando la configuracin Multi track
asegrese de que estn palomeadas las lneas del laser correspondiente a cada
canal por separado.
EJEMPLO PARA SINGLE TRACK

EJEMPLO PARA MULTI TRACK

19. Posicione el botn marcado Detector Gain a la mitad de la barra de cada


lnea(s) seleccionada(s) (esta es solo una posicin inicial para empezar la
adquisicin y se podr modificar hasta que el investigador considere que est en
el nivel ptimo para sus condiciones experimentales).
20. Posicione el botn indicador del % de transmisin a un tercio de la barra (en el
caso de las lneas 458, 488 y 514) y a la mitad o de la barra (en el caso de las
lneas 543 y 633). Esta es solo una posicin inicial para empezar la adquisicin
y se podr modificar hasta que el investigador considere que est en el nivel
ptimo para sus condiciones experimentales).

21. Presione el botn Fast XY (adquisicin rpida de baja resolucin) que se


encuentra en la columna de conos en el extremo derecho de la ventana Scan
control. La adquisicin continua de la imagen iniciar y se puede parar en
cualquier momento presionando el botn Stop. Si logra ver la imagen esperada,
pero con poca resolucin, asegrese de usar el objetivo de 40x de inmersin en
aceite. Si no logra ver la imagen esperada, puede intentar las siguientes
opciones:
a. mueva el micromtrico hasta que encuentre seal en el plano focal
deseado mientras el sistema est adquiriendo continuamente la imagen y
cuando logre ver la imagen esperada, contine la configuracin de sus
parmetros
b. presione el botn Find que se encuentra en la ventana Scan control.
Esta funcin encontrar automticamente los parmetros de contraste y
brillantez ptimos para su muestra.
c. asegrese de que no haya burbujas en la gota de aceite
d. contine afinando la configuracin de parmetros como se describe en
los puntos siguientes

22. En el men que aparece del lado derecho de la ventana en la que se est
desplegando la imagen adquirida, puede seleccionar la ventana Split xy para
evaluar cada canal por separado, as como la mezcla de ambas imgenes.

23. Inicie la configuracin de los parmetros para la adquisicin de las imgenes


mientras el sistema est en el modo de adquisicin rpida continua (Fast XY).
En el panel superior Channel Settings aparecern 2 recuadros de colores,
con las siglas Ch1 y Ch2 que corresponden al color de la lnea de lser que
se est empleando (los colores de los recuadros, generalmente, coinciden con el
color de la emisin de los fluorforos que usted evaluar empleando las lneas
de lser que seleccion). Presione el botn Ch1 y mueva el botn de la barra
Detector Gain a la mitad de la barra. Esta es la funcin que le permitir
modificar contraste y brillantez de la imagen a adquirir (hacia la derecha
aumenta la brillantez, hacia la izquierda la disminuye), mientras que la barra
Ampl Offset modula el ruido de fondo (hacia la derecha lo aumenta y hacia la
izquierda lo disminuye) y la barra Ampl Gain modula el factor de
amplificacin de la seal. Presione el botn Ch2 y siga el mismo procedimiento.
Si no logra ver la imagen esperada, mueva el micromtrico hasta que encuentre
seal en el plano focal deseado mientras el sistema est adquiriendo
continuamente la imagen y cuando logre ver la imagen esperada, contine la
configuracin de sus parmetros. En caso de no encontrar el campo ideal para
adquirir, puede volver a ver su muestra en capo claro presionando en botn HAL
del microscopio y metiendo la barra plateada hasta la posicin Vis. Una vez
determinado el nuevo campo, inicie el proceso desde el paso 20

24. Cuando haya optimizado los parmetros de adquisicin, presione el botn


Single de la ventana Scan control para obtener una imagen de mayor
resolucin. Generalmente, esta imagen aparecer mucho menos brillante que la

adquirida con Fast XY. Si este es el caso, presione el botn Cont


(adquisicin continua de mediana resolucin) que se encuentra en el men a la
derecha dentro de la ventana Scan control y contine modificando los
parmetros de adquisicin hasta que la imagen le parezca satisfactoria.

25. Si esta imagen le es satisfactoria, podr almacenarla (ver Almacenamiento de


imgenes). De lo contrario, contine modificando los parmetros hasta que
obtenga la imagen ptima.
26. Algunas formas de mejorar la seal:
a. Aumentar la resolucin de la imagen presionando el botn 1024 o 2048
en la opcin Frame Size del submen Mode en la ventana Scan
control
b. Disminuir la velocidad de barrido en la opcin Scan Speed del
submen Mode en la ventana Scan control
c. Aumentar el nmero de promedio de barridos de la muestra en la
opcin Number del submen Mode en la ventana Scan control

Para revisar si la seal de su muestra est saturada, presione el cono Palette que se
encuentra en el men de la ventana en la que est desplegada la imagen adquirida
mientras est trabajando en el modo de ADQUISICIN CONTINUA. Se recomienda
hacer este procedimiento empleando la resolucin final que se vaya a emplear (512,
1024, 2048 pixeles).

a. Aparecer la ventana Color Palette. Elegir la opcin Range indicator.


