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CRECIMIENTO MICROBIANO
CRECIMIENTO CELULAR
1.a.- Temperatura
Cada microorganismo prefiere una T de desarrollo.
Temperatura mnima, por debajo de ella no hay crecimiento
Temperatura ptima a la que la velocidad es mxima.
Tipos microbianos
Sicrfilos: -5 20C, ptimo < 15oC
organismos marinos, algas: Chlamydomonas nivalis
(nieve rosada), bacterias: Pseudomonas, Flavobacterium
membrana con alto % de c. grasos insaturados
Mesfilos 15-45 C, ptimo: 30-40C
Mayora de los m.o (del suelo, aguas, patgenos)
Termfilos 40-70C, ptimo de 55-65oC
Tienen membrana con alto % de cidos grasos saturados,
y enzimas estables al calor
Bacillus stearothermophilus, (compostaje)
Hipertermfilos 80-113C, ptimo > 90o
Pyrococcus, Pyrodictium (aguas termales)
Altas temperaturas desactivan las enzimas y producen
dao celular.
1.b.- pH
Halfitos.
El agua de mar tiene una concentracin del 3%. Los m.o. halfilos:
requieren condiciones salinas:
Discretamente halfilo (1-6%),
Moderadamente halfilo (6-15%),
Halfilos extremos (15-30%)
La principal estrategia de los m.o halfilos para adaptarse al estrs
osmtico es la acumulacin de compuestos en el citoplasma para
compensar la presin osmtica externa. (Gonzales Hernandez y Pea)
Fase de latencia
Cuando se introduce un inoculo en medio fresco, el
crecimiento usualmente no comienza de inmediato sino
despus de un tiempo llamado de latencia o
acostumbramiento.
En este periodo de transicin los microorganismos,
reorganizan sus contituyentes celulares, producen las
enzimas necesarias para aprovechar un nuevo medio
ambiente, e inhiben otras que no necesitan. Estos cambios
suceden segn los mecanismos de regulacin de los
procesos bioqumicos, vistos anteriormente.
En esta fase no hay incremento en el nmero de clulas,
pero hay actividad metablica, aumento en el tamao
individual de las clulas, en el contenido proteico, ADN y
peso seco de las clulas.
Fase de desaceleracin.
Fase estacionaria
Fase de muerte
Ocurre una disminucin progresiva en el nmero de
clulas viables.
velocidad de muerte celular > velocidad de divisin celular
Cuando la concentracin de sustrato es mnima, la clula
se ve forzada a metabolizar su propio protoplasma (se
conoce como metabolismo endgeno)
Manejo industrial.
La fase de latencia, no es deseable, por que se pierde
tiempo y acarrea prdidas econmicas
Para minimizar esta fase, se hace crecer el inculo aparte,
en un medio de cultivo igual al que se va a emplear en el
bioproceso (cultivo o fermentacin) y luego se procede a
transferirlo cuando las clulas ya se encuentran en la fase
exponencial (inoculacin).
Aplicaciones:
Procesos industriales de fermentacin (produccin de
bebidas alcohlicas, de aminocidos, etc)
Su aplicacin ms conocida es para la depuracin de
aguas residuales, por procesos aerbicos o anaerbicos.
El medio de cultivo fresco es el agua residual que
entra en la planta y alimenta a los fangos activados por MO
que luego se retiran por decantacin
3.- DETERMINACION DE LA
CONCENTRACION CELULAR
Existen diversos mtodos, con diferentes propuestas de
clasificacin.
Se pueden agrupar en dos:
mtodos directos y
mtodos indirectos.
a. Conteo celular
Cuadrado de 3 x 3 mm.
Cmara de
El rea sombreada y marcada L es 1
mm2.
La depresin tiene 0.1 mm de
profundidad.
El volumen de la superficie L, bajo el
cubreobjetos es de 0.1 mm3 (0.1
microlitro)
Los cuadrados L estn subdivididos
en 16 cuadraditos de 0,0025 mm2
cada uno.
El cuadrado del centro es usado para
conteo de bacterias, y se divide en 5
cuadrados por lado con una longitud
lateral de 0,2 mm, y superficie de 0,04
mm2.
Al
contar
las
cuatro
reas
sombreadas (L), si hay un total de X
clulas entre las cuatro reas, la
concentracin en la suspensin celular
ser: = 10000 (X/4) clulas/mL
Neubauer
Tcnica de conteo
Para que las clulas, no se cuenten dos
veces, se siguen las siguientes reglas:
-Se cuentan las clulas dentro de la zona
definida.
