UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARAN

DEPARTAMENTO DE QUMICA
SUB-REA DE QUMICA ORGNICA

SEPARAO DOS PIGMENTOS EXTRADOS DA FOLHA DE

BETERRABA POR CROMATOGRAFIA EM CAMADA DELGADA
PREPARATIVA

Material de apoio s aulas prticas das disciplinas

de Cromatografia (CQ019)
Responsvel: Prof. Luiz Pereira Ramos
Apoio: Angelita Nepel e Kahlil Salom

Curitiba, Paran
2014
Procedimento experimental para a prtica de CCDP

Prof. Luiz Ramos, DQUI/UFPR

1. OBJETIVO

Separar pigmentos vegetais usando a tcnica de cromatografia em camada delgada

preparativa (CCDP).

2. EXPERIMENTAL

2.1. Material
2.1.1. Amostra: folhas de beterraba.
2.1.2. Vidraria: almofariz, pipeta de Pasteur, bqueres de 25 ou 50 mL (4), basto de
vidro, proveta de 25 mL, funil simples, papel de filtro, banho-maria, capilares, esptula, cubas
cromatogrficas de diferentes tamanhos e cromatoplacas de 20 x 5 cm e de 5 x 5 cm.
2.1.3. Solvente para extrao das folhas: diclorometano.
2.1.4. Fase mvel para CCD e CCDP: mistura de hexano e acetato de etila (2:1, v/v).
2.1.5. Fase estacionria para CCD e CCDP: slica-gel G 60.

2.2. Procedimento para extrao dos pigmentos

Triture em um almofariz cerca de 3,0 g de folhas de beterraba. Transfira para um bquer
de 50 mL e adicione 10 mL de diclorometano. Agite bem com o basto de vidro e deixe em
macerao por 5 minutos. D preferncia recuperao de um extrato orgnico verde, em
detrimento a um extrato violceo que pode se formar em funo da presena de gua e de
pigmentos hidrossolveis oriundos das nervuras das folhas. Filtre o extrato com auxlio de um
chumao de algodo ou uma folha de papel de filtro. Colete o filtrado e concentre o mesmo em
banho-maria localizado na capela at mais ou menos 2 mL, condio em que o mesmo assume
uma colorao verde escura. Ento, divida o volume obtido em dois frascos. Use um para a
cromatografia preparativa em camada delgada (CCDP) e reserve o outro para a prtica de
cromatografia em coluna, que ser realizada noutra data.

2.3. Separao dos pigmentos por CCD

Selecione uma cromatoplaca de 5 x 5 cm e marque com cuidado a frente de progresso
do solvente e a linha de aplicao da amostra. Ao faz-lo, assegure-se que a linha de aplicao
da amostra no est muito baixa e que o traado da frente de progresso da fase mvel
aproveite ao mximo a rea disponvel para a separao cromatogrfica. Geralmente, uma rea
til de 5,0 a 5,5 cm atende aos objetivos da separao.
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Com o auxlio de um capilar, aplique a amostra concentrada sobre a linha de aplicao

da cromatoplaca (linha imaginria). Use dois pontos de aplicao que devero estar
equidistantes entre si e das paredes da cromatoplaca. Aplique, com o auxlio de um capilar
previamente selecionado, concentraes distintas do extrato em cada ponto (sugere-se uma
aplicao no da esquerda e trs aplicaes no da direita, embora isto dependa da concentrao
em que a sua amostra se encontre). Depois disto, transfira a cromatoplaca j preparada para a
cuba cromatogrfica, tomando cuidado ao inserir a mesma no seu interior. Lembre-se que a
cuba dever estar fechada durante todo o processo de evoluo cromatogrfica. Sem tocar a
cuba em nenhum momento, observe como as bandas progridem na superfcie da slica e fique
atento evoluo da frente de progresso da fase mvel.
Quando a fase mvel atingir a demarcao superior (ou sua frente de progresso),
destampe cuidadosamente a cuba cromatogrfica e retire a cromatoplaca, deixando a mesma
secar em ambiente arejado, preferencialmente dentro da capela. Feito isto, determine
criteriosamente a migrao relativa (Rf) de cada banda de eluio, procurando observar quantos
componentes foram separados e se a migrao foi homognea ao longo de toda a banda.
Variaes neste sentido devero ser explicadas e/ou discutidas no relatrio. O resultado final
dever ser semelhante ao apresentado na Figura 1, onde se v a cromatoplaca do extrato da
beterraba analisado em concentraes distintas, revelando assim a presena de componentes
como o -caroteno, a xantofila e as clorofilas A e B cujas estruturas esto apresentadas na
Figura 2.

Figura 1. CCD em cromatoplacas de 5 x 5 cm do extrato em DCM das folhas de beterraba.

2.4. Separao dos pigmentos por CCDP

Selecione uma cromatoplaca de 20 x 5 cm e marque com cuidado a frente de progresso
do solvente e a linha de aplicao da amostra. Ao faz-lo, assegure-se que a linha de aplicao
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da amostra no esteja muito baixa e que a posio do traado da frente de progresso da fase
mvel aproveite ao mximo a rea disponvel para a separao cromatogrfica.

R = H, -caroteno
R = OH, xantofila

R = CH3, Clorofila A
R = CHO, Clorofila B

Figura 2. Estrutura dos principais pigmentos das folhas de beterraba.

