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Laboratorios de Biologa Celular y Microbiologa

Profesores: Juan Carlos Higuita V. PhD, Ivonne Ximena Cern MSc.

LABORATORIOS 5 y 6
PREPARACIN Y ESTERILIZACIN DE MATERIALES
Y MEDIOS DE CULTIVO
El conocimiento humano sobre los efectos producidos por los
microorganismos ha estado presente incluso desde antes de tener
conciencia de su existencia. Por ejemplo los procesos de fermentacin
provocados por levaduras donde se elabora pan, bebidas alcohlicas y
productos derivados de la leche. En la antigedad la causa de las
enfermedades era atribuida a castigos divinos, fuerzas sobrenaturales o
factores fsicos. Durante el periodo posterior al descubrimiento de los
microorganismos, el reto se convirti en controlar las enfermedades
infecciosas por destruccin, disminucin de su nmero o inhibicin de los
microorganismos. Esto se puede llevar a cabo con diferentes mtodos en
funcin del lugar a aplicar y el grado de erradicacin microbiana que se
pretende conseguir.
Por esto es conveniente definir algunos conceptos:

Esterilizacin: proceso fsico o qumico que destruye toda forma de

vida microbiana, incluidas las esporas.
Desinfeccin: tiene por objeto la destruccin de microorganismos
mediante agentes de naturaleza qumica (desinfectantes), con el fin
de disminuir el nmero de formas vegetativas a niveles mnimos.
Asepsia: trmino que se aplica a los procedimientos utilizados para
prevenir que los microorganismos progresen en un medio
determinado (quirfano, laboratorio. etc.)

1. Fundamentacin
Los microorganismos como otros seres vivos, son susceptibles a los
cambio de condiciones ambientales y en la medida en que se han podido
adaptar a estos cambios, se han distribuido en una gran diversidad de
hbitats incluyendo los de condiciones extremas sobre todo de tipo fsicoqumico.

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Se han desarrollado y aplicado diversos procesos de desinfeccin y

esterilizacin para limitar su presencia o eliminarlos. La esterilizacin es
un mtodo de eliminacin total de todo tipo de organismo y que asegura
la ausencia absoluta de cualquier forma viviente, mientras que la
desinfeccin es un proceso que solamente elimina formas vegetativas de
los microorganismos. Los procesos con calor hmedo se aplican para
esterilizar medios de cultivo, soluciones y cultivos bacterianos que se
desechan, el ms recomendable es el autoclave en el que se utiliza vapor
de agua a presin para alcanzar temperaturas de 121 C. El material se
deja a esta temperatura durante 15 minutos para asegurarse la
destruccin de endoesporas, que son las estructuras bacterianas ms
resistentes al calor.
Cuando se requiere esterilizar diferentes materiales sensibles al calor
como las soluciones de vitaminas, aminocidos, etc. Se esterilizan por
filtracin en membranas estriles de 0.2 micras de dimetro y para el caso
de materiales plsticos es recomendable el uso de gases como oxido de
etileno o con radiaciones gamma. Las superficies generalmente se
desinfectan con radiaciones U.V. o compuestos qumicos en forma lquida
como: los fenoles, compuestos cuaternarios de amonio (alquildimetil
bencilamonio), formaldehido, alcoholes, halgenos y detergentes.
Cada uno de estos procedimientos tienen ventajas y desventajas de uso,
los sistemas de filtracin son muy eficientes y rpidos para la
esterilizacin pero solo se aplican en pequeos volmenes. Los fenoles y
compuestos cuaternarios de amonio son muy efectivos para la
desinfeccin de superficies pero son muy corrosivos. Los detergentes y los
alcoholes tienen actividad limitada contra esporas bacterianas y algunos
virus por lo que slo son desinfectantes.
Medios de cultivo Los medios de cultivo son una mezcla de nutrientes
que en concentraciones adecuadas y en condiciones fsicas ptimas,
permiten el crecimiento de los microorganismos. Estos medios son
esenciales en el Laboratorio de Microbiologa por lo que un control en su
fabricacin, preparacin, conservacin y uso, asegura la exactitud,
confiabilidad y reproducibilidad de los resultados obtenidos. En los
laboratorios de microbiologa se utilizan diferentes tipos de medios de

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cultivo que pueden ser preparados en forma lquida o en forma slida.

