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INTRODUCCION
La Termobacteriologa surge como una disciplina alternativa a la microbiologa de los alimentos
con el fin de entender los fundamentos que el uso del calor acaece sobre los microorganismos y
los propios alimentos, as mismo busca desarrollar y aplicar nuevas metodologas que permitan
elaborar y asegurar la calidad y seguridad de los alimentos. La determinacin de la vida til de
un alimento puede establecerse de diversas maneras, algunas de ellas resultan ser un tanto
ortodoxas por cuanto no aplican una metodologa cientfica y los resultados obtenidos son fruto
de la experiencia y la cotidianeidad, en otros casos la vida til suele establecerse sobre la base
de datos tericos o sobre referencias bien sean a partir de fuentes bibliogrficas o por
observacin de los tiempos de vida til de productos similares que se encuentran en el
mercado.
A travs de este manual se explicaran las diferentes herramientas que pueden usarse de forma
experimental para obtener resultados confiables en cuanto a la determinacin de los diferentes
baremos de termodestruccin, as como al clculo de los tratamientos trmicos sin que afecten
en gran medida los valores nutricionales y cualitativos de los alimentos. Se pretende que las
personas que consulten esta obra adquieran los conocimientos fundamentales que les permita
desempearse de la mejor forma en esta rea del que hacer cientfico aplicado a la
agroindustria.
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NORMAS DE SEGURIDAD
La bioseguridad comprende el conjunto de medidas preventivas destinadas a proteger la salud
del personal frente a riesgos por agentes, biolgicos, qumicos y/o fsicos en las reas de
trabajo del laboratorio, as corro medidas de seguridad aplicables a los edificios e instalaciones
donde se realicen las actividades. Su objetivo es crear un ambiente de trabajo SEGURO Y
ORDENADO que permita alcanzar la productividad ptima.
Reglas bsicas de seguridad:
Usar ropa adecuada (bata manga larga abotonada y limpia, zapatos cerrados y limpios, uso
de cofia y tapabocas).
No permitir el acceso a las reas de trabajo sin la debida precaucin. Respetar las reas de
acceso restringido; no ingresar inmediatamente a cuartos de siembra previamente
esterilizados con radiacin ultravioleta.
Al iniciar y finalizar las prcticas, lavarse las manos con agua y jabn
Flamee el asa antes y despus de usarla.
El lugar de trabajo debe estar siempre limpio y ordenado. Antes de comenzar cada prctica
es conveniente desinfectar la superficie de trabajo. Los desinfectantes ms habituales para
este propsito son la leja y el alcohol (etanol 96), o una solucin de hipoclorito a 15 - 20
ppm.
Los microorganismos deben manejarse siempre alrededor de la llama. Se deben evitar los
desplazamientos innecesarios con el asa bacteriolgica cargada con algn microorganismo
por el laboratorio, ya que pueden crear corrientes que originen contaminaciones, aerosoles
o producir accidentes.
Durante las prcticas est prohibido comer, beber, fumar o mascar chicle.
Cuando se manipulan microorganismos hay que evitar llevarse las manos a la boca, nariz,
ojos, etc.
No portar maquillaje o aplicarse cosmticos en el laboratorio.
Emplear pipeteadores para la transferencia de volmenes y colocar algodn, est prohibido
pipetear soluciones con la boca (reactivos, sueros y soluciones en general).
Libros, carpetas, abrigos y cualquier otro material que no se utilice en la realizacin de la
prctica deben estar apartados del lugar de trabajo.
Para deshacernos del material contaminado utilizaremos los recipientes adecuados. Estos
recipientes sern esterilizados posteriormente. Nunca se debe tirar nada por el fregadero o
a la basura comn.
Bajo ningn concepto debe sacarse ninguna muestra contaminada del laboratorio.
El suministro de gas para los mecheros Bunsen requiere las precauciones propias de estas
instalaciones. Los escapes de gas son muy peligrosos, por lo que hay que cerrar todas las
llaves de paso de gas al finalizar la prctica, evitar la presencia de sustancias inflamables y
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Todo el equipo elctrico debe estar apropiadamente conectado a tierra y debe tomarse la
preocupacin de no sobrecargar los circuitos. No manipular con las manos hmedas o sin
conocer adecuadamente su funcionamiento.
En el laboratorio esta estrictamente prohibido el uso extensiones elctricas y artefactos
domsticos, como cafeteras o calentadores elctricos.
El personal de laboratorio debe informar al supervisor sobre cualquier choque elctrico con
el uso del aparato. Nunca debe intentarse la reparacin mientras el dispositivo esta
conectado con el circuito elctrico.
Los tanques de gases comprimidos deben asegurarse bien a la pared y el nombre de su
contenido debe estar claramente indicado en la etiqueta.
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NIVEL DE RIESGO
Para el desarrollo en general de este curso se han definido en cada una de las prcticas el nivel
de riesgo, sin embargo de forma genrica para las actividades escritas en este manual se ha
definido un Nivel de Riesgo Medio o Nivel 2, ya que se manejaran microorganismos
considerados oportunistas y que en algn momento por malas prcticas de laboratorio pueden
conllevar algn peligro para los manipuladores. Por tanto, todo estudiante, auxiliar y docente
que oriente e intervenga en el desarrollo de este curso deber usar los siguientes
equipamientos:
Bata de Laboratorio manga larga, Guantes, Cofia, Tapabocas, Zapato Cerrado Bajo,
Pantaln Largo
Nota 1: el docente ser el responsable de velar por el cumplimiento de los elementos descritos
anteriormente.
Nota 2: cada estudiante deber portar un kit de trabajo conteniendo mnimo los siguientes
elementos:
Pipeteador, Tijeras, Cinta de enmascarar, Marcador para vidrio, Jabn lquido, en polvo
o en barra antibacterial, Toalla absorbente, Porta y Cubre objetos, Guantes
desechables de ltex, Gasa, Algodn, Asas de platino redonda, recta y de Driglasky
(hockey), encendedor o fsforos.
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1.2.3.1. Coadyuvantes del escaldado: El efecto del calor puede ser acentuado por medio de
sustancias qumicas, para mejorar su efecto sobre el vegetal. El tratamiento trmico
debe ser lo suficientemente elevado para inactivar enzimas y lo suficientemente suave
como para no alterar el tejido vegetal. En algunos casos stas sustancias protegen al
vegetal. Las siguientes son algunos ejemplos de estas sustancias denominadas
coadyuvantes del escaldado:
Sal: eleva la presin osmtica del medio sensibilizando las bacterias.
cido ascrbico: fuerte antioxidante que regulas las reacciones oxidativas de
deterioro.
cido ctrico: acidulante fuerte, reduce el pH lo que sensibiliza a las enzimas y de
paso a los microorganismos.
Sal soluble de calcio: endurece el tejido de algunos vegetales (trozos de manzana,
tomate, etc.) por su reaccin con las pectinas.
Carbonato de sodio: protege a la clorofila, pero afecta la tiamina y la vitamina C.
Fosfatos: reducen la oxidacin de los carotenos.
Sulfitos: evita el pardeamiento enzimtico durante la deshidratacin.
1.2.4. Enzimas alterantes de los alimentos: como hemos mencionado, el principal papel del
escaldado es la inactivacin de enzimas que alteran el producto, sin interesar su origen.
Estas enzimas alterantes puede ser tanto endocelulares como exocelulares y pueden
provenir del tejido vegetal o enzimas microbianas, las cuales pueden actuar a pesar de que
los microorganismos se hallen destruidos. Las enzimas dainas se pueden clasificar en tres
grupos, as:
OXIDATIVAS: Son poco especficas y alteran, generalmente, al mismo tiempo el
color, aroma y otros caracteres del producto. Son las ms termorresistentes.
Ejemplos:
Catalasa:
H2O2 H2O + 1/2O2
Peroxidasa: H2O + 2AH 2H2O + 2A
Deshidrogenacin directa
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1.4. REACTIVOS
1.5. PROCEDIMIENTO
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Nivel 2: Riesgo Medio (Bata de Laboratorio, Guantes, Cofia, Tapabocas, Zapato Cerrado
Bajo, Pantaln Largo).
1.7. BIBLIOGRAFA
Arias, B.P., Gonzlez, M.C., Llanes, L.Y. (2003). Actividad peroxidasa, polifenoloxidasa,
fenilalanina amonio liasa y Glucanasa en somaclones y mutantes de arroz. Rev.
Proteccin Veg., vol. 18, No. 3: 183 188.
Avallone, C.M., Cravzov, A.L., Montenegro, S.B., Pellizzari, E.E. (2001). Estudio de la
actividad peroxidasa, pectinesterasa y polifeniloxidasa en extracto enzimtico de sanda
(Citrullus vulgaris Schard). Resmen T-074. Ciencia y Tcnica, comunicaciones cientficas
y tecnolgicas 2001. Universidad Nacional del Nordeste, Argentina. Disponible en:
http://www.unne.ed.ar/Web/cyt/cyt/2001/cyt.htm, vnculo Tecnolgicas.
