Pirosecuenciacin

Todos los pasos se realizan in vitro,

1. procesado y adaptacin del ADN para obtener una librera de fragmentos monocatenarios. Fragmentar el
ADN a secuenciar mediante un proceso fsico conocido como nebulizacin, el ADN se rompe en
fragmentos de 200 a 800 pares de bases aproximadamente.
2. Aadir 2 pequeas secuencias adaptadoras a cada fragmento de ADN obtenido en la nebulizacin. El
adaptador A y B. Secuencias adaptadores estn diseadas para cumplir funciones en los pasos siguientes.
3. Seleccionar los fragmentos de ADN a los que se han unido correctamente los adaptadores. Para esto, los
fragmentos de ADN se unen a unas esferas especiales por la parte 3 del adaptador B. Esta unin no es
por complementariedad de bases. Los fragmentos que solo contengan adaptador A no se unirn a las
esferas y son eliminados y los que contengan 2 adaptadores B se unirn por 2 puntos. Los fragmentos de
doble cadena unidos a estas esferas son sometidos a alta concentracin de NaOH que provoca la
separacin de las cadenas simples. Si el fragmento tiene 2 adaptadores B se separarn las cadenas pero
ambas permanecern unidas a las esferas. Como resultado se liberan de las esferas los fragmentos de
cadena simple que tienen un adaptador de cada clase con el B situado en el extremo 5 del fragmento, ya
que los fragmentos complementarios a estos permanecern unidos por el extremo 3 del adaptador B.
Para el proceso de amplificacin:
4. los fragmentos libres de cadena simple se unen a otras esferas que tienen un gran nmero de secuencias
complementarias del A. Esta unin est optimizada para que solo se una un fragmento a una esfera.
5. Una vez unidos los fragmentos a las esferas se introducen en una emulsin de agua y aceite de forma que
cada esfera quede dentro de una gota con todos los reactivos y enzimas necesarios para la PCR.
6. Tras una serie de termociclos de PCR se habrn generado en cada esfera un gran nmero de secuencias
de doble cadena idnticas y unidas por el adaptador A.
7. Las esferas se someten a alta concentracin de NaOH para separar cadenas complementarias. Con el fin
que cada esfera tenga adherido a su superficie gran nmero de cadenas simples idnticas unidas en el 3.
Antes de empezar la secuenciacin en s misma:
8. se aaden cebadores complementarios al adaptador B en posicin 5, ADN polimerasas y los cofactores
necesarios para la sntesis de la cadena complementaria a los fragmentos unidos a las esferas.
9. cargar las esferas en un dispositivo conocido como PicoTiterPlate que es el que se introduce en el
secuenciador. Este dispositivo consta de ms de un milln de pocillos de 44 micras de dimetro de forma
que solo quepa una esfera con fragmentos de ADN por pocillo.
10. Adems de las esferas con ADN, se introducen otro tipo de esferas que contienen las enzimas necesarias
para detectar la incorporacin de nucletidos durante la sntesis de la cadena complementaria.
Estas enzimas son la sulfurilasa y la luciferasa. La sulfurilasa genera ATP a partir de pirofosfato y la
luciferasa se transforma en oxiluciferina en presencia de ATP con emisin de luz. De esta forma se
construye una cascada enzimtica que empieza cuando la ADN polimerasa incorpora un nucletido a la
cadena creciente complementaria del ADN a secuenciar liberando un pirofosfato y termina cuando la
luciferasa emite luz.
11. Una vez cargadas las esferas con ADN y las esferas con enzimas, el PicoTiterPlate se introduce en el
secuenciador. El secuenciador automatiza el proceso de secuenciacin, la captura de imgenes y su
interpretacin. El secuenciador vierte automticamente sobre los pocillos los reactivos necesarios y un
tipo de nucletido cada vez. As de forma cclica se irn vertiendo As, Cs, Gs y Ts. En cada pocillo, la
ADN polimerasa aadir uno o ms nucletidos dependiendo de la secuencia que acta como molde y se
emitir luz con una intensidad proporcional al nmerro de nucletidos incorporados a la nueva cadena
que se va sintetizando durante el proceso de secuenciacin. El secuenciador consta de un sistema ptico
especial que recoge el patrn de destellos luminosos que se emiten en el PicoTiterPlate. Mediante
programas informticos se interpretan estos patrones de luz y se generan unas grficas que indican si ha
habido incorporacin o no de nucletidos y su nmero.
12. se lava el exceso de nucletidos y reactivos y se repite el proceso con otro tipo de nucletido de forma
cclica hasta que finalice la sntesis de una cadena complementaria a la cadena que acta como molde. El
resultado es la secuenciacin de los fragmentos que hay en cada pocillo.
En los adaptadores hay unas secuencias conocidas que sirven para calibrar los aparatos de recepcin e interpretacin
de imgenes. Uno de los defectos de este sistema es la prdida de precisin en las regiones homopolimricas. La
posibilidad de automatizar y de paralelizar el proceso de secuenciacin que ofrece esta tcnica es una de las
principales ventajas frente a otros mtodos de secuenciacin. La pirosecuenciacin permite la secuenciacin de
grandes cantidades de ADN en menos tiempo que otras tcnicas y con un coste menor.