ANTONIO CRESPO GOMEZ

INTRODUCCIN AL CULTIVO CELULAR

El cultivo de tejidos ha sido considerado durante mucho tiempo como una mezcla de
ciencia y arte. Inicialmente fue considerada inicialmente como una tcnica
particularmente difcil de aprender. Sin embargo, hoy en da estas dificultades estn
superadas gracias a factores como los medios de composicin definida, la
disponibilidad de antibiticos, las instalaciones aspticas (salas de cultivo limpias,
cabinas de flujo laminar, incubadores estriles, etc), dispositivos de cultivo (botellas con
tapones filtrantes, placas de Petri ventiladas, etc).

1.- Introduccin histrica

El cultivo de tejidos se desarroll a partir de los ltimos aos del siglo XIX como una
continuacin de las tcnicas de la embriologa. Wilhem Roux mantuvo en el ao 1885
clulas de embrin de pollo en solucin salina durante unos das. Se considera al
zologo americano R. G. Harrison como el iniciador de los cultivos de tejidos animales.
En 1907, Harrison fu el primer cientfico que emple tcnicas in vitro para el estudio
de fenmenos in vivo, realizando cultivos de mdula espinal embrionaria de anfibios.
Pudo observar el crecimiento de los axones de los neuroblastos, y estableci que el axn
se formaba por expansin a partir del cuerpo neuronal y no por fusin de una cadena de
clulas. El cultivo se realizaba en una gota de linfa del anfibio que colgaba de un
cubreobjetos sobre una cmara sellada.
La primera limitacin para el establecimiento de cultivos era lograr un medio
nutritivo adecuado. Burrows (1910) emple plasma de pollo para nutrir los explantes
de tejidos embrionarios de pollo. Este medio se revel mucho mejor que los
anteriormente probados, lo que le permiti observar el crecimiento del tejido nervioso,
corazn y piel.
Burrows y Carrel demostraron que la vida del cultivo se puede prolongar mediante
subcultivo. Los medios empleados fueron plasma suplementado con extractos de
embrin.
Rous y Jones (1916) emplearon por vez primera extractos enriquecidos en tripsina para
disociar las clulas de embriones de pollo, estableciendo el primer cultivo celular.
Uno de los mayores problemas que describen para el establecimiento de los cultivos
celulares es la aparicin de mltiples contaminaciones, por lo que desarrollaron
numerosos mtodos de manipulacin en condiciones de asepsia que an hoy da se
utilizan.
En 1913 Carrel demostr la posibilidad de mantener en cultivo clulas extradas de un
animal, embrin de pollo, durante un periodo de tiempo superior al de la vida de ste.
Mantuvo en cultivo clulas de pollo durante 34 aos. Gran parte del xito en el
mantenimiento de los cultivos se debi al desarrollo del denominado frasco de Carrel.
Entre los aos 1920 y 1940 se desarrollaron diferentes estrategias de obtencin de
cultivos y de mantenimiento de las condiciones estriles, pero sin grandes avances. A
partir de los aos 40, con el aislamiento de los primeros antibiticos, se desarrollaron
numerosas aplicaciones.

