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Curso bsico de bacteriologa clnica

Clase 1
GENERALIDADES DE BACTERIOLOGA

-INTRODUCCIN
El estudio de los microorganismos comprende el conocimiento de su forma,
estructura, reproduccin, fisiologa, metabolismo e identificacin.
Los microorganismos estn presentes en todas partes a nuestro alrededor y, a
pesar de sus aspectos ms negativos, son absolutamente necesarios para el desarrollo de
la vida en el planeta.
Con el paso del tiempo, han evolucionado para adaptarse prcticamente a
cualquier ambiente.
Por sus propias caractersticas, sus ciclos vitales son cortos y rpidos.

-BACTERIA
Las bacterias pertenecen al reino PROCARYOTAE.
Son organismos unicelulares, microscpicos, sin ncleo definido ni clorofila.
La mayora son de vida libre, a excepcin de algunos que son de vida
intracelular obligada.(Chlamydias).
Tienen mecanismos productores de energa y material gentico necesario para
su desarrollo y crecimiento.
El grupo de microorganismos procariotas se divide en : ARQUEOBACTERIAS,
que viven en condiciones extremas; y las EUBACTERIAS, entre las que se encuentran las
bacterias de inters mdico, ya que viven en aguas, suelo y organismos vivos.
Su tamao oscila entre 0.5 a 3 micrones. Son visibles a travs de microscopio
ptico y electrnico.

Es la forma de vida ms simple y abundante en la naturaleza.

Estn presentes en los ciclos naturales del Nitrgeno, Carbono, Fsforo, etc.
Son tambin aprovechados por la industria en los procesos de fermentacin y
para la produccin de antibiticos.

-ESTRUCTURA
.La clula bacteriana presenta 3 caractersticas principales:
- No tiene ncleo que contenga el ADN, sino que este se encuentra libre
en el citoplasma.
- El citoplasma contiene adems molculas de ARN en los ribosomas, que
sintetizan protenas que luego tendrn diferentes funciones.
- No poseen compartimientos intracelulares delimitados por membranas.
COMPONENTES:

MEMBRANA PLASMTICA:
- Es una estructura vital para la bacteria.
- Tiene un espesor de 8 nm.
- Est formada por fosfolpidos y protenas.
- Tiene permeabilidad selectiva y permite el ingreso de los nutrientes y la
salida de los desechos por transporte activo y pasivo.
- Sintetiza los componentes de la cpsula y de la pared celular.
- Es el lugar de accin de detergentes y ATB polipeptdicos (polimixina).

PARED CELULAR:
- Est ubicada por fuera de la membrana plasmtica.
- Es una estructura compleja y fundamental para la bacteria.
- Est formada por peptidoglicanos.
- Su espesor vara de 1 a 2 molculas a 50-100 molculas.
- Le otorga rigidez a la bacteria y la protege de los cambios de presin
osmtica del medio.
- En ella se localiza los componentes que determinan su patogenicidad:
endotoxinas.
- Es el sitio de accin de algunos antibiticos: los betalactmicos.

Contiene antgenos que son usados en la clasificacin e identificacin

bacteriana.
Se manifiesta con la tincin de Gram, y permite dividir a las bacterias en
2 grandes grupos: GRAM POSITIVAS y GRAM NEGATIVAS.

CITOPLASMA:
- Est formado en un 85 % por agua.
- Contiene ribosomas y cromosoma bacteriano.
RIBOSOMAS:
- Estn compuestos por ARN y protenas.
- Se encuentran libres en el citoplasma. Tambin pueden presentarse
como polirribosomas (cadenas).
- Interviene en la sntesis de protenas.
- Son el sitio de accin de numerosos ATB: Aminoglucsidos,
Tetraciclinas, Cloranfenicol, Macrlidos y Lincosamidas.
ADN CROMOSMICO:
Las bacterias no poseen membrana nuclear, nuclolo ni aparato mittico, por lo
que se material gentico est constituido por un filamento de ADN circular de
doble cadena que se encuentra enrollado sobre s mismo.
CPSULA:
- Es una envoltura externa, ubicada por fuera de la pared celular.
- Est formada por polisacridos.
- Es de consistencia mucosa, un gel que se adhiere a la clula.
- Protege a la bacteria de la fagocitosis y facilita la invasin.
- Permite la diferenciacin en tipos serolgicos en base a los antgenos
capsulares.
- No es una estructura vital para la clula; su prdida no produce la
muerte de la bacteria, pero s afecta su virulencia.
- Se hace visible al microscopio ptico usando la coloracin con tinta
china.
FLAGELO:
- Son filamentos largos y delgados, helicoidales.
- Estn formados por una protena llamada flagelina.
- Son los responsables de la movilidad de la bacteria.