- Tambin se cuentan las clulas, que se
apoyan o tocan en dos caras, por ejemplo,
en la lnea de medida izquierda y superior.
Otras recomendaciones de conteo.
Efectuar conteo en forma de meandro
El diafragma del condensador en el
microscopio deber estar cerrado en gran
parte.
- El valor medio de los conteos se aplica
luego en una frmula de clculo o se
multiplica por el factor correspondiente.
Cmara Petroff-Hausser
El retculo, est dividido en 25 cuadrados grandes
Cada cuadrado grande tiene 16 cuadraditos
Volumen de la cmara= 0,02 mm3
rea de la cmara 1 mm2
Calculo:
Se observan 12 clulas/cuadrado.
12 x 25 = 300 (nmero de clulas en 0,02 mm3).
300 x 50= 15000 (nmero de clulas en 1 mm3)
15000 x 1000 = 1,5 x 107 (nmero de clulas en 1 mL)
b) Equipos automticos
"Cell Coulter" de Beckman-Coulter
Mide los cambios en la resistencia elctrica
que se producen cuando una partcula no
conductora en suspensin en un electrolito
atraviesa un pequeo orificio.
El contador consta de dos cmaras
separadas por un material no conductor, en
el que hay un orificio de tamao similar al de
las clulas.
Ventajas y desventajas:
Es posible contar y medir varios miles de
partculas por segundo.
Las limitaciones de este mtodo son:
- Se cuentan clulas vivas y muertas.
- Las suspensiones deben estar
libres de partculas diferentes a los
microorganismos, por que el aparato no
puede distinguir entre una u otra.
Ejemplo.
En un recuento en placa, se hacen diluciones seriadas con factor
de dilucin 100, para ello se toma 1 mL del caldo bacteriano, y se
aade a un frasco de dilucin que contiene 99 mL del diluente
adecuado. Se agita y se toma de esta dilucin 1 mL y se transfiere
a un segundo frasco con 99 mL del diluente, se agita y se toma de
esta segunda dilucin 1 mL y se transfiere a un tercer frasco de
dilucin que contiene 99 mL del diluente.
De cada dilucin se siembran por triplicado muestras de 1 mL, se
incuban por 24 horas y se cuentan las colonias.
Si el promedio de las placas de la segunda dilucin, es de 32
colonias. Determine la concentracin celular en la muestra.
Solucion.
Ci = X
Primera dilucion: 1:100 10-2
Segunda dilucion: 1:10.000 10-4
Tercera dilucion : 1:1.000.000 10-6
Respuesta: 32x10,000 = 3.2x105 UFC
Ventajas y desventajas
Ventajas.
Se usa frecuentemente, para estimar poblaciones
bacterianas en leche, agua, y otros productos.
Es fcil de realizar y se adapta a la medicin de
poblaciones de cualquier densidad.
Desventajas:
Tiempo largo, (requieren 24 horas)
Exigen muy buenas tcnicas de esterilizacin
Puede dar errores cuando se trata de clulas agregadas
6 tubos positivos
(com crescimento
bacteriano)
1 mL de inculo
0,1 mL de inculo
3 tubos positivos
1 tubos positivos
Tabla: NMP de
bacterias por 100 g
(ml) de material
analizado
empleando cinco
tubos inoculados
con 10, 1 y 0.1 ml o
g de material
Tomada de:
Enumeration of
coliforms, faecal
coliforms and of e. Coli in
foods using the MPN
methoD MFHPB-19 April
2002 por Donna
Christensen Crawford y
Rick Szabo
Uso de la tabla
Consideremos positivos los siguientes cultivos:
(1) 5 tubos inoculados con 10 ml de dilucin (1/10) del material :
los cinco (5) son postivos
(2) 5 tubos inoculados con 1 ml de dilucin (1/10) del material:
solo uno (1)es positivo
(3) 5 tubos inoculados con 1 ml de dilucin (1/100) del material:
ninguno (0) es positivo
Cada uno de los cinco tubos de las tres diluciones representan
respectivamente a 1, 0.1 y 0.01 g (ml), del material analizado.
La lectura se toma en la ubicacin de la Tabla correspondiente a la
lectura 5-1-0 (NMP de 33) si se hubiesen utilizado 10, 1 y 0.1 g (ml)
de material.
Como se usaron cantidades 10 veces menores (1/10) de aquellas
con las que se construy la tabla, el valor de 33 debe multiplicarse
por 10, lo que proporciona un valor de 330 organismos por 100 ml
de material.
Como usualmente se expresa por g (ml) de material, este valor
(330) debe dividirse por 100. El recuento obtenido por el NMP es
en este caso de 3,3 organismos por ml de material analizado.
d. Peso seco.
