UNIVERSIDAD VERACRUZANA.

OBTENCION DE
PIRUVATO POR
FERMENTACION DE
GLUCOSA.
PRACTICA No. 1

BIOQUIMICA METABOLICA LABORATORIO

EQUIPO No.
5
INTEGRANTES:
DIAZ TORRES KATYA

DURAN HERNADEZ ARIADNA ELIZABETH

FISCAL VELAZCO MARTHA JOSEFA
GONZALEZ TORRES MARIANA
PALACIOS MORALES JORGE ADALBERTO
NOMBRE DE QUIEN REPORTA: DIAZ TORRES KATYA
LABORATORIO 121

PRACTICA NO.1
OBTENCION DE PIRUVATO POR FERMENTACION DE GLUCOSA.
OBJETIVO:
El alumno comprender y demostrara la produccin de uno de sus intermediarios
metablicos: el piruvato, el cual ser identificado a travs de reacciones coloridas.
GENERALIDADES:
El proceso anaerbico mediante el cual la glucosa se degrada en dos moles de
cido pirvico se conoce con el nombre de glucolisis.

Va de la glucolisis

BIOQUIMICA METABOLICA.OBTENCION DE PIRUVATO

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VAS DEL PIRUVATO:

El cido pirvico puede seguir tres caminos:
A.- En condiciones anaerbicas, en musculo y en algunas bacterias, se reduce
cido lctico.
B.- En microorganismos y en condiciones anaerobias, se descarboxila para dar
acetaldehdo y etanol, proceso conocido como fermentacin.
C.- En la mayora de las clulas aerobias, se descarboxila para entra en el ciclo de
Krebs.

Conversin del piruvato hasta etanol-

FUNDAMENTO:
DEMOSTRACION DE INTERMEDIARIOS METABLICOS.
Los metabolitos: piruvato y acetaldehdo se encuentran presentes e normalmente
en muy bajas concentraciones; por lo tanto para demostrar su existencia como
intermediarios en el camino metablico, es necesario impedir que sean
transformados en otros compuestos.
Este procedimiento se usa mucho cuando se investigan rutas metablicas y se
hace: bloqueando la enzima que cataliza la conversin del compuesto que se est
investigando mediante inhibidores. Tambin se pueden cambiar las condiciones
fisiolgicas para que la enzima funcione a una velocidad muy por debajo de su
actividad mxima, o se pude usar un agente que atrape el intermediario y que
forme un compuesto que no puedan metabolizarse.

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Para que la realizacin de esta prctica es necesario detener el proceso de

degradacin en el piruvato, impidiendo la accin de la enzima descarboxlica
pirvica y se pueda as identificar el piruvato mediante reacciones coloridas.
MATERIAL:

10 tubos de ensayo
2 matraces Erlenmeyer de 250
ml
Tapones de hule
2 matraces volumtricos de
250 ml
2 pipetas graduadas de 5 y de
10

1 tina galvanizada
Gradilla metlica.

EQUIPO:

1 termmetro
1 parrilla elctrica con agitador
magntico
1 balanza granatara
1 centrifuga

MATERIAL BIOLGICO:

20 g de levadura para pan (Sacharomyces cereviseae)

REACTIVOS:

Fosfato di bsico de sodio 0.5 M (solucin A).

Fosfato monobsico de potasio 0.5 M (solucin B).
Suspensin de levadura al 10 % en la solucin A.
Suspensin de levadura al 10 % en la solucin B.
Solucin de Nitroprusiato de sodio 5%.
Hidrxido de amonio concentrado.
Sulfato de amonio solido.
Solucin de glucosa al 10 %.
Hidrxido de sodio al 10 %.
Solucin de 2, 4 dinitrofenilhidrazina al 0.1 % HCL 2 N.
cido tricloroacetico al 10 %.
Acido pirvico (sal. Sodica)
Agua destilada c.b.p.

NOTA: Para la preparacin de las suspensiones de lavadura en las soluciones de

fosfato se recomienda dispersarla en la menor cantidad de solucin
(aproximadamente 15 ml) y posteriormente hace el aforo al volumen
correspondiente.

