LABORATRIO DE BIOLOGIA

1 MICROSCOPIA
Microscpio ptico fotnico vulgar
Modo de utilizao.
Iluminao de Khler.
Observao da diversidade celular comparando as clulas procariotas (bacilos e cocos) com
as eucariotas (fungos, protozorios, tecidos animais e vegetais).
Interpretao das imagens em microscopia fotnica
Microscpio ptico invertido
Observao de cultura de clulas animais e interpretao das imagens.
Microscpio ptico de contraste de fase
Modo de utilizao.
Observao de clulas animais vivas no coradas assim como, de clulas vegetais
destacando a epiderme da pgina inferior de uma folha.
Interpretao das imagens nesta microscopia.
Colorao vital
Realizao de preparaes de clulas vivas e sua observao antes e depois da colorao
com diferentes corantes vitais tais como, azul de metileno, vermelho neutro e lugol entre
outos. As clulas no coradas sero observadas no microscpio fotnico e no de contraste
de fase e as coradas no microscpio fotnico vulgar.
Preparaes definitivas
Realizao de incluses em parafina.
Obteno de cortes no micrtomo e sua colagem em lminas.
Colorao dos cortes com vrios corantes tais como, hematoxilina - eosina e sua montagem
definitiva.

Micrometria e Cariometria
Medio de clulas com uma ocular micromtrica utilizando primeiro um micrmetro
objectivo.
Cariometria: Determinao de reas de ncleos celulares.
Microscpio de fluorescncia
Modo de utilizao.
Observao de auto-fluorescncia de componentes das clulas vegetais.
Observao de ncleos, citoplasmas e RNA com colorao de laranja da acridina.
Imunocitoqumica. Estudo dos componentes do citoesqueleto. Observao de microtbulos
com anticorpos anti-tubulina marcados com fluorescena. Observao de microfilamentos
com anticorpos anti-actina marcados com rodamina.
Interpretao de imagens nesta microscopia.
Microscpio Digital
Demonstrao da utilizao.
Observao em campo claro, contraste de fase, fluorescncia, polarizao, contraste
interdiferencial e confocal de clulas animais e vegetais.
Citoqumica dos diferentes componentes qumicos celulares
cidos nucleicos
DNA em cortes histolgicos pela reaco de Feulgen.
DNA e RNA pela colorao do verde - metil - pironina.
Lpidos
Lpidos totais com os corantes Sudan III, tetrxido de smio e Sudan Black B.
Lpidos no cidos com o corante azul de nilo em clulas vivas e cortes histolgicos.

Polissacridos
Corantes: Lugol, azul de alcio e cido peridico de Schiff (PAS) em cortes celulares e
esfregaos de sangue fixados.
Protenas
Protenas totais com o fast green cido, segundo Deitch
Protenas histnicas com o corante fast green alcalino, segundo Alfert e Geschwind
modificado por Deitch.
Peroxidases pelo mtodo da benzidina, segundo Prenant.
Clcio e Ferro
Clcio com a colorao de Alizaran.
Ferro com a colorao azul de Turnbull.
Citoqumica de organitos celulares nas clulas animais
Lisosssomas com marcao da fosfatase cida segundo Gmori.
Mitocndrias segundo o mtodo de Rgaud.
Complexo de Golgi segundo o mtodo de Ramon e Cajal.

2 - MICROSCOPIA ELECTRNICA
Microscpio Electrnico de Transmisso
Observao de grelhas para o respectivo microscpio com cortes ultra- finos contrastados.
Observao e interpretao de microfotografias de clulas animais, vegetais e
microorganismos infectando ou no, as clulas hospedeiras.
Observao e interpretao de microfotografias de contrastao negativa
Microscpio Electrnico de Varrimento
Observao e interpretao de microfotografias de rplicas celulares

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TCNICAS DE OBTENO DE PREPARAES CROMOSSMICAS
Cultura celular
Escolha de tecido, Colheita, Cultura e meios de cultura e respectiva tcnica
Bandas
Tcnicas para as Bandas G, R, C e NOR
Observao ao microscpio e de fotografias
Estudo das leucemias

3 - CLULA VEGETAL
O estudo da clula vegetal e a sua importncia em Botnica Farmacutica, como auxiliar na
caracterizao de frmacos de origem vegetal e na deteco de adulterantes.
A parede celular em microscopia ptica
Composio qumica da parede celular primria e secundria. Diferentes reaces de
caracterizao qumica dos seus principais constituintes: celulose, lenhina, cutina e
suberina.
Sua aplicao caracterizao de frmacos de origem vegetal.
O sistema vacuolar
Os vrios tipos de vacolos e o seu contedo. Tcnicas para a sua observao.
Realizao de testes histoqumicos para a caracterizao de alguns grupos de compostos do
metabolismo secundrio armazenados nos vacolos: compostos fenlicos e alcalides.
Utilizao do microscpio de fluorescncia para a caracterizao de contedos vacuolares.
Aplicaes ao estudo de alguns frmacos de origem vegetal e seus adulterantes.
O sistema plastidial
Observao de diferentes tipos de plastos em microscopia ptica: cloroplastos,
cromoplastos, amiloplastos e leucoplastos.

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Observao de gros de amido, sua classificao e colorao. Importncia da sua utilizao
como auxiliar na identificao de frmacos de origem vegetal e seus adulterantes, atravs
da consulta da Farmacopeia Portuguesa.
Histologia e Anatomia Vegetal. Aplicaes ao estudo de Frmacos de origem vegetal
Observao e caracterizao de alguns tecidos vegetais. Sua importncia em Botnica
Farmacutica como auxiliar na caracterizao de frmacos de origem vegetal e na deteco
de adulterantes.
Estudo do tecido epidrmico
Observao de alguns microcaracteres a nvel do tecido epidrmico: classificao de
estomas e determinao do ndice estomtico; tricomas tectores e secretores. Importncia
destes caracteres em taxonomia e na identificao de frmacos de origem vegetal.
Utilizao de monografias da Farmacopeia Portuguesa para estudo de microcaracteres da
epiderme em frmacos de origem vegetal.
Cortes histolgicos
As estruturas primrias e secundrias de raz, caule e folhas em exemplares de
monocotiledneas e de dicotiledneas.
Observao de cortes histolgicos de vrios exemplares.

4 CICLO CELULAR EM CLULAS ANIMAIS E VEGETAIS

Estudo do ciclo celular
Observao microscpica de mitoses em clulas animais e vegetais.
Observao microscpica de figuras das fases das duas divises meiticas em anteras de
vegetais.
Observao microscpica de cromossomas em interfase
Observao microscpica dos cromossomas gigantes das glndulas

salivares da

Drosophila, visualizao das diferentes bandas e observao dos cromossomas plumosos.

Observao microscpica e fotogrfica de cromossomas humanos em metafase cariotipo humano

Observao microscpica e fotogrfica das placas metafsicas marcadas por diferentes
tipos de bandas.
Apoptose
Observao de preparaes em microscopia ptica de clulas com figuras de apoptose.
Bibliografia
ALLAN JONES, ROB REED and JONATHAN WEYERS. (1998). Practical Skills in
Biology. Longman Press.
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Theory and Practice of Histological

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FRANCO, J. A. (1971). Nova Flora de Portugal. Vol. I, II, III, Lisboa.
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New York. W. H. Freeman and Company / Worth Publishers, Inc. 1999.
SALEMA, R. et al. (1983). Atlas de Ultraestrutura Celular. Porto Editora.

mbito
A descoberta e o estudo das clulas feita por M. Schleiden, botnico e pelo zologo T.
Schwann reconheceram semelhanas entre clulas vegetais e animais e a TEORIA
CELULAR foi proposta juntamente com R. Virchow que sugeriu que todas as clulas so
originrias doutras clulas pr- existentes.
Ao objectivo da Biologia Celular alia-se o da aprendizagem das tcnicas de manuseio de
diferentes tipos de microscpios pticos, observao de estruturas celulares em microscopia
ptica e electrnica, metodologias utilizadas nos diferentes microscpios assim como, o
reconhecimento e interpretao de imagens de microscopia e anlise crtica experimental.
Conjuntamente, sero estudadas as tcnicas experimentais mais importantes para o estudo
das clulas.
O estudo da clula Vegetal, a Histologia e Anatomia Vegetal com a Aplicao ao Estudo
de Frmacos de origem Vegetal ser um dos objectivos desta Licenciatura. O estudo e
observao de culturas de clulas ser determinante para os ensaios in vitro dos projectos
cientficos das cincias farmacuticas. A citoqumica de acidos nucleicos, lpidos e
carbohidratos assim como, a micrometria de diferentes clulas ao microscpio ptico e
electrnico dar base para o bom estudo do novo medicamento.

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INSTRUMENTOS DE ANLISE DE ESTRUTURAS BIOLGICAS

MICROSCOPIA
A microscopia tem a maior importncia no estudo das clulas. Muitas caractersticas
importantes de interesse nos sistemas biolgicos so demasiado pequenas para serem vistas
a olho nu, s podendo portanto, ser observadas com o microscpio.
Nos anos mais recentes, tem-se notado um grande desenvolvimento em microscpios,
corantes, protocolos de colorao e tcnicas de preparao para ajudar a esclarecer melhor a
estrutura e funo das clulas.
Descreveremos as capacidades e aplicaes das vrias tcnicas de microscopia usadas para
visualizar as clulas, as suas estruturas subcelulares e ainda as suas molculas.
As estruturas celulares que necessitamos de estudar tm dimenses que, em regra, so
invisveis vista desarmada. 1mm (milmetro) = 1 000 m (micrmetro) = 1 000 000 nm
(nanmetro) = 10 000 000 (Angstrom).
O olho humano s consegue formar imagens de objectos com dimenses superiores a cerca
de 0,2mm. Para observar objectos mais pequenos necessrio formar deles uma imagem
ampliada.
Os microscpios so os aparelhos utilizados para formar essas imagens.
Radiao electromagntica
Os microscpios usam radiaes electromagnticas para formar imagens ampliadas dos
objectos a observar.
O microscpio ptico usa a luz visvel (radiao electromagntica com comprimento de
onda compreendido entre 400 e 800 nm)

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O microscpio electrnico usa raios catdicos (feixe de electres) cujo comprimento de
onda inversamente proporcional voltagem de acelerao dos electres usados no
microscpio, sendo de 0,0037nm para uma voltagem de 100KV.
Resoluo e ampliao
H um limite mnimo para a dimenso dos objectos que podem ser observados com um
determinado sistema ptico, limite esse que se denomina resoluo do sistema. Por
exemplo, a resoluo do olho humano de cerca de 0,2mm, e determinada pela estrutura
celular da retina. A de um microscpio ptico de 0,2mm e limitada pelo comprimento
de onda da luz visvel.
A ampliao da imagem produzida pelo sistema ptico, permite observar objectos de
dimenses inferiores a 0,2 mm (resoluo do olho humano), mas apenas at ao limite de
resoluo do sistema ptico. Objectos menores que este limite no podem formar imagens,
por maior que seja a ampliao utilizada.
A ampliao til a ampliao necessria para que a imagem do objecto se torne visvel,
ou seja, para que atinja dimenses iguais ou superiores ao limite de resoluo do olho
humano. Para conforto do observador, as imagens so ampliadas at dimenses que tornam
a sua observao confortvel. O factor de ampliao adicional a ampliao vazia.
Exemplo: Para que um objecto no limite de resoluo do microscpio ptico se torne
visvel necessrio ampli-lo: 0,2mm / 0,2 m = 200 m / 0,2 m = 1000 x. Para uma
observao confortvel, podemos ampli-lo at 1mm, utilizando um factor de ampliao
adicional de 1mm/0,2mm=5.
V-se assim que a ampliao til de um microscpio ptico no excede as 1000x
Tipos de microscpio
O limite de resoluo de um microscpio depende do comprimento de onda da radiao
electromagntica usada para formar a imagem e de aberraes das lentes .

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Deste modo, pode-se melhorar a resoluo construindo microscpios que utilizem
radiaes de comprimento de onda menor que o da luz visvel. A construo deste tipo de
microscpios depende da capacidade de produzir lentes para a radiao em causa. A
radiao ultra-violeta permite algum ganho de resoluo, mas usada principalmente nos
microscpios de fluorescncia. Os raios-X comeam a poder ser usados com lentes
especiais, e raios-gama no foram ainda usados por falta de dispositivos que possam
funcionar como lentes. Os raios catdicos (feixes de electres) utilizam ++ e so usados
nos microscpios electrnicos.
Nos microscpios mais comuns, o feixe de radiao esttico e irradia simultaneamente
toda a rea observvel da amostra. Noutros aparelhos (microscpios de varrimento), o
feixe possui dimenses muito reduzidas irradiando apenas um ponto da amostra, e dotado
de um movimento relativamente quela, irradiando em sequncia todos os pontos do
objecto (varrimento ou varredura).
O microscpio ptico usa a luz visvel como radiao electromagntica.
Os componentes principais do microscpio ptico so:

Fonte luminosa:

Condensador

Diafragmas de campo e do condensador

Platina

Objectiva

Tubo

Oculares
MICROSCPIO PTICO FOTNICO VULGAR

No microscpio ptico de transmisso a luz emitida pela fonte luminosa e concentrada

pelas lentes condensadoras, atravessa a amostra e penetra na objectiva. A objectiva forma
uma imagem real, ampliada, do objecto e as oculares formam uma imagem virtual,
tambm ampliada, da imagem real produzida pela objectiva. A imagem virtual situa-se
distncia de 25cm do olho do observador, e a imagem que pode ser observada. A

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ampliao total o produto dos factores de ampliao da objectiva e das oculares, podendo
existir outros dispositivos no trajecto da luz que introduzam factores multiplicativos
adicionais.
O feixe luminoso que atravessa a amostra modificado por interaces com esta, que
consistem na absoro de certos comprimentos de onda produzindo cr, difraco,
refraco, reflexo, diferena de fase etc. Estas interaces vo-se traduzir na produo
de diferenas de cr ou de intensidade luminosa na imagem do objecto, que podem ser
percebidas pelo olho humano.
MICROSCOPIA DE CONTRASTE DE FASE
Ambos os microscpios usam a propriedade de dar contraste a estruturas biolgicas
transparentes luz visvel, visto que fazem mudanas de fase e/ou atrasos nas radiaes que
atravessam essas estruturas.
O microscpio de contraste de fase usa um condensador e objectivas especiais. O
condensador est provido de um diafragma em forma de anel (diafragma anular) que
produz um cone oco da luz que o atravessa.
A luz ilumina o objecto e o que o rodeia. A luz que passa o objecto desviada em relao
que passa directamente o meio que o rodeia. O efeito de fase depende da interferncia
entre a imagem geomtrica directa e a imagem difractada lateral. Se os dois grupos de raios
se somam em contraste brilhante ou negativo o objecto aparecer mais brilhante que o
meio. Quando o contraste positivo ou escuro os jogos de raios experimentam uma
interferncia substrativa sendo a imagem do objecto mais escura que o meio. Deste modo,
pequenas mudanas de fase so transformadas em diferenas de amplitude (intensidade).
I

S+D

Comp. de onda
S

D. Raios difractados
S. Raios directos

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I

S
S-D

Comp. de onda
D

Para obter os dois tipos de contrastes o microscpio provido de objectivas com

dispositivos de fase especficos:
CONTRASTE BRILHANTE

vidro
material retardante de fase
material absorvente
CONTRASTE ESCURO
A)

vidro

material
absorvente
B)

vidro
material retardante de fase
Conforme os fabricantes de microscpios o contraste escuro pode ser obtido com dois
dispositivos diferentes (ver Figuras A e B). Utilizando o dispositivo A, a luz directa

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levada ao foco da objectiva onde est colocada a placa de fase. Esta, tem uma ranhura em
forma de anel que coberta por uma fina camada de metal que tem por fim fazer avanar os
raios da luz directa de um quarto de comprimento de onda e reduzir a sua intensidade.
Os raios da luz desviada do objecto que tinham sido atrasados comparativamente luz da
fonte luminosa passam sem alterao pela placa de fase.
Em seguida, as ondas de luz que passaram pelo objecto e aquelas que passaram pelo meio
que o circunda, encontram-se no plano onde se forma a 1 imagem dada pela objectiva.
Aqui, algumas das ondas de luz interferem entre si e o brilho reduzido. A ocular recebe os
dois conjuntos de ondas de luz para formar uma imagem altamente contrastada do objecto.
Esta imagem tem um halo considervel em virtude dos efeitos de difraco.
Os esquemas mostram a passagem da luz atravs da preparao, e os dispositivos de fase.

