ANDRS ROMERO NAVARRO

PRCTICA 6:MANEJA EL
ESPECTROFOTOMETRO DE
ACUERDO A LAS INSTRUCCIONES
DEL MANUAL DE OPERACIN

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ANDRS ROMERO NAVARRO

PRCTICA 6

INTRODUCCIN
En la espectrofotometra se aprovecha la absorcin de radiacin electromagntica en la zona del ultravioleta y
visible del espectro. La muestra absorbe parte de la radiacin incidente en este espectro y promueve la transicin
del analito hacia un estado excitado, transmitiendo un haz de menor energa radiante. En esta tcnica se mide la
cantidad de luz absorbida como funcin de la longitud de onda utilizada. La absorcin de las
radiaciones ultravioletas, visibles e infrarrojas depende de la estructura de las molculas, y es caracterstica de
cada sustancia qumica.
Un espectrofotmetro es un instrumento usado en el anlisis qumico que sirve para medir, en funcin de
la longitud de onda, la relacin entre valores de una misma magnitud fotomtrica relativos a dos haces
de radiaciones y la concentracin o reacciones qumicas que se miden en una muestra. Tambin es utilizado en
los laboratorios de qumica para la cuantificacin de sustancias y microorganismos.

OBJETIVO DEL EJERCICIO:

MANEJAR EL ESPECTROFOTOMETRO DE ACUERDO A LAS INSTRUCCIONES DEL MANUAL DE
OPERACIN PARA DETERMINAR LA CANTIDAD DE NITRATO CONTENIDO EN UNA MUESTRA DE
AGUA.

GENERALIDADES.

Hay varios tipos de espectrofotmetros, que son de absorcin atmica, de absorcin molecular (que
comnmente se conoce como espectrofotmetro UV-VIS), y no debe ser confundido con un
espectrmetro de masa.
Este instrumento tiene la capacidad de proyectar un haz de luz monocromtica a travs de una
muestra y medir la cantidad de luz que es absorbida por dicha muestra. Esto le permite al operador
realizar dos funciones:

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1.

dar informacin sobre la naturaleza de la sustancia en la muestra,

2. indicar indirectamente qu cantidad de la sustancia que nos interesa est presente en la muestra.
Componentes de un espectrofotmetro
Fuente de luz
La fuente de luz que ilumina la muestra debe cumplir con las siguientes condiciones: estabilidad,
direccionabilidad, distribucin de energa espectral continua y larga vida. Las fuentes empleadas
son: lmpara de wolframio (tambin llamado tungsteno), lmpara de arco de xenn y lmpara
de deuterio que es utilizada en los laboratorios atmicos.
Monocromador
El monocromador asla las radiaciones de longitud de onda deseada que inciden o se reflejan desde
el conjunto, se usa para obtener luz monocromtica.
Est constituido por las rendijas de entrada y salida, colimadores y el elemento de dispersin. El
colimador se ubica entre la rendija de entrada y salida. Es un lente que lleva el haz de luz que entra
con una determinada longitud de onda hacia un prisma el cual separa todas las longitudes de onda
de ese haz y la longitud deseada se dirige hacia otra lente que direcciona ese haz hacia la rendija de
salida.
Compartimiento de Muestra
Es donde tiene lugar la interaccin con la materia (debe producirse donde no haya absorcin ni
dispersin de las longitudes de onda). Es importante destacar, que durante este proceso, se aplica
la ley de Lambert-Beer en su mxima expresin, con base en sus leyes de absorcin, en lo que
concierne al paso de la molcula defundamental-excitado.
Detector
El detector, es quien detecta una radiacin y a su vez lo deja en evidencia, para posterior estudio.
Hay de dos tipos:
a) los que responden a fotones;
b) los que responden al calor.
Fotodetectores
En los instrumentos modernos se encuentra una serie de 16 fotodetectores para percibir la seal en
forma simultnea en 16 longitudes de onda, cubriendo el espectro visible. Esto reduce el tiempo de
medida, y minimiza las partes mviles del equipo.

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Celdas

Celdas de espectofotometra. En un primer plano, dos de cuarzo aptas para el trabajo con luz
ultravioleta; en segundo plano, de plstico, para colorimetra (es decir, empleando luz visible).