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PROCEDIMIENTO:
FORMACION DE PIRUVATO A PARTIR DE GLUCOSA.
1.- En dos tubos de ensaye pipetear 5 ml, de solucin de glucosa al 10 % y
marcarlos como A y B; al tubo A agregar 5 ml de suspensin de levadura
ligeramente alcalina. Al tubo B aadir 5 ml de suspensin de levadura ligeramente
acida.
2.- Colocar los tubos en bao de agua a 37 C por una hora.
3.- Aadir a cada tubo 2 ml, de cido tricloroacetico al 10 %.
4.- Mezclar vigorosamente, utilizando tapones de hule (hacerlo con cuidado).
5.- Centrifugar por 10 minutos a 300 rpm
6.- Separar el sobrenadante y usarlo para la determinacin del piruvato.
NOTA: Si alguno de los sobrenadantes queda turbio, adicionar 1 ml, ms de TCA
al 10 % y centrifugar nuevamente.
DETERMINACION DE PIRUVATO USANDO NITROPRUSIATO DE SODIO.
1.- Hervir los sobrenadantes por 3 minutos en bao Mara.
2.- En un tubo de ensayo agregar 2 ml de sobrenadante sobre 1 g de sulfato de
amonio slido.
3.-Agregar 2 gotas de solucin de Nitroprusiato de sodio al 5 %.
4.-Mezclar vigorosamente y dejar deslizar con cuidado por las paredes del tubo,
hidrxido de amonio concentrado, hasta que se formen dos capas.
Si hay piruvato se forma un anillo verde o azul en la interface de los dos lquidos.
La formacin de un anillo rosado transitorio en la interface indica la presencia de
grupos tioles, esto se observa con frecuencia antes de la formacin de un anillo
azul.
DETERMINACION DE PIRUVATO CON 2,4 DINITROFENILHIDRAZINA COMO
PRUEBA CUANTITATIVA.
1.- Agregar 1 ml de solucin saturada de 2,4 dinitrofenilhidrazina a 2 ml de
sobrenadante.
2.- mezclar fuertemente y colocar 2 o 3 gotas de esta mezcla en otro tubo de
ensaye,
3.- Agregar 1 ml de solucin de sodio al 10 % y diluir hasta 5 ml con agua
destilada. La formacin de un color rojo indica la presencia de piruvato.

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CURVA COMPARATIVA DE PIRUVATO DE SODIO.

PREPARACIN DE LAS SOLUCIONES.

Solucin stock de piruvato de sodio 10 g%: pesar 1g de piruvato de sodio

afore a 100 ml con agua destilada.
Solucin de piruvato de sodio 0.5 g%: tomar 5ml de la solucin stock
aforar a 100 ml con agua destilada.
Solucin de piruvato de sodio 1 g%: tomar 10 ml de la solucin stock
aforar a 100 ml con agua destilada.
Solucin de piruvato de sodio 1.5 g%. tomar 15 ml de la solucin stock
afore a 100 ml con agua destilada.
Solucin de piruvato de sodio 2 g%. tomar 20 ml de la solucin stock
afore a 100 ml con agua destilada.
Solucin de piruvato de sodio 2.5 g%. tomar 25 ml de la solucin stock
afore a 100 ml con agua destilada.

y
y
y
y
y
y

Etiquete 5 tubos de ensaye y mrquelos de acuerdo a la concentracin de 0.5 a

2.5 g% tome 2 ml de la solucin correspondiente y determneles piruvato con 2,4
dinitrofenilhidrazina como prueba cualitativa a cada uno.Compare los colores
obtenidos con el problema.

OBSERVACIONCES:
FORMACION DE PIRUVATO A PARTIR DE GLUCOSA.

En dos tubos de ensaye se pipete 5ml

de solucin de glucosa al 10%
Se
marcaron
como
A
y
B
respectivamente
Al tubo B se adicionaron 5ml de
suspensin de levadura(ligeramente acida)

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Se colocaron en bao mara durante

una hora

Se aadi a cada tubo 2 ml, de

cido tricloroacetico al 10 %.
Posteriormente
se
mezcl
vigorosamente, utilizando tapones de
hule
Se centrifugo por 10 minutos a 300
rpm

Se separaron los
sobrenadantes para utilizar en los pasos
siguientes

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DETERMINACION DE PIRUVATO USANDO NITROPRUSIATO DE SODIO.

