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MICROSCOPIO CONFOCAL
LSM 5 DE ZEISS
Dra. Anglica Zepeda R.
Responsable Acadmico de la Unidad de Microscopa
Instituto de Investigaciones Biomdicas
Universidad Nacional Autnoma de Mxico
Fecha de elaboracin: Enero del 2009
1 revisin: Abril del 2010
Esta gua describe la operacin bsica del microscopio confocal LSM 5 para
observacin de tejido o clulas montadas en vidrio e inmunohistoqumicamente
procesadas (marcaje fluorescente de uno, dos y tres fluorforos).
Este manual pretende cubrir todos los aspectos bsicos de adquisicin de imgenes. Sin
embargo, si se requiere informacin mas precisa que no se incluya en la gua, se podr
solicitar asistencia tanto a la Tcnica, como al Investigador Acadmico responsable de
la Unidad para recibir asesora individual.
Contactos:
SOFTWARE
El software LSM 5 PASCAL, Versin 2.8 controla el microscopio, los lseres, el
mdulo de escaneo, el proceso de adquisicin, las herramientas de adquisicin y el
despliegue de las imgenes.
El software del microscopio confocal cuenta con tres lseres de un fotn (Ar, HeNe
543 y HeNe 633) que permiten al usuario seleccionar entre longitudes de excitacin de
458, 488, 514, 543 y 633nm, y el software LSM (propio de Zeiss) provee diversas
funciones para la adquisicin de imgenes, que incluye la adquisicin con diferentes
resoluciones de imgenes en 2D y 3D (x, y, z).
El software se puede operar empleando el mouse y el teclado de la computadora y se
usan de la misma manera en la que opera WINDOWS.
MICROSCOPIO
El microscopio cuenta con los siguientes juegos de filtros para observar las muestras
empleando la lmpara de mercurio:
1) Filtro FITC
Pase de banda de excitacin: 450-490nm
Espejo Dicrico: FT 510
Emisin:
LP 515
2) Filtro DAPI (Las muestras marcadas con DAPI solo se podrn observar al
microscopio, no con el sistema confocal)
Pase de banda de excitacin: 365nm
Espejo Dicrico: FT 395
Emisin:
LP 397
3) Filtro Rodamina
Pase de banda de excitacin: 546nm
Espejo Dicrico: FT 580
Emisin:
LP 590
6. Presione con un solo click el botn Acquire en la barra del men principal
que aparece en la pantalla de la computadora
Nota importante: El botn Store solo se usa para guardar configuraciones con
parmetros que el usuario ha establecido para sus propios experimentos. Si lo presiona por
error, la configuracin predeterminada se guardar con nuevos parmetros y podra dejar
de funcionar ptimamente para el resto de los usuarios.
Debido a que las configuraciones que aparecen en este men han sido
estructuradas por cada usuario, la configuracin puede no representar lo que
negras que se encuentran en la base del estativo debajo del tornillo micromtrico.
Una vez que coloc la gota de aceite, regrese al objetivo a emplear asegurndose de
pasar por los objetivos de aire, NO por el resto de los objetivos de aceite.
Se recomienda dejar abierta la ventana Scan control con el objeto de
modificar los parmetros que se requieran a lo largo del experimento.
16. Presione el botn Channels de la ventana Scan control y se desplegar un
panel que permitir establecer los parmetros de los canales a usar (Channel
settings) as como determinar las lneas de excitacin del/los lseres a usar
(Excitation of Track).
17. En el panel Channel Settings, aparecen los parmetros del Pinhole (apertura
confocal). Presione el botn marcado con el nmero 1. Esta es la apertura
ptima que el sistema genera automticamente para el objetivo que se est
empelando.
18. En el panel Excitation of Track la configuracin predeterminada debe
mostrar marcadas con palomita las lneas de lser propias de la configuracin
que usted eligi en los pasos 11-12 de la seccin Adquisicin de Imgenes.
De no ser as, mrquelas manualmente presionando sobre la ventana cuadrada
que aparece a la izquierda de cada lser y palomee nicamente las lneas de lser
que utilizar.
Nota importante: Si usted est usando la configuracin Multi track
asegrese de que estn palomeadas las lneas del laser correspondiente a cada
canal por separado.
EJEMPLO PARA SINGLE TRACK
22. En el men que aparece del lado derecho de la ventana en la que se est
desplegando la imagen adquirida, puede seleccionar la ventana Split xy para
evaluar cada canal por separado, as como la mezcla de ambas imgenes.
Para revisar si la seal de su muestra est saturada, presione el cono Palette que se
encuentra en el men de la ventana en la que est desplegada la imagen adquirida
mientras est trabajando en el modo de ADQUISICIN CONTINUA. Se recomienda
hacer este procedimiento empleando la resolucin final que se vaya a emplear (512,
1024, 2048 pixeles).
12. Si desea guardar el apilado con mejor resolucin, modifique los parmetros
Scan Speed y Number del submen Mode en la ventana Scan
Control.
13. Para ver la galera de secciones que componen el apilado, presione el cono
Gallery que aparece en el men de la derecha de su imagen
14. Para ver el apilado presione el botn 3D view de la ventana LSM 5 Pascal
men principal, ventana LSM 5 Pascal. Aparecer un submen, presione
Projection. Se abrir la ventana Projection. Elija el plano en el que desea
ver la reconstruccin presionando en la ventana circular x y o z segn sea
el caso y presione Apply.
15. Aparecer una nueva ventana con la imagen reconstruida del apilado. Si desea
cada uno de los pasos de la rotacin de su imgen, presione la ventana
Gallery que aparece a la derecha de la ventana de la imagen adquirida.
16. Para volver a la funcin de escaneo en un solo plano focal, presione el botn z
stack
Emisin (nm)
HFT
NFT
Ch1
Ch2
Un solo fotomultiplicador
FITC (CY2, Alexa 488)
Enhaced GFP (EGFP)
Enhaced Cyan FP (ECFP)
Enhanced Yellow FP (EYFP)
Lucifer Yellow
Argn
Argn
Argn
Argn
Argn
488
488
458
514
458
488
488
458
514
458
None
None
None
None
None
LP505
LP505
LP475
LP 530
LP 475
He-Nen Verde
He-Nen Verde
543
543
543
543
None
None
LP560
LP560
He-Nen Rojo
633
488 / 543 /
633
None
LP650
545
LP560
BP 505-530
545
LP650
BP 505-530
635
LP650
BP 560-615
plate
plate
plate
plate
plate
LP505
LP475
LP 530
LP 475
LP560
Dos fotomultiplicadores
CY3 / Cy5
Argn+He-Ne
Verde
Argn+He-Ne
Rojo
He-Ne Verde +
Rojo
Argn
Argn
Argn
Argn
He-Nen Verde
FITC / Cy3
FITC / Cy5
543 / 633
488 / 543 /
633
488 / 543 /
633
488 / 543 /
633
488
458
514
458
543
488
458
514
458
543
488 / 543
488 / 633