Son los recipientes donde se depositan las muestras lquidas a analizar. El material del cual estn
hechas vara de acuerdo a la regin que se est trabajando; son de vidrio o plstico si se trabaja en la
regin visible, de cuarzo si se trabaja en la ultravioleta y de NaCl si se trabaja la regin de
infrarrojo. Se caracterizan por tener dos paredes correspondiente a los lados pticos por donde cruza
el haz de luz.

Historia
En 1940 estaban disponibles en el mercado varios espectrofotmetros, pero los primeros modelos
no podan trabajar en el ultravioleta. Arnold O. Beckman desarroll una versin mejorada en el
National Technical Laboratorios Company, ms tarde la empresa Beckman Instrument y en ltima
instancia Beckman Coulter. Se desarrollaron los modelos A, B, y C (se produjeron tres unidades del
modelo C), y luego el modelo D, que se convirti en el DU. Toda la electrnica estaba contenida
dentro de la caja del instrumento y tena una nueva lmpara de hidrgeno con continuum
ultravioleta, y un mejor monocromador. Este instrumento fue producido desde 1941 hasta 1976 con
esencialmente el mismo diseo; ms de 30 000 unidades fueron vendidas. El precio en 1941 fue
de US$723. El laureado con el Nobel de qumica Bruce Merrifield dijo que era probablemente el
instrumento ms importante que se ha desarrollado para favorecer la realizacin de la biociencia

Espectrofotometra
La espectrofotometra es la medicin de la cantidad de energa radiante que absorbe o transmite un
sistema qumico en funcin de la longitud de onda; es el mtodo de anlisis ptico ms usado en
las investigaciones qumicas y bioqumicas. El espectrofotmetro es un instrumento que permite
comparar la radiacin absorbida o transmitida por una solucin que contiene una cantidad
desconocida de soluto, y una que contiene una cantidad conocida de la misma sustancia.

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Principio de la Espectrofotometra
En la espectrofotometra se aprovecha la absorcin de
radiacin electromagntica en la zona del ultravioleta y
visible del espectro. La muestra absorbe parte de la
radiacin incidente en este espectro y promueve la
transicin del analito hacia un estado excitado,
transmitiendo un haz de menor energa radiante. En esta
tcnica se mide la cantidad de luz absorbida como
funcin de la longitud de onda utilizada. La absorcin de
las radiaciones ultravioletas, visibles e infrarrojas depende de la estructura de las molculas, y es
caracterstica de cada sustancia qumica.
La espectrofotometra ultravioleta-visible utiliza haces de radiacin del espectro electromagntico,
en el rango UV de 180 a 380 nm, y en el de la luz visible de 380 a 780 nm, por lo que es de gran
utilidad para caracterizar los materiales en la regin ultravioleta y visible del espectro.

Ley de Beer
La Ley de Beer afirma que la cantidad de luz
absorbida

por

un

cuerpo

depende

de

la

concentracin en la solucin.
Por ejemplo, en un vaso de vidrio tenemos agua con azcar disuelta y en otro vaso tenemos la
misma cantidad de agua pero con mayor cantidad de azcar en solucin. El detector es una celda
fotoelctrica, y lo que se mide es la concentracin de la solucin de azcar.
Segn la ley de Beer, si hiciramos que un rayo de luz atravesara el primer vaso, la cantidad de luz
que saldra del otro lado sera mayor que si repitiramos esto en el segundo, ya que en este
ltimo las ondas electromagnticas chocan contra un mayor nmero de tomos o/y molculas y son
absorbidos por estos.

Ley de Lambert
La Ley de Lambert dice que la cantidad de luz absorbida por un objeto depende de la distancia
recorrida por la luz.
Por ejemplo, retomando el ejemplo de los vasos, pensemos que ambos tienen la misma cantidad de
agua y la misma concentracin de azcar; pero el segundo tiene un dimetro mayor que el otro.

