Resumen

En este estudio, un protocolo se describe para la rpida preparacin de una

fraccin enriquecida, razonablemente pura de protenas nucleares de las hojas
de tabaco (Nicotiana tabacum), patata (Solanum tuberosum) y la manzana
(Malus domestica). El protocolo da resultados reproducibles y puede llevarse a
cabo rpidamente en 2 horas. Los extractos de tejido aclarados con la filtracin
se trataron con detergente no inico (Triton X-100) para lisar las membranas de
los orgnulos contaminantes. Los ncleos se recogieron a partir de una capa de
Percoll 60% de gradiente de densidad despus de la centrifugacin a baja
velocidad. Western blot utilizando anticuerpos contra las protenas de marcador
de orgnulos indic que las fracciones de protenas nucleares fueron altamente
enriquecido y libre o casi libre de protenas desde el retculo endoplsmico y
cloroplastos.
Background
El ncleo es un orgnulo altamente especializado, complejo y heterogneo de
la clula. Contiene la mayora de la informacin hereditaria de la clula y
controla la mayora de las funciones celulares. Los estudios sobre la
transcripcin de genes, la sntesis y el procesamiento de ARN, y el
silenciamiento gnico postranscripcional se han mejorado por la disponibilidad
de ncleos aislados. ncleos aislados tambin se utilizan para obtener ADN
cromosmico de alta calidad con cloroplasto minimizado y la contaminacin de
ADN mitocondrial, para determinar el nivel de ploida, y para medir el
contenido de ADN nuclear mediante citometra de flujo.
protenas nucleares desempean un papel central en la regulacin de la
expresin gnica. Estudios sobre proteoma nuclear han llevado a cabo en las
especies modelo, tales como Arabidopsis thaliana, Oryza sativa, y Medicago
truncatula, as como en garbanzo (Cicer arietinum). Los estudios han estimado
el tamao del proteoma, colocado las protenas identificadas por clases
funcionales, puesto de manifiesto la orientacin de las protenas y sus
modificaciones posteriores a la traduccin. Pendle et al. realizado el primer
anlisis protemico de nucleolos de A. thaliana, mientras que Calikowski et al.
matriz nuclear caracterizado Arabidopsis. Tan et al. realizado el anlisis
protemico y phosphoproteomic de las protenas asociadas a la cromatina en el
arroz, mientras que Aki et al. [20] identificaron las protenas nucleares
implicadas en mecanismos evolutivamente conservados de respuesta de
azcar en las plantas. anlisis del proteoma nucleares tambin han revelado
cambios importantes en la composicin de la protena nuclear durante la
influencia de los estmulos ambientales [12,21,22]. anlisis comparativos
Speciesspecific o especficos de tejido de proteomas nucleares han
proporcionado nuevos conocimientos sobre la comprensin de la composicin
del ncleo. Repetto et al. [15] en comparacin proteomas nucleares de semillas