A microscopia de interferncia tem por base princpios semelhantes ao microscpio de

contraste de fase, mas tem a vantagem de fornecer dados quantitativos. Este microscpio,
permite a deteco de variaes pequenas e contnuas de ndice de refraco, enquanto que
o microscpio de fase s revela variaes acentuadas.
Porque o atraso de fase consequente da diferena entre o ndice de refraco do meio e do
objecto, e porque o aumento refractivo quase o mesmo para todas as molculas

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biolgicas, possvel avaliar a quantidade de massa seca por unidade de rea do objecto,
medindo o atraso de fase.
A quantificao do atraso de fase feita usando um compensador que reduz o brilho do
objecto a negro. Embora o seu uso seja remoto, pode ser empregue no futuro com sistemas
analisadores de imagem.
MICROSCOPIA DE FUNDO ESCURO
No microscpio de fundo escuro, a luz dirigida do condensador amostra num ngulo
oblquo de maneira a que nenhuma luz incidente entre nas lentes da objectiva (criando um
campo escuro se nenhuma amostra estiver presente). Nestas condies, s a luz refractada
ou difractada pela amostra entra nas lentes da objectiva para formar a imagem.
A resoluo no muito boa, mas com este mtodo podemos observar objectos pequenos
que refractam a luz incidente. usado na microbiologia, para detectar bactrias ou na
autoradiografia, para detectar gros de prata produzidos na emulso fotogrfica por
radiao.
A Figura mostra um esquema deste tipo de microscpio.

Uma das grandes vantagens dos microscpios de contraste de fase, interferncia e de fundo
escuro que eles tornam possvel a observao dos movimentos envolvidos em processos
como, mitose e migrao celular. Como muitos movimentos so demasiado lentos para
observar em tempo real til fotografar (microcinematografia) ou filmar em sistema de
vdeo.
Ultimamente, as cmaras de vdeo e a tecnologia associada do processamento de imagem
tm tido maior impacto na microscopia ptica. Alm de possibilitarem a resoluo de certas

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imperfeies do microscpio, resolveram de igual modo as limitaes do olho humano, tais
como a percepo de pequenas diferenas na intensidade da luz contra um fundo brilhante.
Como as imagens dadas pelas cmaras de vdeo so em forma electrnica, elas podem ser
digitalizadas e processadas por um computador. Este facto tornou possvel, atingir o limite
de resoluo terico do microscpio ptico e aumentar o contraste das imagens. Um dos
exemplos a observao de microtbulos, com dimetros de dimenso inferior ao da luz
(0,025 m) no microscpio de interferncia assistido por um computador.

MICROSCOPIA DE FLUORESCNCIA
um microscpio de luz incidente (epi-iluminao), como o microscpio de reflexo. O
feixe luminoso tem no entanto um comprimento de onda apropriado (habitualmente na
regio azul ou ultravioleta) para excitar substncias fluorescentes (fluorocromios) que se
encontram na amostra. Estas substncias podem fazer parte da composio natural amostra
ou ser introduzidas pelo processamento tcnico como corantes.
A luz emitida pelos fluorocrmios excitados pelo feixe luminoso, entra na objectiva para
formar a imagem.
Mecanismo da fluorescncia
Quando certas substncias como o vidro, gotas de gordura e diversos corantes so expostos
s radiaes UV, modificam o comprimento de onda destas radiaes e tornam-se
luminosas, isto , so fluorescentes. Se tratarmos tecidos, clulas, bactrias com um corante
fluorescente e as examinarmos ao microscpio com luz UV, elas tornam-se luminosas e
aparecem como corpos brilhantes num fundo escuro.
A fluorescncia data de 1904 com Kohler e foi usada mais frequentemente com Coons que
introduziu a tcnica dos anticorpos fluorescentes em 1941.
A fluorescncia um fenmeno ptico no qual a luz absorvida por uma substncia
chamada fluorforo e quase instantneamente re-emitida com luz dum maior. Como
resultado da absoro da luz, as molculas de fluorforo tornam-se excitadas, quer dizer,
absorvem a energia da luz e o seu estado electrnico mudado para um estado excitado no
qual a energia de cada molcula maior do que o seu estado normal.

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A energia excedente dissipada em calor, emitida em fluorescncia, ou usada numa
reaco fotoqumica.
No primeiro caso, a luz meramente absorvida sem fluorescncia. No segundo, a
fluorescncia ocorre. No terceiro, a reaco fotoqumica induzida pela luz apagar-se-.
Esta tcnica no s utilizada quando se pretende detectar substncias em concentraes
mnimas, mas tambm se usa para observaes depois de tratamentos qumicos. Quando
surgem mudanas de excitao ou emisso do espectro de substncias fluorescentes devido
sua unio ao substrato, tambm se podem obter informaes a respeito da conformao
das molculas do substrato.
Tipos de fluorescncia do material biolgico
Tipos de fluorescncia

Locais e Tcnicas

Autofluorescncia

Fluorescncia natural de substncia(s) no

tecido
Drogas fluorescentes
Substncia no tecido convertida a
fluorfero
A.Tc.colorao simples sem p. trat.
Qumico
B. Reac. qumica seguida de colorao, ex.
Feulgen
Fluorocromia indirecta
Mt. Fluorescentes

Fluorescncia induzida
Fluorescncia do corante

Imunofluorescncia
Fluorescncia prod. Enzimaticamente

No Quadro, podem ver-se os tipos de fluorescncia e os materiais

microscpio de fluorescncia.

a observar no

Autofluorescncia
A autofluorescncia predominante nos tecidos vegetais. Nos tecidos animais, podemos
encontr-la nas fibras do tecido conjuntivo (colagnio e elastina) e nas lipofucsinas. No
interior celular, a maior parte da autofluorescncia devida presena do NADH unido a
uma dehidrogenase mitocondrial.

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Todas as protenas fluorescem quando so excitadas a 250-280 nm (UV), devido presena
do triptofano, tirosina e fenilalanina.
As gotas lipdicas tambm podem ser observadas no microscpio de fluorescncia.
Fluorescncia induzida
Algumas substncias podem ser convertidas a fluorescentes por tratamento qumico. Ex o
formol reage com as ariletilaminas por reaces de condensao levando formao de
isoquinolinas e outros compostos fluorescentes.
Fluorocromia
Os corantes fluorescentes so conhecidos por fluorocromos em contraste com os que so
visualizados no microscpio de luz que so chamados diacromos. Muitos corantes podem
ser usados como diacromos e fluorcromos: Vermelho Congo, Vermelho neutro, Eosina e
Fucsina Bsica. A maioria dos corantes amarelos, laranja, e vermelhos so de facto,
fluorescentes, (laranja de acridina e quinacrina, esto entre eles.
A colorao do DNA com fluorcromos importante, principalmente, devido aos estudos
fluorimtricos. Primeiro, foi usada para o estudo da conformao do DNA, mas agora
utilizada para a quantificao do contedo em DNA. Usam-se Laranja de Acridina, reaco
de Feulgen, Brometo de etdio, etc.
Fluorescncia Metacromtica
Alguns fluocromos so metacromticos, isto , fluorescem com mais de uma cor. Com os
fluorcromos metacromticos, assim como os diacromos, a mudana da ortocromasia para
metacromasia envolve um aumento no pico de excitao (absoro) em direco a curtos
comprimentos de onda, e um decrscimo na absoro mxima. Adicionalmente, existe um
correspondente aumento do espectro de emisso em direco a grandes . Resumindo, a cor
emitida pela fluorescncia muda para uma de maior, e o brilho da fluorescncia diminui.
A fluorescncia metacromtica devida formao de dmeros e polmeros como resultado
duma agregao das molculas do corante.
Dos corantes fluorescentes metacromticos, o mais conhecido a Laranja de Acridina,
verde na sua forma ortocromtica, cora o DNA, e vermelho na forma metacromtica, cora o
RNA, DNA desnaturado e polissacridos.

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Imunofluorescncia
Certos corantes fluorescentes podem utilizar-se para marcar os anticorpos do soro. Eles so
adicionados s gamaglobulinas custa de determinados radicais e tornam fluorescente o
conjugado resultante. Pode empregar-se o isotiocianato de fluorescena.
As figuras 1 e 2 apresentam, respectivamente, as estruturas da fluorescena e
tetrametilrodamina, dois corantes usados em imunoflorescncia. O 1 emite luz amarela
esverdeada quando activado por luz de comprimentos de onda prprios, enquanto que o
2 emite luz vermelha. Na zona sombreada onde esto localizadas os grupos reactivos
quimicamente. Nesta posio vai ser formada uma ligao covalente entre o corante e a
protena ou outra molcula. Quando se ligam a protenas a ligao feita ao grupo SH ou
ao NH2.

HO

CH 3

O
H3 C

COO

Fig.1 - Fluorescena

CH 3
+
N

COO

CH 3

Fig. 2 - Tetrametilrodamina

Fluorescncia produzida enzimaticamente

A actividade enzimtica nas clulas (vivas ou fixadas) pode ser estudada em sistemas onde
a enzima produz uma mudana de fluorescncia pela aco num substracto ou co-enzima.

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Microtubules
Rat aortic smooth muscle cells
stained with an anti-tubulin
antibody and FITC-conjugated
secondary antibody (green).
(Omega Optical Filter Set #
XF71). Photograph by Jim San
Fillipo

Aplicaes
As tcnicas de fluorescncia podem ser aplicadas a todas as espcies de material biolgico.
O microscpio de fluorescncia tem grande sensibilidade tornando possvel detectar
pequenas quantidades de substncia ou partculas de tamanhos abaixo da resoluo do
microscpio de luz. Podem ser visualizadas as mesmas preparaes que no MO de luz e
tem a vantagem de observar os corantes que absorvem na regio do UV fluorescendo no
visvel.
MICROSCOPIA DE POLARIZAO
Este mtodo baseia-se no comportamento de certos componentes de clulas e tecidos,
quando so observados com luz polarizada. Se o material for isotrpico, a luz polarizada
propaga-se atravs dele com a mesma velocidade, independentemente da direco do plano
de incidncia. Estas substncias caracterizam-se por terem o mesmo ndice de refraco em
todas as direces. Por outro lado, num material anisotrpico a velocidade de propagao
da luz polarizada varia. Este material tambm chamado birrefringente, porque apresenta
dois ndices de refraco diferentes, correspondentes a diferentes velocidades de
transmisso.
Nas fibras biolgicas, a birrefringncia positiva se o ndice de refraco for maior ao
longo do comprimento da fibra, do que no plano prependicular, e negativa no caso oposto.
A birrefringncia (B) pode ser expressa quantitativamente como a diferena entre os dois
ndices de refraco (Ne N0) associados com os raios de maior e menor velocidade.

22
Na prtica, com o microscpio de polarizao, mede-se o atraso (T) que a luz sofre num
plano, relativamente velocidade que a luz apresenta num plano perpendicular a este. O
atraso est relacionado com a espessura do espcime (t) da seguinte maneira:
B = Ne - N0 = T/ t
O microscpio de polarizao difere do microscpio vulgar pela presena de dois
elementos de polarizao: o polarizador e o analizador, que consistem de folhas polaride
ou de prismas de Nicol em calcite. O polarizador monta-se por baixo do condensador e o
analizador por cima da objectiva.
O microscpio de polarizao, tal como o microscpio de interferncia, pode ser acoplado a
uma cmara de vdeo, o que melhora consideravelmente o contraste e a qualidade de
imagem.
Microscpio confocal
Trata-se de um microscpio ptico que funciona em modo de varrimento. Portanto o feixe
luminoso irradia apenas um ponto da preparao, sendo produzido por um laser. Do mesmo
modo que no SEM, o feixe de radiao percorre a preparao.
Microscpio invertido
um microscpio ptico de transmisso, em que as posies da objectiva e do condensador
se encontram invertidas relativamente platina.
O aparelho usado para observar o fundo dos frascos de cultura de clulas, que no podem
ser facilmente estudados com os microscpios normais.
ALINHAMENTO DOS MICROSCPIOS PTICOS
Focar a preparao e fechar o diafragma de campo ate observar um pequeno crculo.
Centrar o crculo com os parafusos do condensador e deslocar o condensador na vertical
para que os bordos do diafragma que delimitam o crculo fiquem perfeitamente focados.
Manter o condensador nesta posio para a objectiva alinhada. A rea iluminada pode ser
ajustada abrindo ou fechando o diafragma de campo. S deve ser iluminada a rea a
observar abrindo o diafragma at que todo o campo esteja iluminado e no mais que isso.

23
O diafragma do condensador pode ser usado para regular o ngulo do cone de luz que entra
na objectiva. Em condies ideais, este cone de luz deve iluminar toda a lente frontal da
objectiva e no mais do que isso. Nestas condies toda a abertura numrica da lente
aproveitada, e toda a luz proveniente do condensador entra na objectiva. Uma maior
abertura do diafragma do condensador pode produzir maior intensidade luminosa, mas
produz um fundo brilhante que impede a visualizao de pequenos detalhes. O fecho do
diafragma vai diminuir a abertura numrica da objectiva, reduzindo a resoluo, mas
permite aumentar o contraste da preparao.
A imagem do diafragma do condensador pode ser monitorizada no plano focal da objectiva,
que directamente observvel removendo a ocular e observando directamente o interior do
tubo do microscpio. As condies de iluminao descritas designam-se por "iluminao
de Koeller".

MICROSCOPIA ELECTRNICA DE TRANSMISSO

Interpretao da imagem em microscopia electrnica de transmisso
As imagens observadas com um microscpio electrnico de transmisso (TEM
Transmission Electron Microscope) so imagens de cortes de objectos tridimensionais. A
formao das imagens no microscpio depende de mtodos de contrastao que introduzem
nos cortes metais pesados que, ao interagir com o feixe de electres, do origem imagem.
Na interpretao destas
imagens h que atender
portanto a estes dois
factores:
1. Em que medida que a
imagem produzida pelo
mtodo de contrastao
corresponde realidade
estrutural, e que dados
sobre a sua composio
qumica se podem
recolher por maniulao
dos mecanismos de
contrastao.

24

2. Que se pode inferir relativamente estrutura do objecto tridimensional que se pretende

compreender, do estudo das seces bidimensionais, em termos qualitativos e quantitativos.

O contraste
Para compreender a primeira questo necessrio conhecer o mecanismo da formao do
contraste no TEM. O feixe de electres, acelerado por um potencial de vrias dezenas de
kilovolts (tpicamente 60-80 KV em estudos de materiais biolgicos), atravessa a amostra
interagindo com os seus tomos.
As colises dos electres do feixe com os tomos da amostra processam-se segundo dois
processos essenciais:
1) colises dos electres do feixe com os electres dos tomos da amostra.
2) colises com os respectivos ncleos.
No primeiro caso, o electro do feixe transmite parte da sua energia ao electro do tomo
da amostra e pouco desviado da sua trjectria. Trata-se de uma coliso no elstica. Estas
colises reduzem a energia dos electres do feixe, que podem produzir contraste por
interfncia com os electres do feixe que no sofreram colises. Este mecanismo de
formao do contraste tem importncia sobretudo para o detalhe mais fino, perto do limite
de resoluo do microscpio.
No segundo caso, os electres do feixe no perdem energia, mas so desviados da sua
trajectria segundo ngulos elevados, quando colidem com ncleos de tomos pesados.
Estes electres podem ser selectivamente removidos pela introduo de diafragmas que s
deixam passar os electres no desviados (fig). Consequentemente, nas regies da amostra
onde h maior concentrao de tomos pesados, h uma maior fraco de electres
desviados e removidos do feixe, gerando regies deficientes em electres.

Tcnicas de contrastao
Uma vez que o contraste que interessa obter principalmente contraste de amplitude,
dependente das colises elsticas dos electres do feixe com tomos pesados, este efeito
pode-se obter ligando qumicamente amostra compostos com metais pesados.
Alguns destes compostos funcionam tambm como fixadores (tetrxido de smio, acetato
de uranilo) e so usados para tratar as amostras no includas, durante os passos de fixao.
Outros (acetato de uranilo, citrato de chumbo) so usados para tratamento dos cortes finos
(Fig. 2). A contrastao negativa (Fig.1) mostra o contraste por um corante negativo, isto ,
aquele que fica fora do material a observar.