Secar volmenes conocidos de medio con las clulas en
crecimiento, hasta obtener un peso constante.
Es til para grandes volmenes.
Para levadura se puede usar una centrfuga con
velocidades de 4-6x103rpm. Se obtiene una masa hmeda
de clulas, luego esta masa se lava y seca a 80C por 24
horas, y se pesa.
En clulas bacterianas, se usan filtros de membranas para
obtener la masa celular hmeda, y luego se seca. (1 mg de
peso seco equivale a una masa bacteriana de 5 x 10 9
bacterias)
Puede ser usada cuando el medio no contiene slidos en
suspensin.
Desventajas:
Los componentes voltiles de la clula pueden perderse.
La muestra seca puede recobrar humedad durante el
pesado.
Requiere muestras muy grandes y son lentos.
e. Absorcin de luz.
Consiste en hacer incidir una luz monocromtica a la
suspensin de microorganismos, y medir la luz transmitida a
travs de la suspensin, que es inversamente proporcional a
la concentracin de biomasa, segn la ley de Beer.
Usar, turbidmetro o espectrofotmetro 600- 700 nm.
Se necesitan de 10 millones a 100 millones de clulas por
mililitro para hacer una suspensin suficientemente turbia
para ser leda.
e. Efectos fsicos.
Se puede medir la
variacin de algn
factor externo por
efecto del
crecimiento celular,
tales como; el calor
generado por el
crecimiento, o el
oxgeno captado
por el medio, y que
deja un vaco
medible.
Para CO2.
CO2 + 2NaOH Na2CO3 + H2O
Na2CO3 + BaCl2 BaCO3 + 2NaCl
NaOH (residual) + HCl NaCl + H2O
1.Muestra de suelo, 2.Recipiente con agua
3.Solucin de NaOH 0.5 N
4.Aguja #20 (Venocat calibre 17)
5.Jeringa desechable de 20mL
6.Tubo de plstico flexible de 1-2 mm de
dimetro
4.- ESTEQUIOMETRIA
Estudia el grado en que un microorganismo puede
transformar los componentes del medio de cultivo en nuevas
clulas (biomasa) y productos.
El crecimiento de poblaciones microbianas es en realidad,
el resultado de miles de reacciones intracelulares.
En un medio nutricional adecuado, los microorganismos,
extraen nutrientes del medio y los convierten en
componentes celulares.
4.1.- Conceptos importantes: C-mol de biomasa, grado de
reduccin, y calor de reaccin.
= 4 + a - 2b - 3c
un compuesto con frmula Ch Hi Oj Nk, se lleva a la forma
CH i O jN k
e d is p .
-
= 4 ,1 9
C - m ol
Sustrato
Yx/s
Yx/o2
g/g
g/mol
g/g-C
g/g
Maltosa
0.46
149.2
1.03
1.50
Manitol
0.52
95.2
1.32
1.18
Fructosa
0.42
76.1
1.05
1.46
Glucosa
0.40
72.7
1.01
1.11
Candida utilis
Glucosa
0.51
91.8
1.28
1.32
Penicillium chrysogenum
glucosa
0.43
77.4
1.08
1.35
Pseudomonas fluorescens
glucosa
0.38
68.4
0.95
0.85
Rhodopseudomonas spheroides
glucosa
0.45
81.0
1.12
1.46
Saccharomyces cerevisiae
Glucosa
0.50
90.0
1.25
0.97
Enterobacter aergenes
Ribosa
0.35
53.2
0.88
0.98
Succinato
0.25
29.7
0.62
0.62
Glycerol
0.45
41.8
1.16
0.97
Lactato
0.18
16.6
0.46
0.37
Piruvato
0.20
17.9
0.49
0.48
Acetato
0.18
10.5
0.43
0.31
Enterobacteraergenes
Sustrato
Yx/s
Yx/o2
g/g
g/mol
g/g
g/mol
Cndida utilis
Acetato
0.36
21.0
0.90
0.70
Pseudomonas fluorescens
Acetato
0.28
16.8
0.70
0.46
Cndida utilis
Etanol
0.68
31.2
1.30
0.61
Pseudomonas fluorescens
Etanol
0.49
22.5
0.93
0.42
Klesbiella sp.
Metanol
0.38
12.2
1.01
0.56
Metylomonas sp.
Metanol
0.48
15.4
1.28
0.53
Pseudomonas sp.
Metanol
0.41
13.1
1.09
0.44
Metyloccocus sp.
Metano
1.01
16.2
1.34
0.29
Pseudomonas sp.