de Medicago, hojas de Arabidopsis y plntulas de garbanzo. Por otro lado,

Choudhary et al. [22] realiz un anlisis comparativo de proteoma nuclear en el
nivel de organismo y evaluaron las diferencias en la composicin de protena
de las muestras aisladas de arroz, Arabidopsis, Medicago y garbanzo.
Aislamiento de los ncleos a partir de protoplastos se utiliza comnmente y
proporciona altos rendimientos de ncleos puros [23,24]. Sin embargo, los
protocolos para la preparacin de protoplastos son laboriosos y disponible para
un nmero limitado de especies. Por lo tanto, los mtodos para el aislamiento
de los ncleos de clulas de plantas intactas y tejidos han sido desarrollados
para una serie de especies de plantas con embriones [25,26], capa de semillas
[27], clulas de plantas cultivadas [28], tejidos de la raz meristemticas [29] o
tejidos de la hoja [30,31]. La mayora de los mtodos de aislamiento utilizan los
mismos teps del procedimiento, incluyendo la interrupcin del tejido, filtracin,
centrifugacin, solubilizacin de las membranas de los orgnulos contaminar
con detergentes no inicos, y la separacin de los ncleos por centrifugacin
en gradiente de densidad.
Preparacin de muestras para citometra de flujo por lo general requiere slo
los primeros tres pasos. detergentes no inicos, tales como Triton X-100,
facilitar la liberacin de los ncleos de las clulas y evitar la formacin de
grumos de los ncleos [32]. Por otra parte, la aplicacin de detergente es
crucial para el aislamiento de ncleos de tejido verde, en la que deben ser
separados de los cloroplastos mediante la interrupcin de este ltimo con el
detergente [33] ncleos. Sin embargo, altas concentraciones de detergente o
la exposicin prolongada a ella tambin pueden interrumpir la membrana
nuclear [34,35]. Para facilitar el anlisis de los ncleos de diferentes tipos de
clulas, Deal y Henikoff [36] desarroll un mtodo para el aislamiento de los
ncleos marcados en tipos de clulas especficos (intacto), que permite el
aislamiento de los ncleos marcados con biotina a partir de tipos especficos de
clulas de un tejido de perlas magnticas streptavidincoated. El mtodo
proporciona una alta pureza de los ncleos, pero requiere la construccin de
plantas transgnicas para la expresin especfica de tejido de protena de la
envoltura nuclear afinidad marcada, lo que consume tiempo y no fcilmente
aplicable para muchas especies de plantas.
Diferentes tampones para el aislamiento de los ncleos se han reportado con
composiciones variables de acuerdo con el material vegetal y el propsito de
estudio para los que se aislaron los ncleos. Durante la liberacin de los
ncleos de las clulas intactas, los tampones de aislamiento nucleares deben
asegurar la integridad de la membrana nuclear y la estabilidad de los ncleos a
lo largo del experimento. tampones orgnicos (MES, HEPES, TUBOS, TRIS,
MOPS) son necesarios para estabilizar el pH de la solucin. Las sales
inorgnicas (KCl, NaCl) a mantener la fuerza inica de la solucin, y ciertos
agentes orgnicos (sacarosa, glicerol, hexilenglicol) estabilizar las membranas

[11]. Las poliaminas en presencia de formadores de quelatos metlicos o

cationes divalentes ayudan a estabilizar la cromatina nuclear y para evitar la
agregacin de ncleos [28]. compuestos reductores, tales como mercaptoetanol y ditiotreitol (DTT), son cruciales para preparaciones de
protenas nucleares, debido a que mantienen residuos de cistena en forma
reducida.
El requisito de inhibidores de la proteasa depende de una mayor aplicacin de
los ncleos aislados. Si bien inhibidores de la proteasa se utilizan en
algunos estudios [34,37], que se han omitido de los tampones usados
para ncleos intactos en otras investigaciones [3,12]. Muchas especies
de plantas contienen grandes cantidades de compuestos fenlicos y el
uso de agentes reductores y las resinas absorbentes de compuestos
fenlicos (tales como polivinilpirrolidona) es necesaria [10,16]. las
especies y los tejidos de las plantas varan en su composicin fsicoqumica. Por lo tanto, se necesitan ajuste y la optimizacin de los
protocolos para obtener preparaciones puras de ncleos intactos que
estn libres de las protenas contaminantes no nucleares. El objetivo de
este estudio fue desarrollar un protocolo sencillo aplicable al aislamiento
de los ncleos y las protenas nucleares a partir de tejidos de hojas de
tres especies de plantas diferentes que representan a las familias
Solanaceae y Rosaceae. Esto se consigui por modificacin del protocolo
de Cushman [31] mediante el ajuste de la concentracin de los
detergentes utilizados para la lisis de los orgnulos y los parmetros de
gradiente de densidad y centrifugacin, que eran DEPENDE tamao y la
densidad de los ncleos de especies especficas. Por otra parte, se
realizaron ajustes para eliminar los compuestos fenlicos y estabilizar
muestras de protenas para los anlisis de protemica. Las fracciones
enriquecidas con ncleos obtenidos con el protocolo optimizado
mostraron contaminacin insignificante con plastidios, otros orgnulos
celulares y las protenas no nucleares. El procedimiento de aislamiento
podra concluir en 2 h.
materiales y mtodos
reactivos
2- (4-amidinofenil) -1H-indol-6-carboxamidina (DAPI)
(Carl Roth-Cat. No. 6335.1)
2- (N-morfolino) etanosulfnico (MES) (Carl-Roth
gato. No. 4256.2)
3 - [(3-colamidopropil) dimetilamonio] -1-propanosulfonato
(CHAPS) (Carl Roth-Cat. No. 1479.2)
4- (2-hidroxietil) -1-piperazinetanosulfnico (HEPES)
(Carl Roth-Cat. No. 9105.4)
Reactivo Bradford (Sigma Cat. No. B6916)

ter dietlico (Carl Roth-Cat. No. 5920.2)

