AO DE LA DIVERSIFICACION PRODUCTIVA Y EL

FORTALECIMIENTO DE LA EDUCACION

FACULTAD DE INGENIERIA INDUSTRIAL

ESCUELA PROFESIONAL DE INGENIERIA AGROINDUSTRIAL E
INDUSTRIAS ALIMENTARIAS

INFORME N02: TINCIONES DE GRAM

CURSO:

MICROBIOLOGIA

INTEGRANTES:
DOCENTE:

FECHA DE ENTREGA: 14/10/2015

2015
I.

INTRODUCCIN

La tincin de Gram fue creada por Hans Christian Gram a fines del siglo XIX. La
Tincin de Gram (o mtodo de Gram) es un mtodo para diferenciar especies
bacterianas en dos grandes grupos (Gram-positivas y Gram-negativas). El nombre
proviene de su inventor, Hans Christian Gram. Tincin de Gram diferencia las bacterias
por las propiedades qumicas y fsicas de sus paredes celulares mediante la deteccin
de peptidoglicano, que est presente en una capa espesa en las bacterias Gram
positivas. Los resultados Gram positivos se denotan por un color prpura / azul,
mientras que las Gram negativas son rosa / rojo. La tincin de Gram es casi siempre el
primer paso en la identificacin de un organismo bacteriano. Mientras que la tincin de
Gram es una herramienta de diagnstico valiosa, tanto en entornos de investigacin
clnica, no todas las bacterias pueden ser clasificadas definitivamente por esta tcnica.
Esto da lugar a grupos de Gram-variables y Gram- indeterminado. (Forbes, 2009)
La Tincin de Gram es una tcnica de laboratorio bacteriolgico se utiliza para
diferenciar especies bacterianas en dos grandes grupos (Gram-positivas y Gramnegativas) sobre la base de las propiedades fsicas de sus paredes celulares. La
Tincin de Gram no se utiliza para clasificar las arqueas, anteriormente arqueo
bacterias, ya que estos microorganismos producen muy diversas respuestas que no
siguen sus grupos filogenticos. (Cavallini, 2005)
La tincin de Gram no es una herramienta infalible para el diagnstico, identificacin,
o filogenia, y es de uso muy limitado en la microbiologa ambiental. Se ha sustituido en
gran medida por las tcnicas moleculares, incluso en el laboratorio de microbiologa
mdica. Algunos organismos Gram son variables (que significa, que pueden manchar
ya sea negativo o positivo); algunos organismos no son susceptibles a la mancha ya
sea utilizado por la tcnica de Gram. En un moderno laboratorio del medio ambiente o
la microbiologa molecular, la mayora identificacin se realiza utilizando secuencias
genticas y otras tcnicas moleculares, que son mucho ms especfico e informativo
que la tincin diferencial. (Cavallini, 2005)
Las bacterias Gram-negativas poseen generalmente una fina capa de peptidoglicano
entre dos membranas (didermas). La mayora son phyla bacteriana Gram-negativas,
incluyendo las cianobacterias, espiroquetas y bacterias verdes del azufre, y la mayora
de Proteo bacteria. (EUNED, 2004)

II.

MARCO TEORICO:

La tincin de Gram, tambin conocida como coloracin de Gram, es una tcnica de

laboratorio que se utiliza rutinariamente en los estudios microbiolgicos de
las bacterias. Fue diseada por Christian Gram, un cientfico dans, en el ao 1884. El
objetivo de Gram era conseguir una prueba con la que fuera posible diferenciar
diferentes grupos de bacterias para as poder estudiarlas y clasificarlas. La prueba
result todo un xito y pronto se convirti en una tcnica muy til no solo para el
estudio de las bacterias, sino tambin para poder identificarlas rpidamente en una
infeccin y seleccionar el antibitico ms adecuado para tratarla.
La tcnica se basa en aplicar una serie de colorantes a una muestra de cualquier
origen (esputo, orina, pus, etctera) que supuestamente contenga bacterias no
identificadas. Los colorantes tien la pared de las bacterias de color morado y, tras
unos minutos, se realiza un lavado del colorante. Despus de eso puede que el
colorante permanezca en la pared bacteriana o que se haya ido. En el primer caso
permanecera el color morado, y se tratara de bacterias Gram positivas y, en el
segundo, la pared tendra un color rosado, y seran Gram negativas.
Estos dos grupos de bacterias son los pilares en los que se basa la clasificacin de la
amplia mayora de las bacterias. Cada uno de los grupos responde de forma diferente
a cada tipo de antibiticos, por eso es una tcnica til para seleccionar el frmaco
antimicrobiano inicial ante una infeccin. Hay que tener en cuenta que en ciertas
situaciones (como la sepsis) es muy importante iniciar un tratamiento antibitico
adecuado de forma precoz, por eso la tincin de Gram se pide de urgencia en muchas
ocasiones.
La tincin de Gram tambin tiene ciertas limitaciones. Algunas bacterias no tienen
pared, como por ejemplo las Chlamidias, y no se podrn identificar, al igual que los
virus. En esos casos la tincin no colorear ningn germen. Otro aspecto negativo de
la prueba es que no puede identificar el tipo exacto de bacteria responsable de la
infeccin. Para ello es necesario realizar un cultivo microbiolgico que se acompaa
siempre de un antibiograma para estudiar de forma exacta el antibitico ms efectivo.