Braverman, J.B.S. (1963). Introduction to the biochemistry of foods. Elsevier.
Pennacchiotti, M. (1998). Captulo 2: Las Enzimas, apartado 3, aplicaciones de las
enzimas. En: Las Protenas: generalidades y su importancia en nutricin y en la industria
de alimentos. Edicin Digital, Universidad de Chile. Disponible en internet:
http://mazinger.sisib.uchile.cl/repositorio/lb/ciencias_quimicas_y_farmaceuticas/penacchiot
tii01/. Fecha de acceso: 1 de marzo de 2008.
Schmidt, H., Pennacchiotti, I. (2001a). Captulo 3: Determinacin de Catalasa en
Vegetales. En: Las enzimas en los alimentos, su importancia en la qumica y la tecnologa
de los alimentos. Edicin digital. Biblioteca digital, Universidad de Chile. Disponible en
internet:
http://mazinger.sisib.uchile.cl/repositorio/lb/ciencias_quimicas_y_farmaceuticas/schmidth0
2/. Fecha de acceso: 1 de marzo de 2008
Schmidt, H., Pennacchiotti, I. (2001b). Captulo 2: Determinacin de Actividad Peroxisada
y de su Regeneracin. En: Las enzimas en los alimentos, su importancia en la qumica y la
tecnologa de los alimentos. Edicin digital. Biblioteca digital, Universidad de Chile.
Disponible
en
internet:
http://mazinger.sisib.uchile.cl/repositorio/lb/ciencias_quimicas_y_farmaceuticas/schmidth0
2/. Fecha de acceso: 1 de marzo de 2008.
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fuerza electromotriz generada por el termopar est en funcin de la diferencia entre la unin
fra y caliente, pero ms especficamente, esta es generada como resultado de los
gradientes de temperatura los cuales existen a lo largo de la longitud de los conductores.
El termopar (Figura 2.2) fue inventado por el fsico y mdico alemn Thomas Johann
Seebeck entre los aos 18211822. l descubri que una corriente elctrica flua a travs
de un circuito cerrado formado por dos metales distintos cuando cada una de sus uniones
son calentadas a distintas temperaturas, este se constituye como el fundamento de los
termopares y a este evento se le denomina el efecto o tensin de Seebeck o Fuerza
Electromotrz (FEM) (Figura 2.3, a y b).
Figura 2.2. Representacin de un termopar
b
Si abrimos este circuito, obtenemos una diferencia de potencial pequea (milivolts), la cual
es directamente proporcional a la temperatura de la unin y a la composicin de los dos
metales (Figura 2.4)
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Tabla 2.1. Tipos de termopares (Denominacin, composicin, rango de temperatura y color base
para identificacin).
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vstago, la lata puede cerrarse fcilmente en todos los tipos de mquinas cerradoras.
Son pocos los partidarios de usar termopares cuyos vstagos van protegidos por fundas
metlicas, por lo que prefieren los que poseen fundas o cubiertas de material no
conductor, lo que evita el riesgo de conduccin del calor desde el centro del bote a lo
largo de la cubierta del termopar. En el calentamiento por conduccin de los botes
pueden originarse errores al transmitirse el calor por los alambres del propio termopar.
Para evitarlo ECKLUDED ha elaborado una tabla de factores de correccin que deben
aplicarse a los valores J, sealando adems que los errores se originan en su mayor
proporcin en las fases iniciales de calentamiento y enfriamiento, para trabajar con
precisin se necesitan termopares construidos con alambres finos, aplicando cuando sea
conveniente factores de correccin de temperatura.
La posicin en que debe situarse el par caliente depende de las propiedades fsicas del
alimento y para comprenderlo es necesario conocer a su travs. Como se ha explicado
en la prctica anterior, en los alimentos slidos el calor se transmite por conduccin y el
proceso es relativamente lento, mientras que en los lquidos el calor se transmite
principalmente por conveccin y la elevacin trmica es ms rpida, puesto que existe
un movimiento continuo del material, de tal modo que las diferencias trmicas dentro del
bote son mnimas en cualquier instante del proceso. En contenidos slidos los alambres
termopares, usualmente requieren soportes no especiales, pero en contenidos lquidos,
es necesario soportar los alambres sobre una fibra de vidrio o pasando ellos a travs de
sellos sobre los lados opuestos a la lata. Los alambres deben ser dejados algo flojos
para permitir la expansin de la lata y abultamiento de las terminaciones durante el
calentamiento. Estos mtodos por ajustamiento de termopares dentro de las latas
permiten que las medidas sean hechas desde cualquier tamao y forma, con un mnimo
de equipo y costo.
2.2.3. Medicin del punto fro en los alimentos enlatados: No todos los puntos de un
recipiente que est siendo calentado se encuentra a la misma temperatura. La zona de
calentamiento ms lenta es llamada el punto fro de un recipiente y es esta zona la ms
difcil de esterilizar, debido al retraso en el calentamiento. En los productos calentados
principalmente por conveccin el punto fro est sobre el eje vertical cerca del fondo del
recipiente. Los productos calentados por conduccin tienen el punto de calentamiento
ms lento aproximndose al centro del recipiente sobre el eje principal. Para determinar
donde se encuentra el punto fro de un alimento puede seguirse la siguiente
metodologa:
Una abertura de 1,8 pulgadas (4,57 cm) de dimetro es perforada en la pared
cilndrica de la lata opuesta al punto propuesto de medida. Un tubo de cobre de 3,4
pulgadas (8,64 cm) de longitud y 1,4 pulgadas (3,56 cm) de dimetro es soldado a la
pared de la lata circundante a la abertura, los alambres termopares son pasados a travs
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del tubo y la abertura hacia el interior de la lata. Los alambres son entonces sellados
dentro del tubo de cobre con una resina basada en epoxi que coloca la temperatura en el
espacio cuando un endurecedor es agregado.
Cuando alambres finos son usados, un sello hermtico al vacio puede ser
obtenido sin el tubo de cobre simplemente con perforar la lata y colocando el alambre
dentro de esta abertura con la resina. Las latas ajustadas con termopares por el segundo
mtodo pueden ser pasadas a travs de muchos tipos de equipos exhaustivos y
cerrados si los alambres son enrollados alrededor de la lata y mantenidos en esa
posicin con cinta adhesiva. Las latas sometidas a experimentos pueden ser entonces
incluidas en una extensa produccin de latas para reproducir condiciones comerciales
tan cuidadosamente como sea posible.
Las cajas de empaquetadoras son soldadas a la lata comenzando a pulgada
(1,27 cm) del fondo de la primera lata, de pulgadas (1,91 cm) del fondo de la segunda
lata, 1 pulgada (2,54 cm) del fondo de la tercera lata, 1 de pulgadas (3,18 cm) del
fondo de la cuarta lata, y as sucesivamente cada de pulgada (0,635 cm) superior a la
del termopar de la lata anterior.
El producto se prepara y se mantiene un llenado uniforme en todos los
recipientes, dejando un espacio de cabeza mnimo del 6% y mximo un 10% de la
capacidad de la lata (medido en trminos de volumen). Las latas se sellan, y los
termopares quedan fijados en cada recipiente, quedando disponibles con termopares
localizados cada de pulgada del fondo de las latas comenzando con la primera a
pulgada del fondo de la misma (Figura 2.6).
Las latas son colocadas luego en una retorta (Autoclave), la cual es llevada a la
temperatura deseada, con la debida precaucin para eliminar el aire. Las temperaturas
son registradas cada minuto manualmente o de forma automtica si se dispone de algn
software adecuado (por ejemplo irMOTIOM premium) o si se usa un potencimetro voltmetro registrador, los valores tiempo-temperatura sern graficados en papel
semilogartmico, lo que da una lnea recta con desviaciones menores para la relacin
entre el tiempo y la temperatura.
Finalmente, una vez localizado el punto frio del alimento, todos los estudios
subsecuentes de penetracin de calor, valores de esterilizacin o pasteurizacin, etc., se
harn ubicando siempre los empalmes de los termopares en la distancia calculada como
dicho punto.
2.3. MATERIALES, EQUIPOS E INSUMOS
Para esta prctica no se utilizaran termopares sino 6 termmetros de 10 100C.
6 frascos de vidrio resistentes al calor con sus respectivas tapas.
1 bao serolgico ajustado a una temperatura de 70C, 80C o la indicada por el
profesor.
Papel milimetrado.
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Figura 2.6. Forma de insercin de los termopares para estudios de penetracin de calor.
2.4. REACTIVOS
No requiere
2.5. PROCEDIMIENTO
Se toman las tapas y se perforan justo en el centro de las mismas.
