MANUAL

DE
BUENAS
PRACTICA
S
LABORATORIO DE MICROBIOLOGA DE FACULTAD DE
BIOLOGIA DE LA UNIVERSIDAD NACIONAL DE PIURA

PRINCIPIOS DE BIOSEGURIDAD
La palabra proteccin contra la contaminacin se usa para describir
mtodos de seguridad para controlar materiales infectados dentro de un
laboratorio donde se manipulen o mantengan estos materiales.
El objetivo de la proteccin contra la contaminacin es reducir o eliminar
la exposicin de trabajadores de laboratorio, otras personas y otros
elementos del medio ambiente, de aquellos reactivos potencialmente
peligrosos.
Proteccin contra la contaminacin primaria.
La proteccin del personal y del medio ambiente cerca al laboratorio que
se hallen expuestos a agentes infecciosos, se prueba mediante tcnicas
adecuadas y el uso de equipos de seguridad apropiados.
El uso de vacunas mejora y aumenta el nivel de proteccin al personal.
Proteccin contrala contaminacin secundaria.
La proteccin al medio ambiente externo al laboratorio de la exposicin
a materiales infecciosos, se mejora mediante combinacin de diseo de
servicios y practicas operativas, de all que los tres elementos de la
proteccin contra la contaminacin incluyan prcticas y tcnicas de
laboratorio, equipo de seguridad y diseo adecuado de servicios. El
riesgo del trabajo a realizar con un agente especfico determinara la
combinacin apropiada de estos elementos.
Prcticas y tcnicas de laboratorio.
El elemento ms importante de la proteccin contra la contaminacin es
adherirse estrictamente a prcticas y tcnicas estndares
microbiolgicas.
El personal que trabaje con agentes infecciosos o materiales
potencialmente infectados, debe protegerse de los riesgos potenciales, y
ser entrenado y evaluado en prcticas tcnicas requeridas para
manipular tales materiales con seguridad. El director o jefe de
laboratorio es el responsable de proveer o dotar de entrenamiento al
personal.

Cada laboratorio debe adoptar o desarrollar un manual de operaciones

de bioseguridad que identifique el riesgo que pueda ser encontrado y
que especifique prcticas y procedimientos diseados para minimizar o
eliminar la exposicin de estos peligros.
Debe advertirse al personal de los riegos especiales y debe ser obligado
a leer y procedimientos.
Un cientfico entrenado y conocedor de las tcnicas apropiadas,
procedimientos de seguridad y riesgos asociados con la manipulacin de
agentes infecciosos debe ser el responsable para conducir el trabajo con
agentes infecciosos. Esta persona deber consultar con profesionales de
salud y seguridad y mantener asistencia en casos de riesgo.
El director de laboratorio es responsable de la seleccin de las prcticas
adicionales, de acuerdo a riesgo asociado con el agente o
procedimiento.
Equipo de seguridad (barreras primarias)
El equipo de seguridad incluye cabinas de seguridad (BSCs), recipientes
cerrados y otros controles de ingeniera diseados para mover o
minimizar la exposicin a materiales biolgicos peligrosos.
Un ejemplo de otra barrera primaria es la capa de seguridad de la
centrifuga un recipiente cerrado diseado para prevenir os aerosoles
que se produzcan durante la centrifugacin.
Para minimizar este riesgo, los controles para la proteccin contra la
contaminacin tales como los BSCs o las capas de la centrifuga debern
usarse cuando se manipulen agente infecciosos que puedan ser
transmitidos a travs de la ruta de exposicin al aerosol.
El equipo de seguridad debe incluir guantes, impermeables, cubiertas
en el calzado, respiradores, proteccin en la cara, anteojos de seguridad
o gafas. El equipo de proteccin se usa en combinacin con cabinas de
seguridad biolgica, y otros dispositivos que contengan los agentes,
animales o materiales que estn siendo manipulados.
Construccin y diseo de los servicios (barreras secundarias)
El diseo y construccin de los servicios contribuyen a la proteccin de
las personas que trabajan en el laboratorio, protegiendo a las personas y
animales que se hallen en contacto con agentes infecciosos que se
puedan escapar accidentalmente del laboratorio.