Metano
0.80
12.8
1.06
0.20
Metanol
0.60
9.60
0.80
0.19
Metano
0.56
9.00
0.75
0.17
Pseudomonas metnica
Moles de O2 consumido.
4.2.2.- Balances
Se plantean balances de materia y energa, para lo cual
se trata al cultivo de un m.o. como una reaccin simple.
1 C m o l S + a m o l F N + b O y X y p r o d + y
C O + w H O + q ( c a lo r )
C - m ol de X
C - m o l d e fte . d e C y E
CO2
2
Si FCE es la fuente de carbono y energa.
yx
Ejemplo 1:
Se cultiva levadura Candida utilis en un medio con glucosa,
SO4(NH4)2 y sales. La concentracin inicial de
microorganismos es 0.53 gL-1, y la glucosa 15.2 gL-1. Al
cabo de 9.5 horas, se consumi totalmente la glucosa, y
0.123 mol de O2 L-1, se produjeron 0.179 mol de CO2 L-1 y la
biomasa alcanz un valor de 6.07 gL-1. Se desea averiguar
si, adems de biomasa, se form algn producto.
Datos:
Xo = 0.53g/L , So= 15.2 g/L
t= 9.5 hr.
Sf= 0, Xf= 6.07 g/L
consumo: O2= 0.123 mol/L
Productos: CO2= 0.179 mol/L .
Solucin: se usa formula de microorganismo promedio, y
el valor de C-mol.
Ecuacion de reaccin:
CH2O + O2 + SO4(NH4)2 ---Yx/s(CH1.79O0.5N0.2) +yp/sP
Biomasa formada = (6.07 -0.53)/25.8 = 0.215 C-mol/L de
biomasa
Glucosa consumida = 15.2/30= 0.506 C-mol/L de glucosa
Rendimiento:
yx/s = 0.215/0.506 = 0.425
yco2/s = 0.179/0.506= 0.354.
Puesto que la suma de yx/s y yco2/s es inferior a 1, es
obvio que se ha formado algn producto:
yp/s= 1-(0.425 + 0.354) = 0.22
Parametros:
Tiempo de duplicacin.
Tasa de crecimiento.
Cinetica
Velocidades del bioproceso:
rx = d x velocidad de crecimiento microbiano: C-molbiomasa/L.hr
;
dt
d
r d t mLo l. Oh
= velocidad de consumo de O2
d
m ol C O
r d t L . h
= velocidad de produccin de CO2
O2
O2
CO2
CO2
Medio
Tiempo de generacion
(min)
E. Coli
Glucosa-sal
17
Bacillus megaterium
Sacarosa-sal
25
Streptococcus lactis
Leche
26
Staphylococcus aureum
27-30
Streptococcus lactis
Caldo lactosa
48
Lactobacillus acidfulus
Leche
66-87
Rhizobium japonicum
Leche
344-461
Mycobacterium
tuberculosis
Sinttico
792-932
Ejemplo.2
Se tienen 1000 bacterias en un medio de cultivo ptimo y
despus de 4 horas de incubacin, creciendo
exponencialmente, se obtienen 100 000 bacterias. Calcule
el tiempo de generacin.
Xo = 1000
X = 100 000
t= 4 horas
g =? g = t/n
Calculo de n de la ec (3):
n = 3.3 log X/Xo , n = 3.3 log 100000/1000 = 6.6
generaciones
Reemplazando en: g =t / n
g = 240/6.6 = 36,36 minutos
Otra forma: con g =0.693 t/(lnX-lnXo)
g= (0.693x4)/(ln100) = 0.602 hr = 36.12 min
Ejemplo 3.
En un cultivo se tiene inicialmente 5x107 bacterias y
despus de 6 horas se tiene 5x108
Calcule el tiempo de generacin
Ecuaciones:
n=t/g, : n= (LnX-LnXo)/Ln2
Reemplazando:
n = (20-17.7)/0.693
n = 3.3
g = t/3.3 = 6/3.3
Td = 1,8 h
Ejemplo 4.
En un proceso de fermentacin microbiana, se toman datos del
conteo celular, obtenindose los siguientes:
t (hr)
X
0 0.5
1 2
1 1.5 2
4
8 16
2.5
32
3 3.5
4 4.5
5 5.5
6 6.5
7
64 128 256 512 1024 2048 4096 8192 16382
0 0.5
1
1
2
4
0 0.7 1.4
1.5
8
2.1
2
16
3
2.5
3
32
64
3.47 4.16
3.5
128
4.9
4
256
5.5
4.5
5
5.5
6
512 1024 2048 4096
6.2 6.93 7.62 8.32
6.5
7
8192 16382
9.01 9.704
Solucin
Grafica:
(criterio)
La pendiente de la
lnea de ajuste
corresponde a la
variacin del doble
del valor de X en la
ordenada y de un
valor g en la absisa.
