AULA PRTICA: DETERMINAO DA CONCENTRAO DE PROTENAS

OBJETIVOS
Conhecer o mtodo espectrofotomtrico na determinao da concentrao de diferentes
compostos.
FUNDAMENTO
1- Espectrofotometria
A espectrofotometria uma tcnica analtica que utiliza o espectro eletromagntico para
determinar a concentrao de espcies qumicas. O espectro eletromagntico um conjunto de ondas
eletromagnticas. Uma onda eletromagnticas composta por um campo eltrico e outro magntico, que se
propagam perpendicularmente e com a mesma direo. Toda onda eletromagntica pode ser caracterizada
por seu comprimento de onda e por sua frequncia.
Na tcnica de espectrofotometria, um feixe de luz atravessa uma soluo ou material
biolgico contendo molculas capazes de absorver luz. Assim, parte da luz incidente ser absorvida,
enquanto o restante atravessar a soluo e ser detectada pelo aparelho. Estimando-se a quantidade de
luz absorvida, possvel determinar a concentrao do composto em soluo. Inmeras molculas
biolgicas tm a propriedade de absorver luz, como: citocromos, clorofila, protenas, DNA etc., o que permite
sua quantificao por esta tcnica.
Normalmente , a absoro de luz por um composto ocorre em vrios comprimentos de onda.
Se for feita uma varredura, ou seja, a determinao da quantidade de luz absorvida em diversos
comprimentos de onda para um determinado composto, observamos que h um comprimento de onda na
qual a absoro mxima. A faixa mais utilizada do espectro vai de 200 nm (ultravioleta) a 1.000 nm
(infravermelho). O espectro visvel, aquele que percebido pelo olho humano (cores), vai de 380 a 750 nm.
Compostos que absorvem na faixa do visvel so naturalmente coloridos, mas mesmo
aqueles que no absorvem luz no visvel podem ser indiretamente detectados por reaes qumicas
especficas que gerem produtos coloridos. A espectrofotometria, tambm denominada fotometria ou
colorimetria, indicada para determinar a concentrao de solutos corados, como tambm os incolores,
mas passveis de adquirir cor mediante o emprego ajustado de certos reativos. Compostos desconhecidos
podem ser identificados por seu espectros caractersticos no ultravioleta, visvel ou infravermelho. As
concentraes de solues podem ser determinadas medindo-se a absoro em um comprimento de onda.
Reaes enzimticas podem ser frequentemente seguidas medindo-se espectrofotometricamente o
aparecimento de um produto ou desaparecimento de substrato.

O aparelho utilizado nesta tcnica denominado espectrofotmetro ou fotocolormetro e

seus componentes principais so:
1- Fonte luminosa (energia radiante)
2- Dispositivo de focalizao (colimador) = transmite um intenso feixe retilneo de luz
3- Monocromador (prisma ou grade)= utilizado na resoluo da radiao emitida pela fonte luminosa em
seus vrios comprimentos de onda ()
4- Dispositivo para selecionar o comprimento de onda desejado
5- Um compartimento para a amostra contida em um tubo de ensaio ou cubeta
6- Um detector com clula fotoeltrica, que converte o sinal luminoso em sinal eltrico
7- Um medidor eltrico (galvanmetro) para registrar a intensidade de energia captada pelo detector.

1- Lei de Lambert-Beer
A espectrofotometria uma tcnica quantitativa, que permite relacionar a quantidade de luz
absorvida com a concentrao da amostra. A medida da absoro de luz dada pela ABSORBNCIA (A),
que definida como:
A = log Io /I
Onde:
Io= intensidade de luz incidente
I= intensidade de luz emergente (transmitida)
Esta medida de absorbncia em uma amostra est quantitativamente relacionada sua
concentrao de acordo com a lei de Lambert-Beer, uma combinao das lei de Lambert quando um feixe
de luz passa atravs de um meio absorvente, pores iguais deste meio iro absorver luz e da lei de Beer
a absoro da luz proporcional concentrao do soluto na soluo.
A absorbncia proporcional concentrao da espcie qumica absorvente, sendo
constantes o comprimento de onda, a espessura atravessada pelo feixe luminoso e demais fatores. Verificase uma relao linear entre absorbncia ou densidade tica e concentrao, e de uma relao logartmica
entre transmitncia e concentrao.
Na prtica mede-se o valor de log Io que determinado absorbncia (A): A = log Io
I
I
A relao inversa I/Io tambm mensurvel e denominada transmitncia (T). Ento, podese afirmar que a Absorbncia equivale ao logaritmo inverso da transmitncia.
A = - log T
A Absorbncia e a Transmitncia so lidas em escala duplas no espectrofotmetro. A
absorbncia lida em escala logartmica enquanto que a transmitncia lida em porcentagem em uma
escala linear de zero a 100%.
necessrio descontar todas as interferncias possveis durante a medida da absorbncia de um
soluto especfico. Para isso, faz-se a calibrao do espectrofotmetro com uma soluo contendo
um sistema como o estudado, exceto o composto de anlise, em um tubo ou cubeta igual quele
que ir conter a soluo-problema. Este tubo conhecido como branco e com ele calibra-se o
instrumento para 100% de transmitncia, o que significa zero de absorbncia.