Com o auxlio de um capilar, aplique a amostra concentrada sobre a linha de aplicao

da cromatoplaca, formando uma faixa contnua conforme demonstrado na Figura 3. Faa o
possvel para que a linha de aplicao seja a mais homognea possvel. Depois disto, transfira a
cromatoplaca j preparada para a cuba cromatogrfica, tomando cuidado ao inserir a mesma no
seu interior. Lembre-se que a cuba dever estar fechada durante todo o processo de evoluo
(ou corrida) cromatogrfica. Sem tocar na cuba em nenhum momento, observe como as bandas
progridem na superfcie da slica e fique atento evoluo da frente de progresso da fase
mvel. Lembre-se tambm de registrar o tempo total de anlise, desde a transferncia da
cromatoplaca para o interior da cuba cromatogrfica at o momento de sua retirada (vide
abaixo).
Quando a fase mvel atingir a demarcao superior (ou a linha demarcada para a sua
progresso), destampe cuidadosamente a cuba cromatogrfica e retire a cromatoplaca do seu
interior, deixando a mesma secar em ambiente arejado, preferencialmente dentro da capela de
exausto. Feito isto, determine criteriosamente a migrao relativa (Rf) de cada banda de
eluio, procurando observar quantos componentes foram separados e se a migrao foi
homognea ao longo de toda a banda. Variaes neste sentido devero ser explicadas e/ou
discutidas em seu relatrio.

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Figura 3. Cromatoplacas de CCD preparativa com a linha de aplicao da amostra antes da corrida
cromatogrfica ( esquerda) e depois de concludo o processo de eluio ( direita).

A prxima etapa refere-se remoo de um componente da superfcie da cromatoplaca.

Selecione uma das bandas de acordo com as orientaes do professor responsvel e remova-a
cuidadosamente com auxlio de uma esptula. Esta remoo dever ser feita por raspagem e a
slica contendo o pigmento dever ser recebida em um bquer de 50 mL. Feita a remoo,
adicione uma mistura de hexano e acetato de etila (1:1, v/v) e deixe em contato por alguns
minutos sob agitao. Transcorrido esse tempo, filtre a suspenso atravs de algodo ou papel
de filtro acomodado em um funil de vidro. Lave o resduo com o mesmo solvente, se
necessrio, e concentre o filtrado lmpido em banho-maria at um volume mnimo,
preferencialmente sem deixar secar.
Finalmente, com o componente extrado j concentrado, analise o produto isolado em
uma cromatoplaca de 5 x 5 cm, utilizando cuba de vidro apropriada. Neste sentido, siga todas
as orientaes que j recebeu em aulas anteriores para fazer a corrida cromatogrfica contra a
mesma fase mvel utilizada na cromatografia preparativa. O resultado final dever ser
semelhante ao apresentado na Figura 3, onde se v a cromatoplaca do extrato da beterraba
esquerda e a cromatoplaca do componente isolado por cromatografia preparativa direita, com
a amostra isolada em evidncia. Faa todas as medidas necessrias nesta cromatoplaca e
registre os resultados no seu relatrio, procurando discutir todas as observaes prticas que
pode fazer ao longo da realizao da prtica.
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Figura 3. CCD em cromatoplacas de 5 x 5 cm do extrato bruto ( esquerda) e de uma frao isolada

por cromatografia preparativa ( direita).

Segundo a literatura especializada, vegetais como a beterraba e o espinafre so ricos em

pigmentos naturais e antioxidantes como o -caroteno (amarelo-alaranjado), a xantofila (vrias
tonalidades de amarelo, as feofitinas A e B (pigmentos acinzentados derivados das clorofilas A
e B pela substituio do on Mg2+ por dois tomos de hidrognio), clorofila A (azul esverdeado
intenso), clorofila B (verde) e vrias formas de xantofilas (pigmentos amarelos). Em geral,
todos estes pigmentos so bastante sensveis luz e ao aquecimento e por isto os seus extratos
devero ser manuseados com cuidado.
Como sugesto, registre os resultados das cromatoplacas na forma de tabela como as
apresentadas logo a seguir, que poder ser montada para os dois sistemas cromatogrficos
(CCDP e CCD). A indexao da cor e do Rf com o seu respectivo pigmento depender de uma
pequena reviso bibliogrfica, onde a avaliao da estrutura destes componentes poder
auxiliar na elucidao do poder eluotrpico da fase mvel. Outra opo interessante
fotografar as suas cromatoplacas, se possvel, de modo a ilustrar o seu relatrio. O relatrio
relativo a esta prtica dever ser entregue ao professor responsvel na prxima aula prtica da
disciplina.

5. REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS
COLLINS, C. H; BRAGA, G. L; BONATO, P. S.; Fundamentos de cromatografia, Editora
Unicamp, 1 Edio, 2006.
GRIFFIN, G.W.; QUACH, H.T.; STEEPER, R.L.; J. Chem. Ed., 81 (2004), 385-387.
FONSECA, S. F.; GONALVES, C. C. S.; Qumica Nova na Escola, 20 (2004), 55-58.
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Tabela 1. Resultados obtidos na separao cromatogrfica em CCD dos pigmentos extrados em

diclorometano da folha de beterraba.

Cor da banda

Pigmento

da (cm)

ds (cm)

Rf

Tabela 2. Resultados obtidos na separao cromatogrfica por CCP preparativa dos pigmentos
extrados em diclorometano da folha de beterraba.

Cor da banda

Pigmento

da (cm)

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ds (cm)

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Rf