Por tanto: m=Ln2/g
Se observa que: Pendiente:
m = 1.386 = 0.693/g
g = o.5 h
rO
rp
Modelo de Monod
Monod en 1942 desarroll una ecuacin cintica simple.
Parte de suponer que slo una enzima con cintica
Michaeliana es la responsable del consumo de S.
El modelo asume tambin que la produccin de biomasa
depende exclusivamente de la concentracin de un
sustrato limitante. Representacin:
Donde:
Kd, es la constante de decaimiento endgeno (t-1)
m S
sx
x [S ]
Ejemplo 5
ln X
CONC. GLUCOSA
(g/l)
1.25
0.2231
100.00
2.45
0.8961
97.00
16
5.10
1.6292
90.40
23
10.50
2.3514
76.90
30
22.00
3.0910
48.10
34
33.00
3.4965
20.60
36
37.50
3.6243
9.38
40
41.00
3.7136
0.63
Desarrollo:
a . Tasa mxima de crecimiento
Modelo logistico
Los modelos anteriores representan el comportamiento de los
m.o, slo en la fase log de un cultivo batch (donde es constante)
Si se quiere representar todo el proceso, es necesario recurrir al
modelo logstico.
Se obtiene combinando la ecuacin de Monod con la expresin
de y la de rendimiento biomasa-sustrato (Yx/s).
dX = m(Yx/s.So + Xo X) . X
dt
(Ks.Yx/s + Yx/s.So +Xo-X)2
Modelos Estructurados
Estos modelos consideran a la clula como un sistema de
componentes mltiples (ribosomas, enzimas, membranas, etc.).
Por ello dividen a la clula en sus componentes y consideran las
reacciones y cambios metablicos que tienen lugar en cada zona de
la clula, como respuesta a cambios en el medio.
Estos modelos consideran: las concentraciones intrnsecas,
(cantidad de un componente por unidad de masa celular) (Ci/X), y
las concentraciones extrnsecas o cantidad de un componente por
unidad de volumen del reactor.
d(Ci/X) = (1.dCi) - ( Ci. dX/dt)
dt
X.dt
X. X
Al construir el modelo se debe decidir cuantos componentes
celulares se tomaran en cuenta. (de 2 a 40). Un resultado aceptable
se produce usando al menos 3 componentes celulares.
Con mas componentes el modelo ser mas preciso, pero tambin
mas complejo.
Ci, es la concentracin de cada componente.
Con ms de un substrato limitante se pueden usar modelos
multiplicativos, modelos aditivos y modelos nominativos
Modelos segregados
Los modelos segregados tienen en cuenta que la
poblacin celular es heterognea, por lo que resultan aun
mas complejos.
Estos modelos pueden reconocer como diferentes a las
"clulas ms viejas" de las "clulas ms jvenes". (Paz
Astudillo)
Tienen en cuenta que el medio no es homogneo, permiten
variaciones de concentraciones de biomasa y de nutrientes
y diferencias en las propiedades fisicoqumicas del medio
(viscosidad, densidad, pH, T, etc.).
En el caso de microorganismos filamentosos, el modelo
tiene en cuenta los cambios morfolgicos que all se
producen, y es, un modelo segregado.(Reyes, 2006)
Balance de Biomasa
En quimostato, las clulas crecen y son, simultneamente, lavadas. El
aumento neto de biomasa estar determinado por los valores relativos
de y D en cada proceso.
Aumento neto de biomasa = Crecimiento -Lavado
Vdx = V.Xdt -FXdt
dividiendo por Vdt
sustituyendo F por D (tasa de dilucin, en hr-1 ),
(8)
(9)
Si u > D, entonces dx/dt ser positivo y la concentracin de
microorganismos en el fermentador aumenta con el tiempo. Si u < D,
dx/dt ser negativo, y la concentracin de microorganismos disminuir
con el tiempo, por el efecto de "lavado" del fermentador.
Balances de materia:
De acuerdo al esquema, se puede plantear los siguientes
balances de materia.
V . dX V .r F . X
x
dt
dS
V . dt F . S R F . S~ V . rs
dP
V.
V . r F .P
P
dt
Cuando se alcanza el estado estacionario, X, S y P ya no
varan con el tiempo, lo que equivale a igualar a cero estas
Ecuaciones:
r X D . X~
rS D . ( S R S~ )
y
~
r
D .P
P
Referencias