QU ES UNA TINCION?

Una tincin o coloracin es una tcnica auxiliar utilizada en microscopa para mejorar
el contraste en la imagen vista al microscopio. Los colorantes y tinturas son sustancias
que usualmente se utilizan en biologa y medicina para resaltar estructuras en tejidos
biolgicos que van a ser observados con la ayuda de diferentes tipos de microscopios.
Los diferentes colorantes pueden ser utilizados para aumentar la definicin y examinar
grandes cortes de tejido (resaltando por ejemplo fibras musculares o tejido conectivo),
poblaciones celulares (por ejemplo clasificando diferentes clulas sanguneas) o
incluso para resaltar organelos dentro de clulas individuales.
TIPOS DE TINCION:
Tinciones simples
Se usa un nico colorante, que siempre es de tipo bsico. Se utilizan solamente para
incrementar el contraste; todas las clulas absorbern el colorante y quedarn teidas
del mismo color. Se fija el espcimen, se aade el colorante y se deja el tiempo
adecuado para que se absorba, se retira el exceso de colorante y la preparacin ya
est lista para ser observada.

Tamao, arreglo y forma

Un solo tinte

Directa

Tie bacteria

Negativa

tie el fondo pero no a la bacteria.

Tinciones diferenciales
Se utilizan para distinguir entre tipos de microorganismos. La tcnica de tincin
diferencial consta de dos etapas:
Una tincin simple seguida de una tincin de contraste. En la tincin de contraste se
utiliza otro colorante que tie (y por tanto, revela) las clulas no teidas por el primer
colorante. Estas tinciones son muy utilizadas en microbiologa.

Separar y clasificar los microorganismos observados de acuerdo a sus

caractersticas.

Ms de un tinte

Ejemplos: Tincin Gram y cido resistente

Tincin de Gram: es un tipo de tincin diferencial empleado en bacteriologa

para la visualizacin de bacterias, sobre todo en muestras clnicas. Se utiliza
tanto para poder referirse a la morfologa celular bacteriana, como para poder
realizar una primera aproximacin a la diferenciacin bacteriana,
considerndose bacterias Gram positivas a las que se visualizan de color
morado, y bacterias Gram negativas a las que se visualizan de color rosa, rojo
o grosella.
Tincin cido Resistente: es la propiedad fsica de algunas bacterias a la
resistencia a la decoloracin de la fucsina bsica (rojo) la cual penetra en la
clula por accin del fenol y el calor. Las bacterias cido-alcohol resistentes no
pueden ser clasificados segn la tincin de Gram, la cual es la tcnica ms
comn en la microbiologa contempornea, sin embargo puede ser teido con
algunas tinciones concentradas combinadas con calor. Una vez teida tiene la
capacidad de resistir la decoloracin de una combinacin de alcohol- cido, el
cual es el decolorante ms comn en los protocolos de tincin de bacterias, de
donde viene el nombre Alcohol-cido resistente.
Tinciones especficas
Se utilizan para incrementar el contraste en las clulas microbianas y revelan
estructuras particulares, entre las que se incluyen en los flagelos y las cpsulas.

Para identificar estructuras:

Ejemplos: Tincin de flagelos, cpsulas y esporas.

Tincin de Esporas: La bacteria es una estructura muy pequea, sin embargo,

por medio de esta tincin pudimos observar la estructura interna de la clula
bacteriana, particularmente las endoesporas, en este experimento se utiliza
una tincin simple debido a que la misma permite que se coloree toda la clula
excepto la espora que se observa de un tamao bien aceptable. Se usa verde
de malaquita en contraste con safranina.
Tincin de Cpsula: Colorante nigrosuna, aqu se observa microorganismos
encapsulados creando resistencias.

 Tincin de Flagelos: Se usa mordiente el cual aumenta el tamao

del microorganismo.

