HPLC Ov PDF

Aplicaii ale
Cromatografiei de Lichide de nalt Performan

n Biochimie
Teorie i Practica
Dr. Vasile OSTAFE
2011
OSTAFE, Vasile
Aplicaii ale Cromatografiei de Lichide de nalt Performan n Biochimie.
Teorie i Practic: Curs / Vasile Ostafe
Timioara, Editia a doua (revizuta , 2011
Biochimie Analitic Modern
300 p: il., fig., tab.
22 cm
n amintirea D-lui Dr. Horst D. Schell,

Cel ce mi-a ndrumat primii pai n arta cromatografiei de lichide
D-lui Prof. Dr. B. Jarstorff,

Cel ce m-a iniiat n cromatografia de lichide de nalt performan.
Multumiri,
Autorul mulumete tuturor celor ce au contribuit la

apariia acestei cri, n mod deosebit Prof. Dr. Adrian
Chiriac pentru sprijinul i permanentele ncurajri,
colaboratorilor de la Institutul de Sntate Public Dr.
Leonida Georgescu din Timioara Dr. Ioana Lupa,
Farm. Gabriela Papoe i Ing. Chim drd. Claudiu Brumaru
pentru discuiile utile i constructive asupra manuscrisului.
C
S
NS
RIIN
PR
CU
UP
PARTEA I
NOTIUNI TEORETICE
Prefaa ................................................................................................................. 7
Noiuni Introductive ......................................................................................... 9
Teoria HPLC ........................................................................................................ 15
Mecanismele Separrii...................................................................................... 25
Pregtirea Probelor ........................................................................................... 27
Tehnici de Injectare a Probelor n Sistemul HPLC .................................... 35
Pompele de Faze Mobile i Degazoarele ....................................................... 38
Detectoarele HPLC ............................................................................................ 47
Derivatizarea ...................................................................................................... 74
Colectarea Datelor i Evaluarea Metodelor................................................. 77
CUPRINS
PARTEA A II-A
EXEMPLE PRACTICE DE SEPARARE HPLC
Proteine, Peptide i Aminoacizi .................................................................... 81
Proteine............................................................................................................................................. 82
Peptide .............................................................................................................................................. 90
Aminoacizi ........................................................................................................................................ 94
Glucide ................................................................................................................ 102

Separarea zaharidelor simple ..................................................................................................... 109
Separarea oligozaharidelor ......................................................................................................... 116
Analiza prii glucidice.................................................................................................................. 117
Nucleotide ......................................................................................................... 119

Baze azotate .................................................................................................................................... 123
Nucleozide........................................................................................................................................ 125
Nucleotide ........................................................................................................................................ 130
Lipide .................................................................................................................. 139

Acizi grai ........................................................................................................................................ 140
Acilgliceroli ...................................................................................................................................... 144
Fosfolipide........................................................................................................................................ 148
Sfingolipide ...................................................................................................................................... 153
Steroizi .............................................................................................................. 157

Steroli ............................................................................................................................................... 158
Hormoni steroidici ......................................................................................................................... 161
Vitamine ............................................................................................................. 171

Vitamine hidrosolubile ................................................................................................................... 173
Vitamine liposolubile ...................................................................................................................... 186
P r e f a
Prezentul curs de "Aplicaii ale Cromatografiei de Lichide de nalt

Performan n Biochimie" se adreseaz n primul rnd studenilor seciilor de
chimie i biologie, pentru care cromatografia de lichide este o tehnic absolut
necesar pentru desvrirea pregtirii lor generale i biochimice. n egal msur
cursul se adreseaz analitilor i cercettorilor chimiti, biologi, biochimiti,
farmaciti, etc., ce lucreaz n cele mai diverse domenii ale activitii umane,
pornind de la producia i controlul alimentelor, buturilor alcoolice i nealcoolice,
produselor agricole n general, medicamentelor, cosmeticelor i detergenilor,
pesticidelor, explozibililor, uleiurilor, benzinelor, materialelor plastice i nu n
ultimul rnd n activiti de protecia mediului, a consumatorului i a calitii vieii.
Cursul este structurat pe dou pri: prima teoretic i cea de-a doua cu un
bogat coninut practic.
Partea nti este o tratare teoretic, destul de succint dar complex, a
principalelor noiunilor necesare pentru punerea la punct a metodelor de separare a
amestecurilor de analii i pentru justa interpretare a rezultatelor obinute. Sunt
prezentate i cele mai importante procedee de pregtire a probelor. Se face apoi o
trecere n revist a celor mai comune aparate ce constituie un sistem HPLC. Dintre
acestea, detectoarele HPLC sunt prezentate mai pe larg, cu accentul pus pe cele mai
folosite detectoare la ora actual - detectoarele UV, DAD i MS.
Partea a doua are un puternic caracter practic, nelipsind noiunile teoretice
eseniale. n capitole separate, sunt tratate principalele grupe de biomolecule. Dup
scurte informaii biochimice referitoare la clasa de compui analizat se descriu
cele mai comune metode de pregtire a probelor i se prezint cteva exemple
concrete de separare a acestor substane. Unde este cazul, se descriu metode de
derivatizare presau post-coloan n ideea folosirii detectoarelor UV i DAD, larg
rspndite la ora actual.
Cursul are o bogat bibliografie, prezentat de fiecare dat la subsolul
paginii, pentru a nlesni corelarea informaiilor din carte cu sursa bibliografic
primar utilizat pentru culegerea informaiilor. Se prezint att articolele n care a
fost semnalat pentru prima dat metoda respectiv de separare, ct i articole
publicate n ultimii 3 ani, ce trateaz acelai subiect.
Se preconizeaz nnoirea periodic a informaiilor ct i adugarea de noi
clase de biomolecule de interes biochimic n ediiile viitoare.
Va s i l e O s t a f e
N
VEE
TIIV
CT
UC
NII IIN
DU
UN
OD
RO
IIU
TR
NO
O
NT
DEFINIIE
Cromatografia este un proces de separare n cascad n care

un amestec este separat n componentele individuale, urmat
de detecia acestora printr-un procedeu convenabil.
Cromatografia, n principiu, necesit dou faze, una
staionar i alta mobil. n cromatografia de lichide faza
mobil este lichid, iar cea staionar, este, cel mai adesea,
legat de un solid, ce umple o coloan (de sticl sau
metal)1.
Fig. 1. Ilustrare a separrii cromatografice: (a) soluii A i B sunt adugai

la captul superior al
coloanei cromatografice;
(b) dup ce faza mobil a
percolat coloana pentru
ctva timp, soluii A i B
sunt separai n coloan;
(c) A elueaz din
coloan; (d) B elueaz
din coloan, separarea
fiind ncheiat cu succes.
Snyder, L.R., Kirkland, J.J., and Glajch, J.L. Practical HPLC Method Development, New York, John
Wiley and Sons, 1997
INTRODUCERE
SCURT ISTORIC
n ultimii 50 de ani cromatografia ca tiin s-a dezvoltat

foarte mult din toate punctele de vedere: numrul
sistemelor cromatografice i al utilizatorilor, cantitatea de
material publicat, varietatea i complexitatea probelor
supuse separrilor cromatografice, viteza de separare,
uurina separrilor, etc. Totui aceast dezvoltare nu a fost
continu i nici lin. Dezvoltarea cromatografiei, la fel cu
cea a altor tiine a cunoscut perioade de progres i
perioade de stagnare. Printre evenimentele cruciale, care au
contribuit cel mai mult la dezvoltarea acestei tiine putem
aminti:
Introducerea cromatografiei de partiie i a
cromatografiei pe hrtie din anii 401,2;
Gaz cromatografia i cromatografia n strat subire
introdus prin anii 503,4;
Diferite tipuri de gel-cromatografie sau excludere
molecular din anii 605.
Toate acestea au pus bazele cromatografiei de lichide
moderne.
CROMATOGRAFIA
DE LICHIDE = LC
Cromatografia de lichide (LC) se refer la orice proces

cromatografic n care faza mobil este lichid, n contrast
cu faza mobil gazoas din cromatografia de gaze.
Cromatografia tradiional pe coloan (fie ea de orice tip de adsorbie, partiie, schimb ionic, etc.), n strat subire sau
Martin, A.J.P., Synge, R.L.M., Biochem. J., 35 (1941) 1358

Martin, A.J.P. in: Nobel Lectures: Chemistry 1942-1962, Amsterdam, Elsevier, 1964, p. 359-371
3
James, A.T., Martin, A.J.P., Biochem.J., 48(1) (1951) 7
4
James, A.T., Martin, A.J.P., Analyst (London) 77 (1952) 915
5
Porath, J., Flodin, P. A., Nature 183 (1959) 1657
2
10
VASILE OSTAFE
pe hrtie, i cromatografia de lichide modern sunt toate

forme ale cromatografiei de lichide. Diferenele dintre toate
aceste procedee se refer la detalii de echipament, material
cromatografic, tehnica de lucru, dar cromatografia de
lichide modern are cteva avantaje majore fa de celelalte
tehnici menionate: vitez sporit de separare, posibilitatea
de a separa amestecuri complexe, uurin n executare, etc.
Pentru a aprecia mai bine avantajele cromatografiei de
lichide moderne s facem dou comparaii: ntre
cromatografia de lichide i cea de gaze i ntre
cromatografia de lichide modern i cea tradiional1.
CROMATOGRAFIA DE
LICHIDE COMPARAT CU
CROMATOGRAFIA DE
GAZE
Dezavantaje ale GC:
Probele trebuie s fie
volatile
stabile termic
Capacitatea excepional a cromatografiei de gaze (GC) de

a separa i analiza amestecuri foarte complexe este astzi
unanim
recunoscut.
Comparat
cu
metodele
cromatografice anterioare, GC realizeaz separri mult mai
rapide i eficiente. Exist sisteme cromatografice pentru
GC total automatizate, la preuri acceptabile, cu
performane excelente. Totui multe amestecuri nu pot fi
rezolvate de GC, fie din cauz c substanele respective nu
sunt volatile, fie c sunt instabile termic i se descompun n
timpul cromatografierii. S-a estimat c numai 20% din
compuii organici pot fi separai corespunztor cu ajutorul
GC, fr modificri chimice prealabile1.
Cromatografia de lichide, pe de alt parte nu cunoate
limitri datorit volatilitii sau instabilitii termice a
probelor. Astfel, LC este ideal pentru separri de
Fallon, A., Booth, R.F.G., Bell, L.D., Applications of HPLC in Biochemistry, Amsterdam, Elsevier
Science Publishers B.V. (Biomedical Division), 1990
11
INTRODUCERE
macromolecule i specii ionice (de interes biomedical),

pentru produi naturali sensibili i pentru o mare varietate
de alte substane cu mas molecular mare, mai puin
stabili, cum ar fi: proteinele, aminoacizii, acizii nucleici,
polizaharidele, pigmenii vegetali, lipidele polare,
substanele de interes farmaceutic (hormoni, vitamine,
antibiotice, etc.), coloranii, surfactanii, medicamentele,
pesticidele, etc.2
Avantaje ale HPLC fa

de GC:
Exist 2 faze a cror

parametri pot fi modificai
cu uurin
Cromatografia de lichide are unele avantaje fa de GC i

poate rezolva (de cele mai multe ori) separri mai
complexe deoarece:
n LC sunt utilizate dou faze (una staionar i alta
mobil) cu selectiviti diferite fa de moleculele
supuse separrii, fa de doar una n GC. Separarea
cromatografic este rezultatul unor interacii specifice
ntre moleculele probei cu fazele staionar i mobil.
Aceste interaciuni sunt absente n ce privete faza
gazoas mobil a GC, dar sunt prezente n cazul LC,
furniznd astfel o variabil n plus n ce privete
controlul i mbuntirea separrii3.
Snyder, L.R., Kirkland, J.J., Introduction to Modern Liquid Chromatography, New York, WileyInterscience, 1979
Snyder, L.R., Glajch, J.L., Kirkland, J.J., Practical HPLC Method Development, New York, John
Wiley and Sons, 1988, p.260
Snyder, L.R., Kirkland, J.J., Introduction to Modern Liquid Chromatography, New York, WileyInterscience, 1979
12
VASILE OSTAFE
Exist o mare varietate de

detectoare
Ridicarea la scal se face

uor
Detecie nedistructiv
n LC exist (cel puin pn acum) o mai mare

varietate de suporturi cromatografice1;
n LC se utilizeaz temperaturi sczute (cel mai
adesea temperatura ambiant).
n LC se poate utiliza o mare varietate de detectoare:
colorimetre (eventual combinate cu reactoare unde
se desfoar reacii de formare a compuilor
colorai), spectrofotometre n UV, fluorimetre,
detectoare de conductivitate, de refracie, detectoare polarografice, detectoare radiometrice,
spectrometre de mas, etc., n anumite cazuri de
separri cromatografice n LC utilizarea unui
detector corespunztor elimin necesitatea unei
separri complete2.
Un mare avantaj al LC fa de GC este faptul c dup
separarea cromatografic substanele pot fi uor
recuperate n eprubete separate, cu ajutorul
colectoarelor de fraciuni. Trecerea de la LC
analitic la cea preparativ se face relativ uor,
recuperarea
componentelor
separate
fiind
cantitativ. Exist posibilitatea de recuperare a
componentelor i n GC, dar procedeul este mult
mai complicat i cel mai adesea necantitativ3.
n ciuda avantajelor menionate ale LC fa de GC, aceasta
Snyder, L.R., Kirkland, J.J., Glajch, J.L., Practical HPLC Method Development, New York, John
2
Snyder, L.R., Liquid Chromatography Detectors, New York, Marcel Dekker, Inc. 1983
3
13
INTRODUCERE
HPLC
Substane
hidrofile
din urm este aplicat cu prioritate dac nu sunt de ateptat

probleme speciale n ce privete separarea componentelor
amestecului de analizat. Separrile prin GC sunt n general
mai rapide i mai sensibile i, cel mai adesea, mai puin
costisitoare1,2.
Paraquat
Diquat
Acizi carboxilici
volatili
Fenoxiacizi
Glifosat
Aldehide
Cetone
Sulfoamide
H2S, SO2,
mercapto
Polaritate
Nitrii
Aflatoxine
Carbamai
Acizi grai
Fenoli
nitrai i
clorurai
Hidrazine
Pesticide
organofosforice
BHT, BHA, THBQ

Antioxidani
Triazine
Alcooli
PCB
Dioxine
Epoxizi
GC
Substane
hidrofobe
Uleiuri
eseniale
Co 2, CO,
Metan
Esteri metilici ai
acizilor grai
Anilide
Nitroanilide
Ierbicide
fenil-ureice
Flavonoide
Colorani
alimentari
naturali
Ftalai
Vitamine
liposolubile
PAH-uri
Monomeri
pentru
mase plastice
Benzeni
Hidrocarburi
alifatice C2 - C6
Antibiotice
DDT
Halogenuri
alifataice
Surfactani
Enzime
PG, OG, DG
fenoli
Benzidine
Nitrozamine
Alcooli
Colorani
alimentari
sintetici
Glicoli
Ioni
anorganici
Glucide
Aminoacizi
Fosfolipide
Trigliceride
Esteri aromatici
Hidrocarburi
alifatice >C8
GC
HPLC
Substane
volatile
Substane
nevolatile
Volatilitate
Fig. 2. Domenii de aplicabilitate ale GC i HPLC.
COMPARAIE
NTRE
LC
considerm
acum
diferenele
dintre
sistemul
Wiley and Sons, 1988. p. 260
14
VASILE OSTAFE
CLASIC I HPLC
Dezavantaje ale LC
clasice:
Coloanele
se
pot
refolosi de un numr
foarte mic de ori
Timp de analiz lung
Reproductibilitate
redus
cromatografic tradiional i cel modern:

n LC clasic, o coloan este, n general, utilizat o dat (n
cel mai bun caz de cteva zeci de ori) dup care este golit
i reumplut (eventual materialul de umplere este
regenerat). Aceasta reprezint o mare cheltuial att de
manoper ct i de material. Aplicarea probei, pentru a se
face corect, necesit o mare pricepere din partea
operatorului. Curgerea solventului (eluentului) prin coloan
se realizeaz prin cdere liber (pe baza acceleraiei
gravitaionale), sau cu ajutorul unor pompe peristaltice.
Separrile cromatografice dureaz, n varianta clasic,
cteva ore (uneori cteva zile), fiind prin urmare procedee
mari consumatoare de timp i de efort uman1.
Variantele LC pe hrtie (Paper chromatography - PC)
aprut prin ani 40 i a cromatografiei n strat subire
(Thin Layer Chromatography TLC) din anii 50 a
simplificat ntr-o oarecare msur multe din operaiile
necesare separrii cromatografice. Hrtia cromatografic
sau plcile gata turnate pentru TLC pot fi astzi cumprate
la preuri acceptabile. Aplicarea probelor n aceste tehnici
este mai puin pretenioas, existnd, de altfel, i dispozitive care permit aplicarea semiautomat sau automat a
probelor. Curgerea solventului se realizeaz, cel mai
adesea, prin capilaritate, hrtia sau placa cromatografic
fiind introdus ntr-un tanc cromatografic nchis, ce conine
o cantitate mic din solventul eluant. n acest fel, singura
intervenie a operatorului const n urmrirea frontului de
solvent pentru a opri procesul cromatografic la timpul dorit.
Detectarea i cuantificarea substanelor separate se
realizeaz prin stropirea hrtiei sau plcii uscate cu reactivi
cromogenici corespunztori, pentru a se crea spoturi colo-
Ettre, L.S., LC Mag., 1 (1983) 108
15
AVANTAJE ALE HPLC

FA DE LC CLASIC:
Coloanele pot fi refolosite de

sute de ori
Injectarea probelor se face

(semi)automat
16
INTRODUCERE
rate pentru fiecare component separat.

Tehnica PC i TLC a simplificat mult procesul
cromatografic i a redus timpul de separare, care, n special
n cazul TLC este de ordinul minutelor (30-60 min.).
Totui, anumite limitri, caracteristice metodelor
cromatografice "pat-deschis" (open-bed) s-au pstrat i la
aceste tehnici: reproductibilitate redus; dificultate n
realizarea determinrilor cantitative; timpi de separare mai
lungi i rezoluii mai sczute dect n cazul GC; capacitate
limitat de realizare a separrilor preparative (de ordinul
miligramelor); automatizare dificil.
Cromatografia de lichide modern utilizeaz coloane
nchise, care pot fi refolosite de sute sau chiar de mii de ori,
fr a periclita performanele separrilor. Cu toate c aceste
coloane sunt foarte scumpe (de la 300 $ n sus), innd cont
de faptul c perioada de via este foarte lung, practic
utilizarea lor este mai economic dect cea a coloanelor
deschise. Cu toate c i coloanele HPLC se pot ncrca
individual de fiecare operator, cel mai adesea, acestea se
cumpr gata umplute, astfel c se poate elimina aceast
operaie mare consumatoare de timp i care necesit mult
ndemnare din partea operatorului. Injectarea probelor se
realizeaz cu ajutorul unor dispozitive speciale - valve de
injecie, bucle de injecie - care fac ca operaia s fie rapid
i foarte uor de executat. Curgerea solventului prin
coloan se realizeaz cu ajutorul unor pompe de mare
presiune, motiv pentru care tehnica se mai numete
cromatografie de mare presiune. n funcie de presiunea cu
care este mpins faza mobil n coloan, metodele
cromatografice pot fi clasificate n cromatografie la
presiune redus (sub 5 bari), la presiune moderat sau medie (5-50 bari) i la presiune nalt (peste 50 bari). Curgerea
solventului sub presiune are o serie de avantaje: viteza de
curgere este rapid i (aproape) perfect controlat, ceea ce
duce la reducerea dispersiei moleculare i la o (aproape)
VASILE OSTAFE
detectarea i cuantificarea
analiilor eluai se face
continuu i automat
timpuri multiple de detectoare
automatizarea ntregului
proces cromatografic se face
cu uurin
timp de analiz redus, tipic

sub 20 minute
Pre ridicat al aparaturii,

chimicalelor i deci a
analizelor
perfect reproductibilitate a separrilor cromatografice1.