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En 1948, Earle y col. aislaron clulas de la lnea celular L y mostraron que eran
capaces de formar clones en el cultivo de tejidos. Demostraron que para que una clula
llegue a dividirse necesita ser alimentada con los nutrientes correctos.
En 1952, Gry y col. establecen la primera lnea celular continua, las clulas HeLa. El
medio empleado era extremadamente complejo y poco definido: plasma de pollo,
extracto de embrin bovino y suero de cordn umbilical humano.
En 1954, Rita Levi-Montalcini y col. establecen que el factor de crecimiento nervioso
estimula el crecimiento de los axones en tejidos en cultivo. Este trabajo supuso el
Premio Nobel para Levi-Montalcini en 1986.
En 1955, Eagle realiza la primera investigacin sistemtica de los requerimientos
nutritivos de las clulas en cultivo.
En 1961, Hayflick y Moorhead establecieron que la duracin de
los cultivos de
fibroblastos era finita: podan mantener estos cultivos durante 12 pases. No
consiguieron establecer lneas estables.
En 1965, Ham introduce el primer medio definido libre de suero capaz de mantener
algunas clulas de mamfero en cultivo indefinidamente.
En 1969, Augusti-Tocco y Sato establecen la primera lnea celular estable de
neuroblastoma aislando clones que establecan procesos nerviosos y que eran
elctricamente excitables. Se empiezan a establecer las primeras lneas celulares
diferenciadas.
En 1975, Kohler y Milstein establecen la primera lnea celular productora de
anticuerpos monoclonales. El establecimiento de la tecnologa de obtencin de
anticuerpos monoclonales les vali el Premio Nobel.
En la dcada de 1980 se empiezan a conocer los mecanismos de la transformacin.
En la dcada de 1990 empezaron a producirse medicamentos a escala industrial en
biorreactores. Se desarrolla la biotecnologa.
En 1998 se produce cartlago mediante ingeniera de tejidos y en 2003 se experimenta el
auge de esta nueva disciplina.
En 2007 se reprograman clulas adultas para convertirlas en clulas pluripotenciales
inducidas.

2.- Tipos de cultivo celular

Actualmente se entiende por cultivo celular al conjunto de tcnicas que permiten el
mantenimiento de las clulas 'in vitro', manteniendo al mximo sus propiedades
fisiolgicas, bioqumicas y genticas. Se distinguen varios tipos de cultivos celulares.

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Cultivo de rganos
Se coloca el rgano sobre una rejilla situada en la interfase lquido-gas de un medio del
que obtiene los nutrientes y al que puede liberar los desechos. Este tipo de cultivo
permite mantener, al menos en parte, la arquitectura caracterstica del tejido in vivo.
Se conservan las interacciones histolgicas y, gracias a ello, este tipo de cultivo permite
mantener los tipos celulares diferenciados, por lo que representan una buena rplica
del tejido de origen. Sin embargo, no crecen mucho (la proliferacin celular se limita a
las clulas embrionarias de la periferia) y no se pueden propagar. Se necesita un nuevo
explante par cada experimento lo que supone mucho ms trabajo y una limitada
reproducibilidad de la muestra. Cuantificar es difcil y la cantidad de material que se
puede cultivar es reducida.

Explantes primarios
Se coloca un fragmento de tejido o de rgano en la interfase slido-lquido de un
soporte de vidrio o de plstico. Las clulas se adhieren a la superficie y las clulas de la
periferia del explante pueden migrar y proliferar por la superficie del soporte.

Cultivo celular primario

Es el tipo de cultivo ms utilizado. Se puede obtener a partir de explantes primarios o de
suspensiones de clulas disgregadas. La disgregacin celular se realiza por mtodos
enzimticos o mecnicos. En estos cultivos se pierden las interacciones clula-clula y
las interacciones de la clula con la matriz extracelular. Sin embargo, las clulas son
capaces de proliferar y la poblacin celular crece notablemente. Cuando las clulas
ocupan toda la superficie disponible se dice que han alcanzado la confluencia. En esta
etapa, las clulas establecen contactos entre ellas que inhiben su proliferacin y el
crecimiento se detiene. Por eso, al cabo de un tiempo hay que transplantar las clulas a
un nuevo soporte. Esta operacin se denomina subcultivo o pase.

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Existen dos tipos de cultivo celular primario:

Cultivos en monocapa: las clulas crecen adheridas sobre un soporte slido

(plstico o vidrio). El anclaje al sustrato es un prerrequisito para la proliferacin
celular. Es el mtodo utilizado para la mayora de las clulas excepto para las
hematopoyticas.
Cultivos en suspensin: las clulas se encuentran dispersas en el medio de
cultivo. Su crecimiento no depende del anclaje. Este tipo de cultivo se restringe
a las clulas hematopoyticas, clulas madre, lneas celulares transformadas y
clulas tumorales. Alcanzan la confluencia cuando el nmero de clulas es
grande y los nutrientes son insuficientes.