Tincin adecuada
En su forma ms simple, el verdadero proceso de tincin puede implicar la inmersin
de la muestra en la solucin colorante, seguido del aclarado que es un lavado para
eliminar el exceso de colorante y la observacin. Muchos tintes, sin embargo,
requieren del uso de un mordiente. Cuando la solucin de colorante en exceso se
elimina durante el aclarado, la tincin mordentada permanece.
Tincin negativa
Un mtodo sencillo de tincin para bacterias, que adems es un claro caso de
cromofobia y que por lo tanto funciona aun cuando los mtodos de tincin positiva
fallan, es la tincin negativa. Esto puede ser conseguido simplemente extendiendo la
muestra en un portaobjetos y aplicando directamente sobre ella una gota de nigrosina
o tinta china y cubriendo luego la muestra humedecida con un cubreobjetos. Luego de
esto, los microorganismos pueden ser observados fcilmente por medio de
microscopa en campo claro como inclusiones claras muy bien contrastadas contra el
medio oscuro que las rodea
Tincin indirecta
Se denomina de este modo a las tinciones que hacen uso de un mordiente. Un
mordiente habitual es el cido tnico.
Tincin directa
Hablamos de tincin directa cuando el colorante interacciona directamente con el
sustrato, sin otro tratamiento previo.

III.

OBJETIVO

IV.
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.

Reconoce los grupos de bacterias

Conocer el procedimiento de la tincin de Gram

PROCEDIMIENTO
Limpiar el rea de 4x3 que vas a utilizar con algodn y alcohol.
Limpiar la laminilla con algodn y alcohol.
Prender el mechero de alcohol
Flamear el portaobjeto por el mechero pero no muy cerca
Esterilizar el asa kolle
Flamear la boca de la botella del agua esterilizada por el mechero.
Sacar una pequea muestra del agua esterilizada con el asa kolle y agregarla

al portaobjeto.
8. Flamear nuevamente el asa kolle y dejarla a un lado.
9. Coger la otra asa bacteriolgica y esterilizarla.
10. Coger el microorganismo y pasar la boca del frasco del microorganismo por el
mechero.
11. Tomar una pequea muestra de la cepa y diluirla en el portaobjetos.
12. Posteriormente esterilizar el asa
13. Fijar la muestra al calor flamendola en el mechero, cuidando no quemar la
muestra.
14. Colocar el portaobjetos sobre un soporte
15. Cubrir la muestra con cristal violeta(4gotas)
16. Esperar que transcurra 2 minutos a 3 minutos hasta que se seque.
17. Despus que la muestra este seca se lava la muestra con agua destilada y
escurrimos hasta que seque nuevamente.
18. Cubrir la muestra con solucin de lugol (4gotas) y esperar que transcurra 2 a 3
minutos.
19. Lavar con agua destilada la muestra y esperar que seque.
20. Cubrir la muestra con alcohol cetona (4gotas).
21. Dejar secar ya que este no necesita de lavarse.
22. Cubrir la muestra con safranina (3gotas) y esperar que seque.
23. Lavar la muestra y escurrir.
24. Dejar secar la muestra
25. Agregar una gota de aceite de inmersin (aceite de cedro).
26. Observar al microscopio a 1000X.

4.-flamear la porta
objeto para esterilizarlo.

7.-sacar una gota de

agua esterilizada.

9.-esterilizar el asa
bacteriolgica.

el
10.-11.-diluir
toma una
10.-introducir
elcepa
asa
microorganismo
sobre
del
frasco
del
bacteriolgica en el
el
portaobjetos.
microorganismo.
frasco.

15.-agregar azul
violeta sobre la
muestra 4 gotas.

16.-dejar secar la
muestra y luego
enjuagarla.

18.-agregar 4 gotas
de lugol.

V.

19.-dejar secar la
RESULTADOS
muestra.

22.- agregar 3 gotas 23.-enjuagarla para

luego ser llevada al
de safranina.
microscopio.
Se observaron bacilos Gram +
Aparecen teidos de color azul y
estos son los bacillos

Se observan los Gram

Aparecen de color rojo que son
los cocos.

Observamos una coloracin

Simple: un solo
colorante, aqu se
Le aplica azul de
metileno. Por lo
que todas las
estructuras celulares
se tien con la misma
tonalidad
(Tinta china, Azul Metileno de
Loeffler, Azul de lacto fenol).

Para observacin de
levaduras
Y protozoos
intestinales

VI.

DISCUSION

1. PORQUE LOS COLORES DE LA TINCION?

Tinte primario- Cristal Violeta (CV), tie la bacteria color violeta.

Agente mordante- Yodo, forma un complejo insoluble con CV. Ayuda a adherir

el tinte a la clula. Ayuda a resistir la decoloracin.