Segn la naturaleza de los medios de cultivo estos se pueden clasificar en:
Medios naturales o complejos
Medios definidos o sintticos
De acurdo al uso del medio de cultivo, estos se pueden clasificar en:
Medios enriquecidos
Medios selectivos
Medios diferenciales
Por su composicin los medios de cultivo se clasifican en:
Lquidos
Slidos
Semislidos
Los medios de cultivo se pueden preparar en el laboratorio a partir de
cada uno de sus constituyentes bsicos o por simple rehidratacin de
productos asequibles comercialmente (medios de cultivo deshidratados).
Generalmente se prefiere el uso de los medios de cultivo deshidratados
porque, adems de simplificar el trabajo, con ellos se tiene mayor
probabilidad de obtener resultados reproducibles.
2. Objetivos:
General
Conocer los principios generales de las tcnicas de esterilizacin de
materiales de vidrio y medios de cultivo de uso comn en
microbiologa.
Especficos
o Seleccionar los mtodos de esterilizacin adecuados para las
diversas necesidades del laboratorio de microbiologa.
o Comprobar la efectividad del proceso de esterilizacin.
o Elaborar adecuadamente los medios de cultivo slidos y
lquidos.
o Relacionar la composicin de los diversos medios de cultivo
con sus caractersticas y aplicaciones.
3. Materiales y Reactivos

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Materiales
4 cajas Petri
2 pipetas de 1 mL
2 pipetas de 10 mL
2 Erlenmeyer de 250 mL
4 Erlenmeyer de 100 mL
Beaker de 100 mL
Placa de calentamiento con agitacin
1 autoclave
1 horno de calor seco
1 mechero
1 Incubadora a 35C
7 hisopos estril
Medio de cultivo lquido y slido
1 pliego de papel bond.
Papel o toalla absorbente.
Gasa y papel aluminio.
Alcohol
4. Procedimiento
o Limpie con agua muy bien la mesa de trabajo, posteriormente roci
alcohol para desinfectar.
o Lavar perfectamente las cajas de Petri y pipetas con detergente.
Enjuagar muy bien con agua corriente.
o Escurrir el exceso de agua y enjuagar el material con agua destilada.
Dejar escurrir el agua y secar con papel absorbente.
o Una vez seco el material, envolver las cajas Petri y pipetas en papel
bond.
Las cajas Petri deben ser ensambladas (tapa y caja) y empaquetada
en grupos no superiores de 5 placas. Ver figura 1-a.
Las pipetas deben colocarse en el mismo sentido y se enrollan en
una franja de papel bond como se muestra en la figura 1-b. Sealar
con marcador la orientacin de las pipetas para facilitar su uso
evitando la contaminacin posterior. No empaquetar ms de 6
pipetas juntas.

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Figura 1. A. Empaque Cajas de Petri. B. Empaquetamiento pipetas

Las cajas Petri y las pipetas envueltas, se deben colocar en un horno
a 150C durante 2 horas. Transcurrido el tiempo dejarlas enfriar.
Estas solamente deben abrirse en un rea asptica.
o Preparar 120 mL de medio de cultivo slido en un Erlenmeyer de
250 mL, siguiendo las instrucciones del fabricante.
o Preparar 80 mL de caldo nutritivo en un Erlenmeyer de 250 mL,
siguiendo las indicaciones del fabricante. Distribuir 20 mL en cada
Erlenmeyer de 100 mL.
o Taponar la boca de los Erlenmeyer con gasa y papel aluminio como
se muestra en la figura 2.

o
o Figura 2. Preparacin de tapn para Erlenmeyer.
o En un beaker de 100 mL coloque en la base algodn, introduzca los
hisopos y cubra muy bien con papel aluminio.

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o Esterilizar los medios de cultivo y los hisopos, siguiendo las

siguientes instrucciones:
Revisar que el nivel del agua en el autoclave. Si es necesario
agregue agua.
Conectar el autoclave y poner la perilla de control en 25 minutos
(la temperatura de trabajo debe ser aproximadamente 121 C. (El
autoclave disponible esta automticamente programado para
trabajar a estas condiciones).
Acomodar los Erlenmeyer con medio preparado y el beaker con
los hisopos dentro del autoclave.
Cerrar la puerta y asegurarla.
Dejar que el equipo se caliente, revisando continuamente la
escala del manmetro y mantener el equipo en estas condiciones
durante los 25 minutos.
Al finalizar el purgado abra la compuerta y retire los erlenmeyer
con cuidado evitando quemaduras por la salida de vapor.
Preparacin de medios slidos en las cajas de Petri.
o Dejar que el medio de cultivo slido que se ha retirado del autoclave
se enfre a una temperatura aproximada de 40-50 C, con el fin de
poder sostener el Erlenmeyer con la mano.
o Prenda el mechero en la mesa de trabajo completamente limpia y
desinfectada con alcohol.
o De manera asptica cerca del mechero o en la cmara de flujo
laminar, vierta aproximadamente 25- 30 mL de medio de cultivo
slido en las cajas Petri. Deje solidificar como se muestra en la figura
3.