El director es responsable de proporcionar las facilidades o servicios de

acuerdo al tipo de laboratorio y a la persona que recomiende el nivel de
bioseguridad para alas agentes que estn siendo manipulados.
Las barreras secundarias recomendadas dependern del riesgo de
transmisin de agentes especficos. Por ejemplo: el riesgo de exposicin
para la mayora de servicios de laboratorio en bioseguridad nivel 1 y 2
estarn en contacto directo o exposicin por contacto inadvertidas a
travs del medio ambiente de trabajo contaminando en estos
laboratorios; las barreras secundarias incluyen la separacin del rea de
trabajo del laboratorio de los accesos pblicos; disponibilidad de n
servicio de descontaminacin.
Cuando el riesgo de infeccin por exposicin a un aerosol infecciosos es
ms alto que los niveles presentes, la contaminacin primaria y las
barrera secundarias mltiples pueden ser necesarios para impedirles a
los agentes infecciosos escapar en el ambiente. Tales rasgos del plan
sistemas de ventilacin especializados para asegurar flujo de aire
direccional, sistemas de tratamiento areos para desinfectar o eliminar
agentes del aire de la descarga, al acceso controlado divide en zonas,
las antecmaras como entrada al laboratorio o ambientes separados o
mdulos para aislar el laboratorio.
Ingenieros del plan para los laboratorios pueden recurrir a las
recomendaciones de ventilacin especficas encontradas en el manual
de las aplicaciones para la calefaccin, ventilacin y acondicionamiento
del aire (HVAC) publicado por la sociedad americana de calefaccin y
refrigeracin y el diseo y acondicionamiento del aire. (ASHAE)
Niveles de bioseguridad
Consiste en combinaciones de prcticas del laboratorio y tcnicas,
equipo de seguridad, y medios del laboratorio. Cada combinacin es
especficamente para los funcionamientos realizados, las rutas
documentadas o sospecha de transmisin del agente infeccioso, y la
funcin o actividad del laboratorio.
Los niveles de bioseguridad recomendados representan estas
condiciones bajo las que el agente ordinariamente puede manejarse con
seguridad. El jefe del laboratorio es especficamente el principal
responsable para evaluar los riesgos y aplicar las recomendaciones
apropiadas. Cuando la informacin especfica disponible sugiere que se
altera virulencia, patogenicidad, modelos de resistencia a antibiticos,
la vacuna y disponibilidad del tratamiento, u otros factores

significativamente alterados, ms (o menos) pueden especificarse

prcticas severas.
Bioseguridad nivel 1
En el nivel 1 de bioseguridad las prcticas, equipo de seguridad, y plan
de facilidades y construccin son apropiadas para el estudiante y
entrenamiento educativo secundario y los laboratorios de instruccin en
los que el trabajo se ahce con cepas definidas de microorganismos
viables no reportados como agentes de enfermedad en adultos humanos
saludables. Bacilus subtilis, Naegleria gruberi, virus de las hepatitis
canina infeccioso, y los organismos exentos bajo el NIH de ADN
recombinado. Las lneas guas son representativas de microrganismos en
las que se encuentran estos reunidos. Muchos agentes no
ordinariamente asociados con procesos de la enfermedad en humanos
son, sin embargo, patgenos oportunistas y puede causar infeccin en
jvenes, adultos y en individuos inmunodeficientes o inmunosuprimidos.
Las cepas de la vacuna que han sufrido mltiplos pasajes en vivo no
deben ser considerados avirulentos simplemente porque ellos son cepas
de la vacuna.
El nivel 1 de bioseguridad representa un nivel bsico de contencin que
confa en prcticasmicrobiolgicas estndares.
En las prcticas de bioseguridad NIVEL 2, equipo y plan de facilidades y
construccin son aplcales a diagnstico clnico, enseanza y otros
trabajos de laboratorio en los que se hace con el espectro amplio de
agentes autctonos de moderado riesgo que estn presente en la
comunidad y asociados con enfermedad humana de variada severidad.
Con buenas tcnicas microbiolgicas, estos agentes pueden usarse con
seguridad en actividades dirigidas en ambientes abiertos, con tal que el
potencial para las salpicaduras producidas de los aerosoles sean bajos.
El virus de hepatitis B, HIV, salmonella y Toxoplasmas spp son
representativos de microorganismo asignados a este nivel de la
contencin.
Bioseguridad Nivel 2
Es apropiada cuando el trabajo se hace con cualquier derivado
sanguneo humano, fluidos del cuerpo, tejidos, o las lneas de las clulas
humanas primarias donde la presencia de un agente infeccioso puede
ser desconocida. (Personal del laboratorio que trabaja con materiales
derivados de humano debe consultar el OSHA la Bloodborne Pathogen
para las precauciones requeridas especficas.)