Detectarea i cuantificarea substanelor separate se
realizeaz n mod continuu cu ajutorul detectoarelor de
diferite tipuri i a integratoarelor-nregistratoare ce fac
parte component din sistemele cromatografice HPLC.
Aceste sisteme sunt complet automatizate: probele pot fi
injectate automat cu ajutorul injectoarelor automate,
operaiile executate de sistemul de pompe, detectoare i
integratoare pot fi, de asemenea, controlate de ctre un
calculator, iar regsirea substanelor separate se poate
realiza cantitativ cu ajutorul colectoarelor de fraciuni.
Intervenia manual a operatorului este minim, n cel mai
ru caz, reducndu-se la efectuarea injectrii probei n
coloan, el putnd face alte operaii n timp ce sistemul
cromatografic lucreaz. Operaiile fiind automatizate,
performanele cromatografice sunt excepional de ridicate,
dac le comparm cu metodele de LC clasice, motiv pentru
care metodele cromatografice moderne se numesc de nalt
performan. n plus, ridicarea la scar, adic trecerea de la
cromatografia analitic la cea semi-preparativ i
preparativ se realizeaz foarte uor. Datorit curgerii
solventului sub presiune prin stratul cromatografic, timpul
de cromatografiere a fost redus, majoritatea a separrilor
realizndu-se n mai puin de 20 minute. Pentru realizarea
diferitelor separri cromatografice exist o multitudine de
suporturi cromatografice care fac posibile separri de mare
finee - cum ar fi izomerii optici. Marele "dezavantaj" al
LC moderne (pe care de acum ncolo o vom numi simplu
HPLC) const n preurile foarte ridicate al aparaturii, care
trebuie s fie de cea mai mare precizie, al materialului
cromatografic, care trebuie s fie de cea mai bun calitate,
al solvenilor de eluie, care trebuie s fie ce cea mai mare
puritate, motiv pentru care iniialele HPLC pot s nsemne
i High Price Liquid Chromatography.
Ettre, L.S., LC Mag., 1 (1983) 108
17
T
A H
RIIA
OR
TEEO
HP
PLLC
C
FORE IMPLICATE
N RETENIA
SOLUILOR
PARAMETRI
CROMATOGRAFICI
Retenia unui amestec de solui pe o faz staionar are loc

ca urmare a conlucrrii mai multor fore, printre care
amintim1:
Fore Van der Waals ;
Interacii dipol-dipol;
Legturi de hidrogen;
Interacii ionice.
Principalii parametri cromatografici rezultai n urma
analizei cromatografice sunt prezentai n Figura 3a1,2:
to timpul scurs de la injectarea probei n sistem pn ce
frontul de solvent sau orice solut total nereinut de
coloan a ajuns n celula de detecie;
V0 volumul mort (void volume)(Fig. 3a) reprezint suma volumelor interstiiale dintre particulele fazei staionare i a volumelor accesibile fazei mobile din
porii particulelor fazei staionare (n cromatografia de
cernere molecular3 V0 reprezint doar volumul de
solvent din afara perlelor de gel - Fig. 3b);
tR timpul de retenie al solutului de interes;
2
Ettre, L.S., LC Mag., 1 (1983) 108
3
Fischer, L.,"Gel Filtration Ghromatography", Amsterdam, Elsevier, 1980
VASILE OSTAFE
VR volumul de retenie al solutului de interes (volumul

de faz mobil colectat de la momentul injectrii
probei pn n momentul n care solutul de interes
iese din celula de detecie); VR i tR pot fi
interconvertii prin relaia:
VR = tRF,
Fig. 3a. Un profil cromatografic tipic, prezentnd

diferii parametri cromatografici.
unde F este viteza volumetric a fazei mobile,

exprimat n mLmin1 (VR este mai mare dect Vx cu
excepia cromatografiei de excludere molecular,
unde volumul de retenie este egal cu volumul la care
are acces solutul de interes - Fig. 3b).
K este coeficientul de partiie sau de distribuie a
solutului ntre faza staionar i faza mobil i este
legat de volumul de retenie prin relaia:
VR = V0 +KVS
Fig. 3b. Variabile folosite

pentru a caracteriza patul
cromatografic: Vo - volumul de solvent din afara
perlelor de gel; Vx - volumul fazei staionare (atunci
se mai noteaz cu Vs) sau
volumul la care are acces
analitul; Vt - volumul total
al coloanei.
(unde VS este volumul fazei staionare. n cromatografia de

cernere molecular, sau gel-cromatografie, se folosesc
adesea 2 coeficieni de partiie, diferena provenind din
modul de definiie a fazei staionare: daca ntreg gelul este
considerat faz staionar atunci Kaw = (VR-V0)/VX; dac
faza staionar este doar poriunea de faz mobil din
interiorul perlelor de gel, dar fr volumul ocupat de pereii
perlelor de gel, atunci Kd = (VR - V0)/VS, dei n al doilea
caz msurarea lui VS este dificil)
19
TEORIA H P L
C
Factorul de
capacitate (sau
factorul de retenie)
k
Ec. 1
t
t t
V V0
k' s R 0 R
t0
t0
V0
Ec. 2.
K k'
Vm
C
i K s
Vs
Cm
Factorul de
separare
k B'
(Ec. 3)
k A'
CARACTERIZAREA
DISPERSIEI BENZILOR
CROMATOGRAFICE
Fig. 4. O band cromatografic Gaussian i

cteva mrimi corelate.
20
n procesul de trecere prin coloan moleculele de solut

fluctueaz continuu ntre faza mobil i cea staionar. Prin
urmare, tR va cuprinde timpul pe care moleculele de solut l
petrec n faza mobil (t0) i cel petrecut n faza staionar
(ts): tR = t0 + ts.
Factorul de capacitate (sau de retenie) k, care reprezint
o modalitate mult utilizat n HPLC de a exprima gradul de
retenie al solutului de interes n faza staionar, este dat de
ecuaia 1.
Factorul de capacitate este corelat cu coeficientul de
distribuie prin ecuaia 2, unde Cs i Cm sunt concentraiile
solutului n fazele staionar i respectiv mobil.
Raportul factorilor de capacitate a doi solui A i B se
numete factor de separare (denumit i selectivitate),
conform ecuaiei 3, unde kB > kA
n urma migrrii prin
coloan, zonele individuale ale soluilor sufer dispersii sau lrgiri
ale benzilor, aa cum se
prezint n figura 4, care reprezint un pisc
cromatografic tipic, de
form Gaussian.
VASILE OSTAFE
NUMRUL DE TALERE
TEORETICE
tR
Ec. 4.
Deviaia standard a benzii Gaussiene (Wb = 4) poate fi

calculat cu ecuaia 4., unde N reprezint numrul de talere
teoretice.
Wb este lrgimea benzii la baza ei, iar Wh este lrgimea
benzii la jumtatea nlimii piscului cromatografic:
t
N R
Wb = 2Wh = 4
Ec. 5.
Eficiena coloanei cromatografice depinde de N.

4tR
Wb
t
N 5,54 R
Wh
Ec. 6.
Ec. 7.
t h
N 2 R Ec. 8.
A
2
Noiunile de talere teoretice i teoria talerelor au

fost introduse de Martin
i Synge [2]. Teoria lor
vedea coloana cromatografic ca fiind divizat
ntr-un numr mare de
segmente, numite talere
teoretice similare cu
treptele individuale dintro separarea n contracurent. n fiecare din aceste
1
S considerm coloana mprit n multe talere teoretice

n fiecare taler teoretic moleculele de solut vor atinge un
echilibru de distribuie ntre faza mobil i cea staionar.
N este att o msur a eficienei coloanei ct i a lrgimii
(dispersiei) benzilor cromatografice1, conform cu ecuaiile
5, 6 i 7.
Determinarea valorilor dispersiei la baza sau la jumtatea
nlimii piscurilor cromatografice poate fi o sarcin destul
de dificil. Majoritatea integratoarelor sau a softurilor
dedicate nu calculeaz automat aceste valori. n schimb
integratoarele i softurile cromatografice calculeaz aria i
nlimea piscurilor cromatografice, motiv pentru care
numrul de talere teoretice poate fi calculat cu mai mare
uurin cu ecuaia 8, n care h este nlimea piscului
cromatografic iar A este aria sa (ambele exprimate n
unitile integratorului sau softului respectiv).
Syed, S.E.H. High Performance Liquid Chromatographic Assays. In: Enzyme Assay. A Practical
Approach, edited by Eisenthal, R. and Danson, M.J.Oxford New York Tokyo:Oxford
University Press, 1991,p. 123-166
21
TEORIA H P L
C
talere ipotetice se presupunea a avea loc o echilibrare complet a partiiei
solutului ntre faza staionar i cea mobil. Aceste
echilibrri se presupuneau a avea loc secvenial
de la primul la ultimul taler teoretic al coloanei.
Cu ct numrul de talere
teoretice este mai mare
cu att separarea este mai
eficient. Din acest motiv
N este o abreviere pentru
eficiena separrii.
Cu ct valoarea lui N este mai mare cu att separarea va fi

mai bun. N crete:
cu ct particulele cromatografice ale fazei staionare
sunt mai mici
cu ct viteza fazei mobile prin coloan este mai mic;
cu ct temperatura fazei mobile este mai ridicat:
cu ct viscozitatea fazei mobile este mai sczut;
cu ct mpachetarea fazei mobile este mai bun;
cu ct moleculele de solut au mase moleculare mai mici.
NLIMEA
ECHIVALENT A UNUI
TALER TEORETIC
N este direct proporional cu lungimea coloanei (L). O alt

exprimare a eficienei unei coloane este nlimea
echivalent a unui taler teoretic H, determinat conform
ecuaiei 9. Este evident c H trebuie s aib valori ct mai
mici pentru ca o coloan s fie eficient. Cei mai importani
factori de care depinde H sunt:
dispersia benzilor cromatografice,
difuzia Eddy,
difuzia longitudinal,
variaiile n transferul de mas
volumul mort (void) excesiv al sistemului
cromatografic.
(factori ce nu vor fi discutai n prezentul capitol, dar ce pot
fi studiai n lucrrile prezentate ca bibliografie).
L
N
CUM
Ec. 9.
SE
DETERMIN
EXPERIMENTAL N?
22
Calitatea coloanei ca o msur a numrului de talere

teoretice N se determin experimental astfel:
VASILE OSTAFE
proba const dintr-o substan cu mas molecular mic

(de exemplu toluen sau naftalin)
viteza volumetric 1 mLmin1 pentru coloane cu
diametrul de 0,4 0,5 cm (pentru coloane cu
diametrul mai mic sau mai mare se va folosi o vitez
volumetric proporional cu ptratul diametrului
coloanei)
viscozitatea fazei mobile ()v s fie mai mic de 1 cP
(de exemplu faza mobil poate fi amestec acetonitril
ap, pentru temperaturi >20C.
temperatura de lucru <40C
echipament cromatografic cu volum mort minim.
23
TEORIA H P L
C
Valori reprezentative pentru N sunt prezentate n tabelul 1.
Dac o coloan nou are valori N mai mici de dou treimi
din aceste valori ideale, ea trebuie nlocuit cu o coloan
mai bun.
Tabelul 1.
Numrul de talere teoretice N pentru o coloan
HPLC bine mpachetat,
n condiii cromatografice
ideale1
Diametrul
particulei
m)
REZOLUIA
Optimizarea procesului cromatografic implic realizarea

unui compromis ntre obinerea unei separri maxime ntre
doi solui ce elueaz consecutiv (fie ei A i B) i obinerea
unei dispersii minime a benzilor lor cromatografices2.
Raportul celor dou efecte este exprimat prin rezoluie Rs,
conform ecuaiei 10.
Ec.10.
10
10
5
5
5
3
3
3
Lungimea
coloanei
(cm)
15
25
10
15
25
5
10
15
Numrul de
talere teoretice
N103
67
8 10
79
10 12
17 20
67
12 14
17 20
24
Rs
VASILE OSTAFE
2(t RA t RB )
WbA WbB
Ec. 11.
Rs
1
4
k'
1 k'
Rezoluia poate fi exprimat i n termenii cromatografici

fundamentali: selectivitatea ( =kA/kB) , numrul de
talere teoretice N i factorul de capacitate k, conform
ecuaiei 11. Pentru a obine cea mai bun rezoluie, aceti
trei factori pot fi optimizai separat. Factorul de
selectivitate pare a fi cel mai important factor al rezoluiei
i el poate fi modificat prin schimbarea1:
temperaturii,
a compoziiei fazei mobile,
a fazei staionare.
Schimbarea compoziiei fazei staionare este opiunea cea
mai des folosit pentru a mbunti rezoluia.
25
M
MEELLEE S
SM
RIIII
R
NIIS
R
AN
AR
CA
MEEC
SEEPPA
TIPURI DE FAZE
STAIONARE
Fazele staionare pot fi clasificate n funcie

mecanismele prin care ele separ moleculele1,2:
de
faze de partiie
faze de adsorbie
faze schimbtoare de ioni
faze de excludere molecular
Cele mai populare materiale cromatografice actuale sunt

fazele inversate, unde separarea este realizat prin
mecanisme de partiie (i eventual adsorbii pe gruprile
silanol neprotejate). In cromatografia n faz inversat, faza
staionar este nepolar (sau mai puin polar dect faza
mobil) i soluii sunt reinui pn ce elueaz cu un volum
suficient de faz mobil3.
Materialele pentru faza inversat pot fi folosite la
AVANTAJE ALE
majoritatea separrilor, au un timp de via lung,
MATERIALELOR PENTRU
reproductibiliti foarte bune, timpi de echilibrare redui,
FAZA INVERSAT
stabilitate mecanic mare i ordinea i timpul de eluie al
soluilor pot fi predictibile.
MATERIALE PENTRU FA- Materialele schimbtoare de ioni comparate cu cele
utilizate n cromatografia n faz inversat au timp de via
ZELE SCHIMBTOARE DE
2
Ettre, L.S., LC Mag., 1 (1983) 108
3
Fallon, A., Booth, R.F.G., Bell, L.D., Applications of HPLC in Biochemistry, Amsterdam, Elsevier
Science Publishers B.V. (Biomedical Division), 1990
IONI
GELURI
DE EXCLUDERE
MOLECULAR
MATERIALE
PENTRU
CROMATOGRAFIA
DE
ABSORBIE
AVANTAJELE
COLOANELOR CU DIAMETRU INTERN MIC
(NARROW-BORE)
economie de solvent (de
pn la 60%)
sensibilitate mrit (de

4 - 6 or i)
MECANISMELE SEPARARII
mai scurt, stabilitate mecanic mai mic i necesit timpi

de echilibrare mai lungi. Aceste coloane au aplicabiliti
reduse1.
Cromatografia de excludere molecular este folosit pentru
curarea probelor i pentru fracionare2.
Cromatografia de absorbie este folosit destul de des
pentru pregtirea i curarea probelor. De exemplu,
hidrocarburile aromatice policiclice din aer sunt colectate
pe adsorbani din crbune activ., flavonoidele din plante pot
fi curate de contaminani, fracionate i mbogite pe
geluri de alumin, etc.3
Discuiile referitoare la materialele cromatografice folosite
n HPLC trebuie s ating i problema diametrului intern al
coloanei. Coloanele standard HPLC din zilele noastre au un
diametru intern de 4 5 mm, n timp ce coloanele cu
diametru intern mic (aa numitele coloane narrow-bore) au
un diametru intern de aproximativ 2 mm. Cnd sunt
mpachetate cu aceleai materiale cromatografice ca i
coloanele standard, coloanele narrow-bore pot obine
aceeai putere de separare cu mai puin solvent, deoarece
solutul de interes poate fi eluat cu o vitez volumetric mai
redus (<0,5 mLmin1) dect cea utilizat n cazul
coloanelor standard (13 mLmin1). n plus, coloanele
narrow-bore sunt de 4 6 ori mai sensibile, folosind acelai
volum de injecie utilizat la coloanele standard3.
Smith, F.C.J. Chang, R.C., The Practice of Ion Chromatography, New York:Wiley, 1984
Yau, W.W., Kirkland, J.J., Bly, D.D., Modern Size-exclusion Liquid Chromatography, New
York:Wiley-Interscience, 1979
3
Steiner, F., Applications of Narrow-bore Columns in HPLC, Waldbronn Analytical Devision, HP,
Germany:Hewlett Packard (12-5091-2736E), 1991
2
26
P
AP
REEA
R
OR
TIIR
T
G
BEELLO
OB
PR
REEG
PR
RO
ETAPELE
Separarea analiilor de constituenii matricei probei este

sarcin important de care depinde n cea mai mare msur
succesul separrii. Prepararea probelor pentru HPLC
PROBELOR
implic urmtoarele etape1:
Colectarea i stocarea probelor
Curarea i mbogirea probelor (curarea se
refer la eliminarea ct mai multor contaminani)
presupune folosirea urmtoarelor operaii
6) Extracii n faz solid
1) Omogenizri
7) Extracii n bi ultrasonice
2) Centrifugri
8) Extracii cu fluide supercritice
3) Precipitri
9) Concentrri
4) Hidrolizri
5) Extracii lichid / lichid
Fracionarea (i mbogirea) probelor presupune
utilizarea de
Coloane de protecie,
Cromatografie multidimensional,
Cromatografie de gel-permeaie,
Cuplarea HPLC cu GC
PREGTIRII
PREGTIREA PROBELOR
Derivatizarea chimic a probelor presupune

derivatizarea probelor pre-coloan (nainte de
injectare), operaie ce se poate realiza i automat (dup
injectare). Este posibil i derivatizarea post-coloan.
AUTOMATIZAREA
PROCESULUI DE
PREPARARE A PROBELOR
Extracia manual, curirea i concentrarea probelor

nainte de injectare sunt operaii consumatoare de timp i
necesit operatori specializai. Din aceast cauz operaiile
legate de pregtirea probelor trebuie automatizate ct de
mult posibil. Actualmente exist sisteme HPLC ce
realizeaz integral operaiile legate de prepararea probelor.
Extracia cu lichide supercritice (SFE) i extracia cu faze
solde (SPE) au fost interfaate cu sistemele HPLC.
Echipamentele automate pentru pregtirea probelor pentru
HPLC cuprind1:
Valvele sunt folosite pentru a schimba coloanele ntre
ele, pentru a permite cuplarea direct a sistemului
SPE cu HPLC
Interfee directe cu SFE i SPE
Derivatizare pre-coloan
PROBE SOLIDE
Probele solide, cum ar fi solurile, ciocolata, produsele de

carne, trebuie mai nti omogenizate, dup care sunt
supuse operaiilor de extracie2,3.
Gratzfeld-Husgen, A., Schuster, R., HPLC for Environmental Analysis, Hewlett Packard, 1994
3
Gratzfeld-Husgen, A., Schuster, R., HPLC for Food Analysis, Hewlett Packard, 1996
2
28
VASILE OSTAFE
EXTRACIE CU SOXHLET
operaia se execut
nainte de injectare (offline)
timp lung de extracie
consum
mare
de
solveni
exist metode puse la

punct pentru o mare
varietate de clase de
compui
EXTRACIA CU LICHIDE
N BI ULTRASONICE
consum
redus
solveni
DISTILAREA CU VAPORI
de
Cu un lichid de extracie bine ales, echipamentul Soxhlet

poate extrage componentele nevolatile ct i unele
componente mai puin polare2. Extraciile cu aparatul
Soxhlet sunt lente (12 24 h), dar procesul nu necesit
prezena operatorului. Pentru a reduce timpul de extracie
probele trebuie foarte fin mrunite. Deoarece n vasul cu
solventul la fierbere se acumuleaz analitul extras, acesta
trebuie s fie stabil la punctul de fierbere al solventului
folosit la extracie. Dezvoltarea metodei implic gsirea
unui solvent volatil (cu punct de fierbere sub 100 C) n
care analitul s aib o mare solubilitate, iar contaminanii o
foarte min solubilitate. Fiind cea mai veche form de
extracie eficient, extracia cu Soxhlet este considerat ca
extracie de referin pentru metodele mai noi. Exist
variante micro i parial automatizate ct i variante mixte
n care extracia cu aparatul Soxhlet este combinat cu alte
metode.
Extracia cu lichide n bi ultrasonice este o metod foarte
simpl de extracie pentru probele solide1. Selectivitatea
este asigurat de folosirea unor solveni adecvai. De
exemplu, metoda a fost folosit pentru extragerea
antioxidanilor i conservanilor alimentari din matrice cu
coninut redus de grsimi.
Distilarea cu vapori este folosit doar pentru extracia
29
extracii selective
timp lung de extracie
PREGTIREA PROBELOR
compuilor volatili din matrice solide. De exemplu,

pesticidele bifenilice i 2-fenilfenilfenolice pot fi extrase
din sucuri de fructe prin aceast tehnic1
EXTRACIE CU LICHIDE
SUPERCRITICE
Starea fizic a unei substane poate fi descris de o