25
Microscopia electrnica de varrimento
Enquanto que nos microscpios de transmisso convencionais o feixe irradia toda a
amostra, e so as alteraes produzidas no feixe por interaco com esta que vo ser
convertidas na imagem, nos microscpios de varrimento o feixe irradia apenas um ponto da
amostra. O feixe percorre sistemticamente toda a amostra por um processo de varrimento,
e a interaco do feixe com a amostra gera sinais que podem ser medidos por detectores
apropriados. A imagem forma-se ponto por ponto em tubos de raios catdicos nos quais o
feixe de electres se move de um modo sincronizado com o movimento do feixe de
radiao do microscpio de modo que a cada ponto do objecto corresponde um ponto da
imagem. A intensidade e/ou cr do ponto imagem so moduladas pelo sinal recolhido pelo
detector. A resoluo deste tipo de aparelhos depende principalmente do tamanho da rea
do objecto irradiada pelo feixe
O modo de varrimento pode ser implementado quer em microscopia de transmisso quer
em microscopia de reflexo quer ptica quer electrnica. As implementaes actualmente
mais importantes em biologia so o microscpio electrnico de varrimento (SEM
scanning electron microscope), que essencialmente um microscpio electrnico de
reflexo, e o microscpio confocal, que um microscpio ptico funcionando tambm em
modo de reflexo (fazendo uso principalmente de tcnicas de imunofluorescncia). Merece
tambm referncia o microscpio electrnico de varrimento-transmisso (STEM
Scanning-transmission electron microscope) que um microscpio electrnico funcionando
em modo de transmisso.
SEM
Funcionamento do instrumento
No microscopio electrnico de varrimento o feixe de radiao um feixe de electres que
focado num ponto da amostra pelas lentes electromagnticas do microscpio.A interao do
feixe de electres com a amostra gera um conjunto de sinais em que se contam electres
secundrios, electres retrodifundidos, raios-X, etc. Estes sinais podem ser medidos por
detectores apropriados, repectivamente para electres de baixa energia (electres
secundrios), de alta energia (electres retrodifundidos), e raios-X. Estes sinais, so

26
convertidos pelo detector em correntes elctricas de maior ou menor intensidade que vo
modular a intensidade do feixe de electres que forma a imagem no tubo de raios catdicos.
As amostras estudadas no SEM so amostras espessas, como dentes inteiros, no sendo
importante que o feixe de electres seja capaz de a atravessar uma vez que os sinais
recolhidos dizem respeito, em regra, apenas interaco com a superfcie da amostra.
Portanto estes instrumentos esto particularmente adaptados ao estudo das superfcies das
amostras e no da estrutura interior.
Preparao das amostras para o SEM
Uma vez que interessa estudar a superfcie de amostras inteiras, os mtodos de preparao
tm por objectivo preservar as superfcies, de um modo to fiel quanto possvel. Quando se
torna necessrio estudar o interior das amostras, estas podem ser cortadas ou fracturadas de
modo a expr o interior.
Como as amostras so observadas no vcuo do microscpio, elas tm de ser fixadas e secas.
A secagem habitualmente o passo mais delicado, uma vez que no seu decurso, os
fenmenos de tenso superficial exercem foras capazes de destrur a maior parte da
estrutura biolgica observvel. Para evitar estes efeitos recorre-se secagem por mtodos
de ponto crtico ou a partir de lquidos de tenso superficial muito baixa.
Modernamente tm vindo a ser desenvolvidos microscpios electrnicos de varrimento
ambientais nos quais a cmara que contm a amostra pode ser mantida a uma presso
elevada, prxima da presso atmosfrica, permitindo a observao de amostras no
desidratadas.
Imagens produzidas pelos electres secundrios
Trata-se do modo de observao mais utilizado no SEM. Os electres secundrios so os
electres ejectados dos tomos da amostra pelas colises no elsticas com os electres do
feixe. Estes electres so ejectados direccionalmente em funo da topografia da amostra.
A intensidade da emisso depende da natureza qumica da amostra. Os metais, que

27
possuem electres mais fracamente ligados, emitem melhor que as substncias em que os
electres se ligam mais firmemente aos tomos, caso dos compostos orgnicos. Por este
motivo, a superfcie das amostras recoberta com finas pelculas metlicas. Como o
detector se localiza num dos lados da cmara de observao, a intensidade do sinal
recolhido maior para os pontos das superfcies viradas para o detector. Por este motivo, o
mtodo ideal para revelar a topografia das superfcies.
Imagens produzidas pelos electres retrodifundidos
Estes electres so os electres do feixe que, atravs de sucessivas colises elsticas com os
tomos da amostra so desviados do seu trajecto o suficiente para se libertar da amostra e
re-entrar no vcuo da cmara de observao (retro-difuso). Como se trata de electres do
feixe de radiao do microscpio, desviados por colises elsticas, a sua energia muito
maior que a dos electres secundrios. A sua emisso tambm direccional como a dos
electres secundrios. No entanto trata-se de electres que penetram na amostra a maior
profundidade e que so deflectidos mais intensamente nas regies de maior densidade de
massa ( semelhana do que se passa no mecanismo de formao de contraste do TEM).
Portanto, a intensidade do sinal reflecte no apenas a topografia da amostra como a sua
composio qumica.
Tcnicas especiais de microscopia electrnica
Tcnicas citoqumicas para localizao de polissacardeos e cidos nucleicos. Digestes
enzimticas em cortes ultrafinos para localizao de protenas e lpidos. Os mtodos
citoqumicos para deteco de actividades enzimticas. A autorradiografia, a criomoldagem
e a colorao negativa. Tcnicas de imunocitoqumica.

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Fotografia de E. Coli num SEM

CULTURA DE TECIDOS

A Biologia Celular faz crescer clulas em condies artificiais para os seus ensaios, so
chamados os estudos in vitro e so feitos em culturas de tecidos. Estas clulas tm
vantagem para alguns estudos e sobre isso falaremos.
1. Breve histria
2. Possibilidade de fazer crescer em laboratrio clulas animais e vegetais.
3 Importncia e aplicaes.
4. Biologia das clulas em cultura: sua origem, caracterizao e diferenciao.
5.Tipos de clulas: Culturas primrias, linhas celulares e clulas hbridas.
6.Curva de crescimento das clulas eucariotas
7.Diferenas entre a cultura de procariotas e eucariotas
8.Meios de cultura: composio e importncia.
Cultura de tecidos a arte de manter e crescer clulas vivas ou tecidos num meio artificial
controlado.

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Comeou a ser realizada em 1800 com o exame in vitro de orgos e tecidos do corpo que
podem ser mantidos fora do corpo, assim como de clulas tumurais.
A possibilidade de estudar clulas depende da maneira como elas podem crescer e ser
manipuladas em laboratrio. Embora o protocolo da cultura de clulas no seja to fcil
como o que diz respeito cultura de bactrias, j se faz por rotina a cultura de tecidos
animais e vegetais.
Importncia e aplicaes
Em primeiro lugar, importante referir o desejo dos investigadores de estudar as prprias
clulas, isto , como elas crescem, quais os factores que as estimulam ou inibem, quais as
suas necessidades e como que morrem.
Os sistemas de cultura celular in vitro tm dado possibilidade aos investigadores de
estudarem o crescimento e diferenciao celular, a modulao do ciclo celular, o
crescimento viral, as interaces vrus-clula (muito importantes, porque permitem
melhorar e esclarecer mecanismos e factores celulares at agora desconhecidos) e as
manipulaes genticas com vista ao estudo da estrutura e expresso gnica.
Alm destas aplicaes, so referidos outros usos em processos biolgicos e qumicos:
- Ensaios para antibiticos, vitaminas, aminocidos, vacinas, qumica orgnica e alimentos
- Testes de diagnstico clnico
- Produo de produtos farmacuticos
- Produo energtica e fermentao
- Investigao sistemtica e taxonmica
- Testes de toxicidade e diagnstico de doenas
Metodologia
Depois da disperso dum tecido nas suas clulas componentes, estas so colocadas numa
placa de Petri ou num frasco de plstico prprio ou de vidro tratado, juntamente com o
meio de cultura contendo os respectivos nutrientes.
Os tipos de clulas mais utilizadas so: fibroblastos, clulas epiteliais, embries ou clulas
tumurais. Contudo, em condies especiais muitas clulas especializadas podem ser postas

30
em cultura levando os investigadores ao estudo das suas propriedades de diferenciao.
Resumindo, temos as culturas primrias e as linhas celulares.
As culturas primrias consistem na manuteno de clulas normais ou tecidos que so
obtidos duma fonte viva num sistema in vitro.Claro que para os tecidos sobreviverem
intactos devem ser seccionados finos de modo a promoverem as trocas de gs e eliminarem
os resduos. O maior problema com as culturas de tecidos primrias o facto de, tal como
no animal normal, as clulas s se poderem dividir um nmero de vezes antes de ficarem
quiescentes. Tambm possvel transformar clulas primrias em imortais, transfectandoas.As linhas celulares podem ser obtidas depois da triturao de um tumor e observao
das clulas que ficaram aderentes placa de Petri, pois muitas das clulas devero ser de
origem tumural e ficaro imortais. Isto significa que se as colocarmos num meio favorvel
elas continuaro a proliferar criando uma linha celular. A linha celular clonal quer dizer,
que um largo nmero de clulas foi originado apenas de uma clula.
As linhas celulares so armazenadas na American Type Culture Collection.
Os meios de cultura comearam por ser o plasma, soro e extractos embrionrios. Em 1955,
Harry Eagle descreveu o primeiro meio sinttico que permitiu o crescimento celular.
Eagle estudou o crescimento de duas estirpes celulares: HeLa e fibroblastos de rato. Para
isso, estas clulas foram colocadas a crescer num meio formado por uma mistura de sais,
carbohidratos, aminocidos, vitaminas e soro de bovino. Para saber quais os nutrientes
especficos para o crescimento celular, Eagle foi variando os componentes do meio.
O meio descoberto por Eagle ainda hoje o meio base de todas as culturas de clulas (ver o
Quadro).

31

Meio base de Eagle

L- aminocidos

Vitaminas
(mM)
(mM)
Arginina
0.1 Biotina
10-3 NaCl
Cistina
0.05 Colina
10-3 KCl
Glutamina

2.0

Histidina

0.05 Nicotinamida

Isoleucina
Leucina

0.2 cido
10-3
0.2 Piridoxal

Lisina

0.2

Metionina
0.05
Fenilalanina
Trionina
Triptofano
0.02
Tirosina
Valina

cido flico
3
3

Tiamina
3

Sais
(mM)

10- NaH2PO4 . H2O

10- NaHCO3

Outros
100 Glucose
5 mM
5 Penicilina
0.005%
1 Estreptomicina
0.005%
20 Vermelho
fenol
0.005%

pantotnico CaCl2
1
-3
10 MgCl2
0.5
10-

Riboflavina

10-4

0.1
0.2
Soro de bovino ou

cavalo a 10% para

todas as culturas stock

0.1
0.2

Contaminao
Consiste no crescimento de microorganismos (fungos ou bactrias) indesejveis cultura
de clulas.
Crescimento celular
Quando se comea com metade do nmero de clulas a cobrir o frasco de cultura e
posteriormente se observa o frasco todo coberto, isto significa que as clulas cresceram.
Ao longo do tempo, as clulas utilizam os nutrientes do meio e os resduos aparecem
modificando muitas vezes o pH do meio. Depois de trs dias, se as clulas no cresceram
70-80% da confluncia ( quando no existe nenhum intervalo entre elas, neste ponto as
clulas deixam de crescer), ento pode-se substituir parte ou a totalidade do meio por meio
fresco aquecido.

32
Quando as clulas atingem a confluncia, usualmente so removidas do frasco com tripsina
e colocadas num novo frasco numa concentrao celular mais baixa. Ento, elas proliferam
at que se faa novamente a sub-cultura.
Cada vez que se passa as clulas considerado uma passagem. Para as clulas primrias
normais, existe um nmero finito de passagens, enquanto as imortalizadas continuam a
crescer. Contudo, no se devem fazer muitas passagens para no alterar a linha celular
original porque com o tempo as clulas tendem a duplicar parte ou a totalidade dos
cromossomas e consequentemente alterar os genes que exprimem.

Mtodos citoqumicos e imunocitoqumicos

A aplicao de compostos qumicos com metais pesados pode ser feita por intermdio de
reaces qumicas que apresentem especificidade para componentes qumicos presentes nas
amostras, como glcidos, cidos nucleicos, etc.
Estas reaces de que so exemplo as reaces derivadas da reaco de Feulgen para
contrastao do DNA ou PAS para contrastao dos glcidos, designam-se por reaces
citoqumicas, e permitem revelar, de um modo especfico ou preferencial, a presena de
componentes qumicos nas amostras.
Devido possibilidade de, por pouca especificidade dos mtodos qumicos que podem
marcar vrias substncias (muitas vezes devido a impurezas dos reagentes difceis de
controlar), necessrio, como em todas as experincias cientficas, elaborar controles que
garantam que a marcao observada especfica. Para esse fim podem-se usar neste caso
digestes enzimticas, com enzimas que removem selectivamente os compostos que se
pretende identificar. Aps o tratamento enzimtico, o componente marcado dever
desaparecer.
Mecanismo de colorao para a microscopia ptica vulgar
A maioria das clulas e tecidos no seu estado natural contm pouco pigmento para a
absoro da luz. Normalmente so translcidas luz e por essa razo no possvel ver
muitos detalhes. Consequentemente, tm de ser empregues mtodos para a colorao das
clulas e das suas estruturas. Falaremos de tcnicas para a observao dos componentes
celulares e de outros, os citoqumicos, para a observao dos seus componentes qumicos.

33

1. Mecanismo de produo de cores: noo de grupo cromforo e auxcromo

2. Tipos de corantes: cidos e bsicos mecanismo de colorao; noo de ponto
isoelctrico das protenas.Exemplos.
2.1 Outro tipo de corantes: neutros, anfotricos, indiferentes e metacromticos.
2.2 Inverso da colorao
2.3 Uso de mordentes e diferenciadores.
2.4 Classificao dos tipos de colorao: colorao vital e ps-vital. Colorao progressiva
e regressiva, directa e indirecta. Mtodo das coloraes combinadas.

COLORAO VITAL EM CULTURA DE TECIDOS E CLULAS VIVAS

As clulas Vero foram obtidas da American Type Culture Collection e cresceram em
monocamada no meio Eagle modificada por Dulbeccu (Gibco, Scotland). Este meio foi
suplementado com 10% de soro de vitela recm nascida e 50g/ml de gentamicina.
Estas clulas so de linha contnua fibroblstica de rim de Cercopithecus aethiops
(macaco African Green).
Este trabalho tem como objectivo observar clulas vivas coradas com diferentes tipos
de corantes vitais.
Material
Microscpio; Clulas Vero; Lminas de vidro ; Papel de filtro; Pipeta Pasteur; Pina
Reagentes
Azul de metileno; Vermelho neutro; Lugol; Azul de tripano; Soro fisiolgico
TCNICA
Coloque uma gota de Soro fisiolgico numa lmina limpa.
Retire uma lamela com monoestrato celular Vero da caixa de Petri e monte-a na
lmina e observe ao Microscpio.
Retire a preparao do Microscpio e coloque uma gota de um corante vital num
bordo da lamela para que a soluo entre por capilaridade. A penetrao mais rpida,

34
se do lado oposto aquele em que ps a gota, extrair o lquido que sobra, com o auxlio
de papel de filtro.

Visualizar ao m. o.

Clulas de cultura sem colorao

Verde de Janus
uma colorao vital, especfica para mitocndrias. Dependendo do organismo e do seu
estado fisiolgico, aps alguns minutos esta soluo cora as mitocndrias de azul escuro ou
verde. medida que os organismos vo morrendo, outros organelos celulares comeam
tambm a receber o corante, pelo que importante ter em considerao o aspecto da
preparao antes da colorao (exame a fresco).
Protocolo: Retirar uma gota da suspenso celular e colocar sobre a lmina. Cobrir com a
lamela contendo o filme de corante, esperar 1 a 2 minutos e observar ao microscpio.
Registar as observaes.