Se adiciona un volumen conocido de agua o el producto que indique el profesor en los
recipientes, dependiendo de la capacidad de los mismos. Se debe procurar dejar un
espacio de cabeza que no sea menor al 6% del volumen del recipiente, ni mayor al 10%.
En todos los botes deber adicionarse la misma cantidad.
Se tapan los botes, se introducen los termmetros a distintas profundidades
comenzando por ubicar el bulbo a 1,25 cm del fondo del primer bote. El segundo
termmetro se ubica a 1,9 cm del fondo, el tercero a 2,5 cm, el cuarto termmetro a 3,13
cm, el quinto a 3,75 cm y el sexto termmetro a 4,38 cm del fondo. En la medida que se
disponga de ms termmetros y botes, se ubicaran cada de altura a la
inmediatamente anterior.
Se introducen todos los botes en el bao serolgico y se toman los datos de temperatura
en intervalos de 1 minuto hasta alcanzar la temperatura de proceso establecida.
Construir la grfica Temperatura vs tiempo para cada bote en papel milimetrado y
determinar la curva de ms lento calentamiento.
En este punto se ubicara el punto frio del producto.
2.6. NIVEL DE RIESGO
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Para el desarrollo de la presente prctica se ha definido un Nivel de Riesgo Medio o Nivel 2. Por
tanto, todo estudiante, auxiliar y docente que oriente e intervenga en el desarrollo de la misma
deber usar los siguientes equipamientos:
Bata de Laboratorio manga larga, Guantes, Cofia, Tapabocas, Zapato Cerrado Bajo,
Pantaln Largo.
2.7. BIBLIOGRAFA
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Termopares
Punto fro
En la figura 3.2 puede verse diversos ejemplos de las curvas tpicas de penetracin de calor
dependiendo de la naturaleza de la matriz alimentaria, destacndo tres ejemplos:
a. Producto muy mvil de viscosidad bastante baja, agitado enrgicamente (por
ejemplo, un zumo de frutas calentado en capas finas y en circulacin rpida en un
intercambiador de calor). la transmisin del calor ocurre por conveccin y la
temperatura de tratamiento se consigue casi instantneamente, es decir, en un
tiempo despreciable.
b. Producto mvil poro no agitado (por ejemplo, frutas en almbar ligero o una crema
de verduras). La trasferencia de calor tiene lugar especialmente por conveccin; en
ste caso las corrientes de conveccin se deben a diferencias en la temperatura y,
como consecuencia de esto, de densidad entre las capas del producto prximas a
las paredes del recipiente y de las proporciones que estn ms alejadas.
c. El producto est constituido por una masa slida compacta (ej.: pat de hgado) o
por un lquido de muy alta viscosidad (ej.: solucin de almidn o soluciones pcticas
por encima de determinadas concentraciones), aqu la propagacin del calor se
hace por conduccin, es decir, por transmisin gradual de vibraciones trmicas de
molcula a molcula en la masa del producto, desde las paredes del recipiente
hasta el punto fro.
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Temperatura (C)
120
110
100
10
20
30
40
Tiempo (min)
400 ml de un producto fluido (sin leche). El instructor asignara a cada grupo un producto
diferente, p.ej. Bebida de malta, jugo de fruta en agua, sopas, bebida gaseada, etc.
1 Fiola estril de 500 ml de capacidad.
1 Termmetro de 10 250 C.
1 Bao serolgico.
Mnimo 10 pipetas estriles de 1 mL de capacidad.
12 Cajas de petri estriles.
3.4. REACTIVOS
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3.5. PROCEDIMIENTO
Tomar aproximadamente 300 ml de producto en una fiola estril de 500 ml de
capacidad. Realizar recuento de aerobios msofilos de las diluciones 10-2 y 10-3.. Si su
producto se trata de una muestra comercial realizar recuento de las diluciones 10-1 y 102.
Tomar la temperatura inicial e iniciar el calentamiento.
Verificar la temperatura del producto en el punto frio, a intervalos de 2 minutos, segn
sea la velocidad de transmisin de calor (puede ser ms amplio o ms reducido), hasta
llegar a una temperatura constante que se repita 3 o 4 veces.
En este punto se toma de la muestra 1 ml para realizar otro recuento de aerobios
mesfilos a partir de las diluciones 10-1 y 10-2.
Se siguen con el enfriamiento rpido en agitacin y ayudados con un chorro de agua
fran, hasta llevar el producto a una temperatura aproximada de 35C, siempre haciendo
seguimiento de la temperatura cada 2 minutos (o segn el intervalo establecido para
cada producto).
En este punto se hace un ltimo recuento de aerobios mesfilos de las diluciones 10-1 y
10-2.
Construir la grfica de penetracin de calor para el producto, y comparar las cargas en
cada uno de los tres puntos.
Determine la velocidad de penetracin de calor para cada producto y discuta el porque
de los resultados.
3.6. NIVEL DE RIESGO
Para el desarrollo de la presente prctica se ha definido un Nivel de Riesgo Medio o Nivel 2, ya
que se manejaran microorganismos considerados oportunistas y que en algn momento por
malas prcticas de laboratorio pueden conllevar algn peligro para los manipuladores. Por tanto,
todo estudiante, auxiliar y docente que oriente e intervenga en el desarrollo de la misma deber
usar los siguientes equipamientos:
Bata de Laboratorio manga larga, Guantes, Cofia, Tapabocas, Zapato Cerrado Bajo,
Pantaln Largo.
3.7. BIBLIOGRAFA
Board, R.G. (1998). Introduccin a la microbiologa moderna de los alimentos. Editorial
Acribia S.A., Zaragoza, Espaa.
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negativa define la velocidad de destruccin. Sin embargo, el ndice germicida solo nos dice que
fraccin de la poblacin inicial sobrevive a un periodo determinado de exposicin al agente
antimicrobiano. Para determinar el nmero real de sobrevivientes es necesario conocer el
tamao inicial de la poblacin. Esta relacin se expresa de forma matemtica por la frmula:
Donde,
N0 = nmero inicial de microorganismos
Nf = nmero final de supervivientes despus del tiempo t.
Tericamente se ha descrito que la destruccin de una poblacin bacteriana sigue un orden
matemtico progresivo, que obedece a un descenso exponencial (o logartmico, si se desea
linealizar). Esto es comn para todas las bacterias, pero cada una de ellas difiere en su
velocidad de destruccin, la cual se halla reflejada en la pendiente de la grfica. Esta velocidad
ser la que determine el grado de resistencia del microorganismo a las altas temperaturas, por lo
tanto sta ser diferente para cada especie bacteriana; constituyndose en una importante
herramienta para la medida de la termorresistencia bacteriana.
Como puede observarse en la figura 4.1, la pendiente negativa de la curva obtenida refleja la
tasa de destruccin a esa temperatura en especial; pero dicha tasa es independiente del nmero
inicial de bacterias y se ve influenciada por un sinnmero de factores.
Log No de sobrevivientes
Figura 4.1. Grfica de la velocidad de muerte bacteriana o TDT (Thermal Destruction Time).
0
10
20
30
40
Tiempo (min)
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Tiempo (min)
Presin (lb)
Tiempo (min)
121
15
15
126
10
20
134
30
140
180
150
150
160
120
170
60
D=
1
;
m
m=
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1
D
Ntese el signo negativo como una compensacin ya que la pendiente en todos los casos ser
negativa, y por tanto el tiempo de reduccin positivo.
La grfica TDT clsica, que se obtiene al realizar un estudio de termorresistencia a un
microorganismo cualquiera, es la siguiente (Figura 4.2):
Log # m.o
(xa; ya)
log a 4
y
log b 3
(xb; yb)
x
Y = mx + b
y = -x/D + b
0
0
10
15
ta
tb
20
25
30
35
Tiempo (min)
m=
y
x
yb ya
xb xa
m=
1
D
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(4.2)
1 log b log a
=
(4.3)
D
tb ta
Despejando D, obtenemos:
(1) * (tb ta )
D=
(4.4)
log b log a
Donde (tb ta), es considerado como el tiempo en que la poblacin inicial que tena una
concentracin de log a, se redujo a una poblacin final con una carga de log b; sta diferencia
de tiempo, es decir, el tiempo en que disminuir el nmero de microorganismos desde una
poblacin conocida hasta una poblacin final estipulada y debido a que siempre ser una
diferencia as est como un producto se conoce como t. Este t, se puede hallar si se conoce
el valor D del microorganismo en estudio, as (debemos recordar que t es negativo en la
ecuacin del valor D, ya que se trata de un diferencial: tb ta):
t
D=
(4.5)
(log b log a )
Entonces,
O lo que es lo mismo:
t = D * (log a log b)
(4.6)
Ntese que en la anterior ecuacin el diferencial de la poblacin se ha invertido, de tal forma que
el diferencial de tiempo es positivo. Si la diferencia de poblaciones log a log b es igual a uno,
entonces el valor D ser igual a la duracin del tratamiento trmico t, as:
D=
t
; es decri: D = t
1
(4.7)
En una grfica TDT, la recta tericamente, se puede prolongar por debajo del eje x, hasta la
zona de los negativos en el eje y, as por ejemplo, luego de a minutos de proceso la curva se
ubicar en el punto -2. Si lo anterior llega a suceder, debe interpretarse estadsticamente en
trminos de probabilidad; es decir:
Antilog de 2: log 1 2 = 0,01
Esto no indica que una centsima parte de una bacteria o endospora por gramo o mililitro ha
sobrevivido en la muestra, como sera de suponer matemticamente; lo que esta cifra quiere
decir, es que a esa temperatura y durante ese tiempo, existe la posibilidad de que en 100 g de
producto, sobreviva una bacteria o endospora. De tal manera que cuando la grfica llega en el
eje y hasta 3, una bacteria sobrevivir en 1000 g del producto.