(SFE - supercritical fluid diagram de faze care definete regiunile corespunztoare
extraction)
strilor solid, lichid i gazoas2. Punctele de pe curbele
diagramei definesc situaiile n care exist un echilibru ntre
dou dintre faze, n diagrama fazelor dioxidului de carbon,
capacitatea redus de
solvatare limiteaz aria linia dintre faza lichid i cea gazoas are o zon terminal,
de aplicabilitate
numit punctul critic, spre deosebire de linia dintre fazele
solid i lichid. Punctul critic este definit de temperatura
critic i presiunea critic. Deasupra punctului critic
consum
redus
de
regiunea supercritic gazul nu poate fi convertit in stare
solveni
timp redus de extracie
lichid prin modificarea presiunii. Un lichid supercritic se
procesul poate fi manifest ca un gaz n ce privete transferul de mas i ca
automatizat
un lichid n ce privete proprietile de solubilitate. Astzi
SFE este larg utilizat pentru extracia analiilor nepolari
sau puin polari din matrice solide.
PROBE LICHIDE
Pentru pregtirea probelor lichide exist o mare varietate de

metode, dar numai unele mai sunt astzi utilizate larg n
HPLC. De exemplu, distilarea este limitat la compuii
volatili, liofilizarea este limitat la purificarea probelor
biologice, etc.
EXTRACIA
LICHID LICHID
Extracia lichid lichid (ELL) este cea mai comun metod

de extracie folosit pentru probele lichide. Cuprinde
30
VASILE OSTAFE
necesit mari cantiti de
solveni organici toxici
dificil de automatizat
simpl
modificatori
(pH, sruri,
ionice)
selectivi
perechi
Tabelul 2.
Solveni pentru ELL
EXTRACIA N FAZ
SOLID
Avantaje SPE vs ELL

extracia analitului mai
complet
consum redus de
variante simple, cum ar fi utilizarea unui solvent

convenabil i a unei plnii de separare, ct i variante
sofisticate de extracie continu sau de distribuie n contracurent. ELL este util pentru separarea analiilor de
contaminani prin partiionarea probei ntre 2 faze lichide
nemiscibile. Una dintre faze este apoas, iar cealalt un
solvent organic. Compuii mai hidrofili vor prefera faza
apoas, n timp ce compuii mai hidrofobi vor prefera faza
organic. Analiii extrai n faza organic pot fi recuperai
prin evaporarea solventului, pe cnd cei extrai n faza
apoas pot fi injectai direct n coloana HPLC1.
Solveni apoi
Solveni
organici
nemiscibili cu apa
Apa pur
Soluii acide
Soluii bazice
Sruri (salting-out)
Ageni de complexare
(chelare, chirali, perechi-ionice, etc.)
Combinaii ale celor
de mai sus
Hidrocarburi alifatice
(hexan, izooctan, eter
de petrol, etc)
Eteri
Clorur de metilen
Cloroform
Acetat de etil sau ali
esteri
Cetone alifatice superioare (>C6)
Alcooli superiori
Toluen, xileni
Solveni
organici
miscibili cu apa
(neutilizabili pt. ELL)
Alcooli inferiori
Cetone inferioare
Acizi carboxilici inferiori
Acetonitril
Dimetil sulfoxid
Dioxan
Extracia n faz solid (Solid Phase Extraction - SPE) este

foarte potrivit pentru analiza probelor de ap sau a
diferitelor tipuri de buturi1. Proba este sucionat peste un
cartu pre-condiionat sau un disc umplut cu adsorbani
corespunztori. Materialul adsorbant reine analiii ce pot fi
31
solveni
recuperarea uoar a
analitului
automatizare uoar
PREGTIREA PROBELOR
eluai cu solveni organici. Exist o mare varietate de materiale adsorbante ceea ce permite utilizarea tehnicii la
aproape toate tipurile de probe. SPE poate fi utilizat i ca
tehnic de separare, deoarece proba iniial poate fi divizat
i trecut pe mai multe tipuri de adsorbani. Sistemele
HPLC noi permit executarea operaiilor SPE automat, online. Aplicaiile SPE n pregtirea probelor include:
ndeprtarea contaminanilor i a substanelor de distrug
coloanele analitice (substane ce se adsorb prea
puternic)
concentrarea analitului (solutului de interes)
eliminarea srurilor din prob
schimbarea solventului (sau a tamponului)
derivatizare in situ
pstrarea i transportul probelor.
Aplicarea SPE implic urmtoarele etape2:
condiionarea adsorbantului (implic o splare cu un
solvent tare (cu mare putere de eluare), de obicei cu
metanol sau acetonitril i are rolul de a ndeprta
impuritile i de a permite solvatarea adsorbantului)
aplicarea probei (proba este dizolvat ntr-un solvent
slab (cu putere de eluare mic), cel mai adesea apa,
eventual cu mici concentraii de solvent organic)
splarea adsorbantului de contaminani (se face cu
un solvent de trie intermediar, deci ap cu ceva mai
32
VASILE OSTAFE
mult solvent organic i are rolul de a elimina

contaminanii din prob dar de a pstra adsorbit
analitul)
recuperarea analitului (se face prin eluarea cu un mic
volum de solvent tare, de obicei metanol sau
acetonitril)
CROMATOGRAFIA DE
GEL-PERMEAIE
necesit mari cantiti de
solveni
foarte reproductibil
posibiliti bune
automatizare
CROMATOGRAFIA DE
LICHIDE
MULTIDIMENSIONAL
TEHNICI HPLC CG
CUPLATE
de
Cromatografia de gel-permeaie (GPC), cunoscut i sub

numele de cromatografie de excludere molecular, a
devenit o metod larg utilizat pentru izolarea compuilor
cu mas molecular mic (cum ar fi pesticidele) din probele
ce conin compui cu mase moleculare mari, cum ar fi
uleiurile i grsimile. Separarea se bazeaz pe diferenele
de dimensiuni, compuii cu mase moleculare mai mari sunt
reinui mai puin dect cei cu mase moleculare mai mici1,2.
Cromatografia de lichide multidimensional (MDC)
incorporeaz cel puin 2 coloane analitice de separare,
interconectate printr-o valv, care prin modificarea poziiei
permite transferarea fraciunilor eluate dintr-o coloan n
cealalt. Tehnica poate fi utilizat pentru curirea probelor
de contaminani, dar i pentru mbogirea n analit3.
Utilizarea tehnicilor HPLC GC cuplate pare a fi opiunea
ideal, ce ar trebui s rezolve toate tipurile de analize.
Sistemul HPLC fracioneaz proba, o cur de
Snyder, L.R., Glajch, J.L., Kirkland, J.J., Practical HPLC Method Development, New York:John
2
Yau, W.W., Kirkland, J.J., Bly, D.D., Modern Size-exclusion Liquid Chromatography, New
York:Wiley-Interscience, 1979
3
Gratzfeld-Husgen, A., Schuster, R. HPLC for Food Analysis, Hewlett Packard, 1996
33
PREGTIREA PROBELOR
contaminani i o mbogete n analit, n timp de GC

separ eficient soluii de interes iar un detector
spectrometru de mas i identific cu mare acuratee.
Dificultile constau n posibilitile de interfaare a celor 2
sisteme cromatografice, deoarece din sistemul HPLC iese
n mod continuu faza mobil cu o vitez de 1 - 2 mLmin1,
iar n GC se injecteaz doar 10 L1.
PROBE GAZOASE
1
2
Compuii organici din aer pot fi mprii n trei grupe2:

Gazele (n stare natural), sunt, de obicei, analizate
prin GC.
Substanele organice ce au o presiune de vapori
suficient pentru a sublima sau a se volatiliza, sunt
colectate prin sucionarea unui volum bine determinat
de aer ntr-un tub umplut cu un material adsorbant
potrivit. Compuii adsorbii pot fi eluai cu solveni
organici, concentrai i injectai n sistemul HPLC.
Substanele organice ce sunt ataate la particule din
aer, cum ar fi praful, sunt colectate prin filtrare,
precipitare electrostatic sau alte procedee, dup care
sunt izolate (extrase n solveni potrivii) i
concentrate.
Ettre, L.S., LC Mag., 1 (1983) 108

34
T
A P
N
DEE IIN
REE A
R N
AR
OR
CII D
TA
CT
NIIC
BEELLO
HN
OB
TEEH
NJJEEC
PR
RO
S
ULL H
MU
TEEM
ST
SIIS
HP
PLLC
C
PRINCIPIILE I
CARACTERISTICILE
UNUI BUN
DISPOZITIV DE
INTRODUCERE A
PROBELOR
Dup pregtirea probelor acestea pot fi injectate n coloana

HPLC. Determinarea cantitativ a analiilor impune un
control riguros al volumului probei injectate. Principalele
cerine pentru un dispozitiv de introducere a probelor n
coloana HPLC sunt1,2,3.
O bun precizie;
Efecte de memorare reduse (contaminarea cu material
de la injectarea anterioar);
Posibilitatea de a injecta probe vscoase;
Posibilitatea de a injecta volume variabile.
Automatizarea injectrii, eventual cu posibilitatea de
derivatizare pre-coloan, nclzire, rcire, amestecare
soluii, etc. sunt opiuni dar i cerine ale sistemelor
HPLC actuale.
2
Ettre, L.S., LC Mag., 1 (1983) 108
3
Fig. 5.
Valva tip Rheodyne, cu 6
porturi. n poziia din stnga
(notat load) are loc
ncrcarea probei n bucla
(spirala) calibrat. Excesul
de prob este eliminat. Prim
modificarea poziiei pe injectare (notat inject), faza
mobil intr n bucla calibrat i mpinge proba
coninut n ea n coloana
analitic.
INJECTAREA PROBELOR
Sistemele de injecie sunt, cel mai adesea, bazate pe valve

cu ase porturi1, aa cum se prezint n figura 5.
INJECTOARE MANUALE
Injectoarele manuale sunt nc suficient de mult folosite

deoarece sunt ieftine i nu necesit experien din partea
operatorului. Atenie deosebit trebuie acordat splrii
exhaustive a seringii nainte de a se efectua injectarea unei
noi probe.
INJECTOARE AUTOMATE
Principial injectoarele automate utilizeaz acelai principiu

al valvei cu 6 porturi. Sisteme pneumatice sau electrice
permit schimbarea poziiei valvei de pe load pe inject ct i
injectarea de volume foarte mici (0,1 1,5 L). Exist
sisteme sofisticate de injectoare automate, care pot controla
aspirarea probei din stratul inferior sau superior al unei
probe formate din 2 faze nemiscibile, sau care realizeaz
reproductibilitate foarte
bun
Syed, S.E.H., High Performance Liquid Chromatographic Assays. In: Enzyme Assay. A Practical
Approach, edited by Eisenthal, R. and Danson, M.J.Oxford New York Tokyo, Oxford
University Press, 1991,p. 123-166.
36
VASILE OSTAFE
retragerea acului cu o anumit vitez, mereu aceeai i fac

injecia atunci cnd pistoanele pompei sunt n aceeai
poziie, mereu aceeai, pentru mbuntirea reproductibiliti1,2,3.
AUTOSAMPLERE
(INJECTOARE AUTOMATE
DE PROBE)
Autosamplerele permit, pe lng injectarea automat a

probelor, realizarea de derivatizri pre-coloan, diluarea
volumelor mici de probe, adugarea de standarde interne la
probe, realizarea automat de curbe de etalonare, etc.4,5.
2
Ettre, L.S., LC Mag., 1 (1983) 108
3
Syed, S.E.H., High Performance Liquid Chromatographic Assays. In: Enzyme Assay. A Practical
Approach, edited by Eisenthal, R. and Danson, M.J.Oxford New York Tokyo:Oxford
University Press, 1991, p. 123-166
4
Kraak, J.C. Sample Introduction Systems. In: Instrumentation for High-Performance Liquid
Chromatography, ed. Huber, J.F.K., Elsevier Scientific Publishing Company, Amsterdam,
1978.
5
37
P
DEE F
II
PEELLEE D
MP
BIILLEE
PO
OM
FA
A ZZEE M
MO
OB
D
REELLEE
AR
OA
AZZO
GA
DEEG
CARACTERISTICILE UNEI
POMPE HPLC
Pompa este piesa critic a echipamentului HPLC. Reproductibilitatea rezultatelor, posibilitatea identificrii
piscurilor cromatografice i a cuantificrii acestora depinde
n cea mai mare msur de performanele pompei1. O
pomp HPLC modern trebuie:
S nu aib pulsuri de presiune
S aib o vitez volumetric foarte constant, indiferent
de compoziia fazei mobile
Posibilitatea de a pompa volume variabile
S aib un volum mort foarte mic
S aib limitator de presiune maxim
S permit pomparea i amestecare cu mare precizie a cel
puin 2 lichide, pentru formarea de gradieni.
Huber, J.F.K., The Chromatographic Apparatus from the Viewpoint of System Theory. In:
Instrumentation for High-Performance Liquid Chromatography, ed. Huber, J.F.K., Elsevier
Scientific Publishing Company, Amsterdam, 1978, p. 1-9
POMPAREA
VASILE OSTAFE
DE VOLUME
VARIABILE
De obicei, pompele ce realizeaz gradieni de joas

presiune pot pompa lichidele cu o vitez volumetric de 0,2
10 mLmin1, pe cnd pompele ce realizeaz gradiente la
presiune ridicat pompeaz lichidele cu o vitez
volumetric de 0,05 5 mLmin-1, utilizate i pentru
coloanele narrow-bore1,2.
ELUAREA CU
GRADIENI
Unele probe complexe conin mai muli solui de interes,

care trebuie separai ntr-o singur cromatografiere. Dac
eluarea
se face fr modificarea compoziiei fazei mobile
crete rezoluia
scade timpul total de spunem c eluarea este izocratic. Schimbarea compoziiei
analiz
fazei mobile pe parcursul elurii (eluarea cu gradieni)
este o tehnic larg folosit n HPLC n scopul mbuntirii
separrii acestor probe complexe. Tehnica este absolut
obligatorie n cromatografia de schimb ionic i foarte mult
utilizat n cromatografie n faz inversat. n acest din
urm caz, tria solventului crete pe parcursul elurii.
Aceasta duce la creterea rezoluiei, fr a se mri timpii de
retenie (i deci fr a crete dispersia benzilor
cromatografice). Timpul total de analiz scade n urma
utilizrii elurii cu gradieni.
FORMAREA DE
Dac amestecarea solvenilor are loc la presiune ridicat,
GRADIENI LA PRESIUNE
deci dup ieirea solvenilor din pompe, nseamn c
RIDICAT
sistemul HPLC trebuie s conin cel puin 2 pompe,
creeaz gradieni
fiecare funcionnd izocratic, cu unul din cei 2 solveni.
cu pant mare
Sistemul are avantajul c poate forma gradieni foarte
1
2
Martin, M., Guiochon, G., Pump Systems. In: Instrumentation for High-Performance Liquid
Chromatography, ed. Huber, J.F.K., Elsevier, Amsterdam, 1978, p. 10-40
39
pre ridicat
POMPE H P L C
exaci, cu pant mare i permite schimbarea rapid a

solvenilor (de la 100% A la 100% B) fr ca degazarea
solvenilor s fie absolut necesar. Dezavantajul principal
const n preul de cost (trebuie cumprate 2 pompe), dar i
n faptul c sistemul ocup mai mult spaiu n laborator1.
FORMAREA DE
Cu o singur pomp, dar cu ajutorul unor valve comandate

de un microprocesor, se pot crea gradieni la presiune
redus. Pompa va trage un timp definit de microprocesor
ieftin,
poate
din diferitele lichide n funcie de valva care este deschis.
amesteca mai mult de
Prin urmare acest sistem, dei mai ieftin, creeaz un
2 solveni
gradient n trepte, acurateea lui depinznd n mare msur
necesit degazare
de programul de control al valvelor i de design-ul
sistemului de amestecare a solvenilor. n plus, degazarea
solvenilor este absolut necesar. Marele avantaj al acestui
sistem este faptul c, n funcie de numrul de valve, poate
amesteca mai mult de 2 solveni2.
REDUS
DESIGN-UL
POMPELOR
Toate tipurile de analize HPLC depind n primul rnd de

performanele pompelor. Dei exist multe tipuri de pompe,
unele nu s-au impus n decursul timpului (pompele
pneumatice), iar altele, dei cu excelente caracteristici,
fiind prea scumpe, au o rspndire limitat3.
Cele mai des ntlnite tipuri de pompe sunt cele cu 2
Huber, J.F.K., ed. Instrumentation for High-Performance Liquid Chromatography, Elsevier