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Segn la ley de Lambert, si hiciramos que un rayo de luz atravesara el primer vaso, la cantidad de
luz que saldra del otro lado seria mayor que si repitiramos esto en el segundo, ya que en este
ltimo las ondas electromagnticas chocan contra un mayor nmero de tomos o/y molculas y son
absorbidos por estos, tal como se explic en la ley de Beer.
Ley de Bouguer-Beer-Lambert
Una ley muy importante es la de Bouguer-Beer-Lambert (tambin conocida como ley de Lambert
Bouguer y Beer), la cual es solo una combinacin de las citadas anteriormente.
Transmitancia y absorcin de las radiaciones
Por las leyes mencionadas anteriormente, al hacer pasar una cantidad de fotones o de radiaciones
hay una prdida que se expresa con la ecuacin:
It/Io=T-kdc''
donde It es la intensidad de luz que sale de la cubeta y que va a llegar a la celda fotoelctrica
(llamada radiacin o intensidad transmitida); Io es la intensidad con la que sale al atravesar la celda
(radiacin intensidad incidente), y la relacin entre ambas (T) es la transmitancia.
En el exponente, el signo negativo se debe a que la energa radiante decrece a medida que el
recorrido aumenta. El superndice k es la capacidad de la muestra para la captacin del haz del
campo electromagntico, d es la longitud de la cubeta de espectrofotometra que recorre la
radiacin, y c es la concentracin del soluto en la muestra ya ubicada en la cubeta.
La ecuacin simplificada de la ley de Lambert-Beer
A = .d.c
comprende la mnima ecuacin que relaciona la concentracin (c), la absorbencia de la muestra (A),
el espesor recorrido por la radiacin (d) y el factor de calibracin (). El factor de calibracin
relaciona la concentracin y la absorbancia de los estndares.
La absorcin (o absorbancia) es igual a A, que es el logaritmo recproco de la transmitancia:
A= log 1/T
lo que es igual a:
A= -log T
Las ecuaciones mencionadas de las leyes son vlidas solo y solo si:

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la radiacin incidente es monocromtica;

las especies actan independientemente unas de otras durante la absorcin;
la absorcin ocurre en un volumen de seccin trasversal uniforme.

Aplicaciones
Las aplicaciones
principales son:
determinar la cantidad de
concentracin en una solucin de
algn compuesto utilizando las
frmulas ya mencionadas;
ayudar en la determinacin de estructuras moleculares;
la identificacin de unidades estructurales especficas, ya que estas tienen distintos tipos de
absorbancia (grupos funcionales o isomeras);
determinar constantes de disociacin de indicadores cido-base.

Un ensayo qumico o anlisis qumico es un procedimiento para medir la concentracin o cualquier

otra propiedad qumica de una sustancia o material.
Hay numerosos tipos de ensayos. Un ensayo no destructivo es aquel que mantiene la integridad de
la muestra. En otros donde se produce una reaccin qumica, el test se realiza en una fraccin
representativa de la muestra llamada alcuota.

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Ensayos qumicos
Determinacin de concentraciones (valoracin, titulacin)
Determinacin de propiedades (pH, conductividad, punto de inflamacin, grado de humedad...)
Identificacin de sustancias e impurezas en una muestra: ensayo a la llama, anlisis por va
hmeda, cromatografa,petrleo crudo, etc.
Pruebas qumicas:

Ensayos bioqumicos
Ensayos de captura de antgeno: ELISA, MELISA
Bioensayo.
Inmunoensayo o

ensayo

inmunoenzimtico: ensayo

competitivo directo para protenas.

Radioinmunoensayo.
Ensayo de unin a receptores sinpticos (binding).
Ensayo enzimtico.
Ensayos de biologa molecular

Ensayo ELISA.
Ensayos para estudiar interacciones de protenas con ADN:

Ensayo de retardo de la movilidad electrofortica (EMSA), ensayo de retardo en

gel.
Ensayo de proteccin frente a la digestin con ADNasa (footprinting).
Ensayo de interferencia con la metilacin.

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Ensayo de enlace al complejo ADN-avidina-biotina (ensayo ABCD)

Ensayo de ADN amplificado
Ensayo de ADN ramificado
ARN

Ensayo de ARN por proteccin a nucleasas.

Ensayo de transcripcin "run on".
Protenas

Ensayo del cido bicinconnico (ensayo BCA)

Ensayo de Bradford
Ensayo de Lowry
Secreciones celulares
Una gran variedad de sustancias tales como anticuerpos especficos, o citoquinas pueden detectarse
mediante la tcnica ELISA. El ensayo ELISPOT permite saber el nmero de clulas que segregan
esas sustancias en particular.

Mtodos de ensayo de metales preciosos

Hay mtodos de anlisis disponibles para su uso con materiales en bruto y otros mtodos ms
especficos de objetos acabados. Los metales preciosos en bruto (lingotes) se analizan en
un laboratorio

de

anlisis.