Ditiotreitol (DTT) (Carl Roth-Cat. No. 6908.2)
cido etilendiaminotetraactico (EDTA) (Sigma Cat. No. EDS)
El glicerol (Sigma Cat. No. 49781)
Nitrgeno lquido
MgCl2 hexahidratado (Carl Roth-Cat. No. HN03.2)
Percoll (Sigma Cat. No. P1644)
La polivinilpirrolidona (PVP) (Sigma Cat. No. PVP40)
El cloruro de potasio (KCl) (Fluka Cat. No. 60128)
fosfato monobsico de potasio (KH2PO4) (Sigma n de cat P8416)
cctel inhibidor de proteasa (Sigma Cat. No. P9599)
El cloruro de sodio (NaCl) (Carl Roth-cat. No. 9265.1)
dodecil sulfato de sodio (SDS) (Carl Roth-Cat. No. 2326.2)
fosfato dibsico de sodio (Na2HPO4) (Sigma Cat. No. S9763)
La espermidina (Sigma Cat. No. S0266)
Espermina (Carl Roth-Cat. No. 7162.1)
Sacarosa (Sigma Cat. No. S0389)
Tiourea (Sigma Cat. No. T7875)
Triton X-100 (Carl Roth-cat. No. 3051.2)
reactivo Trizol (Invitrogen Cat. No. 15596-026)
Urea (Bio-Rad cat. No. 161 a 0730)
ECL anti-IgG de conejo, peroxidasa de rbano picante vinculado
anticuerpo completo (GE Healthcare Cat. No. NA934V)
Rabbit anti-H3 histona (Agrisera gato. No. AS10 710)
la protena 2 (cat Agrisera conejo anti-luminal vinculante. N
As09 481)
Conejo anti-plastocianina (Agrisera Cat. No. 141 AS06)
Equipo
cuchillas
Estopilla
tubos Falcon (15 ml, 50 ml)
embudos
Contenedor de vidrio
Homogeneizador (Ultraturrax T25, IKA)
Hybond-P de membrana de fluoruro de polivinilideno (GE
Cuidado de la salud)
microscopio Leitz Laborlux S con una extensin de epifluorescencia
(Leitz Ploemopak) y el filtro DAPI
Miradoth
Mortero y maja
incubador agitador orbital
pipetas Pasteur
Balanceando centrfuga del rotor (por ejemplo, Eppendorf 5804R)
soluciones
tampn de aislamiento ncleos (NIB)
1 NIB: 10 mM MES-KOH (pH 5,4), 10 mM de NaCl,
mM KCl 10, EDTA 2,5 mM, sacarosa 250 mM, 0,1 mM
espermina, espermidina 0,5 mM, DTT 1 mM.

4 solucin madre de NIB fue preparado sin espermina,

espermidina y DTT, y se almacena a 4 C. 1 NIB era
preparado a partir de la poblacin de 4 y que ser completada
inmediatamente
antes de su uso con espermina, espermidina y DTT
a partir de las existencias de espermina 100 mM, 100 mM de espermidina
y DTT 1 M en H2O desionizada.
Material vegetal
Las plantas de tabaco (Nicotiana tabacum L. cv Samsun NN) fueron cultivadas
a partir de semillas. Las plantas de papa (Solanum tuberosum L. lnea de cra
v2-108 [38]) se propagaron en cultivo de tejidos, las plntulas transfirieron al
suelo en macetas y se multiplican por el enraizamiento de esquejes. Las
plantas fueron cultivadas bajo condiciones controladas en una cmara de
crecimiento a 23 C con fotoperodo de 16 h (110 E m-2 s-1) bajo iluminacin
de lmparas fluorescentes (tubos de 58 W / 830 y 36 W / 77 turnos) y humedad
relativa del 40%. Las plantas se regaron dos veces por semana y semanal
fertilizado con 1% de N: P: K = 16: 9: 22 de fertilizante. Las hojas frescas de
tabaco (cdigo etapa de crecimiento BBCH: 1004 [39], en tambor de la hoja de
8-11 cm) y patata (BBCH cdigo etapa de crecimiento: 19 [39]; prospecto
longitudes de 2-5 cm) de plantas se muestrearon en el maana (2-4 horas
hasta el perodo de luz) para el aislamiento de los ncleos. Las hojas de la
joven de la manzana (Malus domestica Borkh cultivar de Orlovim.) (BBCH
cdigo etapa de crecimiento: 19 [39]; longitud de las hojas de 5-7 cm) se
recogieron en junio (antes del medioda) de los brotes jvenes de los rboles
que crecen en el campo recursos genticos coleccin del Instituto de
Horticultura, Lituania y almacenados a -70 C despus de la congelacin
rpida en nitrgeno lquido.
Protocolo
Una visin general de las principales etapas del protocolo se presenta en la
Figura 1.
Aislamiento de los ncleos
NOTA: Todas las soluciones, material de vidrio, tubos y equipos debern
refrigerarse a 0-4 C y se mantuvieron en hielo todo el tiempo. cabezas
homogeneizador y rotores de centrfuga pueden enfriar a la misma
temperatura.
La homogeneizacin de tejido de las hojas
Solanaceae Quitar el nervio central de las hojas y picar 3-5 g de ellos en
pequeos trozos con una cuchilla. Tratar con ter dietlico enfriado con hielo (23 ml / g) durante 3-5 minutos en un recipiente de vidrio. hojas de ter-drenado
enjuague con helado NIB (3-5 ml / g de peso fresco) y deseche de enjuague.
Moler en 5-10 volmenes de helado NIB en 50 ml tubo Falcon con
homogeneizador fijado en su velocidad ms baja (8000 rpm) 3-5 veces, cada 5
s, hasta que el tejido est completamente interrumpida. NOTA: De acuerdo con
nuestras observaciones, los ncleos de papa son ms frgiles que los de
tabaco y deben ser manejados con cuidado especial.