Colorao com Vermelho neutro:

Esta soluo cora ligeiramente os ncleos e outras
incluses, como os fagolisossomas. Este corante
tambm utiizado como indicador de pH: cor de laranja
a pH alcalino, vermelho-cereja a pH neutro e azul a pH
cido. Isto d-nos uma indicao do que ocorre a nvel
dos vacolos digestivos, que tm um pH cido

Imagem de clulas Vero sem col..

35
Protocolo: Retirar uma gota da infuso e colocar sobre a lmina. Cobrir com a lamela
contendo o filme de vermelho neutro, esperar 1 a 2 minutos e observar ao microscpio.
Registar as observaes.

Colorao com verde Janus

uma colorao vital especfica para mitocndrias.Dependendo do organismo e do seu
estado fisiolgico, aps alguns minutos esta soluo cora as mitocndrias de azul escuro ou
verde. medida que os organismos vo morrendo, outros organelos celulares comeam
tambm a receber o corante, pelo que importante ter em considerao o aspecto da
preparao antes da colorao (exame a fresco).
TCNICA
Retirar uma gota da suspenso celular e colocar sobre a lmina.
Colocar gota do corante e esperar 1-2 minutos.
Observar ao mcroscpio
Colorao com azul de tripano
O mtodo de excluso do Azul de Tripano baseia-se no princpio de que clulas viveis
apresentam membranas intactas, que evitam a entrada do corante,enquanto que membranas
metabolicamente inactivas de clulas mortas (no viveis) no conseguem evitar a
penetrao do corante na clula. Logo, clulas azuis correspondem a clulas mortas. A
diferena entre o nmero total de clulas e o o nmero de clulas mortas ser o nmero de
clulas viveis numa dada amostra da nossa cultura

Colorao com azul de metileno

36

Col. Vermelho neutro

Co. Azul de Tripano

FUNDAMENTO DO PROCESSAMENTO DE CLULAS E TECIDOS PARA

OBSERVAO AO MICROSCPIO PTICO
Existem muito poucas clulas suficientemente finas para serem visualizadas directamente
ao microscpio (algas, protozorios, sangue e cultura de tecidos), a maioria dos tecidos
(fgado, rim, crebro,e outras) so suficientemente espessos para permitir a passagem da
luz. Ento, os tecidos devem ser seccionados em fatias muito finas depois de previamente
processados para impedir a danificao das clulas. Este processamento envolve vrios
passos: fixao, desidratao, impregnao e corte feito em micrtomo. Estes passos sero
estudados assim como, algumas das modificaes introduzidas na estrutura e composio
das clulas.
Preparaes extemporneas, exame a fresco e vital

37
Estudo post-mortem. Autlise, putrefaco e fermentao.
Esfregaos de bactrias e sangue. Vantagens e inconvenientes. Opacidade.
Mtodo dos cortes
Fixao. Conceito e mtodos.
Tipos de fixao: qumica e fsica. Perfuso.
Classificao de fixadores qumicos (aldedos, agentes oxidantes, agentes desnaturantes de
protenas, etc.).
Vantagens e inconvenientes dos diferentes tipos de fixao
Qualidades dos fixadores e solues tampo.
Desidratao
Diafanizao
Impregnao e Incluso
Microtomia: Micrtomo de Minot, de corredia e de congelao.

EXAME DE PREPARAES FIXADAS

Introduo
Sempre que possvel usam-se, em conjunto com o exame a fresco, materiais biolgicos
fixados e cortados em fatias finas (cortes). Estes so atravessados pela luz e podem ser
corados para introduzir contraste e diferenciao entre as estruturas celulares.
O exame de cortes permite a conservao dessas preparaes o que traz algumas
vantagens:
- permite exames mais demorados;
- podem repetir-se as observaes sempre que se deseje;
- podem confrontar-se antigas e novas preparaes;
- podem arquivar-se documentos dos trabalhos realizados.
Tambm se usam clulas fixadas sem serem submetidas ao corte, para serem observadas.
Um dos exemplos, o esfregao.

38

Esfregaos (bactrias e sangue)

Por cima de uma lmina, coloca-se uma gota de gua estril contendo as bactrias e faz-se
um esfregao que seca ao ar para depois ser fixado pelo calor, colocando-o numa placa
metlica aquecida. Depois o esfregao est preparado para ser corado.
No caso do sangue, coloca-se uma gota com uma lanceta estril e posteriormente feito o
esfregao. Neste caso so necessrias 2 lminas. Depois de se ter colocado a gota de
sangue na extremidade de uma lmina, leva-se a outra segundo um determinado ngulo a
tocar o sangue e espalha-se o sangue at outra extremidade da lmina (ver na Figura).
O sangue seco e depois corado.

Esfregao de sangue
Para a execuo da tcnica de observao de material biolgico em corte so realizados
vrios passos dos quais se destacam:
A colorao com um corante aninico ou cido, a eosina e com um corante catinico ou
bsico, a hematoxilina, uma maneira de fazer contrastes de colorao necessrios para um
estudo morfolgico.
A eosina um corante sinttico aninico ou cido. Como se sabe todos os corantes
sintticos so derivados do benzeno. Quando a eosina utilizada para a colorao de um
tecido, as estruturas acidfilas so chamadas eosinfilas.
A hematoxilina um corante natural extrado do tronco da rvore: Campechium
Hernatoxylin encontrada na Amrica Central e do Sul. O extracto sofre oxidao em
hematena que um cromognio cido com pequena afinidade ou especificidade, ento,
um mordente essencial para a converso deste corante a base podendo ligar-se fortemente
aos cidos nucleicos.

39
1 - Colheita do material biolgico
A colheita deve ser feita o mais rapidamente possvel, tendo em conta que aps a morte
do ser vivo, se iniciam uma srie de processos destrutivos intracelulares de natureza
enzimtica, isto , a autlise.
Tambm se pode fazer colheitas com animais vivos. Estas so feitas por mtodos
endoscpicos ou cirrgicos (bipsias).
2 - Fixao
2.1. Introduo
A fixao dos tecidos deve ser feita imediatamente a seguir paragem da circulao para
prevenir a decomposio postmortem, e tem como objectivo preservar a estrutura dos
tecidos o mais possvel existente in vivo.
A fixao consiste em mergulhar fragmentos celulares ou tecidulares em solues qumicas
orgnicas ou inorgnicas, aquosas ou no, que podem ou no precipitar ou coagular as
protenas.
A maioria dos fixadores so solues que exercem a sua actividade principalmente ao
nvel dos complexos proteicos da clula. Portanto, necessrio escolher um fixador que
mantenha a estrutura das protenas prxima da original, precipitando-as o menos possvel.
Logo que se coloca um fragmento de tecido num fixador a morte das clulas no
instantnea e, assim, podem produzir-se modificaes nos tecidos em consequncia da:
- autlise (aco enzimtica);
- alteraes osmticas;
- actividade microbiana;
- extraco de molculas intra- e extracelulares.
A fixao pode ser feita por perfuso, que consiste em passar o fixador na corrente
sangunea do animal antes da remoo dos orgos, tendo a vantagem de reduzir artefactos
resultantes do manuseamento dos tecidos a fixar.
Tcnica de perfuso
Alm da fixao por imerso das peas no lquido fixador emprega-se, em certos casos, em
que se pretende actuar mais directamente, a fixao por injeco do lquido nos vasos do
animal.
1 - Anestesiar o animal com ter.
2 - Abrir o trax, deixando o corao a descoberto.

40
3 - Fechar as artrias mamrias e passar um lao no pedculo do corao.
4 - Introduzir o catter no ventrculo esquerdo penetrando na aorta ascendente.
5 - Cortar a veia cava inferior para aspirar o sangue e abrir imediatamente a perfuso
(fixadores mais usados: fixador de Bouin, formol e lcool a 70) para que este fluxo
substitua o do sangue.
6 - O tempo deve ser de 15-20 minutos e o volume deve ser 20 vezes superior ao do sangue
do animal.
2.2. Objectivos
Os objectivos da fixao so:
- Impedir a: - autlise, processo precoce que resulta da aco de enzimas proteolticas das
prprias clulas (lisossomas rompem-se e libertam as enzimas). Essas
enzimas digerem e alteram a clula introduzindo aspectos que no existiam
in vivo e que resultam das tcnicas usadas e da prpria morte celular;
- putrefaco, degradao proteica por aco de microorganismos (bactrias,
fungos, etc.);
- fermentao e liplise, degradao dos lpidos e dos glcidos por aco de
microorganismos;
- Manter as estruturas o mais possvel iguais s que existiam in vivo;
- Dar resistncia pea para suportar as operaes subsequentes na tcnica da incluso;
- A fixao tem ainda duas funes acessrias:
- facilitar certas coloraes;
- comear o processo de endurecimento das peas, para que cortes finos sejam
possveis.
2.3. Qualidades de um bom fixador
Um fixador tem propriedades fixantes, isto , d resistncia ao tecido para as operaes
subsequentes da tcnica de incluso e prepara a colorao. Tambm se observam nos
fixadores propriedades conservantes, isto , no produzem tumefaces, retraces ou
remoes celulares; destroem os microorganismos evitando a sua proliferaco e
inactivam as enzimas hidrolticas.
Portanto, um bom fixador aquele que:
- tem bom poder de penetrao e por isso mata o tecido rapidamente;
- quando se difunde pelas clulas do tecido no deve remover nem arrastar certos
constituintes das mesmas, tais como, glcidos ou lpidos;
- deve preparar o tecido para no ser alterado pelos processos que se seguem:

41
- desidratao,diafanizao, incluso, corte, colorao e montagem;
- no causa retraco dos tecidos;
- revela todos os organitos da clula sem os mascarar;
- preserva os fenmenos de osmose;
- deve permitir usar vrias tcnicas de colorao (no entanto, a colorao de detalhes
celulares especficos como o aparelho de Golgi ou as mitocndrias requerem fixadores
especiais, assim como citoqumicas especficas de enzimas.).
2.4. Regras gerais para uma boa fixao
1 - Utilizar tecidos vivos logo aps a morte;
2 - Utilizar fragmentos pequenos ( 2 cm de comprimento e 4-5 mm de espessura) para
que o fixador fixe igualmente periferia e no interior do tecido;
3 - Havendo paredes contrcteis no tecido ou rgo a fixar (ex. Intestino), devem ser
fixados os dois topos para impedir a contraco;
4 - O volume do fixador deve ser em mdia 20 vezes maior do que a pea a fixar;
5 - O tempo de fixao deve ser calculado em funo dos resultados de uma boa fixao.
2.5. Tcnica de fixao
1 - Pequenos blocos de tecido so colocados numa quantidade de fixador seleccionado o
mais rapidamente possvel depois da colheita, durante 6-48 horas a 4C.
Claro que, o tempo da fixao depende do tamanho e da densidade da pea a fixar e da
temperatura a que se processa a fixao.
2 - Remoo do fixador por lavagem com meios determinados pelo fixador.
Nas fixaes em Lquido de Zenker, os tecidos devem ser lavados em gua corrente de 1 a
24 horas para remover a colorao amarela deixada pelo dicromato de potssio.
Quando se usa o formol como fixador, o tecido deve ser lavado rapidamente em gua e ser
transferido para o lcool a 70, porque o formol extrado mais depressa em lcool.
2.6. Mecanismo da fixao.
2.6.1. Protenas
Na fixao dos tecidos as reaces mais importantes so aquelas que estabilizam as
protenas. Embora os detalhes no sejam conhecidos, parece que alguns fixadores tm a
propriedade de formar "cross links" entre as protenas formando um gel e idealmente

42
conservando-as como se encontravam in vivo. As protenas solveis so fixadas a protenas
estruturais, ficando assim insolveis e deste modo do uma fora mecnica estrutura total
permitindo os passos subsequentes no processo de incluso.
A desnaturao das protenas causada pela fixao no muito importante nas observaes
de rotina mas, no deve acontecer na imunocitoqumica e trabalhos de microscopia
electrnica de alta resoluo.
2.6.1.1. Aldedos (Formaldedo ou formol, Glutaraldedo e Acrolena)
A formao de "cross links" entre os grupos terminais das protenas so devidas a estes
fixadores.
Formol
As reaces do formol com as protenas tecidulares so numerosas e complexas. A reaco
mais frequente a formao do composto metilol.
RH + CH2O

R.CH2O(OH)

Este composto reactivo e pode condensar-se com um tomo de Hidrognio para formar
uma ponte metilnica (-CH2- ):
R.CH2(OH) + HR

RCH2 R + H2O

Estas pontes metilnicas, como a que est na reaco anterior, so desfeitas por hidrlise.
O formol tambm pode reagir com ligaes duplas etilnicas nas cadeias de lpidos
insaturadas.
Caractersticas:
- usa-se dissolvido em gua a 5 ou 10%;
- um bom fixador, no dissolve as gorduras pois, reage com os cidos gordos insaturados
durante a fixao, e a dupla ligao atacada, sendo formados 1:3 glicis e 1:3 dioxanas;
- presta-se a cortes por congelao;
- simultaneamente um agente conservante;
- ideal para microscopia ptica;
- tem uma boa penetrao, danifica pouco e barato;
- irrita as mucosas;
- a sua reaco lenta e pode ser reversvel com um excesso de gua nas primeiras 24 h e
depende do pH sendo mais rpida a pH alcalino;
- preserva mal a estrutura das protenas;

43
- um dos fixadores eleitos para a imunologia, pois consegue manter melhor que o
glutaraldedo a antigenicidade das protenas.
Glutaraldedo

COH COH
H

(CH 2) 2
Protena

CH2

(CH2 ) 2
+

(CH2 ) 3

(CH2 ) 2

Protena

(CH2 ) 2

C
H

CH2

C
O

Fig. 2 - Estrutura do glutaraldedo

glutaraldedo

Fig. 3 - Formao de cross-links com o

As reaces do glutaraldedo (Figs. 2 e 3), um aldedo bifuncional, com as protenas so

anlogas s do formol, ficando completas ao fim de 30 minutos, aps a adio do aldedo.
Caractersticas:
- mais rpido e eficaz na sua aco que o formaldedo;
- causa uma perda de 30% da estrutura em hlice das protenas.
- sempre utilizado em microscopia electrnica;
- desnatura um pouco as protenas e enzimas;
- penetra mais dificilmente do que o formol nos tecidos a fixar;
- a sua reaco reversvel e tambm depende do pH sendo mais rpida a pH alcalino.
Acrolena
A acrolena penetra rapidamente o tecido preservando a morfologia e actividade
enzimtica. O aldedo acrlico ou acrolena, H2C = CH.CHO, um aldedo bifuncional que
capaz de fazer um maior nmero de cross links do que o formol. Reage de maneira
semelhante ao formol com as protenas.

44
A acrolena reage com os grupos -OH e -NH das protenas para formar CH2=CH-CH-N-.
Segue-se um processo de polimerizao.
OH
Tambm reage com cidos gordos e com as duplas ligaes dos alcenos.
2.6.1.2. Agentes oxidantes (Tetrxido de smio, permanganato de potssio e dicromato
de potssio)
Tetrxido de smio
Caractersticas:
- o tetrxido de smio (OsO4) forma cross links com as protenas;
- pode empregar-se imergindo as peas no lquido, ou submentendo-as ao seu vapor;
- tem fraca penetrao;
- devido a ser um coagulante enrgico e rpido do citoplasma (sem o retrair) e de se reduzir
ao contactar com as gorduras dando uma cor caracterstica, recomenda-se o seu uso em
histologia;
- muito caro;
- altera-se facilmente.
2.6.1.3. Agentes desnaturantes de protenas (cido actico, lcool metlico e lcool
etlico)
lcool metlico e lcool etlico
Os lcoois reduzem a constante isoelctrica das protenas causando a sua precipitao
prximo ou nos seus pontos isoelctricos. A alterao da estrutura das protenas causada
pelo metanol e etanol devida disrupo das suas ligaes hidroflicas, importantes na
manuteno da sua estrutura terciria. No entanto, os lcoois conservam a estrutura
secundria das protenas.
O lcool absoluto ocasionalmente usado como fixador porque desidrata. usado
especificamente para preservar o glicognio.
Caractersticas:
- alteram a estrutura terciria das protenas fazendo com que haja ruptura das pontes
hidrofbicas;
- removem histonas;
- podem causar retraces.