Puede variar su cantidad de 1 a cientos.

No es una estructura vital para la clula.
Son demasiado pequeos para ser vistos en su estado natural con el
microscopio ptico, por eso existen coloraciones especiales que los dejan
en evidencia.

PILI O FIMBRIAS:
- Son estructuras filamentosas y proteicas.
- No son vitales para la bacteria.
- Cumplen funciones de adherencia a receptores especficos y tienen u
papel fundamental en la colonizacin de epitelios.
- No cumplen funcin de movilidad.
- Solo pueden ser vistos por microscopa electrnica.
- Los pilis sexuales intervienen en el intercambio gentico entre
bacterias, en donde una clula donadora transfiere Plsmidos a otra
receptora en un proceso denominado conjugacin.
PLSMIDOS:
- Son secuencias cortas de ADN circular bacteriano que puede existir y
replicarse independientemente del ADN cromosmico.
- No son esenciales para la vida de la bacteria, pero le dan algunas
ventajas: resistencia a los ATB, patogenicidad, etc.
- Pueden transferirse de una bacteria a otra a travs de la conjugacin.

- REPRODUCCIN
La reproduccin se lleva a cabo asexualmente por divisin celular.
- El ADN circular se empieza a replicar.
- A los 20 min. el nuevo cromosoma esta completo y se fija a un sitio de la
clula.
- Aparece una divisin en el centro de la clula.
- A los 38 min. la divisin ya es una pared.
- A los 45 min. la divisin ya se ha completado.

- CLASIFICACIN
Se puede decir que en el proceso de identificacin de microorganismos se
ponen en juego todos los conocimientos acumulados en Microbiologa.
La identificacin de las bacterias es ms precisa cuanto mayor es el nmero de
criterios utilizados.
Esta identificacin basada en modelos, agrupados en familias y especies, forma
la clasificacin bacteriana.
Algunos de los criterios en los que nos basamos son:
- Morfologa microscpica y microscpica.
- Requerimiento de O2 para su desarrollo.
- Capacidad para consumir glucosa.
- Composicin de su pared celular.

- REQUERIMIENTO DE O2.
-

AEROBIAS ESTRICTAS: bacterias que crecen en presencia de O2 y lo

requieren para su continuo crecimiento. (20% de O2.).

ANAEROBIAS ESTRICTAS: No se desarrollan en presencia de O2.

Utilizan CO2, H2, N2.

ANAEROBIAS FACULTATIVAS: prefieren crecer en presencia de O2,

aunque pueden hacerlo sin l.

MICROAERFILAS: crecen mejor en condiciones atmosfricas

parcialmente anaerobias: menos de 12 % de O2 y aumento en la
concentracin de CO2.

-FORMA Y AGRUPACIN:
El examen microscpico de las bacterias nos permite reconocer su morfologa.
As podemos reconocer:
-

COCOS: tiene forma esfrica u ovalada.

Pueden presentarse: - aislados
-de a pares: diplococos.

- en cadenas: estreptococos.
- en racimos: estafilococos.

BACILOS: tienen forma cilndrica, recta o curva.

Sus extremos pueden ser rectos o redondeados.
Pueden estar aislados, en cadenas o formando letras chinas
y empalizadas.
-

ESPIRILOS: tienen forma de espiral. Varan en el nmero de vueltas.

VIBRIOS: tiene forma de coma.

-COMPOSICION DE LA PARED CELULAR:

Para evidenciar la pared celular, se utiliza la coloracin de Gram
Segn la composicin de su pared celular, las bacterias pueden clasificarse
en:
Gram +.
Gram -.

Pared de las bacterias Gram Positivas: .

La pared de la clula gram-positiva es gruesa y consiste en varias capas
interconectadas de peptidoglicano as como algo de cido teicoico.
Generalmente, 80%-90% de la pared de la clula gram-positiva es
peptidoglicano.

Pared de las bacterias Gram Negativa:

La pared de la clula gram-negativa, por otro lado, contiene una capa mucho
ms delgada, nicamente de peptidoglicano y est rodeada por una
membrana exterior compuesta de fosfolpidos, lipopolisacridos, y
lipoprotenas. Slo 10% - 20% de la pared de la clula gram-negativa es
peptidoglicano.