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Por lo anterior es evidente que la poblacin no puede nunca quedar reducida a cero, de lo que
se infiere que si se somete cierto nmero de recipientes conteniendo una poblacin conocida, a
un determinado tratamiento trmico, siempre existir la probabilidad de supervivencia de al
menos un microorganismo en alguna lata. Estos hechos son muy tiles en la elaboracin de los
clculos del diseo de un tratamiento trmico, para un producto en especial que va a ser
sometido a una appertizacin.
Si bien el tiempo de reduccin decimal (valor D) resulta til como parmetro para evaluar la
termorresistencia microbiana, presenta una serie de limitaciones, y entre ellas la ms importante
es que restringe ver la supervivencia de los microorganismos frente a una sola temperatura, que
es la que permanece constante durante el ensayo. Esta limitante conduce a la formulacin de un
nuevo parmetro de termorresistencia denominado valor z, el cual permite realizar un
seguimiento ms global del comportamiento microbiano durante diferentes temperaturas. As, si
se conocen por lo menos dos valores de termorresistencia es posible determinar este nuevo
valor como veremos en la siguiente actividad.
4.2.3. Determinacin del valor D para cultivos asporgenos por el mtodo de los tubos
mltiples o de Bigelow: Este mtodo desarrollado por Bigelow en 1923 es denominado el
mtodo de los tubos TDT consiste en la determinacin del nmero de supervivientes para cada
intervalo de tiempo de exposicin a la temperatura de proceso, obteniendo as un recuento final
para cada tiempo, y posteriormente graficando dichos recuentos en trminos de log10 versus
tiempo. Se calcula la pendiente y el inverso de la misma corresponde al valor D del cultivo.
Diluir un caldo de cultivo de 24 horas (por ejemplo de Escherichia coli), para obtener un
recuento total alrededor de 3x108 clulas por ml. (Esto puede ser determinado por conteo
microscpico, o por nefelometra o por la opacidad de tubos (McFarland) si estos han sido
calibrados usando conteos microscpicos.
Colocar 10 ml de esta dilucin en 90 ml de diluyente estril (por ejemplo agua peptonada al
0,1%) contenido en un recipiente de vidrio. Agitar bien para mezclar y romper los posibles
agregados. Distribuir cantidades de 5 ml en 5 tubos de ensayo estriles de 150 x 16 mm
(preferiblemente con tapa de rosca o de polipropileno).
Colocar simultneamente los tubos preparados anteriormente en un bao de agua a 58C
con un tubo control de temperatura conteniendo un termmetro y 5 ml de diluyente. Cuando
la temperatura del contenido del tubo control alcance 1C por debajo de la temperatura del
bao, remueva uno de los tubos (t0) e inmediatamente iniciar el conteo de tiempo desde este
momento.
Rpidamente enfriar el tubo removido en agua refrigerada. Preparar seis diluciones decimales
y realizar un recuento total en placa con todas estas diluciones.
Retirar otro tubo y repetir el paso 4 despus de cada una de los siguientes tiempos: 2
minutos, 5 minutos, 7 minutos y 10 minutos.
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UFC/ml
Log10 UFC/ml
10000000
7,00
6900000
6,84
540000
5,73
23000
4,36
10
1000
Figura 4.3a. Grfica TDT para la determinacin del valor D del ejemplo de la tabla 4.2.
8,00
7,00
Log10 ufc/ml
6,00
5,00
4,00
m = -0,4191
R2 = 0,9481
R = 0,9737
3,00
2,00
1,00
0,00
0
10
12
Tiempo (min)
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Figura 4.3b. Grfica TDT para la determinacin del valor D del ejemplo de la tabla 4.2.
8,00
7,00
Log10 ufc/ml
6,00
5,00
4,00
m = -0,5155
R2 = 0,9976
R = 0,9988
3,00
2,00
1,00
0,00
0
10
12
Tiempo (min)
Tal y como puede verse en la figura 4.3a el coeficiente de correlacin para todos los datos de
supervivientes vs tiempo es de 0,9737 mientras que para los datos de la figura 4.3b (tiempos
2 hasta 10 min) dicho valor fue 0,9988. De acuerdo con lo anterior, el valor D se
establecer como el recproco de la pendiente para la figura 4.3b; correspondiendo este valor
D58C a 1,94 minutos.
4.2.4. Determinacin del valor D por el mtodo de presencia ausencia o de Halvorson y
Ziegler: Tambin existe otra metodologa para calcular el valor D en aquellos casos donde, se
emplee un mtodo semi-cuantitativo (Nmero ms Probable). Para dicho procedimiento se
empleara una serie de tubos expuestos a diferentes temperaturas y tiempos, para
posteriormente incubarlos y determinar ausencia o presencia de crecimiento. Esta tcnica fue
descrita por Halvorson y Ziegler en 1933, la cual es ampliamente utilizada en
Termobacteriologa. Cuando una gran cantidad de unidades de un lote que contienen N0 de
microorganismos vivos se somete a un tratamiento letal, la letalidad del tratamiento es medida
por comparacin del N0 y el nivel de organismos supervivientes Ns. De acuerdo con Halvorson y
Ziegler (1933) el nmero promedio esperado de microorganismos por unidad experimental
[sometidos a tratamientos letales o no] puede ser calculado solo si una fraccin de las unidades
experimentales [tubos, latas, tarros, frascos, etc.] es estril, es decir, no contiene organismos
vivos. La relacin de Halvorson y Ziegler [Hz] para determinar el nmero de supervivientes es la
siguiente (ecuacin 4.8a y 4.8b):
2,303
(4.8a)
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Donde:
n = nmero total de muestras sometidas a calentamiento
r = nmero de muestras sin crecimiento
Hz = nmero promedio esperado de microorganismos/unidad de muestra, cuando la fraccin de
muestras estriles [es decir, los que no presentaron crecimiento] es igual a Po.
Para este tipo de ensayo es necesario conocer la poblacin inicial antes de iniciado el tiempo de
sostenimiento del calentamiento.
Despus de obtener el Hz para cada tiempo se calcula el valor D para la temperatura en cuestin
con la ecuacin 4.9 (la cual es una modificacin de la ecuacin 4.4).
(4.9)
!"#$% &!"#'()
La ecuacin 4.9 tiene una aplicacin muy amplia en Termobacteriologa, donde usualmente
muchas unidades simples [tubos, tubos capilares, viales, frascos, latas, etc.] se someten de una
a un tratamiento trmico y la supervivencia se mide por la frecuencia de alteracin de las
unidades almacenadas y sin abrir despus de un tiempo y temperatura adecuada. Esta tcnica
es muy valiosa porque permite evaluar la probabilidad de supervivencia a un tratamiento dado en
el mismo sustrato donde se aplica la condicin letal. Es decir que refleja lo que ocurre en la
prctica.
El mtodo:
Diluir un caldo de cultivo de 24 horas (por ejemplo de Escherichia coli), para obtener un
recuento total alrededor de 3x108 clulas por ml. (Esto puede ser determinado por conteo
microscpico, o por nefelometra o por la opacidad de tubos (McFarland) si estos han sido
calibrados usando conteos microscpicos.
Colocar 10 ml de esta dilucin en 5 sets de 5 tubos de ensayo estriles de 150 x 16 mm
(preferiblemente con tapa de rosca o de polipropileno) cada uno. Adicionalmente colocar 10
ml de la dilucin de trabajo en otro tubo de ensayo estril y marcarlo como N0.
Colocar simultneamente los tubos preparados anteriormente en un bao de agua a 58C
con un tubo control de temperatura conteniendo un termmetro y 10 ml de diluyente. Cuando
la temperatura del contenido del tubo control alcance 1C por debajo de la temperatura del
bao, remueva uno de los sets de 5 tubos (t0) e inmediatamente iniciar el conteo de tiempo
desde este momento. Al mismo tiempo retire el tubo marcado como N0 y enfriar todos los
tubos removidos en agua refrigerada. A partir del tubo N0 preparar seis diluciones decimales y
realizar un recuento total en placa con todas estas diluciones, de esta forma determinamos la
poblacin al inicio del calentamiento.