La plata se

analiza

por titulacin,

el oro porcopelacin y

el platino mediante tcnicas acopladas de anlisis: espectrometra de emisin atmica con plasma
inductivamente acoplado/espectrometra de masa (ICP OES).
Los artculos de arte o joyera fabricados en metales preciosos tienen frecuentemente un sello
de contraste segn los requerimientos legales, el lugar de fabricacin o de importacin. Cuando se
requiere un contraste, los artculos semiterminados pasan a travs de los canales de anlisis oficial
donde son su contenido en metal precioso es analizado o ensayado. Cada nacin permite diferentes

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grados de ley por lo que el analista comprobar que el producto cumple el grado de pureza que el
fabricante ha declarado, normalmente mediante la estampacin de un nmero en el artculo (por
ejemplo: 750 significa oro de 18 quilates).
Antes se usaba el mtodo de toque pero actualmente se usa la fluorescencia de rayos X, un mtodo
ms exacto que el anterior. El mtodo ms exacto de anlisis es el ensayo al fuego o copelacin que
se usa ms sobre lingotes y reservas de oro que sobre artculos artsticos o de joyera debido a que
es un mtodo destructivo.
Toque
Este antiguo mtodo se aconseja para piezas muy valiosas en las que resulta inaceptable cualquier
deterioro durante el anlisis, tales como cortar o taladrar. Establece diferencias prximas a 10-20
partes por millar en la ley del producto.
Fluorescencia de rayos X
Esta tcnica moderna es tambin un ensayo no destructivo disponible para requerimientos normales.
Ofrece una precisin de 2-5 partes por millar y se aconseja para superficie relativamente grandes y
planas. Su aplicacin es rpida (unos tres minutos) y permite analizar otros metales de la aleacin.
No est indicado para artculos con un recubrimiento superficial (electroplateado).

DENTRO DE LA PRESENTE PRCTICA FUE POSIBLE LA COMPROBACIN DE LA

IMPORTANCIA DEL REFRACTROMETO EN LOS LLAMADOS ANALISIS
CUANTITATIVOS DEBIDO A QUE SE USA EN UN LABORATORIO DE QUMICA
ANALTICA CON EL FIN DE DETERMINAR LA CONCENTRACIN DE UNA
SUSTANCUA EN UNA SOLUCIN, ES UN APARATO DEMASIADO SOFISTICADO,
UTILIZA LAS PROPIEDADES DE LA LUZ Y SU INTERACCIN CON LAS SUSTANCIAS
DE MODO QUE DE ESTA MANERA SE DETERMINA LA NATURALEZA DE LAS MISMAS,
LA INTENSIDAD DE LA LUZ SALE Y ES CAPTADA Y COMPARA CON LA INTENSIDAD
DE LA LUZ INICIAL Y A PARTIR DE ESO ES POSIBLE CALCULAR LA TRANSMITANCIA
DE LA MUESTRA, QUE DEPENDE DE FACTORES DE CONCENTRACIN EN LA
SUSTANCIA, PARA HACER UN USO CORRECTO DEL APARATO, DEBE COLOCARSE EN
UNA SUPERFICIE DONDE NO ESTE SUJETO A VIBRACIONES, CALOR EXCESIVO,
HUMEDAD, LUZ DIRECTA ETC, SE DEBE DE PROTEGER EL INSTRUMENTO CONTRA
EL POLVO Y LAS SUPERFICIES OPTICASTALES NUNCA DEBEN DE TOCARSE Y
ADEMAS SE DEBE DE MANTENER EL APARATO EN UN CHEQUEO PERIODICO PARA
DETECTAR CUALQUIER ANOMALIA PRESENTADA.

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LOGRO
RASGO
ACTITUD
RESPONSABILIDAD
CALIDAD
DESEMPEO.

PERSONAL
97%
99%
100%
95%

EQUIPO
96%
94%
99%
90%

GRUPO
90%
90%
90%
88%

Espectrofotometra.
"probably the most important instrument ever developed towards the advancement of
bioscience." Robert D. Simoni, Robert L. Hill, Martha Vaughan and Herbert Tabor (5 de
diciembre de 2003). A Classic Instrument: The Beckman DU Spectrophotometer and Its
Inventor, Arnold O. Beckman. THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY Vol. 278, No.
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