Amsterdam, 1978.
2
3
40
VASILE OSTAFE
POMPE CU 2 PISTOANE,
CU FORMARE DE
GRADIENI LA JOAS
PRESIUNE
Fig. 6.
Design-ul unei pompe cu 2
pistoane n serie, cu curs n
contratimp.
PERFORMANE
Precizie realizare vitez
volumetric: <0,3%
Domeniu 0,29,9 Lmin-1
Volum ntrziere n formare gradient: 0,8-1,1 mL
Puls de presiune <2%
Precizie n realizarea compoziiei gradientului 0,2%
pistoane n serie, cu curs n contratimp (figura 6.). Faza

mobil intr n prima camer a pompei prin intermediul
unei valve de intrare comandat electric. Utilizarea acestui
tip de valve elimin problemele de contaminare sau blocare
ntlnite la valvele cu bile. Faza mobil este mpins ntr-un
damper (ce are rolul de a reduce pulsurile de presiune,
create n momentele cnd pistoanele i schimb sensul) cu
volum mic, ce are montat i un traductor de presiune, dup
care ptrunde n cea de-a doua camer a pompei. Cele dou
pistoane acioneaz n contratimp, astfel c atunci cnd o
camer se umple cu faz mobil, cealalt se golete.
Volumul de lichid mpins la fiecare curs a pistoanelor
poate fi redus pentru a optimiza viteza volumetric i
precizia n realizarea debitului, cerine necesare pentru a
asigura o bun reproductibilitate a timpilor de retenie. Faza
mobil este mpins din ce-a de-a doua camer n sistemul
de injecie. Acest sistem poate crea gradiente de joas
presiune, cu ajutorul valvelor de proporionare ce fac
legtura ntre rezervoarele de faz mobil i prima valv de
intrare n pomp. Majoritatea sistemelor conin 3 sau 4
astfel de valve (ajungndu-se pn la 8 la modele mai pretenioase). Valvele sunt sincronizate cu micarea
pistoanelor i amestec solvenii pe parcursul cursei de
umplere a primei camere a pompei. n acest fel nu este
necesar montarea unui mixer, pstrnd volumul de
ntrziere al pompei la valori mai mici de 0,9 mL.
Comparate cu pompele convenionale multi-solvent cu volum fix al camerei de pompare, pompele cu volum variabil
41
POMPE
CU DISPOZITIVE
VOLUMETRICE
PERFORMANE
Precizie realizare vitez volumetric: <0,2%
Reproductibilitate <2%
Domeniu
Var. (a) 0,52,5 Lmin-1
Var. (b) 0,052,5 Lmin-1
Precizie n realizarea compoziiei gradientului
Varianta (a) 0,25%
1
2
POMPE H P L C
al camerei de pompare genereaz gradieni foarte precii.

Modelele mai noi au posibilitate de degazare on-line a
solvenilor1,2 [17, 20].
Mai multe firme specializate n aparatura HPLC
comercializeaz pompe ce formeaz gradieni la joas
presiune cu dispozitive volumetrice de msurare urmate de
pompe de mare presiune. Aceste pompe sunt att mecanic
ct i funcional mai complicate dect pompele cu 2
pistoane n serie (fig. 7.).
Fiecare solvent are un element de msurare propriu, o
micropomp cu 2 pistoane n serie acionate prin
intermediul unui motor electric. Fiecare piston se mic n
trepte de 0,7 m pompnd volume de 7 nL, sistemul fiind
ideal pentru coloanele narrow-bore. Solventul este pompat
ntr-un dispozitiv volumetric unde este stocat momentan
pn ce pompa de mare presiune ajunge n poziia de
aspiraie. n dispozitivul volumetric presiunea este mai
mic de 6 atm. Precizia realizrii vitezei volumetrice a
fazei mobile prin coloan este asigurat de furnizarea
constant a solvenilor din dispozitivele volumetrice n
pompa de mare presiune. Cnd pompa de mare presiune
ajunge n poziia de aspiraie, solvenii din dispozitivele
volumetrice sunt aspirai n capul pompei, presnd
diafragma acesteia. Cnd pompa trece pe poziia de
pompare, foreaz diafragma, pompnd solventul nspre
coloan. Un dispozitiv de atenuare a ocurilor de presiune
Chromatography, edited by Huber, J.F.K., Amsterdam - Oxford - New York, Elsevier
Scientific Publishing Company, 1978, p. 1-9
42
Varianta (b) 0,15%
VASILE OSTAFE
previne apariia variaiilor vitezei volumetrice. Sistemul

poate forma gradieni n dou maniere:
(a) Solvenii din rezervoare diferite sunt aspirai ntr-un
singur dispozitiv volumetric prin intermediul unor
valve de proporionare.
(b) Fiecare solvent este conectat separat la cte un
dispozitiv volumetric, care sunt la rndul lor conectate
prin intermediul unor valve de proporionare la un
dispozitiv de mixare.
Dei primul sistem este mai economic, cel de-al doilea este
mai exact, permind realizarea de gradieni precii la
concentraii limit ale unuia dintre solveni (de exemplu,
crearea unui gradient de la 1 la 99% B la viteza volumetric
F = 0,1 mLmin-1, pe un interval de 3 minute, situaie
ntlnit destul de des n cazul coloanelor narrow-bore).
Filtre speciale pot fi montate n compartimentul de joas
presiune pentru a preveni contaminarea pompei i a
coloanei cu alge, care se tie c pot crete pe tampoanele
fosfat, dac aceste soluii sunt pstrate o perioad mai
lung de timp.
43
POMPE H P L C
Fig. 7.
Pompa cu dispozitive volumetrice de formare a gradienilor la presiune redus.
Pompa se compune din (a)
dispozitive volumetrice de
msurare a solvenilor, (b)
dispozitiv de pompare la
presiune redus, (c) pomp
de mare presiune, (d)
atenuator de pulsuri de
presiune cu dispozitiv de
msurare a presiunii.
POMPE CE FORMEAZ
MARE
Majoritatea pompelor ce formeaz gradieni la presiuni

ridicate sunt formate din 2 pompe conectate n serie ntr-un
singur corp.
Figura 8.
Schema unei pompe ce
formeaz gradieni la
mare presiune.
PERFORMANE
Precizie realizare vitez volumetric: <0,3%
Domeniu 0,055,0 Lmin-1
Precizie n realizarea compoziiei gradientului 0,2%
44
Acest sistem asigur realizarea de conexiuni capilare

interne i externe foarte mici, reducnd astfel volumul mort
extracoloan la mai puin de L i volumul de ntrziere a
formrii gradientului la mai puin de 500 L. Ambele
DEGAZOARE
VASILE OSTAFE
pistoane ale ambelor pompe sunt controlate de

servomotoare comandate de microprocesoare1,2.
Degazarea este un proces de ndeprtare a gazelor dizolvate
n faza mobil, nainte de a fi pompat n coloan. Acest
proces previne formarea bulelor de gaz n faza mobil i
nltur inconvenientele legate de modificrile de volum i
de amestecare a gradienilor. Viteze volumetrice instabile
duc la modificri ai timpilor de retenie i la degradarea
performanelor deteciei. Principalele inconveniente legate
de dizolvarea gazelor (n special a oxigenului) n solveni
sunt1,2:
Apariia de piscuri fantom,
Creterea zgomotului,
Linii de baz instabile i la absorbane ridicate n
detectoarele UV,
Linii de baz ridicate la detectoarele electrochimice,
Modificarea
fluorescenei
la
detectoarele
de
fluorescen.
Degazarea se poate face off-line (nainte de pompare, cu
dispozitive adecvate) i on-line (direct n sistemul HPLC).
Cele mai comune metode sunt:
Purjarea solvenilor cu heliu (sau azot): se poate face
1
2
45
POMPE H P L C
relativ uor i are rolul de a satura solvenii cu acest

gaz i de a ndeprta oxigenul n spaiul nconjurtor.
Metoda este destul de scump i poate duce la
evaporarea solvenilor volatili. n plus, oxigenul este
mai bine purjat prin procedeele cu vacuum.
Degazarea ultrasonic este o metod off-line n care
toate tipurile de gaze sunt scoase din solvenii
respectivi prin supunerea solvenilor unui tratament
ntr-o baie ultrasonic. Principalul dezavantaj const
n faptul c pe msur ce solvenii stau n rezervoare,
redizolv gazele din atmosfer.
Degazarea cu microunde este tot o metod off-line,
similar cu degazarea ultrasonic, doar c solvenii
sunt supui unui tratament cu microunde (atenie
trebuie acordat vaselor ce conin solvenii i
temperaturii la care are loc tratamentul, pentru a se
evita fierberea i eventual aprinderea solvenilor)
Degazarea prin vacuum este o metod on-line, foarte
eficient, ce folosete membrane speciale ce permit
doar trecerea gazelor n compartimente aflate n vid
n raport cu fluxul de solvent. Metoda este ieftin,
permite degazarea continu i elimin oxigenul foarte
eficient.
1
2
46
D
REELLEE H
AR
OA
TO
CT
DEETTEEC
HP
P LL C
C
PARAMETRI
ANALITICI
1
2
Metoda de detecie depinde de caracteristicile fizicochimice ale substanelor ce trebuie analizate. Cea mai des
utilizat metod de detecie este detecia n UV la lungime
de und prestabilit. Posibilitatea de a determina spectrele
UV ale analiilor ajut la confirmarea prezenei n proba
analizat a soluilor de interes. Pentru probleme analitice
speciale, ce necesit sensibilitate ridicat se recomand
utilizarea detectoarelor de fluorescen. Dei detectoarele
electrochimice sunt suficient de sensibile i selective, ele
sunt utilizate mult mai rar, la fel ca si detectoarele de
conductivitate. Detectoarele indice de refracie dei virtual
pot detecta orice substan, au o mic sensibilitate i sunt
folosite n special cnd celelalte tipuri de detectoare nu pot
fi utilizate1,2.
Cei mai importani parametri analitici ai detectoarelor sunt:
Sensibilitatea (limita de detecie i limita de
cuantificare).
Selectivitatea
Linearitatea
Informaiile cantitative
Parriott, D. (ed.), A Practical Guide to HPLC Detection, San Diego:Academic Press, Inc. 1993
LIMITA DE DETECIE I
LIMITA DE CUANTIFICARE
Limita de detecie:
Nivelul zgomotului
multiplicat cu 3
Limita de cuantificare:
Nivelul zgomotului
multiplicat cu 10
DETECTOARELE H P L C
Sensibilitatea unui sistem analitic depinde de zgomotul i

de abaterea echipamentului de detecie. Sensibilitatea
absolut a detectorului poate fi determinat prin injectarea
unei probe direct n detector. Ea este adesea exprimat ca
nivelul minim detectabil sau limita de detecie (definit
adesea ca valoarea zgomotului multiplicat cu 3). Un
parametru mai practic este sensibilitatea relativ a probei,
msurat cu detectorul cuplat la echipamentul HPLC. n
acest fel limita de detecie este influenat nu numai de
detector dar i de coninutul de oxigen al fazei mobile, de
sistemul de injecie, de dispersia benzilor cromatografice
de ctre coloan, de variaiile de temperatur ale diferitelor
componente ale sistemului, etc. Limita de cuantificare
este definit ca valoarea zgomotului multiplicat de 10 20
de ori1.
Un detector UV este capabil s msoare cantiti de ordinul
a 500 pg per injecie. n cazul unor substane cu coeficieni
mari de absorbie limita de detecie poate scdea la 100 pg
per injecie (antioxidani alimentari) sau chiar la 50 pg per
injecie (hidrocarburi aromatice policiclice)2.
Detectoarele de fluorescen i cele electrochimice au
limita de detecie n jurul picogramelor3.
Limita de detecie a detectoarelor spectrometre de mas
(MS) cuplate la HPLC depinde de tipul de interfa.
Instrumentele cu interfa tip electrospray pot detecta
analii n domeniul picogramelor.
Gratzfeld-Husgen, A., Schuster, R. HPLC for Environmental Analysis, Hewlett Packard, 1994
3
Gratzfeld-Husgen, A., Schuster, R. HPLC for Food Analysis, Hewlett Packard, 1996
2
48
VASILE OSTAFE
Detectoarele indice de refracie au limita de detecie n

jurul a 500 ng analit per injecie1.
SELECTIVITATEA
Definim selectivitatea unui sistem de detecie ca fiind

capacitatea acestuia de a selecta numai acei compui de
interes dintr-o matrice complex folosindu-se de
proprietile specifice ale compuilor de interes. Un
detector este selectiv dac nu rspunde la prezena
compuilor ce coelueaz i care ar putea interfera cu
cuantificarea analiilor de interes. Un detector UV poate fi
fcut selectiv prin setarea acelei lungimi de und la care
analitul de interes are absorban maxim, iar contaminanii
au absorban minim. Totui, aceast situaie este destul de
rar ntlnit n practic. Mult mai des sunt ntlnite cazurile
n care analitul de interes prezint o fluorescen
caracteristic sau are proprieti oxido-reductoare
caracteristice, astfel nct folosirea detectoarelor de
fluorescen, respectiv electrochimice fac ca analiza s fie
foarte selectiv, chiar dac analitul nu a fost total separat de
contaminani n procesul cromatografic propriu-zis.
Detectoarele indice de refracie (RI) sunt prin definiie
universale. Detectoarele MS pot fi considerate att ca
instrumente selective ct i universale (dac opereaz n
modul scanare).
LINEARITATEA
Rspunsul detectorului poate fi exprimat n dou moduri:

Domeniu dinamic
Domeniu linear dinamic.
49
Domeniul dinamic este raportul dintre concentraia

maxim i concentraia minim ce pot fi atinse de
proprietatea msurat (absorban, curent, etc.)1.
Domeniu de linearitate Domeniul linear dinamic este intervalul concentraiei
pentru diferite tipuri de
analitului pe care rspunsul detectorului este linear.
detectoare:
(m este concentraia minim Trasarea rspunsului detectorului n funcie de diferite
a domeniului linear)
concentraii ale analitului injectate trebuie s da o linie
dreapt pe o poriune a domeniului concentraiilor luate n
UV
m - m105.
Fl
m - m102.
lucru. Rspunsul este, de multe ori, linear doar pe o
m - m102.
RX
4
poriune limitat (a zecea parte, sau chiar mai puin) din
m - m10 .
IR
m - m103.
MS
ntregul domeniu dinamic. Detectoarele UV sunt lineare de
un domeniu de maxim cinci ordine de magnitudine, cele de
fluorescen i electrochimice pe un domeniu de dou
ordine de magnitudine, cele MS pe trei iar RI pe patru
ordine de magnitudine2.
INFORMAII
CANTITATIVE
Identificarea analiilor de
interes se poate face cu
un grad de siguran
relativ cu urmtoarele
detectoare:
1) MS
2) PDA
3) FL, RX
n HPLC o identificare sigur a analitului de interes se

poate doar cu detectorul MS. Din pcate aplicabilitatea sa
este limitat de preurile nc excesiv de mari ale acestor
tipuri de detectoare. Dac spectrele analiilor de interes
difer semnificativ ntre ele i fa de cele ale
contaminanilor atunci cu ajutorul detectoarelor cu ir (sau
arie) de fotodiode (PDA, adic photodiode array sau DAD,
adic diode array detector) identificarea este, de asemenea,
sigur. Dac analiii de interes au proprieti caracteristice
de fluorescen sau redox, identificarea lor se poate face cu
Scrott, R.P.W., Techniques of Liquid Chromatography (Simpson, C.F., ed.) Wiley-Heden,

Chichester, 1982
2
50
VASILE OSTAFE
destul siguran i cu detectoarele de fluorescen i cele

electrochimice. Identificarea compuilor doar pe baza
timpilor de retenie nu constituie o metod sigur1.
DETECTOARE UV
Drumul optic al unui detector UV convenional este

prezentat n figura 9.
Fig. 9.
Detector UV cu
lungime de und
variabil
Sensibilitate bun
Msurarea la o singur
lungime de unde nu este, de
cele
mai
multe
ori,
suficient. Fr spectre
identificarea analiilor nu
poate fi exact.
Lumina policromatic de la o lamp de deuteriu este

focusat pe o fant de ctre oglinzi plane i sferice.
Monocromatorul transmite selectiv o band ngust de
lumin pe fanta de ieire. Lumina ce trece de aceast fant
trece prin celula de msurare i este parial absorbit de
soluia ce este pompat prin celul. Absorbana probei este
determinat prin msurarea intensitii luminii ce ajunge pe
fotodioda de msurare (i eventual comparat cu un
fascicul de lumin care nu trece prin prob i ajunge pe o
Ettre, L.S., LC Mag., 1 (1983) 108
51
fotodiod de referin pentru a compensa fluctuaiile de

lumin ale lmpii). Detectoarele asistate de computere pot
fi programate ca n timpul procesului cromatografic s-i
schimbe lungimea de und la care se fac msurtorile n
funcie de caracteristicile de absorbie ale piscurilor
cromatografice1.
n practic sunt destul de dese situaiile n care doi solui nu
pot fi separai cromatografic i ar fi necesar ca msurtorile
s se fac la dou lungimi de und diferite n acelai timp.
Acest lucru este posibil cu detectoare cu ci optice duble
sau cu detectoare ce pot trasa spectrul UV. Acestea din
urm sunt de dou feluri2:
Detectoare care necesit oprirea circulaiei fazei mobile
prin sistem, pentru a permite detectorului s scaneze
spectrul
Detectoare ir (arie) de diode3
DETECTOARE IR
(ARIE) DE DIODE
(PDA, DAD)
Figura 10 prezint schema unui detector ir (arie) de diode,

model Hewlett Packard (HP), una dintre cele mai bune i
cunoscute firme de aparatur HPLC din lume4.
Wickam, D., in "A Practical Guide to HPLC Detection", Parriott, D., ed., Academic Press, San
Diego, CA, 1933
2
Pole, C.F., Schuette, S.A., "Contemporary Practice of Chromatography", Elsevier, Amsterdam,
1984
3
Huber, L., Good Laboratory Practice and Current Good Manufacturing Practice, Waldbronn
Analytical Division, HP, Germany, Hewlett Packard, 1994
4
Parriott, D. (ed.), A Practical Guide to HPLC Detection, San Diego, Academic Press, Inc. 1993
52
VASILE OSTAFE
Fig. 10.
Schema drumului optic

i a principalele
componente ale DAD,
model HP
Lentilele acromatice focalizeaz lumina policromatic de la

lmpile de tungsten i deuteriu n celula de msurare.
Lumina este apoi dispersat pe suprafaa unei reele de
difracie i cade apoi pe suprafaa unui cip format din iruri
de diode (traducerea termenului de diode array variaz n
funcie de autor, cele mai uzitate forme fiind ir de diode,
arie de diode sau reea de diode). Domeniul de msurare
variaz, n funcie de model i de firm, de la 190 355
(Perkin-Elmer LC-235 C), la 190 800 nm (Merck L-7450,
Waters PDA 996) i 190 900 (HP 1100). De asemenea,
numrul de diode per cip variaz n funcie de model i de
firm (512 la Merck L-7450 i Waters PDA 996 i 1024 la
HP 1100). Acurateea msurrii este, de obicei, de 1 1,2
nm. Prezena unui filtru special de oxid de holmiu permite
o rapid verificare a acurateei lungimii de und.
53
Majoritatea modelelor sunt dotate cu celule de msurare ce

rezist la presiuni ridicate (peste 100 atm), astfel nct
detectoarele pot fi folosite att cu coloane narrow-bore ct
i n hyphenated chromatography (utilizarea mai multor
tipuri de detectoare cuplate n cascad, la care presiunea
dup ieirea din coloan se menine ridicat mai mult
timp). Volumul celulelor de msurare variaz de la 13 L a
1,7 L, cu un drum optic variind de la 10 mm la 6 mm,
respectiv .
Fig. 11.
Model de DAD cu dublu
fascicul
Rezoluia digital = domeniul lungimilor de und acoperit de reeaua de

difracie (lrgimea maxim a spectrului) supra
numrul de diode din irul de diode al cipului.
Majoritatea DAD sunt mono-fascicul, dar exist i modele

cu dublu-fascicul. Figura 11 prezint schema unui astfel de
model. n acest caz, eventualele fluctuaii ale intensitii
luminii sunt compensate automat. Linia de baz este
realizat prin soft, memorndu-se caracteristicile spectrale
la momentul injeciei1.
Deoarece cantitatea de informaie este foarte mare, DAD
necesit ajutorul unui software specializat. De fapt,
actualmente puterea acestor tipuri de detectoare nu mai
const n caracteristicile tehnice ala aparatului propriu-zis
ci n facilitile oferite de software.
Una din facilitile oferite de acest tip de detectoare este
posibilitatea de a face instantaneu msurtori la mai multe
lungimi de und. Msurarea variaiei intensitii de lumin
pe ntreg domeniul de lungimi de und duce la obinerea
unui spectru de absorpie. Pentru analize de rutin, DAD
Huber, J.F.K., Instrumentation for High-Performance Liquid Chromatography, Amsterdam - Oxford