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Retirar otro set de 5 tubos despus de cada una de los siguientes tiempos: 2 minutos, 5
minutos, 7 minutos y 10 minutos.
Incubar tanto las placas como los 5 sets de 5 tubos a 35C 2C durante 24 48 horas.
Con los recuentos obtenidos en las placas calcular la poblacin inicial (t0).
Determinar para cada set de tubos en cuntos de ellos se presenta crecimiento (turbidez) y
en cuntos de ellos no hay crecimiento.
A partir de la ecuacin 4.8 determine la relacin Hz para cada tiempo, y con estos datos
cuantifique el valor D58C (en minutos) a travs de la ecuacin 4.9.
Con los datos ilustrados en la tabla 4.3., vamos a calcular el valor D con este segundo mtodo.
Tabla 4.3. Ejemplo para el clculo del valor D por el mtodo de Halvorson y Ziegler.
Temperatura (C)
58
Nmero de tubos
Calentadas
Crecimiento
Ausencia
2,5
7,5
10
Para el clculo del valor D vamos a partir con el supuesto de que la poblacin inicial (tubo N0) es
1*107 ufc/ml (7,00 log10 ufc/ml).
Para el tiempo 0 minutos se obtuvo 5 tubos con crecimiento (P0 = 5/5).
Para el tiempo 2,5 minutos se obtuvo 4 de 5 tubos con crecimiento (P0 = 5/1).
Para el tiempo 5 minutos se observa que 3 de 5 tubos presentaron crecimiento (P0 = 5/2).
Para el tiempo 7,5 minutos se observa que 2 de 5 tubos presentaron crecimiento (P0 = 5/3).
Para el tiempo 10 minutos se observa que 1 de 5 tubos presentaron crecimiento (P0 = 5/4).
5
*,+ ,-. 2,303 / 1
1
Hz (2,5min) = 1,61
5
+23 2,303 / 1
2
Hz (5min) = 0,917
5
4,+23 2,303 / 1
3
Hz (7,5min) = 0,511
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5
5
23 2,303 / 1
4
Hz (10min) = 0,223
2,5 min
7 = 0,207)
5 AB = 0 AB
0,71 AB
7 = =0,038)
+79
+79
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4.4. REACTIVOS
Patrn de McFarland No 0,5.
Cepas de bacterias mantenidas a 35C en caldo BHI (en fase exponencial).
4.5. PROCEDIMIENTO
A partir de la cepa mantenida en caldo BHI se prepara una solucin patrn 0,5 de McFarland
(equivalente a una poblacin terica de 1,5x108 bact/ml).
A partir del patrn se toma una alicuota de 11 ml que se suspende y homogeniza en 99 ml
de solucin diluyente para disminuir 10 veces la concentracin y preparar una suspensin
de una poblacin terica aproximada de 1,5x107 bact/ml.
Se pasa 1 ml exacto de la suspensin, previamente homogenizada, a cada uno de los 6
tubos con 9 ml de agua peptona estril. De sta manera reducimos 10 veces la anterior
poblacin, es decir que supuestamente cada tubo tendr una concentracin de 1,5x106
bact/ml. Cada tubo se rotula con 9, 18, 27, 36, 45 y 54 minutos.
Se toma el tubo rotulado para 9 minutos, y se le realiza un recuento inicial para verificar la
concentracin de las suspensiones. El recuento se hace de la dilucin 103, por duplicado en
agar BHI.
En un bao serolgico, mantenido a una temperatura constante, indicada por el profesor
para cada microorganismo, se introducen los 6 tubos, manteniendo la temperatura
constante. Transcurridos los primeros 9 minutos, se toma el respectivo tubo, con la debida
asepsia, y se le realiza el correspondiente recuento de la siguiente manera: se lleva hasta la
dilucin 10-1, tomndose 1 y 0,1 ml para inocular en las placas de Petri estriles, cubriendo
con agar BHI fundido.
El procedimiento anterior se repite para cada tubo cuando se cumpla el tiempo respectivo de
exposicin a la temperatura indicada.
Se incuban las placas durante 24 48 horas a 37C, segn el microorganismo a ensayar. Se
hace la lectura correspondiente y se construye la grfica para especificar el valor D del
mismo.
4.6. NIVEL DE RIESGO
Para el desarrollo de la presente prctica se ha definido un Nivel de Riesgo Medio o Nivel 2, ya
que se manejaran microorganismos considerados oportunistas y que en algn momento por
malas prcticas de laboratorio pueden conllevar algn peligro para los manipuladores. Por tanto,
todo estudiante, auxiliar y docente que oriente e intervenga en el desarrollo de la misma deber
usar los siguientes equipamientos:
Bata de Laboratorio manga larga, Guantes, Cofia, Tapabocas, Zapato Cerrado Bajo,
Pantaln Largo.
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4.7. BIBLIOGRAFA
Brennan, J.G., Butters, J.R., Cowell, N.D. (1990). Heat processing 2. In: Food Engineering
Operations, Elsevier, UK, pp 297-302.
Mescle, J.F., Zucca, J. (1994). El comportamiento de los microorganismos en los
alimentos, la temperatura. En: Microbiologa alimentaria, volumen 1. Aspectos
microbiolgicos de la seguridad y calidad alimentaria. Editorial Acribia, S.A. Zaragoza,
Espaa. Pps. 7-50.
ICMSF. (2000). Temperatura, Captulo 1. En: Ecologa microbiana de los alimentos 1.
Factores que afectan a la supervivencia de los microorganismos en los alimentos. Editorial
Acribia, S.A. Zaragoza, Espaa. Pgs. 1-38.
Rahman, S.M., Guizani, N., Al-Ruzeiki, M.H. (2004). D- and Z-values of microflora in tuna
mince during moist- and dry-heating. Lebensm.-Wiss, u.-Technol., 37: 93-98.
Harrigan, W.F. (1998). Chapter 12, Section 12.4: Effect of heat on microorganisms: the
determination of decimal reduction times (D values) and z values. In: Laboratory Methods
in Food Microbiology. 3rd Edition. Academic Press, San Diego, California, USA. Pgs. 123127.
Halvorson, H.O., Ziegler, N.R. (1933). Applications of statistics to problems in bacteriology.
I. A means of determining bacterial populations by the dilution method. Journal of
Bacteriology, 25: 101-121.
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A partir de sta pendiente se deriva un ndice, que nos servir como otra herramienta para
evaluar la termorresistencia bacteriana, que al igual que el valor D, equivale al inverso de la
pendiente de la curva. Este ndice se conoce como Valor z o Constante de Resistencia
Trmica y se define, como la cantidad de calor (medida en F o C) que debe ser aumentado
necesaria para que la termorresistencia (medida en minutos, unidades del valor D), disminuya 10
veces; o dicho de otra manera, es el nmero en F o C que se necesita para que la curva
mencionada anteriormente, atraviese un ciclo logartmico, o que el tiempo de reduccin decimal
disminuya un 90% (ver figura 5.1).
Figura 5.1. Grfica TDT para determinacin del valor z.
Log Tiempo
(log D)
Y = mx + b
Log Da
y
Log Db
Tb Temperatura (F o
C)
La construccin de sta curva puede llevarse a cabo, como se ve es ms factible, realizando
diferentes estudios de termorresistencia a diversas temperaturas, para determinar los
correspondientes valores D, y posteriormente con estos datos construir la grfica, corregirla
estadsticamente, hallar su pendiente y determinar el correspondiente valor z, el cual es diferente
para cada microorganismo. A pesar de presentar una gran confiabilidad y ser ms exacto, ste
procedimiento implica tiempo y dinero. Como podemos apreciar en la figura 5.1. la pendiente
ser igual a:
y
m=
x
Ta
m=
log Db log Da
T b T a
(5.1a)
Donde IogDb representa el logaritmo base 10 del valor D obtenido (en minutos) en un ensayo a
la temperatura a. Debido a que la pendiente es el trmino que genera el valor z, tenemos que:
z=
1
m
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(5.1b)
(5.2)
Despejando z, obtenemos
Z=
(1) * (T b T a )
(log Db log Da )
Donde (Tb Ta) es el rango de temperatura en el cual el valor D desciende desde Da hasta
Db, y dado que sta expresin a pesar de la introduccin del trmino (-1) no deja de ser una
diferencia, se considera como una T, cuya ecuacin seria:
T
z=
(5.4)
(log Db log Da )
Esta diferencia de temperaturas, puede llegar a equivaler al valor z, siempre y cuando Db sea 10
veces menor que Da , ya que entonces la diferencia logartmica sera de 1, as :
(log Db log Da) = 1 , y, dado que.