Subcultivos y lneas celulares

Las clulas del cultivo primario en monocapa se dispersan por mtodos enzimticos y se
pasan a un nuevo frasco de cultivo. En el caso de clulas en suspensin, sencillamente
se diluyen en medio fresco. Los sucesivos cultivos as formados se denominan una lnea
celular. La formacin de una lnea celular a partir de un cultivo primario implica que:

aumenta el nmero de clulas obtenidas

acaban predominando uno o dos tipos celulares: los que tienen mayor tasa de
crecimiento
la poblacin celular se hace uniforme y homognea
sus caractersticas se conservan durante las sucesivas generaciones y, si se
conservan en nitrgeno lquido, de forma indefinida

Normalmente, las lneas celulares tienen una vida finita que, segn el tipo de clula, se
puede prolongar entre 20 y 100 generaciones. Superado ese lmite, las clulas entran en
una etapa que se denomina senescencia en la que pierden su capacidad de proliferar,
supuestamente por el acortamiento de los telmeros, y mueren. Sin embargo, algunas
clulas (como las clulas de roedores y las clulas tumorales) evitan la senescencia y
dan lugar a lneas celulares continuas, que crecen indefinidamente. Estas clulas
pueden surgir de forma espontnea (exposicin a radiaciones ionizantes o a
carcingenos qumicos) o inducida (infeccin vrica o transfeccin de ADN) y son el
resultado de un cambio genotpico denominado transformacin.

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Las clulas transformadas se caracterizan porque:

Son inmortales: crecen indefinidamente

Su crecimiento es aberrante: se pierde la inhibicin por contacto, la limitacin
de la densidad celular durante la proliferacin y la dependencia del anclaje
Son malignas: invaden tejidos y dan lugar al crecimiento de tumores
Son genticamente inestables: son heteroploides (vara el nmero de
cromosomas) y presentan aberraciones cromosmicas

En 1952 se obtuvo la primera lnea celular continua humana. Son las denominadas
clulas HeLa, clulas extradas a partir de un tumor de cuello del tero de una paciente
afroamericana que se llamaba Henrietta Lacks.

Cultivos histotpicos y organotpicos

Los cultivos histotpicos son cultivos de un solo tipo celular que consigue alcanzar una
elevada densidad celular (tal y como ocurre en los tejidos). Los cultivos organotpicos
constan de varios tipos celulares que interaccionan entre s de una forma que intenta
parecerse lo ms posible a la original. El objetivo final de este tipo de cultivos es la
creacin in vitro de tejidos u rganos completamente funcionales que puedan ser
utilizados en injertos o en transplantes. Los cultivos organotpicos constituyen la base
de una nueva disciplina denominada ingeniera de tejidos.

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3.- Biologa de las clulas en cultivo