Tipos de coloraciones:
El tamao de la mayora de las clulas bacterianas es tal que resultan difciles
de ver con el microscopio ptico. La principal dificultad es la falta de contraste
entre la clula y el medio que la rodea, y el medio ms simple de aumentar el
contraste es la utilizacin de colorantes. Estos pueden emplearse para
distinguir entre tipos diferentes de clulas o para revelar la presencia de
determinados constituyentes celulares, tales como flagelos, esporas, cpsulas,
paredes celulares, centros de actividad respiratoria, etc.
Las clulas generalmente son tratadas para coagular el protoplasma antes de
teirlas, proceso llamado fijacin. Para bacterias, la fijacin por el calor es lo
ms corriente, aunque tambin puede fijarse con sustancias qumicas como
formaldehido, cidos y alcoholes. Despus de la fijacin, si se aade el
colorante, no se producen ulteriores cambios estructurales en el protoplasma.
La fijacin se realiza habitualmente en clulas que han sido fijadas sobre un
portaobjetos, tratando despus ste con el agente fijador, y siguiendo
inmediatamente el proceso de tincin.
Los mtodos de tincin son de gran utilidad, pero deben usarse siempre con
precaucin, ya que pueden conducir a errores. Las molculas de colorante
forman en ocasiones precipitados o agregados que parecen estructuras
celulares autnticas, pero que son formaciones completamente artificiales
inducidas por el mismo colorante. Tales estructuras se denominan artefactos, y
deben tomarse muchas precauciones para tener la seguridad de que no nos
estamos equivocando al creer que un artefacto es una estructura realmente
existente.
Las tinciones pueden clasificarse en:
-DIFERENCIALES
-SIMPLES
-ESPECFICAS
- FLUOROCROMOS

TINCIN DIFERENCIAL
-Se utilizan 2 ms colorantes.
-Permite distinguir entre distintos tipos de microorganismos.
-Tiene al menos 2 etapas: colorante 1rio. y colorante de contraste.
-Ej: Gram, Zielh-Neelsen, Giemsa.

TINCIN SIMPLE
- Se utiliza 1 solo colorante.
- Mejora el contraste.
- Ej: Azul de metileno.

TINCIN ESPECFICA:
-Revelan estructuras particulares.
-Aumenta el contraste.
-Ej: flagelos, esporas.

TINCIN NEGATIVA
-Tie el medio que rodea al microorganismo.
-Realza el contraste.
-Ej: Tinta china.

TINCIN FLUORESCENTE

-Aumenta el contraste por medio de fluorescencia.

-Se utilizan colorantes llamados fluorocromos.
-Ej: Naranja de acridina, auramina.

- TINCIN DE GRAM:
Es el mtodo de coloracin ms importante en el laboratorio de
bacteriologa, ya que permite iniciar el reconocimiento de los
microorganismos.
Se llama as por el bacterilogo dans Christian Gram, quien la desarroll en
1884.
En base a los resultados de la tincin, las bacterias pueden dividirse en
Positivas y Negativas.
Las bacterias se tien de forma diferente debido a las diferencias
constitutivas de su pared celular.

Procedimiento:
Preparacin y secado del frotis.
Fijacin: calor / metanol.
Colorante 1rio: Cristal violeta: 1 min.
Enjuague.
Mordiente: Lugol: 1 min. (Es una solucin de Iodo y Ioduro de potasio).
Enjuague.
Decolorante: alcohol acetona. (30% de acetona y 70% de etanol).
Enjuague.
Colorante 2rio: Safranina: 1 min.
Enjuague y secado.

Explicacin:
-

El primer paso en cualquier tincin debe ser la fijacin.

El cristal violeta penetra en todas las clulas bacterianas, + y -.

El Iodo entra en las clulas y forma un complejo insoluble en solucin

acuosa con el cristal violeta.

La mezcla de alcohol-acetona sirve para hacer la decoloracin, ya que en

la misma es soluble el complejo I/ cristal violeta: los Gram + no se
decolora, mientras que los Gram s lo hacen.

Para poner de manifiesto las clulas Gram- se usa una coloracin de

contraste, como la safranina o la fucsina bsica.

-MICROSCOPA:
La tincin de Gram nos permite observar dos caractersticas de las bacterias:
forma y agrupacin y la diferenciacin en Gram + o -.
Para observar al microscopio los preparados coloreados, le agregamos una gota
de aceite de inmersin.
Usamos el microscopio ptico con la lente de 100X.