Rosaceae Moler las hojas de manzana congelado (2 g) en nitrgeno lquido en

polvo con mortero y mano de mortero y se vuelve a suspender en diez
volmenes de NIB + 1% de PVP (aproximadamente 20 ml).
NOTA: El tratamiento ter dietlico no se utiliz para la homogeneizacin de las
hojas de la manzana.
Filtracin
Solanaceae decantar lentamente homogeneizados a travs de dos capas de
gasa previamente mojado y luego a travs de una capa de Miracloth prehumedecida.
Rosaceae decantar lentamente homogeneizados a travs de dos capas de
gasa previamente mojado. Eliminar los restos de una gasa, se vuelve a
suspender en otros 20 ml de NIB + 1% de PVP y pasar a travs de la misma
gasa. Filtrar a travs de una capa de Miracloth pre-humedecida.

Figura 1 Esquema de los procedimientos utilizados para el aislamiento de

ncleos. A) los ajustes especficos para cada especie en las distintas fases
especficas de aislamiento de los ncleos de las hojas de tabaco, patata y
manzana. NIB, tampn para el aislamiento de los ncleos. B) Aislamiento de los
ncleos utilizando Percoll / centrifugacin en gradiente de densidad de
sacarosa (paso 4) se muestra en ms detalle. La preparacin cruda de los
ncleos se carga en la parte superior de 60% Percoll / 2,5 M de sacarosa de
gradiente de densidad antes de la centrifugacin. Despus de la centrifugacin
(1000 x g para el tabaco y la patata, 1200 g para la manzana), la capa de
Percoll contiene la mayora de los ncleos (ver fraccin Nuclear) y se recoge
para la purificacin adicional en el amortiguador de Percoll 35%. Tambin las
otras dos fracciones (60% P / 2,5 M S de interfaz y la capa de sacarosa 2,5 M)
se sometieron a anlisis de transferencia Western (vase la Figura 2). La
fraccin de la sombra en el fondo del tubo despus de la centrifugacin
contiene granos principalmente de almidn.

NOTA: Es importante usar tan pequeo de una almohadilla de gasa y Miracloth

como sea posible para reducir la prdida de muestra.

La lisis de los organelos contaminantes

Aadir 10% de Triton X-100, gota a gota a la solucin hasta una concentracin
final de 0,5% (el tabaco y la patata) o 1% (manzana) se alcanza. Agitar
suavemente la solucin durante 20 minutos
a + 4 C.

centrifugacin
Centrifugar el homogeneizado a 1000 g (tabaco y la patata) o 1.800 g
(manzana) durante 10 min. Poco a poco volver a suspender el sedimento con la
pipeta Pasteur en 10 ml (tabaco y patata) o 5 ml (manzana) de la punta.

Asamblea de gradiente de densidad

Solanaceae Place 5 ml de 2,5 M de sacarosa en el fro 50 ml tubo Falcon.
superponer cuidadosamente con una pipeta Pasteur 5 ml de solucin de Percoll
60%. Tenga mucho cuidado de no mezclar la sacarosa y capas de Percoll.