2- Curva-Padro ou de calibrao
A determinao da concentrao de um soluto em uma soluo problema pelo mtodo
espectrofotomtrico envolve a comparao da absorbncia da soluo-problema com uma soluo de
referncia, da qual j se conhece a concentrao do soluto. Em geral, so utilizadas solues-padro do
composto que se deseja quantificar, com diferentes concentraes, e sua absorbncia determinada. Com
os valores de absorbncia e concentrao conhecidos, pode-se traar um grfico cujo perfil conhecido
como curva de calibrao ou curva-padro. A reta, que deve passar obrigatoriamente pela origem, indica
a proporcionalidade entre o aumento da concentrao e da absorbncia.
Aplicando-se a lei de Lambert-Beer, ao se plotar o valor da absorbncia da amostraproblema no grfico da curva de calibrao pode-se, por projeo, determinar a concentrao do soluto.
Tubo branco= ir conter todos os reagentes do ensaio, menos a amostra. utilizado para zerar o
aparelho, descontando a cor dos reagentes utilizados no ensaio.
Soluo-padro= ir conter a mesma classe de substncia presente na amostra, porm de concentrao
conhecida e que ser utilizada para confeco da curva de calibrao.
Amostra= ir conter uma soluo de substncia conhecida cuja concentrao pretende-se determinar.

TCNICA

I - CURVA DE CALIBRAO
Constri-se uma curva de calibrao utilizando a soluo-padro de protena de acordo com o protocolo
mostrado abaixo, fazendo-se as leituras em 540 nm.
Tubo
1
Branco
2
3
4
5
6

Volume da soluo
padro de protena
(5mg/mL)

Volume de gua
(mL)

Volume do reagente de
biureto (mL)

0,0

1,0

5,0

0,2
0,4
0,6
0,8
1,0

0,8
0,6
0,4
0,2
0,0

5,0
5,0
5,0
5,0
5,0

Absorvncia 540
nm

1- Organizar 6 tubos de ensaio e identific-los com nmeros de 1 a 6.

2- Adicionar os reagentes conforme tabela acima.
3- Agitar e deixar em repouso por 10 minutos.
3- Utilizar o tubo 1(Branco) para calibrar o espectrofotmetro: 0 de absorbncia em 540 nm.
4- Determinar a absorbncia das solues dos tubos 2 a 6.
5- Traar, em papel milimetrado, o grfico: concentrao final de protena (mg/ml) na abscissa e
absorbncia (A) na ordenada. Interpolar a melhor reta possvel, passando pela origem dos eixos
cartesianos.

Absorbncia
(540 nm)

Concentrao
(mg/tubo)

II- DETERMINAO DA CONCENTRAO DE PROTENAS EM AMOSTRA-PROBLEMA

1- Separar 2 tubos de ensaio.
2- Identific-los como tubo A e tubo B.
3- Adicionar os reagentes conforme tabela abaixo.
3- Agitar e deixar em repouso por 10 minutos.
4- Determinar a absorbncia das solues desconhecidas (tubo A e tubo B), utilizando o tubo 1 (item I) para
calibrar o espectrofotmetro (Absorbncia em 540 nm);
5- Determinar a concentrao de protena (mg/mL) presente na amostra problema utilizando o grfico da
curva de calibrao (item I) e realizando os clculos necessrios.
Tubo

Amostra (mL)

A
B

1,0
0,5

Volume de gua
(mL)
0,0
0,5

Volume do reagente de
biureto (mL)
5,0
5,0

Absorvncia 540
nm