Los riesgos primarios del personal que trabaja con estos agentes estn
relacionados a accidentes percutneos o las exposiciones de las
membranas, o ingestin de materiales infecciosos. La extrema cautela
debe tomarse con agujas contaminadas o los instrumentos afilados.
Aunque rutinariamente los organismos manipulados en Bioseguridad
Nivel 2 no se conocen de ser transmisible por la ruta del aerosol, deben
considerarse los procedimientos con aerosol dado que el potencial de
salpicadura es alto que pueden aumentar el riesgo de tal exposicin del
personal en equipo de la contencin, o en dispositivos como BSC
(cabinas de bioseguridad) o seguridad de lascentrifugas. Otras barreras
primarias apropiadas deben usarse, como escudos de la salpicadura,
protecciones de la cara, mandiles y guantes.
Las barreras secundarias como fregaderos de lavamanos y los medios de
desinfeccin desechables deben estar disponibles para reducir la
potencial contaminacin medioambiental.
Bioseguridad nivel 3
En estas prcticas el equipo de seguridad, plan de facilidades y
construccin son aplicables en el diagnstico clnico, enseanza o
investigacin, o medios de la produccin en los que el trabajo se hace
con agentes potenciales autctonos o extraos de
transmisinrespiratoria, y que pueden causar infeccin seria y
potencialmente letal.
Por ejemplo tolas las manipulaciones del laboratorio deben realizarse
en un BSC u otro equipo adjunto, como una cmara de generacin de
aerosol gas firme. Las barreras secundarias para este nivel incluyen
acceso controlado al laboratorio y requisitos de ventilacin que
minimizan el descargo de aerosoles infecciosos del laboratorio.
Bioseguridad nivel 4
El equipo de seguridad, plan de facilidades y construccin son aplicables
para trabajo con agentes peligrosos y txicos que proponen un riesgo
individual alto de exponerse a enfermedades que pueden transmitirse
va la ruta del aerosol y para lo cual no hay ningunas vacuna disponible
o terapia. Cuando se obtienen datos suficientes, el trabajo con estos
agentes puede continuar a este nivel ms bajo. Virus como Marburg y
Congo-Crimea o la fiebre hemorrgica se trabajan a nivel de
bioseguridad nivel 4.
Los riesgos primarios del personal que trabaja con agentes de
bioseguridad nivel 4 son exposicin respiratoria a los aerosoles
infecciosos, membrana mucosa o exposicin superficial rota a las gotas

infecciosas, y auto inoculacin. Todas las manipulaciones de materiales

de diagnstico potencialmente infecciosos, aislados natural o
experimentalmente de animales infectados representan un alto riesgo
de exposiciones infeccin al personal del laboratorio, la comunidad y el
ambiente.
REGLAMENTO PARA EL LABORATORIO DE MICROBIOLOGIA
1. Est prohibido comer, beber, fumar, tomar t, almacenar
alimentos, aplicarse cosmticos y cambiarse lentes de contacto en
el rea de trabajo. Los lentes de contacto solo deben cuando no
puedan usarse otro tipo de lentes.
2. Est prohibido pipetear con la boca.
3. Deben lavarse las manos al finalizar el trabajo de laboratorio y
cada vez que se sospeche contacto con material contaminado.
4. Deben trabajarse de manera tal de minimizar la creacin de
aerosoles. El asa y aguja de Kolle se esterilizar siempre a la llama
del mechero antes y despus de utilizarse.
5. Siempre debe usarse mandil y esta debe estar abrochada.
6. El pelo largo debe llevarse atado.
7. Deben usarse lentes de seguridad, cuando sea necesario proteger
la cara de salpicaduras, sustancias corrosivas, luz UV y otras
radiaciones.
8. El laboratorio debe mantenerse ordenado y limpio. Deben
minimizarse el material que no sea pertinente al trabajo en las
prcticas.
9. Todo material que ser incubado o utilizado posteriormente ser
etiquetado de la siguiente manera:
Contenido
Fecha
10.
Todo material contaminado debe descontaminarse antes de
desecharse.
11.
Las superficies de trabajo deben limpiarse y
descontaminarse con desinfectantes adecuados al final del trabajo
y en caso de haberse volcado material contaminado.
12.
Todos los accidentes o derrames de material deben ser
comunicados al docente encargado de grupo.
13.
Todo material que sea roto deber reponerse por el grupo o
alumno responsable, as como todo tipo de material faltante al
finalizar la prctica.
14.
El personal se cerciorara de que las llaves de gas y agua
queden perfectamente cerradas antes de salir.
15.
Los resultados de cada prctica debern ser presentados en
protocolos, una semana despus de efectuar la prctica.