Rosaceae cuidadosamente con Pasteur superposicin de pipeta 3 ml de

solucin de Percoll 60% en 3 ml de 2,5 M de sacarosa en un refrigerados tubo
Falcon 15 ml.

Aislamiento de ncleos utilizando Percoll gradientcentrifugation densidad /

sacarosa

cargar con cuidado la preparacin cruda de los ncleos en la parte superior de

la gradiente de densidad mediante la elaboracin del extracto en una pipeta
Pasteur y lentamente la liberacin de la solucin sobre el lado del tubo por
encima de la capa de Percoll 60% (Figura 1B)

Se somete el gradiente de la centrifugacin en un cubo de rotor basculante a

1000 g (tabaco y la patata) o 1200 g (manzana) durante 30 min a 4 C.
Utilice una velocidad de ruptura lenta. Retire el lquido por encima del
gradiente. Recoger la capa de 60% de Percoll que contiene la mayora de los
ncleos cuidadosamente con una pipeta Pasteur (Figura 1B). Tenga cuidado de
no molestar a la banda de color verde oscuro se encuentra en la interfaz entre
las capas de Percoll y sacarosa, que contiene la mayor parte de los residuos
contaminantes y orgnulos.
Lavado
Solanaceae Diluir la suspensin de Percoll que contiene ncleos de tabaco
lentamente con 5 volmenes de NIB y 0,5% de Triton X-100 usando una pipeta
Pasteur y se incuba for10 min bajo agitacin suave. Diluir la suspensin de
Percoll que contiene ncleos de patata con 5 volmenes de NIB. Centrifugar a
1000 g durante 10 min.
Rosaceae Diluir la suspensin de Percoll con 3-5 volmenes de NIB y se
centrifuga a 1800 g durante 10 min.
La purificacin de los ncleos en el amortiguador de Percoll 35%
Resuspender el precipitado de ncleos en 5 ml de NIB y superponer la solucin
en 5 ml (tabaco y patata) o 3 ml (manzana) de solucin de Percoll 35%. Se
centrifuga a 1000 g (Tabaco y la patata) o 1.200 g (manzana) durante 10
min. Lavar los ncleos resuspendiendo el sedimento en 5 ml de NIB y
centrifugado como anteriormente (etapa de lavado). Proceder al aislamiento de
protenas nucleares o, alternativamente, volver a suspender los ncleos en 500
l de tampn de almacenamiento de ncleos, la congelacin en N2 lquido y se
almacena a -70 C hasta su uso.
La extraccin de protenas y cuantificacin
Las protenas totales se extraen utilizando reactivo Trizol de acuerdo con las
instrucciones del fabricante (Invitrogen). La concentracin de protena se
puede determinar utilizando el reactivo de Bradford.
El anlisis de transferencia Western
Las protenas solubilizadas en tampn de electroforesis se analizaron en un gel
de poliacrilamida SDS 12,5% por electroforesis y a electrotransferencia a una
membrana de fluoruro de polivinilideno Hybond-P. Para probar la pureza de las
protenas nucleares, las membranas se pueden probaron con conejo antihistona (H3, 1: 15.000 de dilucin), anti-lumenal-protena de unin 2 (BiP2, 1:
2.000 dilucin), y anti-plastocianina (PC, 1 : 6.000 dilucin) anticuerpos
policlonales. Las seales se detectaron por incubacin con burro anti-conejo
IgG peroxidasa de rbano picante = Conectado anticuerpo completo (1: 20.000