-TINCION DE ZIEHL- NEELSEN

Los BAAR poseen una pared celular rica en lpidos y acido miclico, que
tienen la propiedad de unirse fuertemente al colorante primario cuando se
usa el calor como mordiente. Una vez formado este complejo colorantepared, ni siquiera la accin conjunta del cido y el alcohol pueden
deshacerlo, ya que la pared retiene el colorante en forma resistente.
Pasos:
Preparacin y secado del frotis.
Fijacin: calor / metanol.
Colorante 1rio: Fucsina.
Mordiente: Calor: Flamear hasta que se desprenda vapor blanco.
Repetir 3 veces.
Enjuague.
Decolorante: alcohol cido. 1-2 min.
Enjuague.
Colorante 2rio: Azul de metileno.20 min.
Enjuague y secado.

Los BAAR se observan teidos de rojo y el resto aparece en azul celeste.

Son BAAR las micobacterias, nocardias y algunos hongos.

-OTRAS COLORACIONES:
-GIEMSA:
En microbiologa se usa para visualizar parsitos, hongos, levaduras y
espiroquetas.
Reactivos: 1. Metanol o etanol fijador.
2. Colorante de Giemsa + Agua tamponada (pH 7.2).
El colorante de Giemsa es un colorante compuesto ya que es una mezcla de
varios colorantes. Por esto se dice que la coloracin de Giemsa es una
coloracin compuesta o diferencial (ya que emplea ms de un colorante).

-AZUL DE METILENO:
Azul de metileno (Tincin simple). Permite teir el interior celular.
Tie microorganismos.
-TINTA CHINA:
Es una tincin negativa ya que deja las bacterias sin teir y colorea el medio
que las rodea.
Su mxima utilidad es revelar la cpsula de algunas bacterias.

-AURAMINA Y NARANJA DE ACRIDINA:

Son tinciones realizadas con diferentes fluorocromos.
Se necesita un microscopio de fluorescencia para observarlas.
Auramina: se usa para teir bacilos BAAR. Las bacterias aparecen
anaranjadas brillantes contra un fondo verde.
Naranja de acridina: es muy usado en hemocultivos. Se usa para detectar la
presencia de bacterias.

Lo interesante de estas coloraciones, es que luego, el frotis se puede teir

con Gram o Ziehl-Neelsen (segn el caso) y confirmar el resultado con la
coloracin tradicional que, adems, permite ver la morfologa.

- OBSERVACIN EN FRESCO:

No es el mtodo ms usado para observar la morfologa ya que el citoplasma es

incoloro.
S se utiliza para ver la movilidad de las bacterias, para observar parsitos y
hongos.

-CAMPO OSCURO:
Es una variante del examen en fresco y permite observar el movimiento
caracterstico y la morfologa de las espiroquetas.

Resumiendo
BACTERIA

-Organismo unicelular.
-Procariota.
-Microscpico (Uso de coloraciones).
-Reproduccin asexual.
CLASIFICACIN:

-Morfologa: cocos, bacilos, vibrios y espirilos.

-Composicin de su pared celular: Gram + y -, AAR.
-Requerimiento de O2.

Preparacin de colorantes:
Preparacin de los colorantes para Gram:
CRISTAL VIOLETA

Cristal violeta
10 g.
Oxalato de amonio
4 g.
Etanol
100 ml.
Agua destilada
900 ml.

Dejar reposar a 37C 24 hs.

Filtrar con papel de filtro antes usar

LUGOL

Iodo
10 g.
Ioduro de potasio 20 g.
Etanol
250 ml.
Agua destilada
750 ml.

Dejar reposar a 37C 24 hs.

Filtrar con papel de filtro antes de usar.

ALCOHOL ACETONA (70/30):

Acetona
Alcohol etlico

300 ml.
700 ml.

SAFRANINA
Safranina
Etanol
Agua destilada

2,5 g.
100 ml.
900 ml.

Dejar reposar a 37C 24 hs.

Filtrar con papel de filtro antes de usar.

Preparacin de los colorantes para Ziehl-Neelsen:

FUCSINA FENICADA
-Fucsina bsica
- Etanol
- Fenol
- Agua destilada

10 g.
100 ml.
50 ml.
1000 ml.

Dejar reposar a 37C 24 hs.

Filtrar con papel de filtro antes usar.

ALCOHOL CIDO

-Etanol
970 ml.
- cido clorhdrico 30 ml.

Manipular con precaucin el HCl.

AZUL DE METILENO
Azul de Metileno
Etanol
Agua destilada

1 g.
100 ml.
900 ml.

Dejar reposar a 37C 24 hs.

Filtrar con papel de filtro antes usar.

Ante cualquier duda, no dudes en hacer consultas.

Adriana Nez
Tcnica de laboratorio del Servicio de Microbiologa del Hospital de
pediatra Juan P. Garrahan.
Contacto: adng@live.com.ar

cursodebacteriogarrahan@yahoo.com.ar