INSTRUMENTOS BASICOS EN LA PRCTICA MICROBIOLOGICA

Un laboratorio de microbiologa debe estar implementado con una
serie de instrumentos bsicos de acuerdo a los requerimientos
cientficos actuales.
Los materiales pueden ser de vidrio, de plstico, de aluminio y de
acero inoxidable.
Los vidrios empleados para el uso de laboratorio, tiene propiedades
especiales, de acuerdo a la composicin que poseen las marcas
Kimax y Pirex, utilizan vidrio de Boro-Silicato que toleran
temperaturas de hasta 510C sin deformarse.
Los plsticos presentan propiedades diferentes de acuerdo a su
composicin de resinas que poseen, no sufren la accin de lcalis ni
de cidos.
Los metales empleados en la fabricacin de los instrumentos son de
alta calidad que toleren la actividad qumica de cidos y lcalis y
resistentes a la manipulacin y funcionamiento continuo.
OBJETIVO.- Reconocimiento y utilidad de los instrumentos de uso
frecuente en el laboratorio de microbiologa.
EL MICROSCOPIO
El descubrimiento del microscopio hacia finales de siglo XVI, seala el
inicio de la biologa moderna. Los grandes cientficos del siglo XVII,
Leeuwenhoek, Hooke, etc revelaron a sus contemporneos el
universo de lo infinitivamente pequeo.
CENTRIFUGA
Aparatos de muy diversas capacidades que permiten separar una
sustancia en suspensin del lquido respectivo.
LA BALANZA
Se usa en bacteriologa para pesar colorante, como componentes de
medio de cultivo, animales, etc. Las hay de diferentes tipos segn su
aplicacin y sensibilidad. Las de gran sensibilidad son llamadas de
precisin.
BAO MARIA
Permite la accin de calor de un lquido sobre una sustancia de menor
temperatura a travs de un recipiente. Evitar el calor directo. Se

emplea entre otras cosas, para licuar medios para inactivacin de

sueros, incubacin. Hay diversos modelos segn su aplicacin.

AGITADORES MECANICOS
Diversos diseos y con frecuencia variable en el nmero de veces que
oscila por minuto. Se utiliza para agitar tubos, frascos, etc.
PICTOMETRO
Aparato destinado a determinar la concentracin de iones H+ (pH) en
una solucin. El ms perfeccionado es el de Beckman.
BOMBA DE VACIO
Produce presin negativa y se utiliza de preferencia para filtrar a
travs de buja.
CONTADOR DE COLONIAS
(Quebec) se utiliza para el recuento de colonias en una placa de
cultivo.
MATERIAL DE VIDRIO
Es el mismo que se emplea en cualquier otro laboratorio: tubos de
ensayo, balones, matraces, kitasatos, vasos, probetas, buretas,
pipetas (graduadas, aforadas y pasteurs), placa Petri, placas de
Brewer, tubos de centrifuga, tubos de vidrio de diversos calibres para
pipetas pasteur, jeringas, frascos goteros, tubos en U, esptula de
Driglask, laminas excavadas de Koch, cmara de Levy, laminas portaobjetos, laminas cubre-objetos, perlas de vidrio, termmetros,
embudos, etc.
OTROS MATERIALES
Bujas para esterilizacin por filtracin, morteros, lminas excavadas
de porcelana, gradillas.

LIMPIEZA DE LABORATORIO
Remover el polvo del ambiente usando trapeadores hmedos y
detergentes luego aplicar un agente sanitizante.
Para el ambiente del laboratorio del laboratorio se usaran las
siguientes soluciones de agentes sanitizantes.