Al establecer un cultivo celular se seleccionan las clulas que van a crecer en funcin
de numerosos criterios: slo formarn parte del cultivo aquellas clulas que sean
capaces de superar el proceso de disgregacin, de adherirse al sustrato y de proliferar
(bien en forma de monocapa, bien en suspensin).
El crecimiento en monocapa significa que las clulas se adherirn al sustrato y en esa
forma inician la proliferacin. Muchas lneas celulares son anclaje-dependientes, es
decir, no inician la proliferacin hasta que se han adherido al sustrato. Este es el modo
normal de proliferacin de la mayor parte de las clulas, con excepcin de las clulas
hematopoyticas maduras.
El crecimiento en suspensin es propio de aquellas clulas capaces de proliferar sin
necesidad de adherirse al sustrato, independientes de anclaje. Es propio de las clulas
hematopoyticas, algunas lneas celulares transformadas y de clulas procedentes de
tumores. Es de destacar que en todo tejido existe una fraccin o tipo celular que es
capaz de crecer en suspensin. A pesar de que su origen no est claro se cree que se
trata de clulas madre ("stem cells") indiferenciadas.
Cuando se mantiene el cultivo se establece una nueva seleccin: aumentan en nmero
aquellas clulas que tienen una mayor tasa de crecimiento. As pues, hay que
considerar al cultivo como un ente dinmico en el que las proporciones relativas de los
diferentes elementos que lo forman varan en el tiempo en funcin de la presin
selectiva a la que estn sometidos. En general, se alcanza la confluencia de las clulas,
stas detienen su crecimiento, aunque pueden existir tipos celulares neoplsicos que
sigan duplicndose hasta desplazar a los otros tipos celulares del cultivo.
Al alcanzar la confluencia en el cultivo es cuando muchas lneas celulares expresan
sus aspectos ms caractersticos. Es en este estado cuando su morfologa y fisiologa
son ms parecidas a su estado original. Es tambin el momento en el que se detiene el
crecimiento y se hace necesario dividir, replaquear o propagar las clulas.
A partir del tercer replaqueo, el cultivo se estabiliza y homogeneiza: el tipo celular de
mayor tasa de crecimiento ha ocupado completamente el cultivo, desplazando a los
otros tipos celulares. En general, si no se establecen condiciones selectivas, las clulas
del tejido conjuntivo (especialmente los fibroblastos) sern las seleccionadas. Para
evitar que las clulas ms especializadas del cultivo se vean desplazadas de ste por los
fibroblastos o por otras clulas de rpido crecimiento se han establecido protocolos
detallados de medios selectivos.
En los cultivos primarios, las clulas crecen durante un cierto nmero de pases que
depende, sobre todo, del tipo celular y de las condiciones de cultivo. As, los
hepatocitos de adultos slo se mantienen como cultivo primario, las clulas endoteliales
de cordn umbilical humano (HUVEC) permanecen en cultivo de 3 a 9 pases y los
fibroblastos drmicos humanos pueden superar los 20 pases. Sin embargo, al final todas
ellas entran en una fase de senescencia en la que se acumulan numerosas
anormalidades y se pierden las funciones especializadas, lo que conduce a la muerte del
cultivo.

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Slo ocasionalmente puede mantenerse un cultivo primario durante ms generaciones

de las esperadas. Es debido a la aparicin en el cultivo de clulas inmortales. Estas
clulas forman lneas estables o cultivos celulares permanentes. En la mayora de los
casos se desconoce la razn de la aparicin de clulas inmortales pero se ve favorecida
por infecciones virales y por tratamientos con mutgenos, lo que podra estar
relacionado con la prdida, espontnea o inducida, de las vas de control celular. La
capacidad de un cultivo celular primario para establecerse como lnea estable est
relacionada directamente con su variabilidad gentica. Las lneas celulares que nunca
se establecen como estables se mantienen euploides, como es el caso de fibroblastos
humanos, fibroblastos de pollo y la glia humana. Las lneas que, con frecuencia, se
convierten en aneuploides son las que suelen transformarse en lneas celulares estables,
como es el caso de las clulas epidrmicas. En general, una lnea celular ser tanto ms
fcil de establecer o cultivar cuanto ms indiferenciada sea, con las excepciones de las
lneas tumorales de clulas diferenciadas.
Los cultivos primarios de muchos tipos celulares son posibles porque las clulas
pierden algunas de sus propiedades diferenciadas, entre ellas la incapacidad de
dividirse. Esta prdida de algunas de sus propiedades caractersticas puede deberse a
desdiferenciacin o a desadaptacin. La desdiferenciacin implica una prdida
irreversible de una propiedad diferencial del tipo celular. Por ejemplo, un hepatocito en
cultivo puede perder algunas anzimas (como la arginasa o las aminotransferasas), o ser
incapaz de almacenar glucgeno o de sintetizar las protenas del suero. En la
desadaptacin, la prdida no es irreversible ya que se debe a la ausencia de algn tipo e
seal (hormonal, nerviosa, etc.) y que basta con recuperar esa seal para que la
caracterstica se vuelva a expresar. Por ejemplo, cuando crecen sobre una matriz de
colgeno, los hepatocitos de rata pueden volver a expresar la enzima tirosina
aminotransferasa en presencia de ciertas hormonas (insulina e hidrocortisona).