45
2.6.1.4. Agentes de Mecanismo desconhecido (Cloreto de mercrio e cido pcrico)
Cloreto de mercrio
Com este fixador existe um nmero relativamente grande de resduos de aminocidos a
reagir (tiol, amino, imidazol, fosfato e grupos hidroxilo).
A reaco deste fixador com o grupo tiol tem merecido mais ateno. Como se mostra,
formado um grupo dimercaptide:
RSH + HgCl2
RSHgCl + HCl
RSHgCl + RSH

(RS)2Hg + HCl

Tambm existe evidncia da reaco do cloreto de mercrio com os grupos disulfureto

formando produtos de reaco que podem variar com o pH da soluo.
2.6.2. Mecanismo de fixao dos lpidos
Os lpidos tm sido demonstrados em seces de tecido desde 1896 com os corantes Sudan.
Contudo, os lpidos individualizados s recentemente foi possvel observ-los, devido sua
estrutura molecular e depois da determinao das suas propriedades fsicas e qumicas
2.6.2.1. Classificao de lpidos
Os lpidos mais complexos consistem de cidos gordos ligados a lcoois (glicerol) por
ligaes ster, ou alternativamente ligados a bases por ligaes amida. Adicionalmente eles
podem conter bases orgnicas, cido fosfrico e acares.
A distino mais til do ponto de vista histoqumico o facto de serem hidrofbicos ou
hidroflicos. As propriedades de superfcie dos lpidos determinam a sua permeabilidade
aos reagentes aquosos ou aos solventes orgnicos. Os fosfolpidos com grupos bsicos e
polares fosforilados so hidroflicos. Os glicolpidos acdicos (gangliosidos e sulfatdeos) e
os glicolpidos neutros (cerebrsidos) so tambm moderadamente hidroflicos. Os no
combinados (colesterole cidos gordos livres) e os simples steres tm uma preponderncia
de grupos no polares e so hidrofbicos. Mostra-se o uadro, com as caractersticas que
influenciam a histoqumica dos lpidos.

46

Classe

Membro

I. LPIDOS NO POLARES
cidos gordos
1. Lpidos no conjugados
Colesterol

2. steres

Fosfatidil colina-Lecitinas
a. Com base glicerol

2. GLICOLPIDOS

Ponto de fuso e Sudanofilia

dependente do n. de duplas
ligaes. HIDROFBICOS.
No sudanoflico. Birrefringente

luz
polarizada.
HIDROFBICOS.

Ponto de fuso depende do grau

steres do colesterol
Mono- Di - e Tri - glicridos de saturao dos constituintes
dos
cidos
gordos.
HIDROFBICOS.

II. LPIDOS POLARES

1. FOSFOLPIDOS

b. Com base esfingosina

Caractersticas que
influenciam a histoqumica

Fosfolpidos
com
cido
fosfrico, longas cadeias de
cidos
gordos,
lcoois
polihdricos e vrias bases
nitrogenadas. HIDROFLICOS.
So bsicos e com ligao ster.

Fosfatidil serina

Ligao ster. Acdicos.

Fosfatidil etanolamina

Ligao ster. Bsicos.

Esfingolpidos

Um cido gordo saturado liga-se

esfingosina por uma ligao
amida mais fosforil colina.
Bsicos.

Cerebrosidos

Tm uma hexose (glucose)

ligada ceramida. Neutros.

Sulfatidos

steres de cerebrsidos. Muito

Acdicos.

Gangliosidos

Com cido neuramnico Nacetil (cido silico). Solveis

em gua. Acdicos.

47
2.6.2.2. Fixao de lpidos
A melhor maneira de os fixar atravs da congelao, e os nicos reagentes capazes de os
fixar so o tetrxido de smio e o cido crmico, mas ambos alteram a sua reactividade
qumica.
Agentes oxidantes
Os lpidos insaturados reduzem o OsO4 formando compostos negros.
CH
+

CH

O
O

CH O

OsO 2

OsO 2

CH O

A outra poro livre na molcula pode reagir, se um grupo etilnico oxidado estiver
disposio e ento, forma-se um dister.
HO CH

CH O

OsO 2 +
CH O

CH O

O CH

Os

HO CH

O CH

CH O
O

Formao do dister
Em microscopa electrnica observa-se a deposio do smio nas micelas lipdicas no local
dos grupos polares e no no local original de reaco ou seja, no interior hidroflico das
micelas. Na figura indica-se os dois locais possveis da deposio do smio.

48

Grupos polares

Deposio intramicelar

45 A

Deposio polar

45 A

2.6.3. Mecanismo de fixao dos cidos nucleicos

Muitos fixadores tm sido usados para fixar cidos nucleicos, mas relativamente poucos
reagem com estas molculas.
O etanol e metanol so usados para fixar DNA e RNA e produzem-lhes pouca alterao
apesar de os precipitarem. A presena de sais na reaco essencial para obter a mxima
precipitao.
Outro fixador utilizado o Carnoy.
Carnoy: - constitudo por: lcool absoluto, clorofrmio (fixa bem o citoplasma), cido
actico (fixa bem o ncleo pois penetra bem) (6:3:1);
- um bom penetrador;
- extrai as histonas;
- um fixador cido bom para os cromossomas;

49
- necessrio ter cuidado com o tempo de fixao, pois se o excedermos, extrai o
RNA e depois o DNA;
- passar logo por lcool absoluto e incluir, uma regra a ter em conta;
- utilizado para fixar o ncleo, cidos nucleicos e glicognio.
2.6.4. Misturas de fixadores
Nem todos os fixadores apresentam as mesmas capacidades. Uns conservam bem as
estruturas do ncleo outros, determinadas formaes do citoplasma. Por vezes, o ideal
fazer misturas de fixadores.
lcool-ter em partes iguais - fixador do sangue ou doutros esfregaos;
- tempo de fixao: 10 min.
lcool-formol (9:1): - bom fixador para o tecido nervoso.
Bouin: - fixador universal;
- fixa protenas e cidos nucleicos;
- constitudo por: formol a 40 %, soluo aquosa saturada de cido pcrico e cido
actico glacial (25:75:5);
- a fixao pode durar de 24 h a 3 - 8 dias;
- um bom fixador para estudos citolgicos de glndulas, rgos linfides, ncleos
e glicognio.
Flemming: - constitudo por: tetrxido de smio (4g), trixido de crmio (15g), cido
actico cristalizvel (1g) e gua destilada (100ml);
- excelente fixador citolgico mas de fraca penetrao por causa do cido
smico. A presena de cido actico atenua tal inconveniente;
- em regra s ficam bem fixadas as partes superficiais, a no ser que as peas
sejam muito pequenas;
- utilizado para a fixao de lpidos.
Zenker: - constitudo por: dicromato de potssio (2,5g), sublimado de cloreto de
mercrio (5g) e gua destilada (95 ml). Na altura de utilizar, acrescenta-se 5ml de
cido actico;
- um fixador universal compatvel com a maior parte dos corantes;
- muito bom para estudos citolgicos;
- utilizado para fixar ncleos e tecido conjuntivo.

50

NOTA: os fixadores que permitem obter boas fixaes da estrutura citoplasmtica ou so

muito caros (por conterem cido smico, cloreto de platina, etc.) ou requerem tcnicas
demoradas.
2.6.5. Mecanismo de fixao por meios fsicos
2.6.5.1. Congelao e dessecao
Este mtodo consiste numa rpida congelao dos tecidos, seguida de desidratao no
vcuo a baixas temperaturas. Inicialmente, as peas so imersas em azoto lquido (-160 a 190 C) para serem dessecadas no vcuo a temperaturas da ordem dos 30 - 40 C. Nestas
condies o gelo dos tecidos sublima ao estado gasoso e produz-se a desidratao.
As vantagens so:
- no causa retraco dos tecidos;
- a fixao homognea;
- no h extraco de molculas solveis;
- a composio qumica mantm-se;
- a estrutura conserva-se com raras modificaes produzidas pelos cristais de gelo;
- a fixao rpida.
2.6.5.2. Congelao e substituio
Neste caso, o tecido mantm-se congelado a baixa temperatura (-20 a -60C) num reagente
que dissolve os cristais de gelo (etanol ou acetona).
As vantagens so semelhantes ao mtodo anterior.
3 - Desidratao
A desidratao consiste na remoo da gua livre ou possvel de extrair do tecido fixado
por aco do lcool. A razo deste passo, deve-se ao facto de que nem a parafina, celoidina
ou outra substncia de incluso so miscveis em gua.
Este processamento consiste em passar o material fixado por lcoois de concentraes
crescentes desde 70 at ao absoluto.
O tempo da permanncia em cada um dos lcoois depende do volume, espessura e do tipo
de tecido. A espessura ideal de tecido deve ser de 0,5 cm e o tempo mdio da desidratao
de 1 hora.
O etanol o mais usado por no ser txico e ser rpido na aco.
Existe uma substncia, a dioxana, que permite passar directamente do fixador para a
parafina sem os intermdios ordinrios.

51
4 - Diafanizao
Consiste na passagem dos blocos de tecido fixados e desidratados por uma substncia
diafanizadora, normalmente o xilol. A razo deste passo deve-se ao facto da parafina no
ser solvel em lcool, mas sim em xilol, substncia que por sua vez se dissolve no lcool.
O tempo de diafanizao de 30 min a 2h.
Quando a pea introduzida no xilol fica com um aspecto mais claro e translcido.
O xilol vai ocupar o espao vazio anteriormente ocupado pela gua.
5 - Impregnao
Substitui-se o xilol pela parafina ou celoidina.
A parafina e a celoidina so substncias que penetram homogeneamente na clula na forma
lquida e que depois de solidificarem a tornam rgida, mas no quebradia.
Faz-se na estufa, ao mesmo tempo que o xilol vai evaporando a parafina ocupa os lugares
deixados pelo xilol dando consistncia ao meio celular depois de retirado da estufa.
6 - Incluso
Este passo consiste na infiltrao no tecido duma substncia de suporte para que seja
possvel cortar o tecido em fatias finas de modo a observ-las ao microscpio.
As substncias a ser usadas devem ser convertidas rapidamente do estado lquido ao slido
e quando lquidas devem penetrar nos interstcios do tecido.
A converso pode ser feita por:
cristalizao por arrefecimento (parafina);
evaporao do solvente (celoidina);
polimerizao (plstico).
Os blocos diafanizados devem ser imersos num banho de parafina e serem mudados pelo
menos duas vezes para novos banhos para remover o xilol que est presente nos tecidos. O
tempo de infiltrao depende do volume, espessura e do tipo de tecido, mas dura
aproximadamente 1 hora e 30 min.
6.1 - Parafina
A parafina slida temperatura ambiente e aquecida a 45 - 60C, torna-se lquida.
insolvel na gua e quase insolvel no lcool e solvel no xilol, acetona e ter de
petrleo.
6.1.1. Vantagens
- A incluso fcil e rpida;
- Obteno de cortes suficientemente finos e seriados;
- Conservao dos blocos por perodo indefinido.

52
6.1.2. Desvantagens
- No se deve sobreaquecer a parafina porque torna difcil a obteno de bons cortes;
- O prolongado tratamento dos tecidos com esta substncia de incluso, endurece-os;
- S d bons resultados com peas pequenas;
- Endurece demasiado certos tecidos e rgos (msculo, pele);
- Retrai mais ou menos os tecidos.
6.1.3. Tcnica de incluso com parafina
1 - Funde-se a parafina;
2 - Bafeja-se os quadros de Leuckart para a parafina no aderir (Actualmente usam-se
cassetes de plstico);
3 - Tira-se a pea do banho de impregnao e posiciona-se com pinas de incluso, dentro
do molde;
4 - Deita-se a parafina lquida, mas no a ferver;
5 - Deixa-se solidificar temperatura ambiente ou arrefecendo com gua.
No final da incluso obtemos um bloco de parafina dentro do qual est includa a pea.
6.1.4. Artefactos introduzidos pela incluso em parafina
- Remoo de constituintes:
lpidos;
glicognio.
- Precipitao;
- Pregas;
- Estrias causadas pela faca do micrtomo.
Micrtomo de Minot

Micrtomo de Minot
Colher pequenos
fixar 24 h em 10%

fragmentos de um orgo e
de formol em tampo

53
fosfato com pH neutro.
Desidratar com lcool 70 12 h e mudar para o lcool absoluto duas vezes, a primeira 2h
e a segunda 3 h.
Fazer dois banhos de xilol, o primeiro 2 h e o segundo 90 min.
Fazer o 1 banho de parafina numa estufa temperatura do seu ponto de fuso (60) 16h.
Pode ou no ser feito um 2 banho de parafina nas mesmas condies 5h.
Fazer as incluses em parafina em moldes de lato (Leuckart) ou em cassetes.
7 - Corte
Os blocos com as incluses devem ser cortados em micrtomos, depois de talhados em
pirmides quadrangulares, segundo seces especficas, que podem ser transversais ou
longitudinais. As seces podem ter 5-10 m de espessura. em fatias finas e regulares para
serem estudados por transparncia.
7.1. Equipamento necessrio
- Micrtomo;
- Banho maria a 45 C, para suportar os cortes;
- Placa aquecida, para secar os corte;
- Pina;
- Escova para limpar a face do micrtomo;
- Lminas;
- gua albuminosa (meio de colagem);
- Cubos de gelo.
7.2. Tipos de micrtomos
Faca de Valentim: - dupla faca com 2 lmininas, em que o afastamento das duas lminas
graduado e d-se por meio de um parafuso. Corta o rgo por 2 planos muito prximos,
sendo a largura do corte dependente da distncia entre as duas lminas.
Mcrotomo de Minot: - representado na figura, caracterizado por ter a faca fixa, sendo o
suporte com o bloco que se desloca verticalmente, mais cmodo e o mais usado.
Micrtomo de Corredia: - o suporte da faca (tren ou corredia) move-se numa goteira
horizontal ou plano inclinado e o suporte do bloco elevado a cada corte.
Micrtomos de congelao e criostatos:
So aparelhos utilizados para fazer os cortes mantendo a congelao e tm a vantagem de
fazer cortes de boa qualidade. As suas principais vantagens so: O corte de peas no

54
destri substncias que se pretendem observar e tambm se usam quando necessrio uma
observao rpida (ex. exames extemporneos operatrios).
7.3. Tcnica do corte
1 - Resfriar o bloco e talh-lo;
2 - Fixao do bloco no suporte do micrtomo;
3 - Orientao do bloco e da faca, regulao da espessura dos cortes;
4 - Execuo dos cortes, que se recolhem superfcie da gua a 45 C:
5 - Colagem dos cortes (gua albuminosa ou gelatina);
6 - secagem na estufa das lminas ou lamelas com os cortes colados.
Talha-se o bloco debastando-o pouco a pouco por todos os lados, tirando assim sucessivas
camadas de parafina.
O suporte do bloco mvel segundo as 3 dimenses no espao o que permite orient-lo de
modo que a face superficial do bloco fique num plano vertical nos micrtomos de Minot e
horizontal nos de corredia.
Orientada a pea, fixa-se solidamente a sua posio, por meio de parafusos, a faca
tambm solidamente fixada ao suporte e este ao aparelho.
Uma vez acertado o aparelho para a espessura que se deseja, comea-se a cortar a pea. A
cada movimento sai um corte e o que se lhe segue vem colar-se-lhe pela aresta vizinha,
constituindo-se assim fitas ou tnias de cortes.
8 Colagem
A colagem assegura um perfeito estendimento dos cortes, de modo a que no fiquem
dobras ou rugas.
Meio de colagem gua albuminosa diluda: clara de ovo (50 ml);
glicerina (50 ml);
salicilato de sdio.
Mistura-se, filtra-se e coloca-se uma gota antes de pr a seco do corte.
8.1. Tcnica de colagem
1 - Coloca-se algumas gotas do meio numa lmina;
2 - Coloca-se o corte em cima da lmina;
3 - Com agulhas e com calor moderado estica-se o corte;
4 - Escorre-se o excesso de gua no deixando sair o corte;

55
5 - Leva-se a secar na estufa a 45 C.
A seguir resumem-se os passos para a observao do material biolgico em cortes de
incluses em parafina.