Soluciones Clorinadas
Usar las siguientes concentraciones de soluciones de cloro
USO

CLORO DISPONIBLE

(ppm)
Agua de lavado

2 10

Agua para manos

50 100

Limpieza de superficies lisas

50 300

Limpiezas de superficies de metal o sintticas

300 500

Superficies rugosas (pisos de concreto o paredes)

5000

1000

Iodforos
Usa las siguientes concentraciones de solucin de yodo
USO

YODO DISPONIBLE

Sumergir manos

8 12

Superficies lisas

8 35

Superficies rugosas

125 200

Equipos y utensilios

12 20

LIMPIEZA DE MATERIAL DE VIDRIO

MATERIAL DE LIMPIEZA
Desinfectantes, Escobillas, Detergentes, Agua caliente, agua destilada.
PROCEDIMIENTO
1. Se considera como insegura la prctica de sumergir todo
material de vidrio, tubos, placas, etc. Con cultivos descartables
o contaminados, dentro de un cubo desinfectante, dejndolo
durante una noche, lavndolos despus o tirndolos. Todo el
material debe ser esterilizado en autoclave antes de proceder a
su lavado.
2. Al sacarlos aun en caliente quitar los tapones y vaciar el
contenido.
3. Lavar con agua caliente y detergente.

4. Enjuagar con agua de cao a chorro continuo hasta la

eliminacin del detergente o agente bactericida. Luego
enjuagar con agua tibia y por ultimo dos o tres lavadas con
agua destilada.
5. Dejas escurrir y secar.
Las pipetas los porta y cubre objetos, y otros dispositivos, se
desinfectan sumergindoles en un recipiente de base ancha que
contenga una solucin bactericida como la mezcla sulfocrmica o
una solucin de fenol al 5% por 24 hrs.
Enjuagar y dejar secar.
Cuando el material de vidrio retiene manchas se trata con mezcla
sulfocrmica.

ACONDICIONAMIENTO DEL MATERIAL DE LABORATORIO

MATERIAL.-

Papel Kraft u otro papel para envolver.

Cilindros metlicos
Algodn
Placas Petri
Tubos de ensayo
Pipetas

PROCEDIMIENTO.1.- El material debe estar limpio y totalmente seco.

2.- Las placas de Petri deben estar envueltas en papel Kraft aisladas o
en grupos. Es preferible usar cilindros metlicos.
3.- A los tubos de ensayo o frascos deben, colocarse tapones de algodn
largos, y suficientemente consistentes para no permitir el paso de
grmenes.
4.- A las pipetas se les coloca en el extremo bucal un pequeo tapn de
algodn, ayudndose con un alambre fino; se elimina cualquier fibra
suelta en el flameo, se cubre la pipeta con una tira de papel empezando
por el extremo delgado para terminar en el extremo bucal y se asegura
la envoltura torsin del resto de papel que queda.
5.-Es preferible utilizar cilindros metlicos cuando se preparan grandes
cantidades de material.
ESTUDIOS DE LOS GRMENES POR MTODOS PTICOS
Los microorganismos a excepcin de los virus, son visibles con un
microscopio comn, y la observacin puede ser realizada en muestras
hmedas sin colorear (Examen en fresco) o en preparaciones

previamente coloreadas. Las tcnicas son mltiples y en el trabajo se

eligen aquellas que mejor sirven a un propsito determinado.
Las muestras hmedas (examinadas con poca luz: condensador bajo y
diafragma semicerrado) dan informacin sobre movilidad de
microorganismos o sirven para detectar elementos formes. Es el mtodo
bsico para el estudio parasitoscpico; para este fin se emplean
suspensiones de la muestra en suero fisiolgico u otros diluyentes.
La muestra hmeda puede ser tambin observada en campo oscuro,
contraste de fases, por mtodos de fluorescencia y otros. Es estos
casos los propsitos son mas avanzados que los de un examen simple a
menor aumento en microscopio corriente.
Las coloraciones varan en forma extraordinaria, desde aquellas que
usan un solo colorante, como el azul de metileno hasta otras en las que
las tcnicas son ms complejas. Ellas varan con los fines de estudio y
guardan la relacin con las caractersticas y naturaleza biolgica del
germen que se trata de observar.
En las prcticas que conforman esta parte se describen algunas tcnicas
de coloracin, tiles en el estudio morfolgico y estructural de los
microorganismos. A travs de ellas es fcil tomarse una idea de los
mltiples procedimientos ideados por el hombre para objetivar la fiel
imagen de los microorganismos.
El estudio por mtodos pticos, es generalmente la parte inicial de un
trabajo ms amplio que abarca mltiples procedimientos destinados a la
identificacin fidedigna de un agente determinado.
Los pasos inmediatos son los siguientes:
Cultivar el o los grmenes en medios y ambientes propicios para la
proliferacin.
Determinar nuevamente los caracteres morfolgicos.
Precisar mas acciones sobre el medio en que creci.
Resembrar en otros medios que contienen sustratos para detectar la
actividad enzimtica de los grmenes.
Ensayar suspensiones
del germen frente a sueros que contienen
anticuerpos conocidos y de carcter especfico.
Inocular el microorganismo en animales supuestos, sensibles, ya sea
para objetivar lesiones o reacciones caractersticas, o para demostrar el
poder letal que puede tener, o simplemente para aislarlo por medios
biolgicos en estados de pureza.
Finalmente, ensayar la sensibilidad bacteriana frente a sustancias con
capacidad antibacteriana.
Este es un esquema, mediante el cual se comprende, que el estudio de
grmenes por mtodos pticos, aun siendo de gran utilidad e
importancia, es slo parte de un proceso que debe seguirse
minuciosamente para determinar un microorganismo con certeza.