Para evaluar la intensidad en imgenes con mltiples colores, seleccione el
botn Split xy que se encuentra en el men derecho de la ventana donde
se despliega la imagen.
b. Presionar el botn Cont de la ventana Scan Control. Los pixeles rojos
indican saturacin de color en su muestra, mientras que los azules indican
baja seal.

c. La brillantez adecuada para cada canal en la imagen la podr ajustar


presionando el botn Ch1 y Ch2 del panel Channel Settings en la
ventana Scan control y modificando los valores de las opciones
Detector Gain y Ampl Offset de la ventana Scan Control de cada
canal mientras el sistema est adquiriendo.
d. Se recomienda que ajuste la ganancia de forma que haya entre un 15 y 20%
de pixeles rojos en la imagen y que ajuste el valor Offset hasta que todo o
que usted considera ruido de fondo est marcado en azul.

Al finalizar el procedimiento de ajuste, presione el cono Palette y seleccione


la opcin No Palette para desplegar los colores de sus fluorforos. Cierre la
ventana Color Palette.

Reconstruccin de imgenes en el plano z


Este procedimiento permite producir un apilado de imgenes en el plano XY en
diferentes planos focales (secciones pticas).
Para producir un apilado de imgenes en el plano z:

1. Presione el botn Mode ubicado dentro de la ventana Scan Control e


ingrese: Scan Speed: 8 y Number: 1. Con ello evitar que su muestra se
fotoblanquee rpidamente.
2. Presione el botn Z stack que se encuentra en el men de la ventana Scan
control. Automticamente se desplegar el panel Z Settings.
3. Presione sobre la pestaa Mark First/Last del panel Z Settings
4. Se recomienda determinar el tamao ptimo del apilado mientras se est
haciendo un barrido continuo de la muestra. Para ello, presione el botn XY
Cont de la ventana Scan Control.
5. Gire el tornillo micromtrico para enfocar uno de los lmites del apilado.
6. Presione el botn Mark First
7. Contine girando el tornillo micromtrico en la misma direccin o en direccin
contraria (segn sea su caso) para enfocar el otro lmite del apilado
8. Presione el botn Mark Last
9. Presione el botn Stop
10. Determine la resolucin con la que obtendr el apilado (512, 1024, 2048) del
men Mode que se encuentra en la ventana Scan control. Usted podr
obtener una imagen ms limpia de ruido a medida que aumente el nmero de
escaneos que se encuentra en la ventana Number en el submen Pixel depth,
Scan direction and Scan average
11. Presione el botn Start para iniciar el barrido de las secciones que componen
su apilado. Usted podr ver el avance del apilado por medio de la barra negra
que se encuentra en la parte inferior de la imagen.
Nota: La barra Num Slices le permite determinar el nmero de secciones
pticas que desea que contenga el apilado; los lmites del apilado se mantendrn
constantes. Si usted desea obtener un mayor o menor nmero de secciones de las
que detect el sistema, ingrese el nmero deseado en la casilla Num slices
seguido de la tecla Enter.

12. Si desea guardar el apilado con mejor resolucin, modifique los parmetros
Scan Speed y Number del submen Mode en la ventana Scan
Control.

13. Para ver la galera de secciones que componen el apilado, presione el cono
Gallery que aparece en el men de la derecha de su imagen
14. Para ver el apilado presione el botn 3D view de la ventana LSM 5 Pascal
men principal, ventana LSM 5 Pascal. Aparecer un submen, presione
Projection. Se abrir la ventana Projection. Elija el plano en el que desea
ver la reconstruccin presionando en la ventana circular x y o z segn sea
el caso y presione Apply.

15. Aparecer una nueva ventana con la imagen reconstruida del apilado. Si desea
cada uno de los pasos de la rotacin de su imgen, presione la ventana
Gallery que aparece a la derecha de la ventana de la imagen adquirida.
16. Para volver a la funcin de escaneo en un solo plano focal, presione el botn z
stack

Almacenamiento de imgenes y reconstrucciones


Las imgenes se almacenan en bases de datos creadas por los usuarios.
Para guardar una imagen, primero deber generar una base de datos:
1. De doble clic en el cono My Computer que se encuentra en el escritorio de la
computadora
2. De doble clic en la unidad D:
3. Presione File, aparecer un submen, presione New, aparecer un submenu a la
derecha, presione Folder
4. Grupo Escriba el nombre del Jefe de grupo en la ventanilla que indica el nombre
del Flder
5. Ubique el cursor sobre la ventana de la imagen a guardar
6. Presione el botn Save As que se encuentra en el men de la derecha de la
imagen a guardar
7. Aparecer la ventana Save Image and Parameter As
8. Presione el botn New MDB que se encuentra a la derecha de esta ventana
9. Aparecer la ventana Create New Database