- New York, Elsevier Scientific Publishing Company, 1978
54
VASILE OSTAFE
Rezoluie optic = domeniul lungimilor de und din spectrul maxim al

reelei de difracie care se
va constitui ntr-o singur
valoare de absorban optic. Valoarea rezoluiei
optice poate fi aleas prin
modificarea
fantei
programabile sau din
soft.
Fig. 12.
Rezoluia optic poate fi
ridicat maxim pn la
nivelul celei digitale (1,2
nm), cnd fanta permite trecerea unui fascicul de lumin
cu o fereastr optic egal cu
dimensiunea unei diode din
aria de diode, sau rezoluia
optic poate fi un multiplu al
celei digitale.
poate fi folosit cu aceleai performane ca un detector UV

obinuit, msurndu-se absorbana optic la o sigur
lungime de und (cu scopul de a salva spaiu n memoria
calculatorului).n mod normal DAD este folosit pentru a
trasa spectrele de absorpie pe un domeniu caracteristic de
lungimi de und pentru analitul de interes. Rezoluia
spectral depinde de lrgimea benzii la care se fac
msurtorile. Aceasta poate fi programat cu ajutorul unei
fante acionate de un servomotor, de la 1 sau 1,2 nm (ct
reprezint valoarea maxim a rezoluiei aparatului
respectiv, aceasta fiind rezoluia digital) la valori relativ
mari, cum ar fi 16, sau chiar mai muli nm (termen denumit
rezoluie optic, sau spectral). Figura 12 explic grafic
aceti termeni1,2.
Dac analiza n curs cere o sensibilitate mai mare rezoluia

optic poate fi sczut, dac ns este necesar o acuratele
mai mare a spectrului atunci ea va fi crescut pn la
nivelul rezoluiei digitale (figura 13). De notat c rezoluia
optic este maxim cnd fereastra fantei are valoarea
1
2
Parriott, D. (ed.), "A Practical Guide to HPLC Detection", San Diego, Academic Press, Inc. 1993
Poole, C.F., Schuette, S.A., "Contemporary Practice of Chromatography", Elsevier, Amsterdam,
1984
55
minim, adic egal n rezoluia digital i rezoluia crete

cnd numeric valoarea fantei scade i viceversa.
Fig. 13.
Adaptarea lrgimii benzii
rezoluiei optice duce la
modificarea sensibilitii
semnalului detectorului. Datele de finee pot fi nregistrate cnd rezoluia optic este maxim, dei n
acest caz i raportul semnal /
zgomot este mare.
Fig. 14.
Comparaie ntre spectrele
benzenului detectate la 1,2,
respectiv 3,6 nm rezoluie
optic.
56
Capacitatea de a distinge ntre structuri spectrale fine crete

foarte mult pe msur de rezoluia optic crete. De
exemplu, la 1 sau 1,2 nm, spectrul benzenului ar trebui s
aib 5 maxime de absorpie caracteristice (figurile 12 i
14). La aceast rezoluie, structura fin a benzenului poate
fi detectat, chiar dac concentraia sa estre mic, semnalul
fiind doar de 0,7 mAU (figura 13). La o rezoluie optic de
3,6 nm majoritatea detaliilor sunt pierdute, dup cum se
vede din figura 14.
Pe de alt parte folosirea unei rezoluii optice mai sczute
VASILE OSTAFE
Fig. 15.
Influena lrgimii rezoluiei
optice asupra detectrii
soluilor eluai
(lrgimea benzii de 16 nm sau chiar mai mult) duce la

obinerea unui semnal mai puternic i evidenierea mai
multor sau chiar a tuturor soluilor eluai. Figura 15
prezint un astfel de exemplu, cnd proba supus analizei
era format dintr-un amestec de trei substane: propanolol,
clometiazol i fenitoin. n cromatograma (a) rezoluia
optic a fost doar de 4 nm, n jurul valorii de 280 nm i
aparent proba coninea doar o singur substan. Dac se
modific lungimea de und, dar rezoluia optic se menine
tot la 4 nm, se constat c pot fi detectate 2 substane, dar
diferite de primul caz (cromatograma b). n cromatograma
(c), unde rezoluia optic a fost de 80 nm (n jurul valorii de
260 nm) se constat ce toate cele 3 substane pot fi
detectate1,2.
Avnd n vedere c cele trei substane au
maxime de absorbie la lungimi de und
diferite, rezult c dac s-ar fi folosit un
detector UV clasic ar fi fost nevoie de cel
puin 2 analize separate pentru a putea
pune n eviden toate cele trei substane,
i de 3 analize diferite, realizate la
maximele de absorbie ale fiecreia dintre
substane pentru a realiza o cuantificare
precis. Cu DAD acest lucru se poate
realiza ntr-o singur analiz3.
Syed, S.E.H. High Performance Liquid Chromatographic Assays. In: Enzyme Assay. A Practical
Approach, edited by Eisenthal, R. and Danson, M.J., Oxford New York Tokyo:Oxford
University Press, 1991, p. 123-166
3
2
57
CROMATOGRAME
TRIDIMENSIONALE
Maximele de absorpie ale analiilor eluai pot fi

identificate
cu
uurin
folosind
prezentarea
tridimensional a datelor1.
Fig. 16 (dreapta).
Cromatograma tridimensional (spectru 3D). O dimensiune o reprezint timpul de
retenie, o alta domeniul
lungimilor de und i a treia
densitile optice la toate
lungimile de und i timpii
analizai.
Fig. 17 (jos).
Cromatograma bidimensional (spectru 2D), cu maximele de absorbie
Cromatograma tridimensional, obinut ntr-o singur

analiz, poate fi utilizat apoi n multiple scopuri2:
Determinarea maximelor de absorbie a analiilor eluai
(ca n exemplul din figura 17).
Cuantificarea fiecrui analit n parte la lungimea de
und unde analitul respectiv are maximul de
absorpie
(aa
numita
metod
MaxPlot);
Reprezentnd grafic rspunsul detectorului n funcie
de concentraia analitului de interes, se constat o
foarte bun linearitate i un domeniu dinamic ce
cuprinde ntreaga scal de extincie (figura 18.).
1
2
Gratzfeld-Husgen, A. and Schuster, R. HPLC for Environmental Analysis, Hewlett Packard, 1994
Gratzfeld-Husgen, A. and Schuster, R. HPLC for Food Analysis, Hewlett Packard, 1996
58
VASILE OSTAFE
Fig. 18.
Linearitatea curbelor de
etalonare depete 2
uniti de absorban
optic
Detecia contaminanilor (impuritilor) (tot prin

folosirea facilitii MaxPot, deoarece n acest fel detecia impuritii este maxim)
Spectrele fiecrui analit n parte pot fi vizionate alturi
de cromatograma bidimensional extras la MaxPlot
(figura 19).
Fig. 19. (dreapta)

Indexul de spectre asociat
cu cromatograma extras
MaxPlot.
PURITATEA PISCURILOR
CROMATOGRAFICE
(1) folosind raiogramele (raportul densitii optice la lungimea de und la care

analitului are coeficientul de absorpie
maxim supra densitatea optic la o lungime de und la care
analitul are un coeficient de absorbie
foarte mic. Raiograma este dreptunghiular n cazul analitului pur.
Verificarea puritii piscurilor cromatografice se poate

realiza n mai multe feluri:
Fig. 20. Raportul semnalelor pentru un analit pur i altul impur.
59
(2) Normaliznd i
comparnd 2 sau mai
multe cromatograme
extrase la lungimi de
und diferite. Pentru analii impuri piscurile
au timpi de retenie diferii. Totui, dac timpii de retenie ai piscurilor sunt aceeai,
aceasta nu este un
indiciu sigur c
analitul este pur (figura
21)
Fig. 21. Cromatograme normalizate pentru testarea puritii piscurilor cromatografice.
(3) Normaliznd i
comparnd spectrele la
2 sau mai multe poriuni ale piscului cromatografic respectiv. De
obicei se compar
spectrul din vrful piscului (apex) cu cele din
punctele de inflexiune
(fig. 22). Exist diferite algoritme de comparaie. De exemplu, HP
compar punctele din
spectrele normalizate
genernd o dreapt de
regresie. Coeficientul
de regresie este multiplicat cu 1000 i denumit factorul de potrivire.
60
Fig. 22. Cromatogramele extrase i spectrele normalizate. La

analiza dup algoritmul HP cu ct factorul de potrivire este mai
apropiat de 1000 cu att probabilitatea ca piscul cromatografic
respectiv s fie mai pur este mai mare, deoarece spectrele din
apexul piscului i cele din punctele de inflexiune sunt mai
similare, indicnd lipsa contaminanilor.
IDENTIFICAREA
VASILE OSTAFE
ANALIILOR ELUAI PE BAZA BIBLIOTECILOR DE SPECTRE
AVANTAJE
DAD
Compararea spectrelor analiilor eluai cu spectre ale

diferitelor standarde aflate n baza de date proprie.
Aceleai tipuri de algoritme folosite pentru stabilirea
puritii piscurilor sunt utilizate i pentru compararea
spectrelor analiilor eluai cu spectre ale unor
standarde aflate n bibliotecile de spectre.
Crearea i mbogirea bazei de date proprii cu spectrele
standardelor dorite. Acesta este un proces interactiv,
deoarece oricnd n bibliotecile de spectre pot fi
introduse noi spectre ale unor standarde, mpreun cu
informaiile referitoare la condiiile cromatografice n
care standardele respective au fost eluate.
Depistarea tuturor soluilor prezeni n prob, ce au
spectre i maxime de absorbie foarte diferite (cu facilitatea TotalPlot, care traseaz cromatograma
adunnd densitile optice la toate lungimile de und
n limitele spectrului stabilit pentru achiziia de date;
facilitate, de asemenea util n analiza n urme)
n concluzie, principalele avantaje ale DAD sunt
posibilitatea de a identifica analiii eluai prin compararea
spectrelor lor cu cele ale unor standarde din baza de date
proprie i verificarea puritii piscurilor cromatografice, ct
i posibilitatea de a realiza cromatograme extrase la mai
multe lungimi de und. Dei n ultimii ani s-au fcut multe
progrese n acest sens, principalul dezavantaj al DAD este
sensibilitatea relativ redus, cel puin atunci cnd se
compar cu cea a detectoarelor electrochimice i de
fluorescen.
61
DETECTOARE DE
FLUORESCEN
Fluorescena este un tip specific de luminiscen care este

creat atunci cnd moleculele emit energie ce a fost
anterior adsorbit n timpul unei perioade de iluminare.
Detectoarele de luminiscen au o mai mare selectivitate
dect, de exemplu, detectoarele UV deoarece nu toate
Selectivitate foarte mare
moleculele care absorb lumin pot s i emit lumin.
Sensibilitate foarte bun
Detectoarele de fluorescen sunt mult mai sensibile dect
detectoarele de absorban optic, permind scderea
semnatului de zgomot. Majoritate detectoarelor de
fluorescen sunt configurate n aa fel nct lumina este
msurat la un unghi drept fa de lumina incident.
Aceast geometrie reduce posibilitatea ca lumina incident
Fig. 23. Schema unui s interfere cu lumina emis de substanele din celula de
detector de fluorescen
msurare, reducnd n acest fel raportul semnal / zgomot i
implicit mrind sensibilitatea acestor detectoare1,2.
Figura 23 prezint schematic un detector de
fluorescen. Lumina de la o lamp de xenon,
tip blitz (ce funcioneaz cu intermiten), este
dispersat de o reea de difracie i focusat pe
celula de msurare. Lumina emis de prob este
colectat la un unghi de 90 ntr-un fascicul
incident i msurat cu un fotomultiplicator.
Pentru selectarea lungimilor de und, ntre
reeaua de excitare i celula de msurare, ntre
aceasta din urm i reeaua de emisie i n faa
multiplicatorului sunt plasate fante.
1
2
62
VASILE OSTAFE
Pn acum civa ani, detectoarele de fluorescen aveau

dezavantajul timpului lung de nclzire i al deplasrii
liniei de bat datorit cldurii emanate de lamp n timpul
funcionrii. Astzi, prin folosirea lmpilor tip blitz, care se
pot nclzi imediat i care elibereaz o foarte mic cantitate
de energie termic dezavantajele amintite mai sus au fost
eliminate.
CELULA DE MSURARE
Eficiena transferului excitaieemisie este proporional cu

volumul iluminat cu ct celula este mai mare cu att este
mai bun semnalul de rspuns. Pe de alt parte, cu ct
volumul celulei de msurare este mai mare cu att dispersia
benzilor cromatografice va fi mai mare. Celula de msurare
poate fi optimizat cu un volum de 5 L, fcnd-o astfel
potrivit i pentru utilizarea coloanelor narrow-bore.
SCANAREA
Scanarea att a spectrului de excitaie ct i a celui de

emisie sunt faciliti foarte utile, n special n perioada de
punere la punct a metodei cromatografice. Acest lucru
poate fi executat doar de detectoarele sofisticate (i
scumpe) care au servomotoare ce pot modifica poziia
reelelor de difracie. Odat stabilite lungimile de und
optime pentru excitaie i emisie, detectoarele pot fi
programate s comute pe aceste poziii n timpul procesului
de separare cromatografic.
Spectrele de fluorescen
nu sunt (nc) utilizate
pentru confirmarea
identitii benzilor
cromatografice
63
DETECTOARE
ELECTROCHIMICE
Fig.
24. Schema unui

detector electrochimic cu 3
electrozi.
Tehnica electrochimic de detecie se bazeaz pe procesul

de transfer al sarcinii electrice ce are loc cnd electronii
sunt cedai de o molecul cnd are loc oxidarea ei sau
absorbii de o molecul cnd se reduce [10, 21]. Aceast
oxidare sau reducere are loc pe suprafaa unui electrod de
lucru. Diferena de potenial dintre electrodul de lucru i
soluia coninnd analiii determin dac un compus este
redus sau oxidat i ct de repede are loc aceast reacie pe
suprafaa electrodului respectiv. Viteza de reacie poate fi
determinat din energiile de activare i potenialele redox
exprimate de ecuaia lui Nernst. Curentul rezultat este proporional cu numrul reaciilor ce au loc la electrod, care la
rndul su este un indicator al concentraiei compuilor de
interes la suprafaa electrodului de lucru1.
Detecia se bazeaz pe folosirea a 3 electrozi: electrodul de lucru, unde are loc reacia; electrodul de
numrare, care aplic diferena de potenial dintre
faza mobil i electrodul de lucru; electrodul de referin, care compenseaz eventualele schimbri n
conductivitatea eluentului. Electrodul de referin
preia valorile anterioare ale electrodului de numrare
pentru a menine diferena de potenial constant pe
parcursul elurii piscului cromatografic, n timp ce
curentul este msurat de electrodul de lucru.
Fluxul de electroni dintre electrozi este amplificat i
transformat n semnal. Detectoarele actuale pot amplifica
semnale foarte slabe, provenite de la cantiti de substan
Lavrich, C., Kissinger, P.T., in "Therapeutic Drug Monitoring and Toxicology by Liquid
Chromatography", Wong, S.H.Y., ed., Marcel Dekker, New York, 1985
64
VASILE OSTAFE
din domeniul picogramelor i chiar mai jos1.