Debe anotar que no siempre se ejecutan todos los pasos ni se sigue

necesariamente el mismo orden; todo depende de la naturaleza del
germen y del tipo de trabajo.
Lo que se pretende conseguir con estos procedimientos es informacin
sobre:
Caracteres morfolgicos y timoriales.
Caracteres culturales (abarca los del orden bioqumico y fisiolgico, en
gran parte, reflejo de la actividad enzimtica).
Caracteres antignicos.
Caracteres patognicos y otros.
PREPARACIONES EN FRESCO Y EN SECO
MATERIALES:
Microscopio
Lminas excavadas de Koch
Preparacin en seco
Infusin de heno
con agua destilada
Porta y cubre objetos
Aceite de inmersin
Asa de Kolle
Cultivo de microorganismos

Vaselina
Pizetas

PROCEDIMIENTO
OBSERVACION
DE
MICROORGANISMOS
MEDIANTE
PREPARACIONES EN FRESCO.
A. MONTAJE HUMEDO
1. Colocar sobre el portaobjetos una gota del cultivo en estudio.
2. Cubrir con el portaobjetos procurando evitar la o Browniano.
3. Esquematizar y Nominar sus observaciones.
4. Describa sus observaciones e indique si el microorganismo es
motil o no.
OBSERVACION
DE
PREPARACIONES EN SECO.

MICROORGANISMOS

MEDIANTE

1. Cada estudiante recibir una preparacin coloreada de una

bacteria.
2. Asegrese de que los lentes del microscopio estn limpios,
utilizando el papel silicone.
3. Examine el frotis con los objetos de pequeo, mediano y gran
aumento. Haciendo los ajustes necesarios de iluminacin con cada tipo
de lente.

4. Examine cuidadosamente el frotis de la lente de inmersin sin

utilizar aceite de cedro. Luego aplique en forma correcta el aceite de
cedro. Trate de observar si existen diferencias.
5. Haga esquema de sus observaciones.
COLORANTES Y COLORACIONES
La finalidad principal de los colorantes es, entre otros, hacer visibles a
los grmenes y revelar su estructura. El estudio microscpico de un
germen puede ser realizado de diversas maneras, incluidos los
preparados en fresco. Pueden adems utilizarse tcnicas especiales
como contraste de fases, el campo oscuro, la fluorescencia, etc.
MATERIALES
COLORANTES
Puede ser:
NATURALES: Camn, Hematoxilina, tornasol.
ARTIFICIALES: Estos a la vez pueden ser:
Bsicos: Como azul de metileno, violeta de genciana y fucsina bsica.
cidos: cido pcrico, fucsina cida, eosina.
Neutros: Eosinatos, Wright
Indiferentes: Sudan III.
SOLUCIONES EMPLEADAS EN COLORACIONES COMUNES
Azul de metileno de Loeffer
Azul de metileno
Alcohol etlico
Solucin de KOH al 0.01%

0.31 gr
30 mL
100 mL
100 mL

Violeta de genciana fenicada

Violeta de genciana
cido fnico cristalizado
Alcohol etlico
Agua destilada

1 gr
2 gr
10 mL
10 mL
100 mL

Violeta de genciana de Hucker

(Cristal violeta oxalato de amonio)
Cristal violeta
Alcohol etlico
Oxalato de amonio
Agua destilada

2 gr
20 mL
0.8 gr
80mL

Fucsina fenicada de Ziehl

Fucsina bsica
cido fnico o fenol
Alcohol etlico
Agua destilada

0.3 gr
5 gr
10 mL
100mL

Solucin yodo-yodurada (Lugol dbil)