(5.6)
El mtodo: Existe un procedimiento mucho ms corto y sencillo, pero menos exacto, aunque
preciso, ya que, podramos decir, es semi cuantitativo (no se basa en recuentos totales para
cada tiempo). Este mtodo se conoce con el nombre de la fraccin negativa de Brown o
"Presencia Ausencia" del crecimiento de microorganismos y se basa en la exposicin de un
nmero determinado de tubos con un medio de cultivo lquido con la misma concentracin del
microorganismo, a una temperatura determinada por varios periodos de tiempo.
Estos tubos se exponen, como ya se coment, durante un tiempo dado, existiendo diversos
tiempos estimados y cada grupo de tiempos corresponden a una determinada temperatura,
ensayndose varias temperaturas al mismo tiempo. En este procedimiento, en especial, se
tienen en cuenta los tiempos lmite a los cuales los tubos expuestos dejan de presentar
crecimiento.
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En la tabla 5.1, se ofrece un ejemplo obtenido con Clostridium sporogenes (PA 3679), en el
que se emplearon 6 tubos por cada tiempo y se ensayaron 6 tiempos de exposicin por cada
temperatura trabajada.
Tabla 5.1. Resultados obtenidos para la determinacin del valor Z de Cl. sporogenes (PA 3679)
por el mtodo ausencia-presencia.
Temperatura (F)
230
240
250
Nmero de muestras
Calentadas
Positivas
25
40
60
80
110
140
10
14
18
22
28
36
5,5
7,5
10
13
As, en este ejemplo, a 230F se observa que al finalizar los 110 minutos no existe supervivencia
en ningn tubo, pero s la hay, luego de 80 minutos de calentamiento a la misma temperatura; de
tal manera que el tiempo exacto de destruccin trmica es superior a 80 minutos pero inferior a
110, sin tener un sealamiento exacto entre estos dos datos. Para representar esto, los datos
obtenidos se ubican en el plano cartesiano que relaciona el logaritmo del tiempo de exposicin
contra las temperaturas ensayadas; de sta manera, se ubican los dos tiempos correspondientes
a la misma temperatura, procediendo de igual modo con cada temperatura ensayada, tal como
se aprecia en la grfica 5.2.
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Para hallar el valor z, se puede recurrir a varios procedimientos; uno que consiste en trazar una
lnea recta sobre todos los puntos originados por los datos que se encuentran por encima del
ptimo y otra recta por todos los puntos que se encuentren debajo, trazando un recta final que
pasar por el centro de todos los puntos y la cual ser la que se tome como referencia para
hallar z (como se aprecia en la figura 5.2). El otro procedimiento es ms fiable, y consiste, en
hallar el punto medio de los dos datos de tiempo obtenidos y con esos puntos medios trazar una
nica recta, que servir de referencia para determinar su pendiente y el correspondiente valor z,
como se observa en la figura 5.3.
Figura 5.2. Grfica TDT para determinacin del valor z por el mtodo ausencia presencia
(trazando las rectas para cada punto).
2,10
1,90
1,70
1,50
1,30
1,10
0,90
A
0,70
110
112
114
116
118
120
122
Temperatura (C)
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Figura 5.3. Grfica TDT para determinacin del valor z por el mtodo ausencia presencia
(empleando el punto medio de los datos).
2,10
1,90
1,70
1,50
1,30
1,10
0,90
B
0,70
110
112
114
116
118
120
122
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47 de 70
6
55
9 2,303 / 1
1
Hz (110C) = 1,792
6
55+9 2,303 / 1
4
Hz (115C) = 0,406
6
5*59 2,303 / 1
4
Hz (121C) = 0,406
En segundo lugar, procedemos a calcular el valor D aproximado para cada temperatura:
Log10Hz (110C) = 0,253
Log10Hz (115C) = -0,392
Log10Hz (121C) = -0,392
55
9
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48 de 70
80 = 0
11,56 AB
7,176 = 0,253
55+9
22 = 0
2,91 AB
7,176 = =0,392
5*59
5,5 = 0
0,73 AB
7,176 = =0,392
Log10 D (min)
0,80
0,60
0,40
0,20
0,00
108
110
-0,20
112
114
116
118
120
122
y = -0,1081x + 12,949
R = 1
Temperatura (C)
Con los datos de la pendiente se procede a calcular el valor z empleando la ecuacin 5.1b, lo
que nos da para este ejemplo un valor z de 9,25 C. Como podemos apreciar, este valor z es
muy aproximado al obtenido por el mtodo de la fraccin negativa de Brown.
Como ya hemos visto, el valor z es definido como el nmero de grados que la temperatura tiene
que subir (o bajar) para lograr una reduccin (aumento) del 90% en el valor D, o para que el
valor D disminuya (o aumente) por un factor de 10 veces. La forma ms comn de calcularlo es a
travs de la ecuacin 5.4. o 5.1b.
5 = *
E
*
E5
=1
A
Sin embargo, la representacin que se utiliza con mayor frecuencia entre los industriales es una
representacin del valor D basado en el modelo de Arrhenius, el cual se trata de un modelo
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EF*
19,15
GH
5.9
LnD (min)
2
1,5
1
0,5
0
0,00252
-0,5
0,00254
0,00256
0,00258
1/Temperatura (K)
0,0026
0,00262
y = 37561x - 95,621
R = 1
388,5*
19,15
312288,2
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9,26 I
En este caso vemos que el resultado es muy similar al obtenido con el mtodo de Halvorson y
Ziegler. Con los dos ltimos mtodos se obtienen regresiones con mejor ajuste (en este caso
ambos con R2 = 1), sin embargo, por experiencia el mtodo de Arrhenius es el que mejor bondad
presenta y de all la razn de su uso mayoritario en la industria.
5.3. MATERIALES, EQUIPOS E INSUMOS (por grupo de laboratorio)
Cepas de bacterias mantenidas a 35C en caldo nutritivo o BHI (en fase exponencial).
3 pipetas estriles de 1 ml.
1 pipeta de 5 ml estril.
3 Baos serolgicos ajustados a diferentes temperaturas.
5.4. REACTIVOS
30 tubos con 9 ml de caldo nutritivo estril (puede usarse tambin caldo BHI).
1 fiola con 99 ml de caldo nutritivo o BHI
Patrn de McFarland No 0,5.
1 tubo con 9 ml de agua peptonada 0,1%.
5.5. PROCEDIMIENTO
Se prepara una suspensin bacteriana equivalente a un patrn N 0,5 de McFarland.
A partir del patrn se toma una alcuota de 11 ml que se suspende y homogeniza en 99
ml de solucin diluyente para disminuir 10 veces la concentracin y preparar una
suspensin de una poblacin terica aproximada de 1,5x107 bact/ml.
Se pasa 1 ml exacto de la suspensin de 107 bact/ml, previamente homogenizada, a
cada uno de los 30 tubos que contienen 9 ml de caldo nutritivo estril (se puede usar
tambin BHI), de sta manera reducimos 10 veces la anterior poblacin.
Cada grupo de laboratorio trabajar en una temperatura determinada, para la cual se
ensayarn 6 tiempos, los cuales sern indicados por el instructor, segn la temperatura y
el microorganismo a probar. Para cada tiempo se emplearn 5 tubos de ensayo, por lo
cual cada grupo trabajar en total con 30 tubos.
Toda la clase trabajar en conjunto para determinar el valor Z a un microorganismo,
repartindose a los grupos una cepa del microorganismo y a cada grupo una
temperatura diferente.
Las temperaturas a trabajar sern indicadas por el instructor, de tal manera que un
grupo de laboratorio trabajar con la misma temperatura. En caso de trabajar con dos
microorganismos, dos grupos tendrn la misma temperatura pero un microorganismo
diferente (pensado para 6 o ms grupos).
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tratamiento trmico a 250F durante 3 4 minutos. El concepto 12D, supera en varias unidades
logartmicas los rangos experimentales actualmente usados para determinar la resistencia de las
endosporas de Cl. botulinum; afortunadamente, la efectividad de stos parmetros se ha
demostrado en la prctica. Normalmente en alimentos enlatados, la temperatura se controla en
el punto fro del producto, cuya ubicacin depende de la naturaleza del mismo. La temperatura
de 250F se usa como temperatura referencia para la comparacin de los diversos tratamientos
trmicos.
En 1923, Ball introduce el smbolo F, para designar el equivalente en minutos, a una
temperatura dada, de la sumatoria de las letalidades de cada una de las combinaciones tiempotemperatura, en el punto fro de un producto cualquiera. De sta manera y teniendo en cuenta
las ecuaciones desprendidas de la curva TDT (Prctica 4), podemos traer a consideracin la
ecuacin 4.6:
t = D (log a log b).
Donde t es el tiempo de duracin del tratamiento trmico, por lo cual podemos expresarlo as:
F = D (log a log b)
(6.1)
(6.2)
Estas expresiones nos sern tiles en el momento de establecer los clculos reales para evaluar
el tratamiento trmico.