Cu toate c detectoarele electrochimice detecteaz doar
acele substane ce pot fi electrolizate, aceast limitare poate
fi considerat i un avantaj, atunci cnd se analizeaz probe
complexe, deoarece, n acest fel, crete selectivitatea.
Fig. 25. Relaia CV.
ELECTROZII
Pentru a determina potenial optim al electrodului de

lucru, relaia dintre rspunsul detectorului (curentul)
i potenialul aplicat (voltajul) trebuie trasat grafic
pentru fiecare analit de interes ca o curb curenttensiune (CV), similar cu cea din figura 25. La un
potenial mai mic dect E1, nu poate avea loc
oxidarea deoarece cantitatea de energie furnizat nu
este suficient. Crescnd potenialul la E1/2 pe
suprafaa electrodului vor fi electrolizate 50% din
molecule.
Rspunsul maxim necesit un potenial doar cu puin mai
mic dect E2. Acest potenial este cunoscut sub denumirea
de curentul limit deoarece creterea ulterioar a tensiunii
va limita detecia prin creterea zgomotului2.
Dei se folosesc mai multe tipuri de materiale pentru
construcia electrozilor, cel mai comun este electrodul de
sticl de carbon. Pentru diferite aplicaii se prefer
materiale specifice: aur pentru glucide i alcooli; platin
Li, G., Szulc, M.E., Fischer, D.H., Krull, I.S., in "Electrochemical Detection in Liquid
Chromatography and Capillary Electrophoresis", Kissinger, P.T., ed., Chromatographic
Science Series, Marcel Dekker, New York, 1997
Kissinger, P.T., Heineman, W.R., eds., Laboratory Techniques in Electroanalytical Chemistry,
Marcel Dekker, New York, 1984
65
pentru cloruri, sulfii, hidrazine i peroxizi de hidrogen;

argint pentru halogenuri, cupru pentru aminoacizi, mercur
pentru tiosulfat (varianta reductiv), combinaie mercur-aur
pentru compui organici azotai (varianta reductiv)1,2.
CELULELE DE MSURARE
Fig. 26. Tipuri de celule de

msurare
n
electrochimic.
detecia
Exist multe modele de celule de msurare. Majoritatea pot

fi clasificate ntr-una din cele 3 categorii principale
prezentate n figura 26: modelul n strat subire, modelul jet
la nivelul pereilor i modelul poros.
Modelul poros difer de
celelalte tipuri prin aceea
c detecia coulometric
asigur un randament de
100% a reaciei pe
suprafaa
electrodului.
Celelalte modele au o
eficien de numai 1
10% folosind detecie
amperometric.
Totui
detecia amperometric
este cea uzual fiind mai
senzitiv .
Majoritatea detectoarelor electrochimice folosesc celule de
msurare cu volumul intern de 1 L, fiind deci potrivite
pentru utilizarea coloanelor narrow-bore.
Li, G., Szulc, M.E., Fischer, D.H., Krull, I.S., in "Electrochemical Detection in Liquid
Chromatography and Capillary Electrophoresis", Kissinger, P.T., ed., Chromatographic
Science Series, Marcel Dekker, New York, 1997
2
Krull, I.S., Selavka, C.M., Lookabaugh, M., Childress, W.R., LC/GC, 7(9) (1989) 758
66
VASILE OSTAFE
DETECTOARE
INDICE DE
REFRACIE
nu sunt compatibile
cu eluia n gradieni
au sensibilitate
redus
trebuie termostatate
Detectoarele indice de refracie (RI) sunt bazate pe

diferena n indicele de refracie dintre faza mobil pur i
soluia ce conine analiii eluai1.
Deoarece compoziia fazei mobile, considerat ca indice de
referin, nu trebuie s se schimbe, aceste detectoare nu pot
fi utilizate cnd se elueaz n gradient.
Majoritatea tipurilor de detectoare RI fac parte dintr-un din
cele 4 modele principale:
Modele pe baza legii lui Snell (folosete celule duble i este
cel mai popular)
Modele pe baza reflexiei lui Fresnel
Modele pe baz de interferen
Modele bazate pe efectul Christiansen.
sunt universale,
putnd detecta orice
modificare a fazei
mobile.
Deoarece detectoarele RI au o mic sensibilitate i tendina

de a devia de la linia de baz datorit modificrilor de
temperatur, ele sunt utilizate n special n analiza
glucidelor i a aminoacizilor
DETECTOARELE
SPECTROMETRE DE
MAS
Probele complexe ridic probleme speciale pentru analiza

HPLC. Detectoarele DAD permit identificarea compuilor
ce coelueaz, dar n multe situaii utilizarea lor este limitat
de lipsa de detalii spectrale ale coeluanilor. Detectoarele
specifice, cum ar fi cele de fluorescen, pot oferi o mare
specificitate i sensibilitate, numai dac analiii au
proprietatea de fluorescen. Spectrometrele de mas (MS)
pot oferi o mai mare certitudine n identificarea analiilor,
n special n cazurile n care probele conin compui din
clase foarte diferite. Tehnica HPLC-MS este disponibil
doar de civa ani i nc sistemele cu astfel de detectoare
sunt prohibitiv de scumpe2.
1
2
Niessen, W.M.A.,van der Greef, J., Liquid Chromatography - Mass Spectrometry, Chromatographic
Science Series 58, Marcel Dekker, New York, 1992
67
Crearea de interfee care s permit cuplarea sistemului

HPLC la MS ntmpin o serie de dificulti, datorit
condiiilor operaionale diferite:
HPLC
MS
* Cnd solvenii tipici pentru
HPLC sunt trecui n stare
gazoas are loc o cretere a
volumului de aproximativ
1000 de ori.
Operare n faz lichid

Temperatura 25 30C
Nu exist limitri de
molecular
mas
Folosete tampoane anorganice

Produce mari cantiti de solvent
volatilizat: 100-1000 mL-min gaz*
Operare cu gaz la presiune mic

Temperatura 70 350C
n funcie de interfaa folosit
exist limitri de mas
molecular
Limitat la tampoane volatile
Limitat la 10 mL/min gaz
n decursul anilor au fost create multe tipuri de interfee,

unele dintre ele aprnd astzi ca fanteziste sau chiar
caraghioase. Actualmente pe pia s-au impus 3 tipuri de
interfee1: Interfaa termospray; Interfaa fascicul de
particule; Interfaa electrospray.
INTERFAA TERMOSPRAY Figura 26 prezint un tub capilar nclzit prin care circul
efluentul din HPLC n interfaa termospray. Pe msur ce
tubul este nclzit, solventul se vaporizeaz i produce ioni.
Lentile electromagnetice focalizeaz aceti ioni n MS.
Ionizarea cu interfaa termospray este blnd, producnd o
slab fragmentare.
Piscul mai mare din figura
27 const din M + H (masa
analitului i a protonilor).
Acest tip de detecie este
foarte util pentru determinaFig. 26. Procesul n rea masei moleculare. Fraginterfaa termospray.
mentarea i sensibilitatea pot
fi crescute prin creterea
temperaturii (filamentului de Fig. 27. Spectrul termospray al
prometrynului.
1
Prokay, L., Field Desorption Mass Spectrometry, Marcel Dekker, New York, 1990
68
VASILE OSTAFE
Folosete aceleai
viteze volumetrice ca
HPLC
Nu are pri n micare
INTERFAA
FASCICUL DE
PARTICULE
Fig. 28. (dreapta)

Pompe pentru interfaa
fascicul de particule.
Fig. 29. (jos) Spectru

fascicul de particule al
prometrynului
nclzire) sau prin creterea sarcinii pe un electrod.

Interfaa termospray este util pentru compuii ionici nevolatili.
Principalele dezavantaje constau n faptul c necesit
tampoane volatile i spectrele variaz cu matricea probei.
Interfaa fascicul de
particule se bazeaz
pe principiul separrii momentane a solventului, ilustrat n
fig. 28. Eluentul
HPLC trece prin mai
multe camere sub
presiune.
Pe msur ce eluentul trece prin doze fine,
solventul de evapor i este eliminat prin nite
supape sub presiune.
Particulele mai grele continu pe traiectoria lor
original i intr n sursa de ioni. Instrumentele
cu fascicul de particule folosesc o surs standard
(GC-MS) fie modelul impact cu electroni (EI) fie
modelul ionizare-chimic (CI).
Impactul cu electroni fragmenteaz proba mai mult dect
ionizarea chimic sau termospray-ul, dup cum se poate
vedea comparnd spectrul termospray (fig. 27) cu cel al
impactului de electroni din interfaa cu fascicul de particule
(fig. 29) al aceleai substane.
69
avantaje
dezavantaje
INTERFEE PENTRU
IONIZAREA LA
PRESIUNEA
ATMOSFERIC
Spectrele obinute cu interfaa fascicul de particule cu EI

sunt utilizate pentru crearea bibliotecilor spectrale (folosind
o mare varietate de gaze). Interfaa este uor de folosit i
poate fi utilizat i la sistemele GC. Rezultatele sunt destul
de reproductibile1.
Interfaa necesit tampoane volatile i chiar i analii
trebuie s manifeste o anumit volatilitate. Nu este foarte
sensibil pentru compui hidrofili. Zaharurile complexe,
coloranii tip azo, ionii preformai i compuii sulfonai nu
duc la obinerea de spectre EI adecvate. Cuantificarea este
nelinear la concentrai mici2.
Deoarece interfeele termospray i fascicul de particule au
o sensibilitate relativ redus, un domeniu ngust al maselor
analizate i al domeniului polaritii analiilor, ct i
datorit fiabilitii lor reduse, au fost nlocuite n aparatele
create n ultimii ani cu dou tipuri noi de interfee cu
ionizare la presiunea atmosferic (API)3:
Interfaa electrospray
Interfaa cu ionizare chimic la presiune atmosferic
(APCI)
INTERFAA
ELECTROSPRAY
Fig. 30. Nebulizatorul
interfeei electrospray.
Snyder, L.R., Kirkland, J.J., Glajch, J.L. Practical HPLC Method Development, New York, John
3
Prokay, L., Field Desorption Mass Spectrometry, Marcel Dekker, New York, 1990
2
70
VASILE OSTAFE
Fig. 31. Interfaa APIelectrospray HPLCMS
n aceast interfa efluentul

este dirijat printr-un ac nebulizator ntr-un cmp de
mare tensiune care favorizeaz formarea picturilor i
ionizarea moleculelor1.
Proba intr apoi ntr-un
capilar ncrcat la un voltaj
diferit de cel al restului
ansamblului sursei.
Pe msur ce proba iese din capilar, intr ntr-o camer de
pompare, unde solventul este ndeprtat. Ionii sunt
transportai spre analizorul de mas printr-o serie de camere
cu vacuum i lentile ce focalizeaz ionii2.
Ionizarea cu electrospray poate produce ioni cu sarcini
multiple ale analiilor macromoleculari, cum ar fi
proteinele3. Deoarece detectorii de mas separ ionii pe
baza raportului mas / sarcin (m/z), pot fi folosite cu
aceast interfa i spectrometre de mas n domeniul
ctorva sute de daltoni (respectiv m/z) pentru analiza unor
molecule ce depesc chiar 150000 D. De aceea, utilizarea
imediat a interfeei electrospray a fost analiza compuilor
cu mas molecular mare, dei se poate aplica cu acelai
succes i la compuii cu mas mic.
2
3
Technical literature on LCQ, Analytical Newsletter, Finnigan / MAT Instruments, San Jose, CA,
1995
71
INTERFAA
DE IONIZARE
CHIMIC LA PRESIUNE
ATMOSFERIC (APCI)
Fig. 32. Interfaa APCI

HPLC-MS.
avantaje
dezavantaje
CONCLUZII
REFERITOARE LA
DETECTOARE
APCI poate s analizeze solui cu polaritate moderat. Ca

n electrospray, ionizarea are loc la presiune atmosferic,
prin intermediul unui proces de ionizare chimic (fig. 32).
Folosirea APCI se preteaz la compuii ce au o oarecare
volatilitate i este mai puin potrivit pentru compuii
foarte labili termic1.
Principalele avantaje ale interfeelor API sunt faptul c pot
fi folosite pentru compui polari i semipolari de pn la
150000 D, sunt sensibile i produc un spectru larg de ioni2.
Interfeele API au dezavantajul c matricea poate interfera
cu procesul de ionizare i pentru sensibilitate foarte mare
trebuie redus viteza volumetric, sau temporar oprit.
Tabelul de mai jos face o trecere n revist a tehnicilor de
detecie discutate n acest capitol. Din pcate, decizia de a
achiziiona un detector trebuie s fie un compromis ntre
rezultatele posibile sau dorite i resursele financiare.
2
72
Aplicaii
Avantaje
Tabelul 3.
Comparaii ntre
caracteristicile
detectoarelor HPLC
VASILE OSTAFE
Selectivitate
Sensibilitate
Tip detector
UV
cost redus
universal
DAD
Confirmare
puritate pisc
Fl
++
Foarte
selectiv
RX
RI
++
-
+
-
f. selectiv
Universal
MS
++
++
Structura
Acizi organici, acizi grai,

aldehide dup derivatizare,
ioni anorganici,
Antioxidani,
conservani,
colorani, toxine, vitamine,
pesticide, PAH, fenoli, anioni
anorganici, etc.
Micotoxine,
ndulcitori,
vitamine, carbamai, glifosai,
PAH, etc.
Fenoli, amine, vitamine, ioni
Virtual toate tipurile de
substane
Virtual toate tipurile de
substane
73
D
A
REEA
AR
TIIZZA
AT
VA
RIIV
DEER
ADUGAREA DE
CROMOFORI
Tehnicile de derivatizare1,2 s-au impus n situaiile

Cnd concentraia analitului este foarte mic
(sensibilitatea deteciei poate fi mbuntit prin
derivatizare)
Cnd analitul de interes nu prezint cromofori sau nu
are proprietatea de fluorescen (i se grefeaz o
grupare cromofor sau fluorescent)
Una dintre cele mai populare tehnici de derivatizare o
constituie marcarea compuilor cu reactivi ce prezint
absorbia n UV3. Reactivul trebuie astfel selecionat nct
nu numai s aib un coeficient de absorpie ridicat dar i o
selectivitate mare. Aceast combinaie reduce efectele
datorate matricei sau datorate produilor secundari ai
reaciei de derivatizare. Tabelul urmtor cei mai comuni
reactivi utilizai pentru introducerea de cromofori4,5.
Snyder, L.R., Kirkland, J.J., Glajch, J.L., Practical HPLC Method Development, John Wiley and
Sons, New York, 1997
2
Techniques in Protein Chemistry, Vols. I VIII, Academic Press, San Diego, CA, 1989 1985
3
Ahuja, S., Selectivity and Delectability Optimization, Wiley, New York, 1989
4
Gy, P.M., Sampling of Heterogeneous and Dynamic Material Systems, Elsevier, Amsterdam, 1992
5
Harris, D.C., Quantitative Chemical Analysis, 4th ed., W.H. Freeman, New York, 1994
Tabelul 4
Reactivi folosii
pentru
derivatizare
prin
introducerea de
cromofori.
ADUGAREA DE
MARCHERI DE
FLUORESCEN
VASILE OSTAFE
Compusul
int
Alcooli
Compui cu S
Acizi grai
Grupare
reactiv
-OH
-SO32-COOH
Aldehide i
cetone
Amine
primare
Amine
primare i
secundare
-CO-COH
=C=O, -CHO
-NH2
-NHR
Reactiv
Fenilizocianat
2,2-ditio(5-nitro-piridina)
bromura de p-bromofenacil
bromura de 2-faftacil
2,4-dinitrofenilhidrazina
(nm)
250
320
258
250
365
o-ftalaldehida (OPA)
340
9-fluorenilmetil
cloroformatul (FMOC)
256
Ori de cte ori este necesar a se detecta un compus aflat n

concentraie foarte mic n prob, se recomand
derivatizarea sa cu un reactiv fluorescent1. Tabelul 5
prezint civa reactivi utilizai n acest scop2.
Datorit proprietilor speciale necesare pentru a avea un
semnal de fluorescen puternic, reactivii de marcare
fluorescent sunt mai puin numeroi dect cei folosii
pentru detecia UV3,4.
Wainer, I.W., Liquid Chromatography in Pharmaceutical Development, Aster Publishing,

Springfield, OR, 1985
2
King, B., Graham, G.S., Handbook of Derivatives for Chromatography, Heyden, Philadelphia, 1979
3
Poole, C.F., Poole, S.K., Chromatography Today, Elsevier, Amsterdam, 1993
4
75
Tabelul 4
Reactivi folosii pentru
marcarea fluorescent.
DERIVATIZARE PRESAU POSTCOLOAN?
Compusul
int
Alcooli
Amine
primare
Amine
primare i
secundare
Grupare
reactiv
-OH
-NH2
-NHR
DERIVATIZAREA
Reactiv
Fenilizocianat
o-ftalaldehida
(OPA)
9-fluorenilmetil
cloroformatul
(FMOC)
ex / em
(nm)
230 / 315
330 / 455
230 / 315
Tehnica pre-coloan poate fi utilizat att on-line ct i offline, dar cea post-coloan trebuie executat on-line pentru
acuratee maxim. Dac majoritatea autosampler-elor
moderne au posibilitatea de a realiza operaii simple de
amestecare a probei cu reactivi prestabilii i deci de a
realiza reacii de derivatizare pre-coloan on-line, pentru
derivatizarea post-coloan este necesar aparatur special,
care cuprinde pompe de dozare a reactivilor, cuptoare de
reacie, etc. Prin urmare tehnica post-coloan este mai
scump, implicnd investiii adiionale n aparatur, ct i
consum mrit de reactivi, deoarece tot lichidul efluent din
coloan trebuie supus reaciei de derivatizare, nu numai
proba, aa cum se ntmpl n cazul tehnicii pre-coloan1,2.
Wainer, I.W., Liquid Chromatography in Pharmaceutical Development, Aster Publishing,

Springfield, OR, 1985
2
76
C
A D
II
REEA
AR
R
TA
OR
CT
TEELLO
CO
OLLEEC
DA
AT
E
AM
R
OR
REEA
AR
UA
DEELLO
OD
ALLU
EV
VA
MEETTO
Indiferent de metoda de detecie folosit datele trebuie

achiziionate i evaluate. Rezultatele analizei HPLC trebuie
prezentate ntr-un format uor lizibil i sugestiv. Aparatura
ce permite realizarea acestui lucru variaz de la simple
nregistratoare, la integratoare pn la computere ce ruleaz
software-uri dedicate, foarte sofisticate. Tendina actual
este de a se utiliza tot mai mult sisteme de management al
informaiilor de laborator (LIMS)1.
NREGISTRATOARE
LE CU HRTIE
ieftine
posibiliti limitate
nregistratoarele cu hrtie sunt cele mai ieftine dispozitive

folosite pentru achiziionarea datelor de la detectoare. Au
posibiliti limitate de scalare a datelor (timpul i
amplitudinea semnalului), dar nu au posibiliti de integrare
a piscurilor cromatografice, sau alte tipuri de prelucrri,
cum ar fi memorarea timpilor de retenie, trasarea automat
a liniei de baz, etc.2
Huber, L. Good Laboratory Practice and Current Good Manufacturing Practice, Waldbronn
Analytical Division, HP, Germany, Hewlett Packard, 1994
.
INTEGRATOARELE
ieftine
posibiliti limitate
CALCULATOARE
PERSONALE
COLECTAREA DATELOR
Integratoarele ofer o serie de avantaje, fa de

nregistratoare. Printre acestea amintim:
Posibilitatea scalrii cromatogramei
Integrarea piscurilor cromatografice, dup arie sau
nlime
Calcularea ariei sau nlimii procentuale
Calcularea concentraiilor analiilor eluai pe baza
standardelor externe i interne
Prezentarea sub form tabelar a rezultatelor, incluznd
timpii de retenie, ariile, nlimile i concentraiile
piscurilor
Trasarea liniei de baz
Stocarea (temporar) a datelor i recalcularea
cromatogramelor dup modificarea unor parametri
(cum ar fi viteza hrtiei, extensia scalei semnalului,
modul de integrare, etc.)
Realizarea de calcule statistice, regresii multilineare i
nelineare.
Exist integratoare multicanal ce permit achiziionarea i
prelucrarea datelor de la mai multe detectoare.
Odat cu introducere calculatoarelor personale (PC) ca

instrumente curente de lucru n HPLC posibilitile de
achiziie, calculare, prelucrare i raportare a datelor au
devenit, virtual, nelimitate. De fapt, detectoarele DAD i
MS pot fi folosite la adevrata lor valoare doar mpreun cu
avantaje, avantaje i
programe dedicate. Mai mult, PC-urile prezint avantajul
numai avantaje.
de a combina rezultatele cromatografice cu programe de
editare de texte, calcul tabelar, grafic molecular, etc. Prin
78
VASILE OSTAFE
intermediul reelelor de calculatoare, datele pot fi puse la

dispoziia altor utilizatori.
Cu ajutorul PC-urilor toate modulele componente ale
sistemului HPLC (pompe, autosamplere, detectoare,
colectoare de fraciuni, etc.) pot fi comandate i se pot crea
metode de lucru pentru fiecare modul n parte, care apoi pot
fi integrate ntr-o metod general. Programele dedicate de
cromatografie au faciliti de diagnosticare a modulelor,
calibrare a instrumentelor i multe tipuri de metode
preformate. Datele brute, ct i cele prelucrate de metodele
selecionate, mpreun cu parametri acestor metode pot fi
salvate i refolosite dup dorin, n conformitate cu
cerinele unei practici bune de laborator (GLP). Folosirea
bibliotecilor de spectre UV i MS pentru identificarea
compuilor se poate realiza cu uurin i numai prin
intermediul PC-urilor.
Rezultatele i rapoartele pot fi convertite n diferite formate
pentru a putea fi utilizate de utilizatorii altor sisteme
HPLC. Unul dintre formatele care s-a impus n ultima
vreme este ANDI (Analytical Instrument Association *.cdf)1.
SISTEME DE
MANAGEMENT AL
INFORMAIILOR DE
LABORATOR
LIMS definete o serie de proceduri pentru sarcini

repetitive n laboratorul analitic. Aceste sarcini pot include
mnuirea materialelor i reactivilor, administrarea probelor
ce intr n laborator, compilarea rezultatelor analitice
pentru proba dat i generarea unui raport validat i
Berridge, J.C., Techniques for the Automated Optimization of HPLC Separation, Wiley, New York,
1985
79
COLECTAREA DATELOR
certificat de departamentele n drept. Astfel de sisteme sunt

foarte utile deoarece ajut la creterea productivitii, a
gestionrii resurselor i la scderea cheltuielilor1,2.
1
2
Schoenmakers, P.J., Optimization of Chromatographic Selectivity, Elsevier, Amsterdam, 1986