Yodo
Yoduro de Potasio
Agua destilada

1 gr
2 gr
300 mL

Solucin yodo-yodurada (Lugol fuerte)

Yodo
Yoduro de Potasio
Agua destilada

1 gr
2gr
200 mL

Solucin nenosa saturada de acido pcrico

Solucin de safranina
Safranina o solucin al 2.5% en alcohol etlico
Agua destilada

10 mL
100 mL

Alcohol ter (Licor de Hoffman)

Mezcla a partes iguales de alcohol 95 con ter.
Alcohol acetona
Alcohol 95
Acetona

80 mL
20 mL

Alcohol clorhdrico
Alcohol clorhdrico
3 mL
Alcohol etlico
97 mL
Pasos generales de una coloracin
Extensin en lamina portaobjetos con asa bacteriolgica u otro
instrumento. El asa debe ser esterilizada al rojo en el mechero, antes y
despus de su empleo.
Fijacin: Su objeto es adherir fijamente la preparacin sobre la lmina.
Se emplea para este fin el calor suave o el alcohol ter, este ultimo
indispensable cuando se trata de muestras cerosas.
Tincin: Con el colorante o con el grupo de colorantes elegidos.
Lavado a chorro
Secado: Puede utilizarse el calor suave o el aire a presin

Observacin. Nota. Nunca observe una lmina coloreada, antes de que

seque, sobre todo cuando va a utilizar lentes de inmersin.
COLORACIONES SIMPLES
Son aquellas en las que se usa un solo colorante, ejemplo: el azul de
metileno, con el ziehl u otros colorantes.
MATERIAL.- Cultivos en medios slidos o lquidos de:
Sthapy
lococus airenes
Escheri
chia Coli
Porta objetos desengrasados
Asas de Kolle
Cristal violeta
Azul de metileno
Aceite de cedro
Microscopio
Pizetas con agua destilada
PROCEDIMIENTO
1.- En un portaobjetos limpio colocar una gota de agua, luego aadir una
porcin pequea de la sustancia portadora del inoculo.
2.- Extender la preparacin y fijarla pasando la lamina a travs de la
llama hasta que la extensin se seque
3.- Cubrir la extensin con colorante que puede ser: Cristal violeta, azul
de metileno, etc. Por 1 o 2 minutos
4.-Lavar el exceso del colorante, evitando el desprendimiento del
precipitado
5.- Secar al medio ambiente o con ayuda del papel filtro
6.- Examinar la lamina del microscopio utilizando objetivo de inmersin,
colocando previamente sobre la extensin una gota de aceite de cedro.
7.- Hacer esquemas indicando la morfologa.
COLORACIONES COMPUESTAS
Son aquellas que se emplea mas de un colorante, la ms comn es la de
Gram que fue creada por Christian Gram, estudiante dans entre 18841886.
COLORACION GRAM
MATERIALES
Cultivo en medio lquido o slidos de :

Escherichia Coli
Bacilus Cereus
Proteus Vulgaris
Streptococus
Cristal violeta o violeta de genciana
Lugol
Alcohol-cetona
Safranina
Asas de siembra
Aceite de inmersin
Portaobjetos desengrasados
Pizetas con agua destilada
Microscopio
PROCEDIMIENTO
1. Colocar una gota en medio liquido con bacteria sobre un portaobjetos
limpio y desengrasado, en caso de tratarse de una muestra solida,
colocar previamente una gota de agua destilada esterilizada sobre el
portaobjeto, luego extender la muestra sobre un rea de un cm2 .
2. Fijar la muestra al aire o pasndola rpidamente por encima de la
llama del mechero.
3. Despus de la fijacin de la muestra, cubrirla con solucin fenicada de
la violeta de genciana o la de Hucker.
4. Tiempo: 30 a 60 segundos aproximadamente
5. Lavar con agua a chorro
6. Cubrir con Lugol y dejar actuar de 2 a 3 minutos.
7. Decolorar con alcohol acetona hasta que no se desprenda mas
colorante de la lamina
8. Lavar
10. Contrastar con safranina (10 a 30 segundos)
11. Lavar, secar y observar la inmersin
Al final de la colocacin, segn se vera en el microscopio, los grmenes
pueden quedar teidos de violeta o rojo. Los que toman el color positivo
se llaman Gram positivos y los que toman el color rojo Gram negativos.