Figura 3. Cajas de Petri con medio slido

o Tapar las cajas.
o En zona asptica roce con un hisopo las manos de su compaero y
frote suavemente sobre el agar de una de las cajas y mrquela.
(Frotris grupo sin lavar)

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o El mismo compaero que se lave las manos solamente con agua y

se las seque con una toalla desechable. Repita el procedimiento con
el hisopo y frote en una segunda caja de Petri. Mrquela (Frotis
grupo - agua)
o Rocie sobre las manos de su compaero alcohol y secar con una
toalla desechable. Repita el procedimiento con el hisopo, frote en
una tercera caja de petri y mrquela. (Frotis grupo alcohol)
o Sin abrir la cuarta caja de Petri y mrquela (Control grupo)
o Envolver las cajas con papel cristaflex.
o Colocar las cajas de petri de manera invertida al agar. en una
incubadora ajustada a 30 C durante 24 horas.
o Revisar las cajas para detectar la presencia de contaminantes, por la
aparicin de colonias microbianas en la superficie de los medios.
Cultivo lquido
o En zona asptica roce con un hisopo esterilizado las manos de su
compaero e introdzcalo sobre el medio lquido preparado en un
Erlenmeyer. Tape nuevamente el matraz y mrquela (Frotis grupo
sin lavar)
o El mismo compaero que se lave las manos solamente con agua y
se las seque con una toalla desechable. Repita el procedimiento con
el hisopo y frote en un segundo Erlenmeyer. Mrquelo (Frotis grupo
- agua)
o Roci sobre las manos de su compaero alcohol y secar con una
toalla desechable. Repita el procedimiento con el hisopo, frote en un
tercer Erlenmeyer y mrquelo. (Frotis grupo alcohol)
o No abra el cuarto Erlenmeyer y mrquelo (Control grupo)
o Colocar los erlenmeyer. en una incubadora ajustada a 30 C durante
24 horas.
o Revisar las Erlenmeyer para detectar la presencia de contaminantes,
por la aparicin de turbidez, nata superficial y/o depsito de material
en el fondo.
Esterilizacin de material de desecho
o Finalizada la prctica, vierta el agar de las cajas de Petri en un
beaker de 250 mL y esterilice todo el material usado.
o Una vez estril, lave el material con agua y jabn y entrguelo al
monitor
Describa y analice lo sucedido.

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Preguntas de consulta
1. Cules son las condiciones generales para el cultivo de
microorganismos?
2. Nombre y explique los medios de esterilizacin ms usados.
3. Qu debe contener un medio de cultivo para permitir el desarrollo y
crecimiento de los microorganismos?
4. Qu sustancia permite que los medios slidos se solidifiquen?, Cules
son sus caractersticas?
5. Por qu es necesario esterilizar los medios de cultivo?
6. Cmo se esteriliza el material de desecho?.Por qu es necesario
esterilizarlo?
BIBLIOGRAFA
Aquihuti Ramos, Mara de los Angeles; Pres Chabela, Mara de Lourdes.
Manual de prcticas del Laboratorio de Microbiologa General. Universidad
Autnoma Metropolitana Iztalapa. Mxico. 2004.
Gonzlez, Jos; Gonzlez, Boris; Barrial, Rosa. Laboratorio
Microbiologa: Instrumentacin y principios bsicos. La Habana. 2004.

de

Clavell, L.; Pedrique de Aulacio, M. Microbiologa: Manual de Mtodos

Generales. 2 edicin. Facultad de Farmacia. Universidad Central de
Venezuela. 1992
Ortega, Y.; Quevedo F. Garanta de la Calidad de los Laboratorios de
Microbiologa Alimentaria. Organizacin Panamericana de la Salud.
Organizacin Mundial de la Salud. 1991

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Organizacin Mundial de la Salud OMS. Manual de bioseguridad en

laboratorio. Tercera edicin. 2005.

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