PROTOCOLO GERAL PARA COLORAO DE HEMATOXILINA-EOSINA EM

CORTES HISTOLGICOS INCLUIDOS EM PARAFINA

Clulas coradas com hematoxilina-eosina. As reas escuras tm basofilia, ncleo

(nuclolos e heterocromatina) e as mais claras (rosa) fundamentalmente citoplasma.
1. DESPARAFINAO
Deitar xilol sobre o corte histolgico durante 10 min.
2. HIDRATAO
Cobrir a lmina com alcol 100 durante 3 min. Proceder da mesma forma com a
srie descendente de alcoois e finalmente com a gua destilada durnte 1 min.
3. COLORAO
Cobrir a lmina com HEMATOXILINA 10 min
Lavar com H2O corrente (3 mudanas)
Diferenciar com HCl 1% - 5 sec.
Passar em H2O corrente (2 mudanas)
Corar com eosina 2 min.
4. DESIDRATAO

56
Cobrir a lmina sucessivamente com uma srie ascendente de alcois at ao
lcool absoluto, 3 min. em cada lcool.
5. DIAFANIZAO
Cobrir a lmina com xilol (2 mudanas).
6. MONTAGEM
Depositar uma gota de meio de montagem e cobrir o corte com uma lamela.
Rotular.
7. RESULTADOS e OBSERVAO
Visualizar ao m. o. ncleos azuis e citoplasma rosa.

Hematoxylin (Ehrlich's)
C16H14O6
MW: 302.3
Nuclear stain; used especially in histology and cytology. This is one of the two "cornerstone" dyes for all H &
E techniques, the other being Eosin. When used in conjunction with eosin, the nuclei come out dark blue and
the cytoplasm and nucleoli, red.
Mayers Hematoxylin

PROTOCOLO GERAL PARA COLORAO COM AZUL TOLUIDINA EM

CORTES HISTOLGICOS INCLUIDOS EM PARAFINA
1. DESPARAFINAO E HIDRATAO
Deitar xilol sobre o corte histolgico durante 5 min e depois cobrir a lmina com
alcol 100 durante 3 min e finalmente com gua destilada durante 1 min.
2. COLORAO
Cobrir a lmina com 10 gotas de 2,5% de carbonato de sdio e 1 gota de 1% AZUL
DE TOLUIDINA durante 2 min.
3. DESIDRATAO E DESIDRATAO
Lavagem 3 vezes com gua destilada e desidratao com uma srie ascendente de
alcois at ao lcool absoluto, 1 min. em cada lcool.
4. DIAFANIZAO E MONTAGEM
Cobrir a lmina com xilol e depositar uma gota de meio de montagem e cobrir o
corte com uma lamela.
Rotular.

57

5. OBSERVAO
Visualizar ao m. o. O citoplasma violeta metacromtico porque a polimerizao de
uma molcula de coloraao com certas estruturas resulta num determinado
comprimento de onda de emisso alterado.
Os sinais de metacromasia so a mudana do espectro de aboro de certos corantes
bsicos quando esto unidos a polmeros polianinicos como nucleoprotena. Os
corantes de tiazina tais como, o azul de toluidina so azuis ortocromticos, contudo
podem estar agregadosmem dmeros ou polmeros, que absorvem a um baixo
comprimento de onda e aparecem vermelho metacromtico.

COLORAES CITOQUMICAS
LPIDOS Colorao Negro de Sudo
Esta colorao utilizada para corar todos os tipos de lpidos. O Negro do Sudo uma
susbstncia no polar que se dissolve nos lpidos, tornando-os visveis. Estes so ento
corados de vrios tons de cinzento-escuro, azul muito escuro e preto.
Protocolo:
Negro de Sudo/ Propileno glicol:
Negro de Sudo
0. 7 gm
Propileno glicol
100 ml

58
Dossolver Negro de Sudo em Propileno glicol lentamente. Aquecer at 100C durante
poucos minutos, e agitar constantemente. Filtrar em papel de filtro Whatman 2. Arrefecer
e filtrar novamente por um filtro de vidro de meio poroso com suco
1. Fixar cortes de congelao em 10% de formol
2. Lavar bem em gua destilada
3. Passar duas vezes, cada 5 min em l propileno glicol
4. Agitar 7 min em Negro de Sudo
5. Colocar 3 min em 85% de propileno glicol
6. Lavar bem em gua destilada
7. 3 min em Nuclear fast red
8. Lavar bem em gua corrente e destilada
9. Montar em glicerina
10. Visualizar ao m. o.
11. Desparafinao e hidratao at alcol a 70 do corte histolgico
12. Cubra a lmina com o corante Sudan Black durante a noite temperatura ambiente
13. Lave e diferencie em alcol a 70 o corte histolgico at ver o fundo cinzento claro
14. Lave com gua da torneira
15. Monte uma lamela por cima do corte histolgico com liqudo de montagem aquoso

PROTOCOLO GERAL PARA COLORAO DE SUDAN BLACK B EM CORTES

HISTOLGICOS INCLUIDOS EM PARAFINA
FUNDAMENTO: O Sudo Black B um corante bsico e combina-se com grupos
acdicos em compostos lipidicos e tambm fosfolpidos.

TCNICA

Desparafinao e hidratao at alcol a 70 do corte histolgico

Cubra a lmina com o corante Sudan Black durante a noite temperatura ambiente
Lave e diferencie em alcol a 70 o corte histolgico at ver o fundo cinzento claro
Lave com gua da torneira
Monte uma lamela por cima do corte histolgico com liqudo de montagem aquoso

OBSERVAO DE LPIDOS EM CORTES HISTOLGICOS (SUDO III)

Observao de lpidos em cortes efectuados em sementes. A colorao dos lpidos feita
com Sudo III (corante especfico)
TCNICA
1- Faa um corte muito fino na semente em estudo com o auxlio de um bisturi.

59
2- Coloque um pouco de gua destilada num vidro de relgio e com o auxlio de um
pincel lave o corte.
3- Em seguida coloque um pouco de Sudo III noutro vidro de relgio e deixe o corte
corar mergulhado no corante durante 3 a 5 minutos.
4- Finda a colorao lave o corte, para retirar o excesso de corante, passando-o por
gua destilada contida num vidro de relgio.
5- Observe entre lmina e lamela.

Col Sudam III

COLORAO DE AZUL-DE- NILO PARA LPIDOS NO CIDOS
1. Fixar o material biolgico em formol a 10%, fazer a incluso em parafina e cortar
seces com espessura de 5m.
2. Os cortes so desparafinados
3. Corar 15 min numa soluo de azul-de-Nilo 1%.
4. Lavar em gua
5. Diferenciar rapidamente em cido actico a 1%
6. Lavar em gua
7. Montar
Resultados: Os lpidos de natureza no cida coram de rosa e os cidos coram de azul
assim como outros componentes cels bioquimicamente de natureza no lipdica
.
COLORAO VERDE DE METILO PIRONINA
Fundamento:
DNA + RNA Colorao Verde-Metilo Pironina
O mtodo do verde-metilo pironina utiliza a elevada taxa de carga negativa dos cidos
nucleicos. O verde-metilo um corante catinico que se liga de um modo especfico ao

60
DNA e portanto adequado colorao de ncleos, tanto em clulas vivas como em
material fixado. A pironina um corante vermelho cuja especificidade para o RNA no
to elevada e portanto algumas protenas podem de igual forma corar. A execuo e os
resultados desta tcnica dependem em grande parte da utilizao de condies
cuidadosamente controladas de pH da soluo e da concentrao dos dois corantes.
A existncia de lminas de controlo importante para a interpretao dos resultados, uma
vez que este mtodo de colorao est sujeito a artefactos. Nas lminas de controlo, um ou
ambos os cidos nucleicos devem ser removidos, por extraco enzimtica ou cida.
Tcnica:
1- gua destilada
2- Verde de metilo-pironina (20 minutos)
3- Verde de metilo...........................0,5 g
4- Tampo acetato 0,1M pH4,4........100 ml
5- Purificar com clorofrmio e juntar Pironina Y (0,5 g)
6- Butanol tercirio (4 mudas)
7- Xilol (2 mudas de 10 minutos cada)
8- Blsamo
9- Duas lminas: 1 para a ribonuclease a 40 , durante 4h seguida de verde de metilopironina. Concentrao da ribonuclease: 1 mg/ ml
1 para gua destilada a 40 , durante 4h seguida de verde de metilo-pironina.
COLORAO DE DNA REACO DE FEULGEN
1. DESPARAFINAO
Deitar xilol sobre o corte histolgico durante 3 min.
2. HIDRLISE
Colocar os cortes em cido clordrico normal temperatura de 60 durante 10 min.
Lavar com gua destilada.
3. COLORAO
Colocar os cortes numa tina de colorao com o
reagente de Schiff durante 1 h.
Passar os cortes por 3 tinas contendo gua
sulfurosa durante 2 min.
Lavar com gua destilada.
4. DESIDRATAO E MONTAGEM
Cobrir os cortes sucessivamente com a srie
ascendente de lcoois (70, 95 e 100) durante 3
min.
Passar por xilol.
Montar.

61
5. OBSERVAO E RESULTADOS
Os ncleos celulares e o contorno nucleolar apresentam-se rosa resultante da presena de
DNA.
O mtodo de Feulgen sem dvida o mais largamente utilizado e o mais quantitativo de
todos os mtodos citoqumicos. um procedimento especfico de demonstrao de
desoxirribose. Nesta tcnica, utiliza-se uma hidrlise cida com HCl 1N a 60 C para
quebrar a ligao purina-desoxirribose, da qual resultam aldedos reactivos que
soposteriormente demonstrados pelo reagente de Schiff. Elementos que contenham DNA
so corados de vermelho-prpura. A intensidade da colorao proporcional
concentrao de DNA da nossa amostra. Assim, possvel efectuar observaes
morfomtricas e micro-fotomtricas e determinar as quantidades de DNA no ncleo das
clulas. A ligao purina-ribose no afectada pela hidrlise e consequentemente o RNA
no demonstrado por esta tcnica

. COLORAO DE DIMETILAMINOBENZALDEDO/ NITRITO PARA

PROTENAS COM TRIPTOFANO
1 - Deitar xilol sobre o corte histolgico
durante 10 min.
2 Passar por etanol absoluto, lavando bem o
xilol
3 Deixar secar ao ar
4 Mergulhar 1 min o corte na sol. De
DMAB a 5% em HCl conc.
5 Oxidar o corte 1 min em nitrito de sdio a
1% em HCl conc.
6 Lavar em H2O dest.
7 Contrastar os ncleos durante 1 min corando-os numa sol. de Safranina de 1 gr. em 100
ml de etanol absoluto e 50 ml de H2O dest.
8 Lavar o excesso de corante em H2O dest.
9 Passar por 2 banhos de Etanol Absoluto
10 Passar pro acetona (para fixar o corante nuclear e no desaparecer com o tempo)
11 Clarificar em xilol
12- Montar com DXP.
RESULTADO DA COLORAO:
As protenas ricas em triptofano coram de azul ( grnulos azuis )
Os ncleos coram de rosa vivo pela Safranina

62

COLORAO DAS PROTENAS TOTAIS POR FAST GREEN CIDO SEGUNDO

DEITCH
Procedimento
1. Tratar os cortes com cido tricloroactico a 5%, recm-preparado, durante 15 min, a
90C.
2. Mergulhar as lminas em cido tricloroactico a 5%, recm-preparado, a frio, e a
seguir vrias vezes em gua destilada.
3. Corar com a soluo fast green a pH 2,7, durante 30 min.
4. Lavar os cortes durante 1 min. em soluo de cido actico a 1%.
5. Desidratar em trs banhos de butanol.
6. Diafanizar em xilol e montar com entellan.
Resultados
As protenas totais coram de verde
Soluo Corante
Fast green
cido actico a 1%
pH 2,7

0,1g
100ml

EVIDENCIAO DE PEROXIDASES PELO MTODO DA BENZIDINA,

SEGUNDO PRENANT
1. Mergulhar as seces de tecido cortadas no critomo numa soluo saturada de
benzidina acidificada a pH 4,5 com algumas gotas de cido actico durante 3 min.
2. Mergulhar os cortes em gua oxigenada durante 3 min.
3. Secar, montar e observar ao microscpio ptico.O local de actividade das
peroxidades aparece em cor azul, passando a castanho com o correr do tempo o que
evidencia a presena de peroxissomas.
MTODO DE VON KOSSA PARA A COLORAO DO CLCIO
Fundamento: As seces de tecido so tratadas com soluo de nitrato de prata, o clcio
reduzido pela luz forte e substituido com depsitos de prata visualizados como prata
metlica.

63

1 Desparafinar e hidratar com H2O dest.

2 1 h com uma soluo de 5% de nitrato de prata em frente de uma lmpada de 60-watt.
Se fr necessrio deixar mais tempo at o clcio ficar negro.
3 Lavar trs vezes com H2O dest.
4 5 min com uma soluo a 5% de tiosulfato de sdio.
5 Lavar uma vez em H2O corrente e outra em H2O dest.
6 Contrastar 5 min fast- red para o ncleo.
7 - Lavar em H2O corrente.
8 Desidratar, diafanizar e montar uma lamela em meio de montagem.
RESULTADO DA COLORAO:
Os sais de clcio ficam negros, os ncleos vermelhos e os citoplasmas rosa.

EVIDENCIAO DE POLISSACRIDOS EM ESFREGAO DE SANGUE

REACO DO CIDO PERIDICO DE SCHIFF (P.A.S)

TCNICA:
1) FIXAO
Deitar alcool metlico sobre a lmina durante 10 minutos
2) OXIDAO
Colocar a lmina numa tina de colorao com cido peridico a 1% durante 15
minutos.
Lavar com gua corrente.
3) COLORAO
Colocar a lmina numa tina de colorao com o reagente de Schiff durante 20
minutos, na estufa a 37C.
Passar a lmina por 3 tinas contendo gua sulfurosa durante 2 minutos em cada.

64
Lavar com gua destilada.
Secar entre papel de filtro.
4) COLORAO DE CONTRASTE
Cobrir a lmina com hematoxilina durante 5 minutos.
Lavar em gua corrente.
Secar.
Observar ao microscpio.
A tcnica mais utilizada na histoqumica de hidratos de carbono a reaco cido peridico
Schiff que positiva para estruturas contendo hexoses neutras e/ou cidos silicos. No
mtodo de PAS as seces so tratadas com cido peridico, que oxida a ligao carbonocarbono, formando aldedos, os quais reagem com o reagente de Schiff, formando a cor
magenta.
A colorao PAS utilizada para a demonstrao de membranas basais e mucosubstncias
secretadas pelo epitlio de vrios rgos.
uma tcnica usada, por exemplo, em bipsias de fgado e rim, para fins de diagnstico.
PROTOCOLO GERAL PARA EVIDENCIAO DO COMPLEXO DE GOLGI,
SEGUNDO RAMN E CAJAL
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.

Fixar o material biolgico 8- 24 horas em gua destilada com 1% de nitrato

de uranilo e 15 ml de formol.
Lavar rapidamente em gua destilada
Incubar 1-2 dias em nitrato de prata a 1,5%
Lavar em gua destilada
Incubar durante 12 h numa soluo recm preparada de gua destilada com
2% de hidroquinona, 0,15% de sulfato de sdio e 15 ml de formol.
Lavar em gua destilada
Secar, montar e observar.

COLORAO DA FOSFATASE ALCALINA EVIDENCIAO DO

COMPLEXO DE GOLGI (GOMORI)
1. Os cortes de congelao so incubados em gua destilada a 37 durante 6h com 2%
de - glicerofosfato de sdio, 2% de nitrato de clcio e 1% de cloreto de magnsio
a pH 9,4.
2. Lavar muito bem em gua destilada.
3. Tratar os cortes 2% de nitrato de cobalto.
4. Lavar muito bem em gua destilada.
5. Mergulhar os cortes durante 2 min em 2% de sulfato de amnio.

65
6. Lavar

bem

em

gua

destilada.