4.- Aplicaciones del cultivo celular

Los cultivos celulares se utilizan tanto en la investigacin bsica como en la aplicada.
En la investigacin bsica, permiten estudiar fenmenos complejos como, por ejemplo:

la actividad intracelular: transcripcin de DNA, sntesis de protenas,

metabolismo energtico, ciclo celular, diferenciacin, apoptosis, etc.

el flujo intracelular de biomolculas: procesamiento del ARN, el movimiento

del ARN desde el ncleo hacia el citoplasma, el movimiento de las protenas
hacia diversos orgnulos, el ensamblaje y desensamblaje de los microtbulos,
etc.

genmica y protemica: anlisis gentico, infeccin, transformacin celular,

inmortalizacin, senescencia, expresin gnica, rutas metablicas, etc.

ecologa celular: el estudio de las condiciones ambientales responsables del

mantenimiento de la funcionalidad celular y de su diferenciacin, el estudio de
las necesidades nutricionales, la cintica de la poblacin celular, etc.

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las interacciones celulares: morfognesis, proliferacin celular, adhesin

celular, interacciones con la matriz, invasin celular, etc.

En la investigacin aplicada, las tcnicas de cultivo celular utilizan en reas tan

diversas como:

Virologa: Cultivo de virus animales y de plantas, produccin de vacunas, etc.

Biotecnologa: produccin industrial de frmacos en biorreactores (interfern,

insulina, hormona de crecimiento, etc.)

Inmunologa. Produccin
fenmenos de inflamacin.

Farmacologa: Efecto de diversos frmacos, interacciones con el receptor,

fenmenos de resistencia, etc.

Ingeniera de tejidos. Produccin de tejidos artificiales (piel, cartlagos) para el

tratamiento de grandes quemados, injertos o autotransplantes, desdiferenciacin
y diferenciacin inducida, etc.

Toxicologa: citotoxicidad, mutagnesis, carcinognesis, etc.

de

anticuerpos

monoclonales,

sealizacin,

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5.- Ventajas e inconvenientes de los cultivos celulares

Como ventajas podemos citar:
a) Permiten un control preciso y fino del medio ambiente
En un cultivo se pueden controlar las condiciones fsico-qumicas (pH, temperatura,
presin osmtica, presin parcial de O2 y CO2), y fisiolgicos (hormonas, factores de
crecimiento, densidad celular, etc.). Para algunas lneas celulares se han definido
medios definidos. Un medio definido es aqul en el que se conocen todos y cada uno de
los componentes que lo forman y su concentracin exacta. Para establecer un medio
definido hay que conocer con precisin las necesidades nutritivas de las clulas en
cuestin. Sin embargo en el caso de muchas lneas celulares, estas necesidades no se
conocen. En estos casos se utilizan medios que se suplementan con disoluciones
complejas (suero, extractos de embrin, etc.) que contienen factores hormonales y
nutritivos imprescindibles para el cultivo pero cuya naturaleza se desconoce.
b) Caracterizacin y homogeneidad de la muestra
Una muestra de tejido es siempre heterognea. Sin embargo, al cabo de uno o dos pases,
las lneas celulares cultivadas son homogneas, es decir, su morfologa y su
composicin son uniformes. La presin selectiva de las condiciones de cultivo da lugar
a un cultivo homogneo del tipo celular ms vigoroso. A partir de ese momento se
pueden obtener rplicas idnticas en cada subcultivo y las caractersticas de la lnea
celular se conservan durante varias generaciones o de forma indefinida si la lnea celular
se conserva en nitrgeno lquido. Esto facilita mucho el tratamiento estadstico de los
resultados.
c) Economa
En los cultivos celulares se emplean disoluciones con una concentracin mucho
menor que en el caso del animal completo. Adems, se garantiza el acceso directo de
la sustancia a las clulas sin que se diluya y sin que sufra ningn tipo de
modificacin metablica. El coste de los ensayos clnicos se reduce considerablemente
y se puede hacer un mayor nmero de pruebas. Tambin se reducen los costes
relacionados con la fabricacin del posible nuevo medicamento: en lugar de fabricar
cantidades del orden del gramo (para el estudio en animales) basta con que se sinteticen
unos pocos miligramos.
d) Cuestiones ticas
La investigacin biomdica supone el sacrificio cada ao de muchos miles de animales
de experimentacin. El cultivo celular no puede reemplazar siempre al ensayo 'in vivo'
pero es una alternativa vlida en muchas situaciones. Para obtener un cultivo celular
primario es posible que haya que sacrificar algn animal, pero con ellos se pueden
ensayar un elevado nmero de condiciones experimentales que, en otras circunstancias,
supondran el sacrificio de decenas o cientos de animales de experimentacin.