Agente decolorizante- alcohol etlico al 95%, sirve como solvente de lpidos y

agente deshidratante de protenas. Remueve el cristal violeta.

Contratinte- Safranina, tie de rojo la bacteria.
2. POR QU SE PINTAN LAS GRAM?
Membrana externa de las Gram

es soluble en solventes orgnicos como el alcohol.

la capa de peptidoglicano es demasiado delgada como para retener el

complejo cristal violeta/yodo que se form.

por lo que va perdindose el color azul-violeta.
Las Gram +

no tienen su capa susceptible a la accin de solventes orgnicos.

se deshidratan los poros y se cierran.
retenindose el complejo cristal violeta/yodo y por consiguiente el color azul-

violeta.
3. PARA QU SE NECESITA EL ACEITE DE INMERSIN?
El aceite de inmersin tiene un ndice de refraccin similar al del vidrio (1,5
aprox.) y se utiliza para el objetivo de 100X.

4. D QUE EST HECHA LA PARED DE LAS BACTERIAS?

La pared celular bacteriana est hecha de peptidoglucano (tambin
denominado murena), que est formado por cadenas de polisacrido
entrecruzadas por pptidos inusuales que contienen aminocidos D.
La pared celular es esencial para la supervivencia de muchas bacterias y el
antibitico penicilina puede matar a las bacterias inhibiendo un paso en la
sntesis del peptidoglicano.
Existen dos tipos distintos de pared celular en las bacterias, denominadas
Gram-positiva y Gram-negativa, respectivamente. Los nombres provienen de
su reaccin a la tincin de Gram, una prueba extensamente empleada en la
clasificacin de las especies bacterianas.

En las bacterias Gram-positivas: la pared celular contiene una capa gruesa de

peptidoglicano adems de cidos teicoicos, que son polmeros de glicerol o
ribitol fosfato. Los cidos teicoicos se unen al peptidoglicano o a la membrana

citoplasmtica.
En las bacterias Gram-negativas: la capa de peptidoglicano es relativamente
fina y se encuentra rodeada por a una segunda membrana lpida exterior que

contiene lipopolisacridos y lipoprotenas. La capa de peptidoglicano se une a

la membrana externa por medio de lipoprotenas.
5. CARACTERSTICAS DE LAS BACTERIAS
Una de las caractersticas de las bacterias es su forma, ya que se clasifican de
acuerdo a ella, puesto que si es esfrica reciben el nombre de cocos, si tienen una
forma espiral se denominan espirilos y si tienen forma de bastn se denominan
bacilos.
Otra de las caractersticas de las bacterias es que en su pared celular proseen
flagelos, los cuales utilizan para desplazarse.

VII.

CONCLUSIONES
Conocimos los procedimientos de tincin aunque tuvimos algunos errores
al agregar los elementos de tincin ya que es muy importante saber las
cantidades necesarias y los pasos exactos.
El tamao de las bacterias dificulta su visin al microscopio, por eso la
tincin de estas en la microbiologa es un apartado sumamente
trascendente. La tcnica de tincin tiene como finalidad crear un contraste
entre la clula y el medio que la rodea, y una de las ms importantes, tanto
por su aplicacin clnica para hacer una identificacin preliminar de la
bacteria causal de la infeccin y por su practicidad, es la tincin de Gram.
Es por eso que esta tcnica se vuelve fundamental en el estudio de la
microbiologa, y el conocimiento de su correcta realizacin es
prcticamente obligatorio. El estudio de la literatura acerca de la tincin de
Gram nos permite tener un prembulo para poder diferenciar frente al
microscopio los diferentes tipos de microorganismos .Sin embargo, no hay
que pasar por alto que es de suma importancia tener un completo estudio
previo de los organismos y su reaccin a la tincin para poder dar una
respuesta certera ante el cuestionamiento de la naturaleza de un
microorganismo.

BIBLIOGRAFA:

Jawetz E., etal. Microbiologa Mdica de Jawetz, Melnicky Adelberg. Editorial

Manual Moderno, 19 a Ed. Mxico 2008; 702-703.

Caldas A. L., Gua de Microbiologa y Parasitologa bsico clnica. Disponible

en:
http://www.facultadsalud.unicauca.edu.co/Documentos2010/DptoMedInt/Tencio
n_de_gram.pdf.

Camacho, A., M.Giles, A.Ortegn, M.Palao, B. Serrano y O.Velzquez. 2009.

Tcnicas para el Anlisis Microbiolgico de Alimentos. 2 ed. Facultad de
Qumica, UNAM. Mxico.