COLORAO DA FOSFATASE CIDA EVIDENCIAO DO LISOSSOMA

Um dos mtodos para demonstrar a actividade da fosfatase cida o mtodo de Gomori,
que consiste em incubar cortes de tecidos fixados em formol numa soluo contendo
glicerofosfato de sdio e nitrato de chumbo em tampo pH 5,0. Pela aco da enzima
ocorre a hidrlise do glicerofosfato, com liberao de ioes fosfato, que reagem com nitrato
de chumbo, formando fosfato de chumbo insolvel, que se precipita no local onde h
actividade enzimtica. Numa segunda fase do mtodo processa-se imerso dos cortes
numa soluo de sulfato de amnio, que transforma o precipitado incolor de fosfato de
chumbo num precipitado negro e electro-denso de sulfatode chumdo. Este mtodo muito
utilizado para localizar lisossomas, que so partculas do citoplasma ricas em fosfatase
cida.
PROTOCOLO
Solues stock:
A) Stock HCl-Pararosanilina
Pararosanilina 1g
gua destilada 20ml
HCl concentrado 5ml
A Pararosanilina dissolvida na gua destilada e o HCl adicionado. A soluo aquecida
gentilmente, arrefecida, filtrada e guardada no frigorfico.
B) Nitrito de sdio

Nitrito de sdio 2g
gua destilada 50ml

66

A soluo pode ser preparada na altura ou separada em alquotas de 0,4 ml e armazenada

no congelador.
C) Tampo acetato de sdio

Acetato de sdio (3H2O) 3,88 g

Barbitone de sdio 5,88 g
gua destilada 200 ml

D) Fosfato de Naftol

Fosfato de Naftol 58 mg
Dimetil formamida 5 ml.

Este fosfato para guardar no congelador em aliquas de 0,5 ml

Preparao da soluo de incubao:
Pararosanilina - HCl (A) 0,4 ml
Nitrito de sdio (40 mg/ml) (B) 0,4 ml

Adicione a Pararosanilina gota a gota ao nitrito de sdio descongelado at que a soluo

esteja descorada.
Fosfato de naftol (D)
Tampo acetato (2 ml)
gua destilada 6,6 ml
Misture estas solues e adicione a soluo de nitrito de sdio/pararosanilina.
Ajuste o PH a 4,7-5,0 titter e use imediatamente.
Protocolo:
1 -Incubao dos cortes histolgicoa 10 a 60 min a 37 C
2 -Lave bem em gua destilada e tap gua
3 -Colorao 15 a 30 seg. com 2% de verde de metilo (A hematoxilina pode ser usada como
alternativa)
4- Lave
5 Desidrate clear. Monte as seces em DPX
Resultado
Actividade da fosfatase cida - vermelho

67
COLORAES CITOLGICAS
Colorao de Giemsa
Acolorao de Giemsa apresenta-se como um mtodo histomorfolgico convencional que
tem uma grande variedade de aplicaes, como a colorao de protozorios, tecidos
hematopoiticos (sangue e medula ssea, por exemplo), incluses virais, etc.
Material biolgico: Esfregao de sangue
Procedimento:
-Efectuar um esfregao.
-Deixar secar ao ar 1 hora.
-Fixar 2 a 3 minutos com etanol a 95 C; escorrer o excesso.
-Corar 10 minutos com a soluo de May-Grunwald e lavar com gua destilada.
Corar 10 minutos com a soluo de Giemsa (1:6) e lavar com gua destilada.bservar a
preparao ao microscpio e registar as observaes.-Comparar os diferentes tipos de
Papanicolaou
O mtodo de Papanicolaou uma tcnica de rotina largamente utilizada pelos patologistas
clnicos para reconhecer clulas derivadas de tumores malignos. Esta colorao permite
observar a forma e dimenso das clulas e fornece uma boa visualizao da morfologia
nuclear e da presena no citoplasma de grandes quantidades de ribonucleoprotenas ou de
depsitos de queratina ou muco.
Material biolgico: Esfregao da mucosa oral
Procedimento:
- Efectuar um esfregao da mucosa oral; deixar secar ao ar.
- Fixar o esfregao com a soluo de lcool/cido actico durante 15 minutos.
- Hidratar (lcool 100 2 minutos; lcool 70 2 minutos; lcool 50 2 minutos; gua
2 minutos.
- Corar com hematoxilina 4 minutos.
- Lavar rapidamente em gua.
- Diferenciar em lcool cido 5 segundos
- Azular em gua corrente
- lcool 100 (2x).
- Corar com Laranja G 10 segundos.
- Lavar em lcool 100 (2x).
- Corar com hematoxilina-eosina 2 minutos.
- Lavar em lcool 100 (2x).
- Clarear em xilol (3x).
- Montar com DPX.
- Observar ao microscpio e registar as observaes.

68

.
Col. Giemsa

MICROMETRIA E CARIOMETRIA

A micrometria consiste em fazer medies de preparaes microscpicas com o

microscpico ptico.
H 2 micrmetros:
- Micrmetro objectivo: lmina na qual est gravada uma escala milimtrica em
centsimos de milmetro (parte inferior da Figura).
- Micrmetro ocular: corresponde escala utilizada para fazer medies microscpicas
(parte superior da Figura).

69

Para determinar as dimenses de um objecto microscpico, calcula-se o n de divises do

micrmetro ocular que correspondem a um determinado n de divises do objectivo.
Calcula-se o valor do coeficiente micromtrico, ou seja o valor de cada diviso da escala do
micrmetro ocular. Remove-se este ltimo, e coloca-se na platina do microscpico a
preparao. Determina-se o n de divises da escala do micrmetro ocular.
Cariometria consiste na determinao da superfcie nuclear.
Colorao de Gram
A colorao de Gram um mtodo no qual se baseia a distino entre bactrias Gram
positivas (+) e Gram negativas (-). A reaco positiva ou negativa uma resposta presena
ou ausncia de componentes polissacridos especficos nas paredes celulares das bactrias.
Material biolgico: Esfregao da mucosa oral
Procedimento:
Utilizar um palito para "raspar" ao longo do sulco gengival (espao entre a superfcie do
dente e as gengivas).
Colocar uma gota de tampo fosfato numa lmina limpa e adicionar a amostra do lquido
cravicular retirado da boca; misturar. Fazer um esfregao (figura 1) e deixar secar ao ar.
Fixar o esfregao passando a lmina rapidamente por uma chama 3 vezes. Ateno: No
sobreaquecer a lmina; 0 esfregao tem de estar virado para cima! Deixar arrefecer e corar

Colorao:
- Cobrir a lmina com a soluo de violeta de cristal deixar actuar l'
- Retirar o excesso de corante; lavar com soluo de lugol
- Cobrir a lmina com a soluo de lugol - deixar actuar l'
- Lavar cuidadosamente com gua destilada
- Diferenciar com soluo diferenciadora
- Lavar cuidadosamente com gua destilada
- Cobrir a lmina com a soluo de safranina - deixar actuar l'

70
- Lavar cuidadosamente com gua destilada
- Deixar secar
- Observar ao microscpio com objectiva de imerso (100 x)
- Registar as observaes.
Nota: Bactrias Gram +: azul-violeta Bactrias Gram : rosa a vermelho

IMUNOCITOQUMICA
1. Imunofluorescncia Directa e Indirecta.
2. Localizao dos anticorpos anti - peroxidase em microscopia ptica e electrnica. O uso
da ferritina em microscopia electrnica.
3.Observao de diferentes cortes histolgicos mostrando vrias protenas marcadas com
anticorpos anti - peroxidase.
PREPARAO DO MATERIAL BIOLGICO PARA MICROSCOPIA
ELECTRNICA INCLUDO EM EPON PARA COLORAO
Remoo do Epon
1. Preparao da soluo
b) Dissolver pastilhas de hidrxido de sdio em etanol absoluto, at saturao, com
auxlio de um agitador magntico.
c) Esperar dois ou trs dias at a soluo ficar castanha e filtrar.
2. Colar os cortes semi- finos e deixar secar at ficarem bem colados.
3. Mergulhar a lmina na soluo at o Epon dissolver (cerca de 10 min ou mais).
4. Lavar muito bem em etanol absoluto e depois em gua.
5. Corar com a tcnica pretendida.

Fig 1- Imagem com contrastaonegativa de

vrus

71

Fig. 2- Endocitose de vrus mediada por receptores

TCNICAS DE OBTENO DE PREPARAES CROMOSSMICAS

stas tcnicas tm vindo a ser aperfeioadas ao longo dos tempos e so de enorme
importncia para a obteno de um cariotipo, levando deteco de numerosas alteraes
cromossmicas numricas e estruturais e tornando possvel em muitos casos um
diagnstico laboratorial seguro que, at h relativamente pouco tempo, era difcil de fazer.
Iremos pois, abordar alguns passos destas tcnicas.
1.

CULTURA CELULAR
1.1Escolha do tecido

Para se observar cromossomas em mitose necessrio um tecido a partir do qual se

obtenham com facilidade
clulas em diviso. Podemos referir, em primeiro lugar, os tecidos que se encontram
espontaneamente em diviso como o caso da medula ssea, tecido testicular e tecidos
neoplsicos. Contudo, recorremos a eles unicamente em casos particulares, nomeadamente
medula ssea quando se trata de doentes leucmicos. Entre os outros, verificou-se ser o
tecido sanguneo aquele que mais facilmente proporciona o material necessrio para uma
cultura celular. Com efeito, a cultura de sangue perifrico o mtodo mais frequentemente
usado na deteco laboratorial de anomalias cromossmicas. Emboraa taxa de diviso
celular seja baixa nos linfcitos circulantes, vrios agentes mitognicos podem estimil- los
a sofrer diviso. Quando necessrio, fazem- se igualmente culturas celulares a partir de
fibroblastos, as quais so contudo, bastante mais complexas
1.2 Colheita
Colhem- se aproximadamente 3 cc de sangue perifrico com uma seringa heparinizada.
Como evidente, para qualquer tipo de colheita, nomeadamente quando se destina a uma
cultura celular, imprescindvel que se trabalhe com asspsia.
1.3 Cultura e meios de cultura

72

H diversos meios de cultura, alguns com caractersticasbastante diferenciadas, para serem

utilizados consoante o que se pretende observar com mais pormenor.So ricos em
aminocidos, glcidos e vitaminas. Podemos nomear entre outros, o Ham F 10, o RPMI
1640, o Earle, o McCoy, o TC 199. Este ltimo o meio de cultura adequado para salientar
afragelidade do cromossoma X, visto ser probre em cido flico.
Ao meio de cultura adiciona-se ainda:
- soro de vitela fetal ou soro humano, como factor de crescimento
- antibiticos (estreptomicina e penicilina)
- agente mitognico.
O agente mitognico mais usado a fitohemaglutinina (PHA), extrada do feijo encarnado
(Phaseolus vulgaris), e especfica para o linfcito T. Em casos particulares, podem utilizarse outras lecitinas mitognicas como a concanavalina A e o pokeweed.
As culturas so feitas em frascos de vidro esterilizados contendo todos os componentes
indicados. Em cada um deita-se aproximadamente 0,3 cc de sangue. Para cada caso so
feitos habitualmente dois frascos que so mantidos numa estufa a 37C durante 72 horas.
Este tempo pode prolongar-se sem inconvenientes por mais 24 horas e pode, igualmente,
ser reduzido de 24 horas, obtendo-se neste caso um menor nmero de mitoses.
1.4Tcnica
Hora e meia a duas horas antes do termo da cultura, adiciona-se colchicina a cad frasco (6
gotas) a fim de se fazer parar as mitoses em metafase. A partir desta altura no
so necessrios cuidados especiais de asspsia.

No fim do tratamento pela colchicina o contedo dos frascos transferido para tubos de
centrfuga. A primeira centrifugao, assim como as seguintes, faz-se durante 5 min a 1500
r/m. O sobrenadante rejeitado por aspirao com pipeta de Pasteur, deixando-se sempre
uma pequena quantidade acima do depsito. Este posto cuidadosamente em suspenso
para se fazer o choque hipotnico com aproximadamente 6 ml de KCl 0,075M que fica a
actuar durante 4 min em banho-maria a 37 C. Este tratamento um dos passos essenciais
da tcnica. Foi descoberto por Hsu em 1952 e constitui uma etapa decisiva pois provoca um
aumento do volume celular que tem como efeito a rotura das membranas e consequente
disperso dos cromossomas. Os tubos so novamente centrifiugados para separao do
meio hipotnico que ser aspirado com a pipeta de Pasteur. Deitam-se ento umas gotas de
fixador (mistura de metanol e cido actico glacial na proporo de 3:1) aps o que se agita
rapidamente para evitar a formao de grumos. Completa-se ento a adio de 5 ml de
fixador. Este tem de ser preparado pouco antes de se usar e mantido no congelador.
Termina aqui a primeira parte da tcnica. Os tubos ficam no congelador durante
aproximadamente 30 min para fixao dos cromossomas. Seguem-se 2 ou 3 lavagens com
fixador (centrifugao, rejeio do sobrenadante e adio de fixador) a fim de se eliminar
os restos de hemoglobina e outros resduos que estejam em suspenso, de modo a obter-se
um depsito o mais limpo possvel. Na ltima lavagem deve-se conservar
aproximadamente 4 a 5 mm de sobrenadante para se fazer as lminas.
Um dos tubos fica geralmente de reserva e guardado no congelador. Do outro fazem-se as
lminas (de 6 a 8).

73
As lminas de que nos servimos tm que ser cuidadosamente lavadas, de forma a que
quando vo ser utilizadas possam ficar completamente cobertas por uma fina camada de
gua.
Para fazer as lminas pe-se o depsito em suspenso com a pipeta e deita-se a cada uma 3
gotas, a uma altura aproximada de 4 cm. Deixam-se secar ao ar, etiquetam-se e guardam-se
numa caixa temperatura ambiente durante aproximadamente 1 semana para se proceder
tcnica das bandas G.
Antes de terem sido descobertas as tcnicas de obteno de bandas, as lminas eram
simplesmente coradas, na maior parte das vezes por Giemsa a 4%. Este continua a ser o
corante mais utilizado pois permite a observao das bandas induzidas pela maior parte dos
diversos mtodos.
Os pormenores da tcnica variam de laboratrio para laboratrio e as causas desta variao
vo desde as caractersticas climticas do pas (como temperatura e humidade) e das
condies ambientais criadas dentro do laboratrio (existncia ou no de ar condicionado,
por ex) experincia adquirida por cada tcnico.
Antes de passar tcnica das bandas importante recordar as 3 etapas fundamentais cuja
descoberta permite obter hoje, com relativa facilidade, cromossomas em metafase:
- aco mitognica da fitohemaglutinina no linfcito T;
- aco inibidora do fuso acromtico pela colchicina;
- tratamento hipotnico.
2.

BANDAS

2.1 Aspectos gerais

D-se a designao de bandas a estruturas postas em evidncia nos cromossomas mitticos
ou meiticos, atravs de um conjunto de processos. So zonas do cromossoma que, aps
colorao, se paresentam com diferentes intensidades, alternadamente claras e escuras, pelo
que se torna fcil distingui-las.
As tcnicas de obteno dos diversos tipos de bandas revelaram-se de primordial
importncia, pois so o nico meio que permite distinguir inequivocamente os
cromossomas com maiores semelhanas. Alm disso, na medida erm que cada cromossoma
apresenta um conjunto tpico de bandas, tornou-se possvel verificar se h falta ou excesso
de material gentico, o que se tornava praticamente impossvel se se tratava de pequenas
diferenas.
As tcnicas principais designam-se por uma letra relacionada com o mtodo utilizado ou
com a regio do cromossoma que pem em evidncia.
H vrios mtodos de obteno de bandas. Os mais comuns baseiam-se em:
a) irradiao dos cromossomas com U.V., aps colorao especfica e observao da
fluorescncia por eles emitida (bandas Q);
b) tratamento trmico dos cromossomas em meio salino, seguido de colorao por
Giemsa (bandas R e bandas C);
c) digesto enzimtica dos cromossomas seguida de colorao por Giemsa (bandas G).

