Universidad de Santiago de Chile

Facultad de Qumica y Biologa

Experiencia 1:
Determinacin de la concentracin de
protenas
mediante el
de Bradford

Laboratorio:
Grupo:
Integrantes:

Profesora:
Ayudantes:
Fecha experiencia:
Fecha de entrega:

Bioqumica
2
Germn Cornejo
Juan Canales
Pablo Yaez
Beatriz Valenzuela
-------------06/10/2014
13/10/2014

mtodo

1. INTRODUCCION
Para determinar la concentracin de una muestra de protena existen distintos mtodos
dependiendo de la naturaleza de la protena y de otros componentes presentes en la mezcla, y de la
rapidez y sensibilidad deseada. Los mtodos ms conocidos son:
Bradford: Se basa en la unin de un colorante, Comassie Blue G-250 a las protenas. El
colorante, en solucin cida existe en dos formas, una azul y otra naranja. Las protenas se unen a la
forma azul para formar un complejo protena-colorante con un coeficiente de extincin mayor que
el colorante libre. Este mtodo es sensible (1 a 10

[ g ] de protena), simple, rpido, barato y

pocas sustancias interfieren en su determinacin. Entre las sustancias que interfieren estn los
detergentes y las soluciones bsicas.
Biuret: Se basa en la formacin de un complejo coloreado entre 1 Cu +2 con 4 grupos NH de
los enlaces peptdicos, en medio bsico. La intensidad de coloracin es directamente proporcional a
la cantidad de protenas (enlaces peptdicos) y la reaccin es bastante especfica, de manera que
pocas sustancias interfieren. La sensibilidad del mtodo es muy baja y slo se recomienda para la
cuantificacin de protenas en preparados muy concentrados (0,5 a 10

[ mg ] ) de protena).

Lowry: este mtodo permite analizar muestras que contengan alrededor de 5 a 100

[ g ] .

El reactivo contiene los cido fosfomolbdico o tngstico que al ser reducidos por las protenas
producen especies reducidas de color azul ( max =745750 [ nm ] ). El reactivo tambin contiene
iones cpricos que facilitan el proceso de reduccin. Los principales centros reactivos en las
protenas son los enlaces peptdicos, aminocidos aromticos (Tyr y Trp) y las cadenas laterales
polares. Por lo tanto, el color desarrollado depende de la composicin y secuencia de aminocidos
en la protena.
Los datos que se obtienen experimentalmente de absorbancia son normalmente tratados con
la ley de Lambert-Beer, donde la regresin utilizada debe ser lineal:

A=lC

Donde

es el coeficiente de extincin;

concentracin de la muestra y

es el espesor del medio transparente;

es la

es la absorbancia medida en el espectofotmetro.

OBJETIVOS
Aplicar el mtodo de Bradford para calcular la concentracin de una muestra problema.
Determinar la curva de calibracin en base a BSA.

2. METODOLOGIA

2.1 Preparacin muestras para curva de calibracin

2.1.1 En 9 tubos eppendorf, se agregaron volmenes de BSA de 0, 2, 4, 6, 8, 10,
12, 14 y 20

[L] de Albmina srica de bovino (BSA).

2.1.2 Luego, se enras con agua destilada hasta la medida de 20

2.1.3 A cada muestra se le agreg un volumen de 180

[L] en cada tubo.

[L] del Reactivo de

Bradford.
2.1.4 Luego, se cerraron los tubos eppendorf y se agit cada muestra con la
finalidad de homogeneizar la mezcla.
2.1.5 Se realiz un duplicado de cada mezcla, completando as un total de 18
muestras.

2.2 Carga de muestras

2.2.1 En una placa de elisa se cargan las mezclas y sus duplicados, en las filas A y B
respectivamente.
2.2.2 Se carga la muestra problema en la celda C1.
2.2.3 Se enva la placa para su posterior anlisis espectrofotomtrico.

3. DATOS Y RESULTADOS
Tabla 3.1 Datos para curva de calibracin

l BSA

l agua

0
2
4
6
8
10
12
14
20

20
18
16
14
12
10
8
6
0

l Bradford
180
180
180
180
180
180
180
180
180

[BSA]
0,00
0,01
0,02
0,03
0,04
0,05
0,06
0,07
0,10

Abs
BSA
0,2205
0,4920
0,3973
0,9123
0,8323
0,9866
0,6493
10,448
0,8981

ABs BSA
duplicad
o
0,2685
0,5257
0,6417
0,8811
0,8890
10,0730
10,5230
1,0270
1,0860

1.2
1
0.8

Absorbancia

0.6
0.4
0.2
0

0.02

0.04

0.06

0.08

0.1

0.12

Concentracin BSA g/L

Grfica 3.1 Relacin Abs vs concentracin BSA

Tabla 3.2 Curva de calibracin obtenida para BSA

Curva Calibracin
Rango Abs
Abs = 7,4024[BSA] + 0,4743
0,2685-1,0860

R2
0,7898

Tabla 3.3 Concentracin muestra problema de Abs=11,4020

Muestra problema

[ g /L ]

[ mg /mL ]

[ g / mL ]

84,8764

84,8764

84876,4

4. DISCUSION Y CONCLUSION
4.1 En cuanto a la curva de calibracin obtenida podemos decir que no es lo esperado, ya
que la ley de Lambert-Beer establece una relacin lineal entre la absorbancia y la
concentracin de la protena, mientras que la curva obtenida experimentalmente arroja
un coeficiente de regresin (R 2) de 0,7898 valor por el cual las predicciones de
concentracin para muestras problemas no ser muy acertada. Uno de los problemas al
momento de construir dicha curva fueron los valores de Absorbancia encontrados para
el patrn preparado de BSA y su duplicado, en donde 1 punto del patrn y otros 2 del
duplicado debieron ser eliminados debido a la alta dispersin que posean respecto del
resto, una vez eliminados se trabaj con los datos del duplicado ya que este conjunto
tenia mejores valores que describieran un comportamiento lineal, as como lo establece
Lambert-Beer para luego hacer la curva.
4.2 En tanto para la muestra problema se evidencia claramente que el valor de absorbancia
registrado no puede ser utilizado en la curva de calibracin ya que escapa por mucho
del rango de funcionamiento, pero aun as se hizo para poder obtener un estimado para
la concentracin de protena de aquella muestra. Por tanto de la muestra problema
podemos decir varias cosas, la primera sera una posible falla del equipo de
espectrofotometra que arroj valores errados tanto para la muestra problema como para

el resto (los 3 datos mencionados en 4.1), otra razn puede ser que la muestra problema
estaba muy concentrada, motivo por el cual el mtodo de Bradford queda fuera de su
rango de operacin (se recomienda en ese caso diluir la muestra o utilizar otros de los
mtodos mencionados en la introduccin) y por ltimo se puede hacer la
recomendacin de realizar anlisis de la muestra y un duplicado de la misma.

5.

REFERENCIAS

5.1 Documentos:
Gua 1 de laboratorio Bioqumica, Determinacin de la concentracin de protenas
mediante el mtodo de Bradford, Beatriz Valenzuela, Departamento Qumica y
Biologa, Universidad de Santiago de Chile, 2014.

5.2 Recursos Web:

www.uco.es/dptos/bioquimica-biol-mol/pdfs/27%20MTODOS%20PARA%20LA
%20CUANTIFICACIN%20DE%20PROTENAS.pdf (consultado el da Viernes
10 de Octubre de 2014).