de dilucin) utilizando el sistema de quimioluminiscencia mejorada (ECL) y

SuperSignal West Pico Substrato quimioluminiscente.
tincin DAPI y microscoping
Los ncleos se tieron con DAPI (1 mg / ml en 1 x PBS, 10 l de ncleos en
solucin de almacenamiento se mezclaron en 10 l de solucin de DAPI) y se
analizaron usando un microscopio Leitz Laborlux S con una extensin de
epifluorescencia y un filtro DAPI.
comentarios
orgnulos subcelulares tienen propiedades fsicas similares y se distribuyen de
manera similar en los gradientes de densidad convencionales siguientes
centrifugacin, lo que dificulta la preparacin de las fracciones nucleares puros.
El protocolo para el aislamiento de los ncleos debe ser tan simple como sea
posible, fcil de repetir y producir ncleos intactos y puros. Inicialmente, hemos
probado muchos protocolos publicados para el aislamiento de los ncleos de
las hojas de tabaco, pero encontramos que los resultados insatisfactorios. El
mtodo de la Guilfoyle [33] result en un buen rendimiento de ncleos
intactos, pero con una alta contaminacin cloroplasto. Cuando se excluy la
purificacin de los ncleos en gradiente de densidad, como en Zhang et al.
[30], rendimientos muy bajos de ncleos intactos se obtuvieron a partir de
hojas de manzana. extraccin directa de protenas nucleares, como se describe
por Busk y pginas [40], produjo bajas cantidades de protenas nucleares y el
tiempo necesario para la preparacin de tampones y todo el procedimiento de
aislamiento era excesivo. Se probaron diferentes gradientes de densidad
(Percoll / gradiente de sacarosa, sacarosa discontinua o gradientes de Percoll).
La sedimentacin de los ncleos en la interfaz con otros contaminantes,
orgnulos se experiment con todos los mtodos y medios utilizados en los
gradientes de dos pasos.
En ltima instancia, se encontr que la centrifugacin en un gradiente de
densidad de Percoll / sacarosa, seguido de otra centrifugacin a baja velocidad
fue eficiente para el aislamiento de los ncleos considerablemente puros de las
tres especies de plantas bastante diferentes. En el mtodo presentado, la
diferencia con el mtodo descrito por Cushman [31] es que -mercaptoetanol
se sustituye con DTT menos picante y txico. El tampn para el aislamiento de
los ncleos se complementa con PVP para separar compuestos fenlicos a
partir de muestras de manzana (especies de plantas leosas). La concentracin
de detergente (Triton X-100) se ha optimizado para cada especie de planta. El
protocolo utiliza un gradiente de Percoll / sacarosa densidad y centrifugacin a
baja velocidad para separar los ncleos de los desechos celulares y orgnulos.
Eleccin de tampn para el aislamiento de los ncleos

[31] tampn de Cushman para el aislamiento de los ncleos contiene

poliaminas en conjuncin con EDTA, que ayudan a estabilizar la cromatina y
protenas nucleares. Mg2 + se utiliza como un estabilizador de la cromatina en
algunos otros protocolos caus agregacin grave de ncleos en nuestro estudio
(como se observa con un microscopio), presumiblemente debido a los
precipitados de la cromatina publicado que interactan con Mg2 + [34]. Los
tampones con pH 7.2 a 7.8 se han utilizado para el aislamiento de los ncleos
de tejidos de las hojas, sin embargo, Cushman de [31] MES-KOH tampn con un
pH relativamente bajo (pH 5,8) usado en nuestros experimentos no tuvieron
efectos adversos. Por otra parte, se ha informado de tampones con un pH bajo
para mejorar el rendimiento nuclear con la contaminacin citoplasmtica
mnima y la aglutinacin de los ncleos a partir de protoplastos de plantas [24]
y producir ms ncleos de tablas a partir de clulas animales [28].
la homogeneizacin de la hoja y la filtracin
Un obstculo importante para el fraccionamiento de tejido con xito se
experimenta con una interrupcin de la pared celular de la planta, ya que
cualquier tratamiento que rompe la clula tambin puede interrumpir el
ncleo. De tipo Blender homogeneizadores dan mejores resultados con muchos
tipos de tejidos de las plantas, en comparacin con la homogeneizacin en
nitrgeno lquido con un mortero y una mano de mortero [41]. Por otra parte,
Zhang et al. [30] compararon los dos mtodos (licuadora vs. mortero y mano)
para el aislamiento de ncleos de hojas de tomate (Solanum lycopersicum L.) y
observ 57% y el 95% de los ncleos restante intacto, respectivamente. Se
utiliz un homogeneizador IKA Ultraturrax T25 a la velocidad ms baja posible
(8000 rpm) para romper las clulas de las hojas de tabaco y patata despus de
pre-tratamiento de tejido con ter dietlico, lo que facilita la ruptura celular
mediante la eliminacin de ceras cuticulares [42]. tejido de la hoja de Apple se
almacen a -70 C y se moli en nitrgeno lquido a un polvo fino para el
aislamiento de ncleos. De acuerdo con Guilfoyle [33], la congelacin de los
tejidos vegetales puede conducir a la desintegracin de los ncleos y el
material de la hoja fresca por lo tanto se debe preferir, pero nuestras
observaciones no indic ningn problema significativo con el uso de material
de hojas congeladas. Del mismo modo, Zhang et al. [30] observaron que moler
las hojas de tomate en nitrgeno lquido resultaron en una mayor proporcin de
ncleos intactos que la preparacin de las hojas frescas tratadas con una
batidora de cocina.