Se Hirvieron los sobrenadantes por 3 minutos

en bao Mara.
En un tubo de ensayo se agreg 2 ml de
sobrenadante sobre 1 g de sulfato de amonio slido.

Se agregaron 2 gotas de solucin de

Nitroprusiato de sodio al 5 %.
Se mezcl vigorosamente y se deslizo con
cuidado por las paredes del tubo, hidrxido de
amonio concentrado, hasta que se formaron dos
capas.

La presencia de un anillo verde/ azul

en la interface de dos lquidos indic
la presencia de piruvato en uno de
los tubos (TUBO A)

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DETERMINACION DE PIRUVATO CON 2,4 DINITROFENILHIDRAZINA COMO

PRUEBA CUANTITATIVA

En un tubo se agreg 1 ml de solucin saturada de

2,4 dinitrofenilhidrazina y 2 ml de sobrenadante

Se mezcl fuertemente y se aadieron 2 o 3

gotas de esta mezcla en otro tubo de ensaye,

Se agreg 1 ml de solucin de sodio

al 10 % y se diluy hasta 5 ml con agua
destilada.

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 La formacin de un color rojo indic

la presencia de piruvato.en el TUBO A

CURVA COMPARATIVA DE PIRUVATO DE SODIO.

ESTE APARTADO DE LA PRACTICA NO SE REALIZ

RESULTADOS:

TUBO A
TUBO B

NITROPRUSIATO DE
SODIO
++
++++

2,4 DINITROFENILHIDRAZINA
+
+++.5

DISCUSIN DE RESULTADOS
El objetivo de esta prctica era demostrar la presencia de piruvato en dos tubos
con glucosa, la nica diferencia era, que en el tubo A se aadi levadura
ALCALINA y en el tubo B la levadura era ACIDA, estos factores fueron los que
determinaron la obtencin del piruvato ya que como pudimos notar, la presencia
de este fue mayor en el TUBO B, el TUBO ACIDO, esto indica que se logr
impedir la accin de la enzima piruvato descarboxilasa para as poder identificar la
presencia de piruvato mediante las reacciones coloridas observadas, en este
caso, la formacin de un anillo azul/verdoso y la coloracin completamente roja
del tubo

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CONCLUSION
Podemos concluir que, en la realizacin de esta prctica se obtuvieron los
resultados esperados ya que logramos identificar la presencia de piruvato
mediante reacciones coloridas, esto nos refleja que el objetivo de esta prctica se
cumpli, que hubo un buen manejo de la tcnica y los factores necesarios para
lograr un resultado satisfactorio es decir, inhibir el trabajo de la enzima para un
correcto resultado.
CUESTIONARIO:
1.- Cul es la accin de la enzima descarboxilasa piruvica?
Es una enzima que cataliza en el citoplasma la decarboxilacin del cido
pirvico a acetaldehdo y dixido de carbono.
2.- De qu forma se impide la accin de la descarboxilasa pirvica en el
experimento?
La fermentacin se lleva a cabo en condiciones ligeramente alcalinas para
inactivar la enzima piruvato descarboxilasa.
3.- En cul de los dos sistemas hay menor cantidad de piruvato y por qu?
En el sistema del tubo A esto es porque la pirvico-descarboxilasa no es activa en
soluciones ligeramente alcalinas
4.- Qu utilidad representa para la clula el proceso de la glucolisis?
La gluclisis es una va catablica a travs de la cual tanto las clulas de los
animales como vegetales, hongos y bacterias oxidan diferentes molculas de
glcidos y obtienen energa
5.- Con que prueba se identifica la presencia de etanol en la prctica?
Explique.
La fermentacin de los lquidos azucarados produce alcohol. La fermentacin
alcohlica se caracteriza por que el cido pirvico formado por la glucolisis se
convierte de manera anaerobia en etanol. En este caso se libera dixido de
carbono y se oxida el NADH reducindose a acetaldehdo. Se adiciona 2,4dinitrofenilhidrazina e NaOH y se observa una coloracin naranja seguida de
turbidez y una precipitacin quedando el etanol con un color naranja muy tenue.

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