Glajch, J.L., Snyder, L.R. (eds.), Computer-Assisted Development for High - Performance Liquid
Chromatography, Elsevier, Amsterdam, 1989
80
P
II A
NEE,, P
CIIZZII
DEE
AC
OA
TEEIIN
NO
OT
PR
RO
PEEPPTTIID
AM
MIIN
HPLC a influenat foarte mult dezvoltarea chimiei proteinelor n ultimii 2030 de ani, motiv pentru care anual se ine o conferin internaional dedicat
acestui domeniu. n acelai timp, s-au dezvoltat faze staionare capabile s separe
prin schimb ionic sau faz inversat molecule mai mari de 30 kDa1,2,3. nc din
1983 au aprut diverse cri dedicate domeniului separrii proteinelor, peptidelor i
aminoacizilor prin HPLC4,5
Regnier, F.E., Gooding, K.M:, Anal. Biochem., 103 (1980) 1-25

Ghosh, R., Cui, Z.F., J. Liq. Chromatogr. Relat. Technol., 23 (2000) 1619-1626.
3
Zeng, X.F., Ruckenstein, E., Biotechnol. Prog., 15(1999) 1003-1019.
4
Horvath, C.(ed.) "High Performance Liquid Chromatography: Advances and Perspectives",
Academic Press, New York, vol. 3, 1983
5
Henschen, A., Hupe, K.P., Lottspeich, F., Voelter, W. (eds.) "HPLC in Biochemistry", WCH,
Weinheim, Germany, 1985
2
PROTEINE, PEPTIDE, AMINOACIZI
Interesul n cromatografia proteinelor a fost stimulat de dezvoltarea

tehnologiei ADN recombinant. Aceste dezvoltri au uurat studiile detaliate ale
structurii proteinelor (multe dintre ele cu potenial terapeutic) i au introdus
posibilitatea design-ului structurii proteinelor pentru a modifica activitatea lor
biologic. Pentru aceasta sunt necesare preparate proteice nalt purificate, deoarece
probele trebuiau analizate prin cristalografie de raze X sau RMN bi-dimensional.
n mod tradiional, purificarea proteinelor este considerat o sarcin
consumatoare de timp, laborioas i dificil. Aceasta deoarece prin aceeai metod
nu se ajunge la acelai grad de purificare la dou proteine diferite i prin urmare
procesul de purificare al proteinelor trebuie dezvoltat empiric pentru fiecare caz n
parte. Prezentul capitol prezint unele linii directoare generale utile n etapa de
iniiere a procedurii de purificare.
Aspecte fizico-chimice. Strategiile de purificare se bazeaz, de obicei, pe o
combinaie a metodelor de separare care exploateaz aspectele fizico-chimice
particulare ale proteinei de interes, adic masa ei molecular, sarcina global sau
hidrofobicitatea sa. Dac este posibil, se recomand o extracie iniial cu solvent
organic sau cu un acid, dar trebuie avut grij a se evita denaturarea sau modificarea
proteinei de interes (cum ar fi, de exemplu, deminarea Gln sau Asn). Adesea, prima
metod de fracionare este cromatografia de cernere molecular. Aceasta are ns
dezavantajul de a crete volumul probei i prin urmare, n cazul separrilor
preparative nu se recomand ca prima etap. n acest caz, o strategie mai util este
folosirea unei etape iniiale de adsorpie. Chiar n cazul separrilor analitice,
metoda poate fi utilizat cu succes. Este, de asemenea, important de a se pune la
punct o metod de pstrare pentru perioade lungi a proteinei de interes n forma sa
nativ. n acest fel se pot strnge cantiti suficient de mari din proteina de interes,
folosind metoda analitic de separare de mai multe ori.
Tehnica cromatografiei de schimb ionic este larg utilizat pentru
82
VASILE OSTAFE
purificarea proteinelor deoarece condiiile cromatografice sunt compatibile cu

stabilitatea majoritii proteinelor. Mai mult, capacitatea de ncrcare cu proba este
ridicat i selectivitatea este mai bun dect n oricare alt variant cromatografic.
Separrile pot fi realizate att la pH-uri ridicate (schimb de anioni) ct i coborte
(schimb de cationi). Proba poate fi eluat fie prin modificarea pH-ului fazei mobile,
fie, i aceasta este metoda cel mai des folosit, prin creterea triei ionice.
Comportamentul proteinei n cromatografia de schimb ionic poate fi uneori
predictibil folosind tehnica izoelectrofocusrii bidimensionale. Tehnica d
rezultate bune n cazul proteinelor hidrofile, dar comportarea proteinelor hidrofobe
n cromatografia de schimb ionic poate fi destul de diferit de cea observat n
cazul izoelectrofocusrii. Adesea se folosete includerea unei concentraii mici de
solvent organic (10-20%) n faza mobil i/sau concentraii mari de uree (3-6 M),
mai ales n cazul proteinelor puin solubile n medii apoase. Trebuie avut n vedere
ns c folosirea ureei poate duce la modificarea resturilor de Lys i Cys din
structura proteinelor. Tehnica este larg aplicat att n domeniul analitic ct i
preparativ graie existenei unor schimbtori de ioni foarte eficieni bazai fie pe
materiale polimerice (TSK-PW Toyo Soda, FPLC Pharmacia) sau pe baz de
silicagel (Synchrom, Brownlee, etc.).
Dup cromatografia de schimb ionic, proteina de interes se gsete, n mod
normal, ntr-o soluie cu o concentraie ridicat de sare. Aceasta poate fi ndeprtat
prin precipitare cu sulfat de amoniu urmat de dializ, sau i mai bine, proba poate
fi aplicat pe o faz staionar hidrofob (silicagel cu brae hidrofobe lungi i cu
pori largi, sau polimerice de tipul TSK-PW, cu grupri fenil).
Cromatografia de excludere molecular poate fi utilizat att pentru
schimbarea fazei mobile ntr-una volatil i prin urmare potrivit pentru liofilizare,
ct i pentru a ndeprta contaminanii cu mas molecular mic.
Pentru a se obine randamente mari ale purificrii, cel mai adesea se impune
o strategie ce presupune o combinaie a metodelor de purificare amintite: schimb
ionic, faz inversat i gel filtrare.
83
Cromatografia de afinitate a constituit un avantaj enorm n purificarea

proteinelor. n contrast cu alte metode care exploateaz diferenele fizico-chimice
dintre diferitele proteine, aceast tehnic exploateaz anumite diferene structurale
i funcionale. Singurul dezavantaj al tehnicii este capacitatea de ncrcare cu
prob, n special n cazul folosirii ca ligand imobilizat a unei molecule cu mas
molecular mare.
Ingineria genetic a creat posibilitatea de modificare a structurii proteinelor
i astfel purificarea lor poate deveni mai uoar. Prin manipularea genelor ce
codific a protein specific, peptidele de fuziune pot fi modificate la capetele lor
N- sau C-terminale, pentru a uura purificarea. Ulterior, extensiile peptidice sunt
ndeprtate i proteina de interes este purificat prin metode convenionale1. De
exemplu, se pot lega la captul C-terminal mai multe resturi de Arg i astfel se
modific semnificativ pHi al proteinei. Fa de alte metode de modificare, aceasta
permite proteinei s ia o conformaie normal. Dup o purificare iniial prin
schimb ionic, resturile de Arg sunt ndeprtate cu carboxipeptidaza B dup care
urmeaz o a doua cromatografiere prin schimb ionic2.
Cromatografia de schimb ionic este tehnica cea mai des folosit pentru
separarea proteinelor deoarece condiiile cromatografice sunt compatibile cu
meninerea structurilor teriare ale proteinelor3. Retenia solutului poate fi
controlat prin tria ionic, pH-ul i temperatura fazei mobile. Tot aceti parametri
influeneaz i gradul de recuperare al proteinei. Totui, gsirea condiiilor optime
de separare se face empiric.
Deoarece sunt necesare faze staionare cu pori largi (30-50 nm), perlele
matricei au dimensiuni relativ mari (10 - 50 m). Aceasta face ca stabilitatea
mecanic s fie redus i presiunea aplicat pe coloan s fie limitat sub 400 psi la
1 mLmin1. Cele mai folosite tipuri de faze staionare pentru cromatografia de
Shine, J., Fettes, I., Lan, N.C.Y., Roberts, J.L., Baxter, J.D., Nature, 285 (1980) 456-461
Sassenfeld, H.M., Brewer, S.J., Biotechnology, 2 (1984) 76-81
3
Krull, I.S., Sebag, A., Stevenson, R., J. Chromatogr. A., 887(2000) 137-163.
2
84
VASILE OSTAFE
schimb ionic a proteinelor sunt cele polimerice de la Toyo Soda (TSK-PW)1,

Pharmacia (FPLC Mono Beads) sau pe baz de silicagel de la Synchrom Inc. Fazele
polimerice sunt stabile pe domeniul de pH 2 10 neavnd loc dizolvarea loc la pHuri mai mari de 8, cum se ntmpl n cazul matricelor de silicagel2,3.
Separri preparative cu TSK-5PW-SP4 au dat rezultate complet compatibile
cu cele obinute la nivel analitic5.
Purificarea proteinelor prin cromatografie

de schimb anionic
Coloana
ProtEx-SP, 50 x 4.6mm PEEK
Faza mobil A: 20 mM Bis-Tris HCl, pH 6,0
B: "A" + 0,5M NaCl
Gradient
7 40% B timp de 20 min.
Viteza
0,5 mLmin1
volumetric
Temperatura Camerei
Detecie
UV@415 nm
Proba
1. GHb A1c 2. GHb A1c 3. Hb A0
Kamberi, M., Kamberi, P., Nakano, S., J. Chromatogr. B., 741 (2000) 295-300.
Ren, Q., de Roo, G., Kessler, B., Witholt, B., Biochem. J. 349 (2000) 599-604
3
Engel, S., Barak, Z., Chipman, D.M., Merchuk, J.C., J. Chromatogr. B., 743 (2000) 281-286.
4
Kit, YY., Kuligina, E.V., Onishchenko, A.M., Yurchenko, L.V., Romannikova, I.V., Richter, V.A.,
Vlassov, V.V., Biochem.-Moscow., 64 (1999) 896-900.
5
Brewer, S.J., Dickerson, C:D., Ewbank, J.J., Fallon, A., J. Chromatogr., 362 (1985) 443-449
2
85
Purificarea proteinelor prin cromatografie

de schimb cationic
Coloana
ProtEx-DEAE, 50 x 4.6 mm
PEEK
Faza mobil A: 20 mM Tris HCl, pH 8,0
B: "A" + 0,5M NaCl
Gradient
5 70% B timp de 30 min.
0,5 mLmin1
Viteza
volumetric
Temperatura Camerei
Detecie
UV@415 nm (scala timpului 30
minute)
Proba
1. hGH, 10g 2. hGH desamido
derivative 3. hGH desamido
derivative
CROMATOGRAFIA
N FAZA INVERSATA
Succesele obinute n urma introducerii suporturilor cu pori largi pentru

cromatografia n faz inversat pentru proteine cu mase moleculare mai mari de 30
kDa a ncurajat folosirea tot mai larg a acestui mod de cromatografie1. n teorie,
fazele staionare cu pori largi sunt necesare numai cnd moleculele de interes sunt
mai mari dect porii fazelor staionare "normale". n general este mai bine s se
foloseasc faze staionare cu pori mici deoarece acestea au o suprafa mai mari i
deci i o eficien mai mare2. Prin urmare, pentru o protein mic se va obine un
numr al talerelor teoretice (N) mai mare pe o faz staionar cu pori mici. Cu toate
c n condiiile de pH sczut i n mediu de solveni organici, condiii cerute de
cromatografia n faz inversat, majoritatea proteinelor sunt denaturate exist i
proteine are sunt stabile sau care au capacitatea de a-i recpta conformaia nativ
1
2
Yu, X., Zhao, R., Liu, G.Q., J. Liq. Chromatogr. Relat. Technol., 23 (2000) 1821-1830.
Szpunar, J., Analyst., 125 (2000) 963-988.
86
VASILE OSTAFE
dac sunt repuse n mediu propice1. n anumite circumstane meninerea activitii

biologice nu este necesar, cum ar fi n cazul n care proteina se purific pentru a i
se determina secvena primar2.
Purificarea proteinelor prin cromatografie n faz inversat
C18 Bakerbond wide-pore (250 x
Coloana
4.6mm)
Faza mobil
Gradient
Viteza
volumetric
Temperatura
Detecie
Proba
A:0,05 M bicarbonat de amoniu ajutat

la pH 3,2 cu acid trifluoracetic; B:
tetrahidrofuran
20% B pentru 10 min., 20-30% B n 30
min. i 30% B pentru 15 min.
1 mLmin1
21C
UV@220 nm
1. artefact, 2. Colagen tip III, 3.
Colagen tip I.
n figura de mai sus se prezint separarea prin cromatografie n faz inversat

a formelor mature de colagen tip I i III din pielea bovin. Denaturarea la 56C
pentru 30 minute nainte de cromatografiere a permis separarea subunitilor
individuale3. nc din anii '80 lista proteinelor separate prin cromatografie n faz
inversat cuprindea proteine structurale cum ar fi colagenul sau proteine din snge4,
enzime5, hormoni6, proteine de importan farmaceutic7, etc. Cromatografia n faz
1
Rubinstein, M., Levy, W.P., Moschera, J.a., Lay, C.Y., Hershberg, R., Barlett, R., Pestka, S., Arch.
Biochem. Biopys., 210 (1980) 307-318
2
Mahoney, W.C., Hermodson, M.A., J. Biol. Chem., 255 (1980) 11199-11203
3
Smolenski, K.A., Fallon, A., Light, N.D., Bailey, A.J., Biosci. Rep., 3 (1983) 93-100
4
Kato, Y., Komiya, K., Hashimoto, T., J. Chromatogr., 246 (1982) 13-18
5
Ui, N., J. Chromatogr., 215 (1981) 289-292
6
Voelter, W., in "HPLC in Biochemistry", VCH, Weinheim, Germany, 1985, pp 217-317.
7
Nice, E.C:, O'Hare, M.J., Anal. Biochem., 129 (1979)22-30
87
inversat a fost folosit pentru studiul modificrilor conformaionale ale

proteinelor1, identificarea proteinelor ce conin Cys n hidrolizatele proteice2, sau
pentru studiul diferenelor n comportarea cromatografic a proteinelor mici i
mari3.
Mecanismul reteniei proteinelor n cromatografia n faz inversat nu este
clar definit, dar deoarece folosirea coloanelor scurte nu duce la scderea rezoluiei
s-a sugerat c procesul nu este controlat doar de simpla partiie a solutului ntre cele
dou faze4.
CROMATOGRAFIA
N FAZA NORMALA
Cromatografia n faz normal a fost puin folosit pentru separarea

proteinelor, deoarece majoritatea proteinelor nu sunt solubile n faze mobile ce
conin un procent mare de solvent organic, condiie cerut de acest tip de
cromatografie. Exist i excepii5, cum ar fi unele proteine din membranele
biologice, care sunt solubile n hexan sau dimetil sulfoxid.
CROMATOGRAFIA
DE AFINITATE
Dei cromatografia de afinitate are o foarte mare eficien ea este folosit

destul de rar6. Cele mai cunoscute faze staionare utilizate pentru acest tip de
cromatografie sunt fazele staionare de la Beckman ("Fast Affinity"), Pharmacia,
LKB, BioRad i Pierce.
Sunt date exemple de parteneri afini n care ligandul i solutul i-au schimbat
rolurile. De exemplu, lactat dehidrogenaza a fost purificat n prezena piruvatului
(0,1 M) pe o coloan avnd AMP imobilizat. Eluarea enzimei s-a realizat folosind
1
Luiken, J., Van der Zee, R., Welling, G.W., J. Chromatogr., 284 (1984) 482-486
Fullmer, C.S., Anal. Biochem., 142 (1984) 336-339
3
Ekstrom, B., Jackobson, G., Anal. Biochem., 142 (1981) 134-139
4
O'Hare, M.J., Nice, E.C., Chromatogr. Sci., 16 (1982) 277-322
5
Froescheis, O., Moalli, S., Liechti, H., Bausch, J., J. Chromatogr. B., 739 (2000) 291-299.
6
Garcia ,M.C., Marina, M.L., Torre, M., J. Chromatogr. A., 880 (2000) 169-187.
2
88
VASILE OSTAFE
NAD i 0,1 M pirazol1. ntr-alt exemplu, alcool dehidrogenaza a fost imobilizat

pe o matrice de silicagel, coloana fiind utilizat pentru separarea unor cofactori
nucleotidici2.
CROMATOGRAFIA
DE EXCLUDERE MOLECULARA
Cele mai multe aplicaii ale cromatografiei de excludere molecular sunt

desalifierea soluiilor proteice i determinarea maselor moleculare ale proteinelor3.
Fazele mobile folosite n gel-filtrare trebuie s conin anumii aditivi
(detergeni neionici, propilen glicol sau sruri caotropice slabe) care s previn
interacia chimic a proteinelor cu faza staionar, dar care s nu interfere cu
structurile de ordin superior ale proteinelor4.
Purificarea proteinelor prin gel-filtrare
Bio-Sil TSK-250 (300 x 7.5mm)
Coloana
Faza mobil
Gradient
Viteza
volumetric
Temperatura
Detecie
Proba
0,02 M fosfat de soidu, pH 6,5; 5,0 M

guanidin HCl.
Nu
1 mLmin1
Camerei
UV@280 nm
Separarea IgG uman (redus i
alchilat) n subuniti: 1. Lanul greu
(51 kDa); 2. Lanul uor (26 kDa); 3.
Reactivul de alchilare (iodacetamida).
Lowe, C.R., Glad, M., Larsson, P.-O., Ohlson, S., Small, D.A.P., atkinson, A., Mossbach, K., J.
Chromatogr., 215 (1981) 303-316
2
Nilsson, K., Larsson, P.O., Anal. Biochem., 134 (1983) 60-72
3
Oliva, M.L.V., Souza-Pinto, J.C., Batista, I.F.C., Araujo, M.S., Silveira, V.F., Auerswald, E.A.,
Mentele, R., Eckerskorn, C., Sampaio, M.U., Sampaio,,C.A.M., Biochim. Biophys. ActaProtein Struct. Molec. Enzym., 1477 (2000) 64-74.
4
Wenk, S.O., Kruip, J., J. Chromatogr. B. 737(2000) 131-142.
89
INTRODUCERE
HPLC a fost folosit pentru analiza i purificarea peptidelor att pentru
producerea de peptide sintetice ct i pentru izolarea peptidelor naturale. n
domeniul cromatografierii peptidelor exist o bogat literatur tiinific, exemplele
din prezentul capitol avnd rolul doar de a ilustra anumite aplicaii specifice.
CROMATOGRAFIA
DE SCHIMB IONIC
Aplicaiile cromatografiei de schimb ionic pentru peptide sunt similare cu

cele pentru proteine. Avnd mase moleculare mai mici, pori matricelor nu trebuie s
fie foarte mari i prin urmare rezistena mecanic i presiunile ce pot fi aplicate
asupra coloanei sunt mai mari dect n cazul coloanelor folosite pentru purificarea
proteinelor. n plus, n cazul peptidelor, exist i aplicaii specifice, cum ar fi
cartarea peptidelor.
Purificarea peptidelor prin cromatografie
de schimb ionic
Coloana
ProtEx-SP (50 x 4.6mm) PEEK
Faza mobil
A: 20mM Bis-Tris HCl, pH 7.0