Hemos mencionado frecuentemente, el trmino letalidad o efecto letal, pero.en qu consiste
ste trmino?. El efecto letal total ejercido por una determinada temperatura sobre el
microorganismo referencia, es un valor numrico sin unidades; un coeficiente que se deduce a
partir de los conceptos de valor Z, as:
(Ta Tb)
log Da log Db
(6.3)
Da (Ta Tb)
=
Db
Z
(6.4)
a)
Z=
b)
log
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Como existe una temperatura referencia (250F), la usaremos reemplazndola como nuestra Ta,
a la cual existir un determinado valor D.
c)
log
Si se quiere saber cual es el valor de la razn entre los valores D a cualquier temperatura y el
valor D a 250F, tenemos que elevar ambos lados de la ecuacin a una base de 10, para
eliminar los log de la misma. Esta relacin es la que nos determina la Letalidad.
d)
D250
= 10
Db
( 250 Tb )
Z
D250
= 10
Db
( 250 Tb )
Z
(6.5)
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cuenta el efecto protector que ejerce el alimento, ya sea su estado fsico, presencia de grasas,
almidones, etc.
Metodologa: Para determinar el valor F0, existen diferentes mecanismos y mtodos, pero tal
vez el ms extendido y utilizado gracias a su facilidad de clculo y ejecucin, es el mtodo
general, donde el proceso comienza con la construccin de una curva de penetracin de calor
(calentamiento, sostenimiento, enfriamiento), usando termopares ubicados en el punto frio del
producto. De esta forma se logra construir la respectiva historia de la penetracin de calor en el
alimento. Este procedimiento se lleva a cabo de sta manera dado que se puede llegar de
manera directa a establecer las letalidades que cada temperatura ejerce sobre los
microorganismos del alimento.
En un tratamiento esterilizante, la premisa a cumplir, es que la poblacin final sobreviviente (Nf)
debe ser inferior o igual a una poblacin de seguridad (Ns) establecida, la cual depende de la
intensidad del tratamiento y de la poblacin inicial (No). Esto establece una desigualdad:
Nf Ns
Esta desigualdad puede ser transformada dividiendo ambos lados de la desigualdad por No:
Nf
Ns
No No
Y tomar logaritmos en ambos lados de la ecuacin para obtener:
log
Nf
Ns
log
No
No
(6.6)
log
Nf
= m * dt
No
0
(6.7)
m * dt log
0
Ns
No
(6.8)
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que se debe establecer. A decir verdad, es muy difcil de establecer tanto la una como la otra
debido a la variabilidad tanto de la materia prima como de algunas condiciones del proceso. Para
esto se han establecido valores tericos de reduccin decimal de la carga microbiana en los
alimentos enlatados, son valores conocidos como coeficientes de reduccin (M).
Si:
y
Entonces:
9t = log No log Ns
M = log (No/Ns)
-M = log (Ns/No),
Que representan el nmero de unidades logartmicas que un proceso trmico debe reducir. En la
actualidad y como se coment anteriormente, se considera que para un alimento el coeficiente
de reduccin debe ser de 12. Teniendo en consideracin lo anterior, la ecuacin 6.8 quedara:
t
m * dt M
0
m * dt M
(6.9)
Donde m es la pendiente de la curva TDT. Como sabemos, la pendiente equivale al inverso del
valor D, segn la expresin:
1
m=
D
D * dt M
(6.10)
De esta expresin se deduce que un tratamiento trmico que asegure una esterilidad comercial
debe ser aquel cuya rea, debajo de la curva, (eso lo indica la integral) construida graficando el
inverso del valor D vs tiempo de proceso, sea mayor o igual a 12 (que es el valor de M para
alimentos con pH > 4.5).
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Para ilustrar lo anterior obsrvese la figura 1. En otras palabras, el rea (sombreada) bajo la
curva debe ser mayor a M. Esta grfica se podra construir si se conociera como evoluciona el
valor D en el punto fro del producto, con la temperatura y a medida que transcurre el tiempo.
Figura 1. Ejemplo de una grfica de penetracin de calor.
(1/D)
min-1
Area M
Area 12
Tiempo (min)
Esa variacin del valor D es muy difcil de determinar, adems de costoso y poco prctico.
Debido a esto, la expresin anterior debe modificarse para encontrar otra equivalencia que
permita una determinacin emprica ms prctica y eficiente. Para esto, podemos recordar por
un momento la ecuacin 6.5, que determina el valor letal de una temperatura.
D250
= 10
Db
( 250 Tb )
Z
1
10 Z
=
Db
D250
(6.11)
Este trmino es el mismo que se encuentra dentro de la integral, en 6.9; de tal manera que
podemos reemplazar 6.11 en 6.9, de lo cual se obtiene:
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( 250 Tb )
t
10
D250
* dt M
(6.12)
Como D250 es un valor constante (ya predeterminado), puede salir de la integral como 1/D250,
pasando a multiplicar al otro lado de la desigualdad:
( 250ZTb )
* dt M * D250
0 10
(6.13)
L * dt M * D
250
(6.14)
Si analizamos la ecuacin, nos encontramos que ambos lados de la desigualdad, las unidades,
son minutos. Por ejemplo, en la segunda expresin, el valor D viene dado en minutos y M carece
de unidades, por lo cual sus resultados sern minutos.
Si nos detenemos un poco ms, veremos que esa segunda expresin se puede transformar, si
recordamos la equivalencia que tiene M = log No log Ns. De tal manera, que si reemplazamos,
obtenemos:
M * D250 = 9t( log No log Ns)* D250
Esta expresin corresponde, a la ecuacin 6.2, que define de manera terica el valor F0, por lo
cual:
F0 = D250 (log No log Ns)
Reemplazando en 6.13, se obtiene la ecuacin 6.15:
t
L * dt F
(6.15)
Esta ecuacin final nos indica que si graficamos la letalidad obtenida a cada temperatura, contra
el tiempo de tratamiento trmico, obtendremos una curva (figura 2), cuya rea (con unidades en
minutos, debido a que la letalidad es un valor numrico), debe ser igual o mayor a un F0 dado.
De sta manera, el F0 obtenido por el rea de la grfica ser denominado real y el F0 contra el
cual se va a comparar se llamar terico. La mejor manera y la ms exacta para determinar el
valor del rea bajo la curva de letalidad, es por medio de un software matemtico que recibe los
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datos y la funcin, construyendo la grfica y resolviendo la integral dando como un dato el valor
numrico del rea en minutos.
Figura 2. Curva resultante de letalidad contra el tiempo de exposicin.
Letalidad
t
L * dt F
Tiempo (min)
El mtodo grfico: Segn lo anterior, los datos de la curva de penetracin de calor obtenida,
pueden ser transformados para generar una grfica de letalidad vs. tiempo, para que luego de su
construccin se proceda a determinar el rea de la curva generada por el proceso calentamientosostenimiento-enfriamiento, y luego determinar si esta rea hallada obedece a la ecuacin 6.15,
s decir, que sea mayor al F0 terico estimado por la NCA. Este valor debe superar en ms de un
10% de su valor al F0 terico, para considerar al tratamiento como seguro. Es una precaucin
que se toma para poder asegurar una esterilidad comercial en los productos alimenticios. La
diferencia consiste en que ste mtodo contempla una manera diferente de hallar el rea bajo la
curva y es realizando la grfica sobre un papel milimetrado como se muestra en la figura 6.3, en
el cual, posteriormente se sealarn los cuadros y se procede a contar el nmero de ellos que se
encuentran debajo de la curva, multiplicando luego este nmero por el rea que presenta cada
cuadro seleccionado. El resultado de sta multiplicacin se interpreta como el valor F0 real del
proceso. Este mtodo, aunque poco exacto, si es bastante preciso y adecuado, segn el
tratamiento; se considera cuando carezca del software necesario para procesar la informacin
obtenida.
1.3. MATERIALES, EQUIPOS E INSUMOS
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1.4. REACTIVOS
No requiere
1.5. PROCEDIMIENTO
Cada grupo procesar trmicamente un producto diferente (asignado por el instructor),
tomando la temperatura durante el proceso, en el punto frio del producto.
Construir la curva de penetracin de calor del producto respectivo.
Basados en la tabla del anexo 1, usar los datos de la historia de la temperatura en el
punto frio, para determinar los respectivos valores de letalidad.
Construir la grfica de letalidad vs. tiempo en un papel milimetrado.
Escoger un cuadrado del papel y usarlo como referencia, de la siguiente manera:
Determinar el rea del cuadrado escogido (LxL), la cual se dar en minutos
(letalidad x minutos = minutos).
Determinar el nmero exacto de cuadrados con igual rea al de referencia
existente dentro de la curva.
Determinar por aproximacin el nmero de cuadrados restantes bajo la curva
(completar los cuadrados incompletos por aproximacin con los otros faltantes).
Sumar el nmero total de cuadrados bajo la curva, estableciendo posteriormente
el rea total bajo la curva mediante la multiplicacin del nmero de cuadrados
por el rea de cada uno.