10. Ubique el cursor sobre la ventana que indica Create in y de un clic. Se


desplegar la lista de unidades que contiene la computadora
11. Ubique el cursor sobre la flecha que marca hacia arriba de la ventana hasta que
vea la unidad D: y de doble clic sobre el icono de esta unidad
12. Aparecer una lista de folders. Localice su flder y de de doble clic en l
13. Aparecer la ventana Create New Database
14. Escriba un nombre para su base de datos en el espacio File name y presione
el botn Create
15. Aparecer la ventana Save Image and Parameter As. En la parte inferior
aparece la subventana Database (MDB). Asegrese de que el nombre del
flder donde guardar su imagen este resaltado en azul. Si no es as, de doble
clic sobre el nombre de su flder
16. En la parte superior de la venta aparece la opcin Name. Borre el contenido
de esa ventana e introduzca el nombre de su imagen. Presione Ok.
17. Su imagen habr quedado guardada y lo podr rectificar por que el nombre de la
imagen aparecer en la barra superior azul que enmarca a su imagen.
18. Las imgenes almacenadas las deber copiar a las carpetas de red X: o W: si
esta en la Sede de Circuito Escolar o Exterior respectivamente. Asegrese de
copiar todo el contenido de su base de datos (archivos .mdb .ldb y .lsm)
a su flder en red. Los datos almacenados en estas unidades se borrarn
automticamente los das martes y viernes a las 6:00 AM. Por favor tmelo
en cuenta para evitar la prdida de sus datos.
19. Las imgenes almacenadas en este formato se pueden desplegar para su
posterior procesamiento empleando programas de anlisis de imgenes como los
siguientes: LSM VisArt, Image J, Image Pro e Imaris entre otros. Usted
encontrar software de uso libre en la pgina electrnica de la Unidad, bajo el
cono de anlisis de imgenes:
http://www.biomedicas.unam.mx/_administracion/_unidades_apoyo_inst/unidad_mi
croscopia.html
Para finalizar el programa, cierre todas las ventanas excepto la LSM pascal. Oprima
el botn File y despus el botn Exit
aparecer la ventana switch off light manager, presione No.
SOLUCION DE PROBLEMAS COMUNES
1) No logro observar la muestra en el microscopio
Posibles soluciones:
Mueva el deslizante plateado ubicado al lado derecho del estativo del
microscopio a la posicin LSM y asegrese de que el obturador
(shutter) ubicado del lado derecho en la parte superior del estativo
(entre los dos deslizantes ubicados con las letras F A) est
completamente metido
Posicione los pasos de luz marcados con F A en la posicin mas
superior
Mueva el plano focal girando lentamente el tornillo micromtrico
mientras contina la adquisicin
Asegrese de que los lseres estn encendidos
Asegrese de que la configuracin que escogi tenga marcadas (con
palomita) las lneas de lser de inters

Asegrese de que el botn indicador de ganancia Detector Gain


est posicionado como mnimo a la mitad de la barra

2) Veo mi muestra con el objetivo de 20X al microscopio, pero no veo nada en


empelando el sistema confocal
Posible solucin:
Cambie al objetivo de 40X
3) La imagen adquirida se ve muy pixelada
Posibles soluciones:
Aumente la resolucin espacial del Frame Size a 1024 y si usa un
objetivo de 100X, use 2048 del submen Mode en la ventana
Scan control
Aumente el nmero de escaneos en la opcin Number del men
antes mencionado
Asegrese de estar adquiriendo con el modo Single o Cont, no
con Fast XY
4) Muy baja seal aun con los valores de ganancia de deteccin y de
amplificacin altos
Posible solucin:
Aumentar el tamao del pinhole, aunque con ello perder
confocalidad

ANEXO: TABLA DE CONFIGURACIONES


Lser

Emisin (nm)

HFT

NFT

Ch1

Ch2

Un solo fotomultiplicador
FITC (CY2, Alexa 488)
Enhaced GFP (EGFP)
Enhaced Cyan FP (ECFP)
Enhanced Yellow FP (EYFP)
Lucifer Yellow

Argn
Argn
Argn
Argn
Argn

488
488
458
514
458

488
488
458
514
458

None
None
None
None
None

LP505
LP505
LP475
LP 530
LP 475

Cy3 (Rhodamine, Texas Red)


DS Red

He-Nen Verde
He-Nen Verde

543
543

543
543

None
None

LP560
LP560

Alexa 633, Cy5

He-Nen Rojo

633

488 / 543 /
633

None

LP650

545

LP560

BP 505-530

545

LP650

BP 505-530

635

LP650

BP 560-615

plate
plate
plate
plate
plate

LP505
LP475
LP 530
LP 475
LP560

Dos fotomultiplicadores

CY3 / Cy5

Argn+He-Ne
Verde
Argn+He-Ne
Rojo
He-Ne Verde +
Rojo

Enhaced GFP (EGFP)


Enhaced Cyan FP (ECFP)
Enhanced Yellow FP (EYFP)
Lucifer Yellow
DS Red

Argn
Argn
Argn
Argn
He-Nen Verde

FITC / Cy3
FITC / Cy5

543 / 633

488 / 543 /
633
488 / 543 /
633
488 / 543 /
633

488
458
514
458
543

488
458
514
458
543

488 / 543
488 / 633