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Los cultivos celulares tambin pueden suponer algunas desventajas:

a) Tcnica sensible
El crecimiento de las clulas animales se tiene que realizar en estrictas condiciones de
asepsia porque su crecimiento es mucho ms lento que el de los contaminantes ms
habituales (hongos, levaduras, bacterias, micoplasmas, etc.). Adems, las clulas
animales son incapaces de mantenerse vivas en ausencia de la compleja mezcla de
nutrientes presente en el plasma o en el fluido intersticial. Todo esto condiciona en gran
medida el instrumental requerido y el grado de preparacin del personal encargado de
los cultivos.
b) Cantidad y coste
Producir 1 gramo de clulas en cultivo cuesta 10 veces menos que obtenerlas a partir del
tejido de un animal. En un laboratorio normal se pueden conseguir hasta 10 gramos de
clulas sin que se resienta mucho el presupuesto de investigacin. Para producir hasta
100 gramos de clulas hay que incrementar tanto el instrumental como el personal. Para
producir cantidades mayores se necesitan instalaciones de tipo industrial.
c) Inestabilidad
Muchas lneas celulares continuas son inestables y adoptan una dotacin cromosmica
aneuploide, lo que afecta tanto a su velocidad de crecimiento como a su capacidad para
diferenciarse. Es posible, por tanto, encontrar diferencias significativas en la lnea
celular de una generacin a la siguiente. La nica manera de evitarlo es emplear lneas
estables que se resiembran cada determinado tiempo o despus de un determinado
nmero de generaciones a partir de un stock congelado.

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d) Desdiferenciacin e identificacin de las clulas

Al propagarse la lnea celular, las clulas pierden las caractersticas fenotpicas
propias del tejido de procedencia. Este fenmeno se denomina desdiferenciacin y,
entre otras, cosas se hacen mviles e inician su proliferacin. La relacin entre las
clulas cultivadas y las clulas originales del tejido puede perderse. En este caso se
necesitan marcadores estables que permitan identificar la procedencia de las
clulas. En algunos casos es posible revertir la desdiferenciacin, bien por
procedimientos de diferenciacin inducida por hormonas, bien por compuestos
qumicos (steres de forbol) pero no est claro si el estado rediferenciado es equivalente
al estado de diferenciacin in vivo.
e) Validez del modelo 'in vitro'
En realidad, un cultivo celular es un disgregado celular de un tejido y se diferencia de
ste en que:

se ha perdido la organizacin espacial tridimensional propia del tejido ya que

stas se propagan en dos dimensiones.
se han perdido las interacciones entre los distintos tipos celulares y entre las
clulas y la matriz extracelular. Adems, al formarse una lnea celular slo se
conservan uno o dos tipos celulares (los que proliferan a mayor velocidad).
carece de los componentes sistmicos implicados en la regulacin de la
homeostasis in vivo, especialmente los sistemas nervioso y endocrino.

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La presin parcial de O2 es reducida, ya que no hay un transportador de

oxgeno como la hemoglobina. Por tanto, la energa se obtiene principalmente a
travs de la glicolisis, ya que el ciclo de Krebs juega un papel muy reducido.

Por tanto, hemos de ser precavidos en cuanto a la validez de los resultados obtenidos in
vitro porque pueden diferir de lo que pueda observarse in vivo.