Este resultado final sera el F0 del proceso trmico.
Lo anterior, lo podemos ilustrar con un ejemplo como el que se muestra mediante la figura 3, all
se establece un tratamiento trmico para un enlatado de zanahorias con arveja (en porciones
personales). Cada cuadrcula de la grfica, tiene un rea de 0,2 minutos (Lado = 0,1 x Lado 2
minutos). Haciendo el estimado del conteo total de cuadrculas contenidas en la grfica, se
establecen que hay 49,5 cuadrados. De tal manera que el F0 real para el proceso ser de 9,9
minutos (0,2 minutos x 49,5).
Este valor as obtenido, debe ser superior al F0 terico establecido por lo menos en un 10% del
valor de ste ltimo, para considerar el tratamiento seguro. Por ejemplo si el F0 terico era de 8
minutos, para el ejemplo anterior, el F0 real debera ser igual o superior a 8,8 minutos, lo cual
nos indica que el proceso trmico que se est llevando a cabo es satisfactorio.
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Letalida
0,9
0,8
0,7
0,6
0,5
0,4
0,3
0,2
10 12
14 16
Tiempo
SINGH, R.P., HELDMAN, D.R. (1997). Captulo 5: Procesado trmico. En: Introduccin a
la Ingeniera de los alimentos. 1ra edicin. Editorial Acribia S.A. Zaragoza, Espaa. Pgs.
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Procesado trmico y envasado de los alimentos. Ress, J.A.G., Bettison, J. Editores.
Editorial Acribia S.A. Zaragoza, Espaa. Pgs. 17-55.
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LEWIS, M.J. (1993). Captulo 10: Transferencia de calor en estado no estacionario. En:
Propiedades fsicas de los alimentos y de los sistemas de procesado. 1ra edicin. Editorial
Acribia S.A. Zaragoza, Espaa. Pgs. 307-340.
MESCLE, J.F., ZUCCA, J. (1994). El comportamiento de los microorganismos en los
alimentos, la temperatura. En: Microbiologa alimentaria, volumen 1. Aspectos
microbiolgicos de la seguridad y calidad alimentaria. Editorial Acribia, S.A. Zaragoza,
Espaa. Pps. 7 50.
ICMSF. (2000). Temperatura, Captulo 1. En: Ecologa microbiana de los alimentos 1.
Factores que afectan a la supervivencia de los microorganismos en los alimentos. Editorial
Acribia, S.A. Zaragoza, Espaa. Pps. 1 38.
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Medio de cultivo: El medio en el que tiene lugar el crecimiento tiene una gran importancia. La
influencia que ejercen los nutrientes del medio, su tipo, y su concentracin, ser diferente para
cada microorganismo, aunque, en general, cuanto ms rico es el medio de crecimiento ms
termoresistente son las clulas vegetativas o las esporas. La existencia en el medio de un aporte
apropiado de factores accesorios de crecimiento suele favorecer la aparicin de clulas o de
esporas termorresistentes. Esta probablemente sea la causa de las infusiones de hortalizas y los
extractos de hgado aumenten la termorresistencia de los microorganismos que crecen en ellos.
Las esporas que se han originado y envejecido en la tierra o en los granos de avena son ms
termorresistentes que las que se han originado en el caldo nutritivo o en el agar nutritivo. Los
carbohidratos, aminocidos y radicales de cidos orgnicos tambin influyen en la
termorresistencia, aunque en stos casos resulta difcil pronosticar en qu sentido influirn. Una
baja concentracin de glucosa en el medio puede determinar un leve aumento de la
termorresistencia, pero una alta concentracin de azcar puede dar lugar a la formacin de
suficiente cido como para que la endospora, en stas condiciones generada, tenga una menor
termorresistencia. Parece ser que algunas sales influyen de alguna manera sobre la
termorresistencia, se dice que los iones fosfato y magnesio la reducen, cuando se genera la
endospora en presencia de una concentracin suficiente. La prolongada exposicin a productos
metablicos provoca la disminucin de la termorresistencia, tanto de las clulas vegetativas
como de las esporas.
1.3. MATERIALES, EQUIPOS E INSUMOS
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1.4. REACTIVOS
10 tubos con 9 ml de caldo nutritivo.
8 tubos con 9 ml de agua peptonada 0.1%.
800 mL de Agar BHI.
1.5. PROCEDIMIENTO
Se inoculan tubos de ensayo con caldo nutritivo y BHI, con los microorganismos a ser
probados. Estos tubos se dividen en tres grupos iguales incubndose cada uno a una
temperatura diferente: 25, 37 y 45C.
Cada grupo recibir 10 tubos de ensayo con 10 mL, ya sea de caldo BHI o de caldo
nutritivo.
Los tubos de cada grupo correspondern a dos grupos de 5 cada uno, los cuales
representan a dos microorganismos diferentes, que han sido preincubados a la misma
temperatura (25, 37 o 45C).
Las dos series de 5 tubos se someten a un calentamiento a 70C (80C o a la
temperatura indicada por el profesor), para determinar su respectivo valor D.
Cada tubo ser retirado a intervalos de 2 minutos realizando diluciones 10-1, 10-2 y 10-3 y
depositando por duplicado 1 mL de cada dilucin en cajas de petri estriles adicionndo
entre 15 20 mL de agar BHI.
Homogenice las placas e incube a 35 +/- 2C por 24 48 horas haciendo el respectivo
recuento.
Hallar el valor D para cada microorganismo y compararlo con el obtenido por todos los
grupos para concluir acerca del efecto que se observ tanto del medio de cultivo como
de la temperatura de incubacin.
1.6. NIVEL DE RIESGO
Para el desarrollo de la presente prctica se ha definido un Nivel de Riesgo Medio o Nivel 2, ya
que se manejaran microorganismos considerados oportunistas y que en algn momento por
malas prcticas de laboratorio pueden conllevar algn peligro para los manipuladores. Por tanto,
todo estudiante, auxiliar y docente que oriente e intervenga en el desarrollo de la misma deber
usar los siguientes equipamientos:
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Bata de Laboratorio manga larga, Guantes, Cofia, Tapabocas, Zapato Cerrado Bajo,
Pantaln Largo.
1.7. BIBLIOGRAFA
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la Ingeniera de los alimentos. 1ra edicin. Editorial Acribia S.A. Zaragoza, Espaa. Pgs.
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8.4. REACTIVOS
8.5. PROCEDIMIENTO
Cada grupo recibir un tubo de ensayo con una suspensin de esporas en agua
destilada estril. Cada suspensin corresponder a un determinado microorganismo.
Se someter, el tubo de ensayo, a un tratamiento trmico en el autoclave durante 6
minutos a 121C, para destruir esporas.
Una vez finalizado el tratamiento trmico, se procede a realizar una dilucin decimal 10-1
en 9 mL de diluyente.
Inocular 1 mL a partir de 100, 1 mL de 10-1 y 0,1 mL de 10-1 en profundidad en 6 cajas de
petri estriles.
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SINGH, R.P., HELDMAN, D.R. (1997). Captulo 5: Procesado trmico. En: Introduccin a
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HARRIGAN, W.F. 1998. Laboratory Methods in Food Microbiology. 3rd Edition. Academic
Press, San Diego, California, USA.
HELDMAN, S. Introduccin a la ingeniera de los alimentos. Editorial Acribia S.A.,
Zaragoza, Espaa. 1998.
ICMSF. Ecologa Microbiana de los alimentos Vol. 1 y 2. Editorial Acribia S.A., Zaragoza,
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ICMSF. Microorganismos de los alimentos Vol. 1 y 2. Editorial Acribia S.A., Zaragoza,
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MADIGAN, M.T., y otros. BROCK, Biologa de los microorganismos. 8 edicin revisada.
Prentice Hall. 3 reimpresin. Madrid, Espaa, 2000.
NICKERSON, J.T., SINSKEY, A.J. Microbiologa de los alimentos y sus procesos de
elaboracin. Editorial Acribia S.A., Zragoza, Espaa. 1978.
RESS, G.A., BETTISON, J. 1994. Procesado trmico y envasado de los alimentos.
Editorial Acribia S.A., Zaragoza, Espaa.
STUMBO, C.R. Thermobacteriology in food procesing. 3rd edition. Academic Press. New
York, 1976.
8.8. ANEXOS
Tabla 1. Variables a tener en cuenta para el desarrollo de la actividad prctica.
Grupo
Nmero de cajas
Medio de Cultivo
Temperatura de
Incubacin
Agar SPC
25C
Agar SPC
35C
Agar SPC
45C
Agar BHI
25C
Agar BHI
35C
Agar BHI
45C
Agar Nutritivo
25C
Agar Nutritivo
35C
Agar Nutritivo
45C
Agar TSA
25C
Agar TSA
35C
Agar TSA
45C