74

este ltimo o mtodo utilizado neste laboratrio para obter bandas G, mas h tambm um
mtodo trmico para as conseguir.
H dois tipos principais de bandas para a eucromatina:
a) Bandas Q (quinacrina) e bandas G (Giemsa)
Tm a mesma localizao, isto , tm uma topografia coincidente e coram
aproximadamente 50 % da eucromatina.
b) Bandas R (reverse)
Coram o restante da eucromatina, o que significa que tm uma localizao inversa
das anteriores, isto , apresentam-se claras quando as anteriores so escuras e viceversa.
A eucromatina pois, evidenciada pela alternncia das bandas Q ou G e R.
H tambm 2 tipos principais de bandas para a heterocromatina:
a) bandas C (centrmero)
b) bandas NOR (regio dos organizadores nucleolares)
2.2 Tcnica das bandas G
Esta a tcnica de rotina utilizada neste laboratrio, havendo outros que preferem fazer
habitualmente bandas R.
Pelo mtodo proteoltico (enzimtico) esta tcnica deve-se a Dutrillaux e col. (1971) e a
Seabright (1971).
Em banho-maria a 37 C, coloca-se uma tina de lminas de forma alta com 90 ml de uma
soluo de tripsina em soro fisiolgico na proporo aproximada de 1:2. a concentrao
de 250 mg de tripsina em p em 100 ml de tampo fosfato de pH= 7,0.
Todos os mtodos de bandas so de difcil realizao porque no h necessidade de obter
de antemo o tempo exacto durante o qual se deve fazer actuar os seus agentes indutores,
neste caso a tripsina. As condies atmosfricas, particularmente a humidade, e a idade das
lminas tm grande influncia. Assim, para lminas com a mesma idade, quando a
atmosfera est mais seca a tripsina precisa de mais tempo para actuar, o memso
acontecendo para lminas mais velhas. Dest modo, por tentativas que se obtm tempo de
actuao necessrio, tanto mais que se verificam ainda variaes de caso para caso.
Para lminas com uma semana, faz-se actuar a tripsina de 10 seg a 1 min. Introduz-se a
lmina na tina controlando-se o tempo com um cronmetro. Seguidamente, lava-se 2 vezes
em soro fisiolgico e cora-se numa soluo de Giemsa a 4% durante 10 min, findos os
quais se passa a lmina por gua corrente. Deixa-se secar e monta-se uma lamela por cima.

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2.3 Outros tipos de bandas
a) Bandas R
Como j se disse, apresentam um padro inverso do das bandas G e s se utilizam neste
laboratrio em casos particulares, nomeadamente se existe qualquer dvida referente a
uma zona terminal clara, visto que com este mtodo as extremidades dos cromossomas
se apresentam bem coradas. um mtodo por tratamento trmico, desnaturao a 87 C
e deve-se fundamentalmente a Dutrillaux e Lejeune (1971). A colorao faz-se com
Giemsa a 4% e as metafases apresentam-se bastante plidas.
b) Bandas Q
Deve-se a Caspersson e col. (1970). A colorao feita com uma soluo de
mostarda de quilacrina e a observao feita num microscpio de fluorescncia. O padro
das bandas igual ao das bandas G e apresentam-se alternadamente escuras e brilhantes.
Certas regies heterocromticas brilham intensamente, sobretudo a regio distal do brao
longo do cromossoma Y.
Tudo deste cromossoma tem particular interesse este tipo de bandas. A fluorescncia do seu
brao , por vezes, de tal modo intensa que ele pode ser reconhecido mesmo em ncleos
interfsicos.
c) BANDAS C
Devem-se fundamentalmente a Arrighi e Hsu (1971) e Yunnis e col. (1971). Coram
especificamente a heterocromatina constitucional que est localizada nas regies
centromtricas, na parte proximal dos braos longos dos cromossomas 1, 9 e 16, na parte
distal do brao longo do cromossoma Y e nos braos curtos dos cromossomas
acrocntricos. Os cromossomas apresentam-se uniformemente plidos e s as referidas
regies coram fortemente. Deste modo, possvel observar os polimorfismos resultantes da
variao da heterocromatina, assim como certo tipo de anomalias. o caso, relativamente
frequente, da inverso pericntrica do cromossoma 9. Com efeito, visto a heterocromatina
se situar na parte proximal do brao longo do cromossoma, se houver inverso pericntrica
ela passa, pelo menos parcialmente, para o brao curto, pelo que com este tipo de bandas se
visualiza com facilidade uma alterao muitas vezes difcil de diagnosticar apenas com
bandas G.
d) BANDAS NOR
Podem ser postas em evidncia por um mtodo de desnaturao (bandas N) devido a
Funaki e col. (1975) e por um mtodo de precipitao do nitrato de prata devido a Bloom e
Goodpasture (1976). Neste ltimo, os gros de prata concentram-se nos braos curtos dos
cromossomas acrocntricos.
3.OBSERVAO AO MICROSCPIO E FOTOGRAFIA
A observao das lminas faz-se em fundo claro. As metfases so procuradas com a
objectiva de ampliao 10x e analisadas e fotografadas com a objectiva de imerso de

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ampliao 100x. As oculares so de 12,5x o que equivale a dizer que observamos com uma
ampliao de 1250x.
Faz-se a anlise directa de 10 a 20 metafases, consoante os casos, e contam-se os
cromossomas de mais 30 ou 40. Desta forma, mesmo tratando-se de um mosaico
(existncia num indivduo de mais do que uma linha celular) h a garantia de no passar
despercebida qualquer anomalia. Quando se encontra alguma alterao o nmero de
metfases analisadas aumenta, podendo, nalguns casos, ser superior a 100. Dentre as
melhores metfases observadas, fotografam-se geralmente 4. Na fotografia, os
cromossomas apresentam-se com uma mapliao de aproximadamente 2800x.
A partir das fotografias ampliadas recortam-se ento os cromossomas que so arrumados
segundo critrios bem determinados estabelecidos em diversas reunies internacionais:
Denver (1961), Chicago (1966), Paris (1971) e Estocolmo(1977). O essencial das regras
adoptadas foi agrupado num volume (ISCN, 1978) e utilizado na generalidade dos
laboratrios.
precisamente ao resultado da ordenao dos pares de cromossomas que se chama
cariotipo. Os principais critrios para essa ordenao so o tamanho relativo e a posio do
centrmero. Actualmente, a arrumao dos cromossomas no apresenta qualquer
dificuldade, uma vez que a descoberta das bandas veio permitir a sua rigorosa identificao.
ESTUDO DAS LEUCEMIAS
Este estudo particularmente difcil devido no s ao reduzido nmero de metfases que
habitualmente se consegue obter como, essencialmente, sua m qualidade.
feito na medula ssea e , em caso de aplasia medular, no sangue perifrico cultivado sem
agente mitognico.
A tcnica em tudo semelhante j descrita, apresentando pequenas variaes relacionadas
com o tipo de tecido (medula ssea) e com o nmero de leuccitos. Assim, no que se refere
medula, visto ela estar espontaneamente em diviso activa, faz-se um exame directo e um
outro aps 24 horas de incubao na estufa a 37 C. Em cada frasco com meio de cultura e
soro deita-se 0,1 ml de medula. Num deles adiciona-se de imediato a colchicina que fica a
actuar durante meia hora. O resto da tcnica praticamente igual, variando apenas o tempo
do choque hipotnico que aumenta para 6 minutos. Como se disse, o outro frasco fica a
incubar 24 horas aps o que se procede da mesma forma.
No caso do sangue perifrico faz-se uma cultura de apenas 24 horas quando o nmero de
leuccitos superior a 100000 e de 48 horas se esse nmero oscila entre 50000 e 100000.
Como lgico, a quantidade de sangue a cultivar dever ser inferior que se utiliza nos
casos em que o nmero de leuccitos normal.
A determinao do tempo de actuao da tripsina extremamente demorada e penosa e as
bandas raramente ficam ntidas. o posterior exame ao microscpio que apresenta,
contudo, as maiores dificuldades. Com efeito, alm do reduzido nmero de metafases, os
cromossomas apresentam-se, em regra, muito pequenos e juntos.
As alteraes que podem surgir so muito variadas e, grande parte das vezes, no
constantes. A aneuploidia (desvio do nmero normal de cromossomas) bastante
frequente, verificando-se muitas trissomias. Observam-se tambm com frequncia
cromossomas anmalos que possuem uma morfologia diferente da dos cromossomas

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normais e a que se chama cromossomas marcadores. Como por exemplo temos o chamado
cromossoma de Filadlfia (Ph 1) que constitui das alteraes mais frequentes e tambm
mais procuradas devido ao seu importante valor diagnstico na leucemia mieloide crnica.
Visualmente, apresenta-se como uma deleco do cromossoma 22. Trata-se, porm, de uma
translocao entre este cromossoma e o 9 (por vezes o 8).

ORGANITOS CELULARES VEGETAIS. APLICAES AO ESTUDO DE

FRMACOS DE ORIGEM VEGETAL
O SISTEMA PLASTIDIAL
Observao de diferentes tipos de plastos em microscopia ptica: cloroplastos,
cromoplastos, leucoplastos e amiloplastos.
Os plastos so organitos celulares com uma estrutura e funo especfica.
Os cloroplastos existem nas clulas fotossintticas. As clorofilas a e b so os pigmentos
predominantes nestes plastos, conferindo-lhes uma cor verde.
Os cromoplastos so plastos pigmentados, ricos em carotenos, xantofilas ou licopenos,
conferindo-lhes uma cor laranja, amarela ou vermelha, respectivamente. Encontram-se
Nas clulas epidrmicas das ptalas de algumas flores, no pericarpo de certos frutos e em
razes.
Os leucoplastos so plastos incolores, no possuem pigmentos. Existem em epidermes de
rgos expostos luz e em algumas razes, bolbos e tubrculos.
Os amiloplastos so organitos celulares especializados no armazenamento de amido,
acumulando-o em gros de vrios tamanhos. Existem sobretudo em caules subterrneos,
razes tuberculosas e sementes.
Identificao e caracterizao de gros de amido. Sua utilizao como auxiliar na
identificao de frmacos de origem vegetal, atravs da consulta da Farmacopeia
Portuguesa.
Determinadas incluses celulares, em funo da sua importncia na identificao de
frmacos de origem vegetal, merecem um estudo detalhado, o que se verifica com o
amido.
O amido um polmero de condensao da glicose formada nas plantas durante a
fotossntese. Basicamente constitudo por uma mistura de dois polissacridos, a amilose e
a amilopectina.
A observao microscpica de um gro de amido pode revelar a presena de um ponto ou
ranhura simples ou cruzada, central ou excntrica, formaes estas denominadas hilo.
Circundando o hilo pode-se observar ou no uma sucesso de zonas claras e zonas escuras,
as quais so denominadas estrias ou camadas.

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A posio e a forma do hilo so importantes na identificao do gro de amido, bem como
a centricidade ou no das camadas.
So caractersticas importantes na identificao de amidos: a forma, a estrutura, o tipo de
hilo e o estado de agregao.
Os gros de amido adquirem cor azul-arroxeada caracterstica, quando tratados pelo lugol
diludo. O iodo forma um complexo com a amilose, originando compostos de incluso nos
quais a cor varia do azul ao arroxeado, da acordo com o tamanho da cadeia polissacardica.
Consultar a Farmacopeia Portuguesa para as descries dos amidos observados na aula.

TIPOS DE PLASTOS: CLOROPLASTOS, LEUCOPLASTOS, CROMOPLASTOS E

AMILOPLASTOS. GROS DE AMIDO E A SUA IMPORTNCIA NA
IDENTIFICAO DE FRMACOS

Material vegetal:

Material de apoio:

Reagentes:

1 fildeo de brifito
2 folha de pteridfito
3 raz de Daucus carota
4 baga de Lycopersicum esculentum
5 tubrculo de Solanum tuberosum
6 cariopses e/ou farinha de Oryza sativa,
Zea mays e Triticum aestivum

1 lupa
2 microscpio ptico composto (M.O.C.)
3 lminas e lamelas
4 bisturi
5 pina
6 pincel

1 gua destilada
2 soluo de lugol

Mtodos:
1. Observe lupa os exemplares de um Brifito. Destaque um dos seus fildeos, monte em
gua destilada e observe ao M.O.C.. Registe a forma das clulas e tenha especial ateno ao
tipo de plastos nelas existentes. Faa o esquema com a respectiva legenda.
1.1. Pelo mtodo de irrigao coloque lugol na preparao anterior. Registe eventuais
alteraes.
2. Destaque um fragmento da epiderme da pgina inferior da folha de um Pteridfito.
Faa uma preparao e observe ao M.O.C..

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2.1. Repita o teste do lugol para esta preparao. Registe eventuais alteraes e o tipo de
plastos observados.
3. Faa um corte longitudinal, o mais fino possvel, na raiz de Daucus carota L.. Monte em
gua destilada e observe ao M.O.C.. Registe o tipo de plastos que observa neste orgo, bem
como a substncia e a forma sob a qual a se encontra armazenada. Faa o esquema com a
respectiva legenda.
4. De uma baga de Lycopersicum esculentum Mill., retire um fragmento de mesocarpo
(polpa) e esmague--o levemente, entre lmina e lamela. Obsrve ao M.O.C. e faa o registo
do tipo de plastos que encontra neste orgo, assim como o tipo de substncia neles
armazenada e a forma de armazenamento. Faa o esquema com a respectiva legenda.
5. Faa um corte transversal, o mais fino possvel, no tubrculo de Solanum tuberosum L..
Monte em gua destilada e observe ao M.O.C.. Faa o esquema com a respectiva legenda.
5.1. Pelo mtodo de irrigao coloque lugol na preparao anterior. Registe eventuais
alteraes.
6. Alguns amidos utilizados na Farmacopeia Portuguesa distinguem-se pelos seus
caracteres particulares. Tem ao seu dispor material em p, proveniente de cariopses de
Oryza sativa L., Zea mays L. e Triticum aestivum L. (T. vulgare Vill.).
6.1. Faa a preparao do material em gua destilada e observe ao M.O.C.. Anote os tipos
de gros de amido observados para cada material e refira a sua forma, dimenses relativas,
localizao do hilo e faa os respectivos esquemas.

VACOLOS. O CONTEDO VACUOLAR E A SUA IMPORTNCIA NA

IDENTIFICAO DE FRMACOS DE ORIGEM VEGETAL
Material vegetal:
1 - folhas, ptalas e
pericarpos de frutos de
vrias espcies

Material de apoio:
1 - microscpio ptico (m.o.)
2 - lminas e lamelas
3 - bisturi e pina
4 - pincel

Reagentes:
1 - gua destilada
2 - amnia
3 - reagente a designar

A - CONTEDO VACUOLAR DISSOLVIDO

1- Observao de vacolos corados naturalmente
1.1 - Destaque a epiderme inferior do material vegetal ao seu dispor. Monte em gua
destilada entre lmina e lamela e observe ao m. o.
1.2 - Faa o esquema com a respectiva legenda.
1.3 - Caracterize o tipo de vacolos encontrado.
1.4 - Pelo mtodo de irrigao introduza amnia como novo meio de montagem.
1.5 - Registe eventuais alteraes.

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2- Observao de vacolos no corados naturalmente
2.1 - Destaque um pedao de epiderme inferior do material vegetal ao seu dispor. Coloqueo em contacto com o reagente disponvel.
2.2 - Monte o outro pedao de epiderme entre lmina e lamela tendo como meio de
montagem gua destilada. Observe ao m. o., faa o esquema com a respectiva legenda,
fazendo ainda a interpretao do que observa.
2.3 - Monte agora o primeiro pedao de epiderme, tendo como meio de montagem a mesma
soluo onde permaneceu anteriomente. Observe ao m. o., registe eventuais alteraes
interpretando o que observa tendo em ateno o tipo de vacolos observados e a natureza
do seu contedo.
B - CONTEDO VACUOLAR NO DISSOLVIDO
3- Observao de vacolos com incluses
3.1 - Proceda ao esmagamento de um pedao de folha do material vegetal ao seu dispor.
Monte em gua destilada entre lmina e lamela e observe ao m. o. Faa o esquema com a
respectiva legenda e registe a sua observao, atendendo ao tipo de contedo vacuolar
encontrado.
4 - Faa um corte transversal, o mais fino possvel, no material vegetal ao seu dispor.
Monte em gua destilada entre lmina e lamela e observe ao m. o. Faa o esquema com a
respectiva legenda e registe a sua observao.
C - CONCLUSES
Atendendo s vrias observaes feitas tire uma concluso geral quanto natureza do
contedo vacuolar e a sua importncia na identificao de frmacos.
HISTOLOGIA ANATOMIA VEGETAL. IMPORTNCIA NA IDENTIFICAO
DE FRMACOS DE ORIGEM VEGETAL
MATERIAL:
Tem ao seu dispor preparaes definitivas de cortes transversais de razes, caules e
folhas

de

alguns

exemplares

de

Anthophyta,

pertencentes

classes

Monocotiledoneopsida e Eudicotiledoneopsida.

1 Atravs da sua observao ao m. o. faa os respectivos esquemas com legenda.

2 Recorrendo a um quadro ou a um esquema proceda distino entre os diferentes
orgos e estruturas dentro de cada classe.
3 De que modo que a identificao dos diferentes tecidos e orgos pode ser til na
identificao de frmacos.