B: "A" + 0.5M NaCl
24-69% B timp de 20 min.
0,5 mLmin1
Gradient
Viteza
volumetric
Temperatura
Detecie
Proba
90
Camerei
UV@280 nm
Separarea citocromului c din diferite
surse biologice: 1. Bovin; 2. Cal; 3.
Iepure.
VASILE OSTAFE
CROMATOGRAFIA
N FAZA INVERSATA
Folosirea foarte larg a cromatografiei n faz inversat pentru separarea

peptidelor a permis dezvoltarea unei metode de previziune a timpilor de retenie a
peptidelor de interes a cror structur primar este cunoscut1. Metoda se bazeaz
pe studiul reteniilor unei serii de peptide i aminoacizi, la care s-au atribuit anumii
coeficienii de retenie n funcie de aminoacizii individuali care la rndul lor au
fost corelai cu anumii coeficieni de hidrofobicitate. Suma coeficienilor de
retenie a aminoacizilor din peptida necunoscut poate fi folosit pentru a prezice
timpul ei de eluare2. Valoarea absolut a coeficienilor de retenie depinde de
compoziia fazei mobile. Totui, peptidele mai mari de 10 kDa au o comportare
anormal probabil datorit schimbrilor conformaionale cauzate de solventul
organic i de pH. Datorit caracteristicilor bune UV i a faptului c ajut la
solubilizarea multor peptide, acidul trifluoroacetic este mult folosit n compoziia
fazelor mobile.
Purificarea peptidelor prin cromatografie n faz inversat
Peptica C18 (50 x 4,5 mm)
Coloana
Faza mobil
Gradient
Viteza
volumetric
Temperatura
Detecie
Proba
A: 0.1% TFA in 5% MeCN

B: 0.1% TFA in 50% MeCN.
0-30% B n 10 min., apoi 30-50% B n
10 min.
1,5 mLmin1
Camerei
UV@220 nm
Separarea 1. Gly-Tyr 2. Val-Tyr-Val 3.
Enkephalin-Lys 4. Enkephalin-Met 5.
Angiotensin II 6. Enkephalin-Leu 7.
Eledoisin.
Selectivitatea diferit a fost obinut prin schimbarea tipului de coloan, folosind aceeai faz mobil.
1
2
Voelter, W., n "Biochemistry", VCH, Weinheim, Germany, 1985, pp. 217-317

Meek, J.C., Rosetti, Z.L., J. Chromatogr., 211 (1985) 15-28
91
Pentru determinarea secvenei primare a proteinelor, cromatografia n faz

inversat este exhaustiv folosit pentru izolarea fragmentelor peptidice dup
digestia enzimatic a proteinelor. Fiecare peptid izolat poate fi apoi supus
reaciei Edman i resturile peptidice ct i derivaii PTH ai aminoacizilor sunt apoi
separai tot prin cromatografie n faz inversat1.
Cartarea peptidelor triptice prin cromatografie n faz inversat
Coloana
Peptica C18 (50 x 4,5 mm)
Faza mobil A: 0.1% TFA in 5% MeCN
B: 0.1% TFA in 50% MeCN.
Gradient
0-35% B n 100 min., apoi
100% B.
Viteza
1,5 mLmin1
volumetric
Temperatura Camerei
Detecie
UV@220 nm
Proba
Fragmente dup digestia triptic
a albuminei serice bovine
Linia de baz a unei "cromatografieri" fr injectarea probei, indic faptul c peak-urile
mici din cromatogram nu sunt artefacte.
Separarea peptidelor prin cromatografie
de excludere molecular
Coloana
TSK 2000SW (60 x 7,5 mm)
Faza mobil 0,05 M fosfat de potasiu, 0,1
M sulfat de amoniu, pH 7,0.
Gradient
Nu
Viteza
0,8 mLmin1
volumetric
Temperatura Camerei
Detecie
UV@280 nm
Fragmente dup digestia triptic
Proba
a albuminei serice bovine
Coloana a fost iniial calibrat
cu markeri cu mase moleculare
cunoscute, indicate prin sgei.
Tempst, P., Hunkapiller, M.W., Hood, L.E., Anal. Biochem., 137 (1984) 188-195
92
VASILE OSTAFE
CROMATOGRAFIA
DE EXCLUDERE MOLECULARA
Rezoluia peptidelor mai mici de 10 kDa nu se poate realiza prin acest mod
de cromatografiere. Gel-filtrarea se utilizeaz fie la separarea moleculelor mari, fie
pentru o separare grosier a proteinelor i peptidelor n grupuri ce au un domeniu
destul de larg al maselor moleculare1, fie pentru regsirea peptidelor dup
modificarea chimic, cum ar fi ndeprtarea agentului de alchilare dup alchilare.
Determinarea precis a maselor moleculare a peptidelor, chiar folosind
standarde pe un domeniu ngust al maselor moleculare nu se poate realiza, dei
folosirea unor denaturani puternici aduce unele mbuntiri ale metodei.
CROMATOGRAFIA
N FAZA NORMALA
Cromatografia n faz normal a fost mult mai mult folosit pentru separarea
peptidelor dect pentru separarea proteinelor sau a aminoacizilor, n special din
cauza slabei solubiliti a proteinelor n soluii ce conineau concentraii ridicate de
solveni organici i a relativei bune solubiliti a majoritii aminoacizilor n soluii
apoase. Din contra, majoritatea peptidelor sunt mai solubile n faze organice dect
n faze apoase. Prin aceast metod s-au pus n eviden multe interacii subtile. De
exemplu n figura alturat se prezint separarea unor peptide ce difer prin poziia
unui singur rest de Gly.
Separarea peptidelor prin cromatografie n faz normal
Porasil (300 x 3,9 mm)
Coloana
Faza mobil
Ciclohexan-izopropanolmetanol (92:6:2)
Nu.
1,0 mLmin1
Gradient
Viteza
volumetric
Temperatura
Camerei
Detecie
UV@220 nm
Proba 1. Boc-Met3-Gly-Met2-OMe; 2. BocMet2-Gly-Met3-OMe; 3. Boc-Met5Gly-OMe; 4. Boc-Gly-Met5-OMe; 5.
Boc-Met4-Gly-Met-OMe.
Sullivan, R.C., Shing, V.W., D'Amore, P.A., Klagsbrun, M., J. Chromatogr., 266 (1983) 301-311
93
O problem care apare adesea n timpul sintezei i secvenionrii proteinelor

este apariia unui intermediar care nu este solubil n soluii apoase; problema se
rezolv prin folosirea unei soluii apoase de dimetilsulfoxid i folosirea
cromatografiei n faz normal1.
INTRODUCERE
Dezvoltarea fazelor staionare de mare performan pentru analiza
aminoacizilor a fost un proces continuu de la prima apariie a analizorului automat
de aminoacizi2. Valoarea mic a coeficienilor de extincie a majoritii
aminoacizilor a dus la dezvoltarea unor metode de detecie prin derivatizarea3
gruprilor amino cu un derivat colorat4 sau fluorescent. Cei mai des utilizai reactivi
de derivatizare a aminoacizilor sunt prezentai n tabelul alturat.
Reactivi utilizai pentru derivatizarea aminoacizilor
Clorura de dansil
Ninhidrina
Clorura de dabsil
Ortoftalaldehida (OPA)
Diaminoazoben izo-tiocianatul
Flurescamina (fluram)
Detecie la 200 nm
Fenil izotiocianatul
Dei sporadic sunt semnalai i ali reactivi i metode de derivatizare ale
aminoacizilor, ei nu sunt larg folosii.
Naider, F., Huchital, M., Becker, J.M., Biopolymers, 22 (1983) 1401-1407

Spackman, D.H., Stein, W.H., Moore, S., Anal. Chem., 30 (1950) 1190-1205
3
Fernandes, J.O., Ferreira, M.A., J. Chromatogr. A., 886 (2000) 183-195.
4
Strong, R.A., Liu, H.J., Krull, I.S., Cho, B.Y., Cohen, S.A., J. Liq. Chromatogr. Relat. Technol., 23
(2000) 1775-1807.
2
94
VASILE OSTAFE
CROMATOGRAFIA
DE SCHIMB IONIC
Majoritatea analizoarelor automate de aminoacizi folosesc rini

schimbtoare de ioni pentru separarea aminoacizilor derivatizai pre-coloan1 cu
ninhidrin2. OPA3, fenilizocianatul4 sau fluram-ul5 pot fi folosii n egal msur,
alturi de ageni de derivatizare mai puin folosii6.
Analiza aminoacizilor prin
cromatografie de schimb ionic
Dionex DC-6A (300 x 4,6
Coloana
mm)
Faza mobil
Gradient
Viteza
volumetric
Temperatura
Detecie
Proba
Tampon citrat
Program de schimbare a 3
tampoane
1,0 mLmin1
Camerei
Derivatizare post-coloan cu
ninhidrin
1. Cys-Cys, 2. Asp, 3. Met
sulfonat, 4. Thr, 5. Ser, 6.
Glu, 7. Pro, 8. Gly, 9. Ala, 10.
Cys, 11. Val, 12. Met, 13. Ile,
14. Leu, 15. N-Leu, 16. Tyr,
17. Phe, 18. Amoniu, 19. Lys,
20. His, 21. Arg.
Kubec, R., Svobodova, M., Velisek, J., J. Chromatogr. A., 862 (1999) 85-94.
Zdebska, E., Koscielak, J., Anal. Biochem., 275 (1999) 171-179.
3
Husted, S., Hebbern, C.A., Mattsson, M., Schjoerring, J.K., Physiol. Plant., 109 (2000) 167-179
4
Albin, D.M,. Wubben, J.E., Gabert, V.M., J. Agric. Food Chem., 48 (2000) 1684-1691.
5
Kelly, MT., Fabre, H., Perrett, D., Electrophoresis., 21 (2000) 699-705.
6
Wang, F., Chen, X., Chen, Q., Qin, X.C., Li, Z.X., J. Chromatogr. A., 883(2000) 113-118.
2
95
Analiza aminoacizilor prin cromatografie

de schimb ionic
Polyspher AA NA (120 x
Coloana
4,6 mm)
Faza mobil
Gradient
Viteza
volumetric
Temperatura
Detecie
Proba
Buffelute (Pierce Cehmicals)

Gradient n trepte
0,5 mLmin1
Camerei
OPA, fluorescen; ex - 330
nm; em - 450 nm
1. Asp, 2. Thr, 3. Ser, 4. Glu,
5. Gly, 6. Ala, 7. Val, 8. Met,
9. Ile, 10. Leu, 11. Tyr, 12.
Phe, 13. His, 14. Lys, 15.
Amoniu, 16. Arg.
CROMATOGRAFIA
N FAZA INVERSATA
Tot mai multe firme comercializeaz analizoare automate de aminoacizi ce

folosesc cromatografia n faz inversat. Viteza de analiz este mrit datorit
faptului c acest tip de cromatografie nu necesit reechilibrarea coloanei ntre
analize1.
Pentru detecia aminoacizilor s-au propus metode de derivatizare pre- i postcoloan.
Derivatizarea pre-coloan
Orto-ftalaldehida (OPA). Simplitatea acestei metode de derivatizare a fcut
ca metoda s devin foarte popular2. Timpul de separare a OPA-aminoacizilor a
fost mult redus prin scderea lungimi coloanei i creterea vitezei volumetrice a
1
2
Vacchina, V., Chassaigne, H., Oven, M., Zenk, M.H., Lobinski, R., Analyst., 124 (1999) 1425-1430.
Husted, S., Hebbern, C.A., Mattsson, M., Schjoerring, J.K., Physiol. Plant., 109 (2000) 167-179
96
VASILE OSTAFE
fazei mobile. Principalele dezavantaje ale metodei sunt timpul de via relativ scurt
al derivailor OPA n comparaie cu derivaii de dansil sau furam i slaba
reactivitate fa de aminele secundare (dei adugarea de hipoclorit poate s
nlture aceast din ultim problem).
Analiza aminoacizilor prin cromatografie de n faz inversat
NovaPak C18, 4 m (150
Coloana
x 3,9 mm)
Faza mobil
A: 60 mM KH2PO4, pH 6,65;
B: tampon A: acetonitril: metanol:2-propanol
(46:18:18:18)
Gradient
min. mL/min
%A
%B
0
0,0
90
10
0,5
0,5
90
10
2,5
1,0
90
10
15
1,0
60
40
27
1,0
0
100
Temperatura
Camerei
Detecie
Derivatizare pre-coloan cu
nm; em - 425 nm
Proba
1. Asp, 2. Glu, 3. Ser, 4. His,
5. Arg, 6. Gly, 7. Thr, 8. Ala,
9. Tyr, 10. Met, 11. Val, 12.
Phe, 13. Ile, 14. Leu, 15. Lys.
97
Derivatizarea post-coloan
Orto-ftalaldehida (OPA). Pentru a realiza o derivatizare post-coloan cu
OPA se folosete o spir de reacie (4 x 0,3 mm) inserat ntre punctul de
amestecare cu agentul fluorescent i detector1. Deoarece volumul spirei de reacie
influeneaz dispersia peak-urilor, derivatizarea post-coloan nu este la fel de bun
ca cea pre-coloan. n plus se impune folosirea unei viteze volumetrice mici, ceea
ce duce la creterea timpului total de analiz. Totui, principalul avantaj al
derivatizrii post-coloan este reproductibilitatea. Fa de metoda cu ninhidrin,
derivatizarea cu OPA nu necesit un dispozitiv de nclzire.
Analiza aminoacizilor prin cromatografie de schimb ionic, detecie cu
florescamin
Durrum DC-4A (500 x
Coloana
4,6 mm)
Faza
mobil
Gradient
n trepte
18 mL/h
A: 0,175 N citrat de sodiu, pH

3,5; B: 0,175 N citrat de sodiu,
pH 3,45; C: 0,2 N citrat de sodiu,
0,05% tiodiglicol, pH 4,1; D. 0,52
N citrat de sodiu, 1 N NaCl, 0,05
% tiodiglicol.
min. %A %B %C %D
0
15
17
24
41
100 0
0
0
100 0
0
0
0
100 0
0
0
0
100 0
0
0
0
100
Temperatura
57C
Detecie
Derivatizare cu Fluram
Proba 1. Asp, 2. Thr, 3. Ser, 4. Glu, 5. Cys,
6. Pro, 7. Gly, 8. Ala, 10. Val, 11.
Met, 12. Ile, 13. Leu, 14. nor-Leu, 15.
Tyr, 16. Phe, 17. His, 18. Lys, 19.
Amoniu, 20. Arg.
Vasanits, A., Kutlan, D., Sass, P., Molnar-Perl, I., J. Chromatogr. A., 870 (2000) 271-287.
98
VASILE OSTAFE
Fluorescamina (Fluoram). Pentru realizarea derivatizrii cu fluorescamin

sunt necesare 2 pompe separate, una pentru pomparea fazei mobile i alta pentru
reactiv1, motiv pentru care metoda este mai puin comod dect cea cu OPA.
Nivelul sensibilitilor este similar pentru ambii reactivi i de 10 ori mai bun dect
n cazul ninhidrinei. Fluramul reacioneaz, de asemenea, slab cu aminele
secundare (cum ar fi prolina), dar neajunsul poate fi ndeprtat prin adugare de
anhidrid succinic2.
cromatografie n faz inversat
Ultrasphere ODS (150
Coloana
x 3,9 mm)
Faza mobil
Gradient
Temperatura
Detecie
Proba
0,01 M acetat de sodiu

(pH 4,9) - acetonitril
(62:38)
Nu
Camerei
Derivatizare post-coloan
cu fenilizotiocianat
100 L plasm a fost
diluat cu standard intern
(metionil sulfona), deproteinizat prin ultrafiltrare
centrifugal
i
derivatizat.
Fenilizotiocianat (PITC). Folosirea fenilizotiocianatului3 (reactivul Edman)

pentru a forma derivai tiohidantoinici (PTH) ai aminoacizilor este bine cunoscut
Udenfriend, S., Stein, S., Bohlen, P., Dairman, W., Leimgruber, W., Weigle, W., Science, 178 (1972)
871-873
2
Stein, S. Brink, L., Methods Enzymol., 29 (1981) 120-121
3
Miller, M.L., Johnson, G.V.W., J. Chromatogr. B., 732 (1999) 65-72.
99
fiind folosit la secvenionarea peptidelor1. Metoda a fost folosit i pentru analiza

amestecurilor de aminoacizi prin cromatografia n fat inversat2, iar firma Waters
comercializeaz un kit bazat pe aceast metod (Waters, Pico-Tag).
Clorura de dansil (DNS-Cl) (clorura de 1-dimetilaminonaftalen-5sulfonil)3. Iniial reactivul a fost introdus n chimia proteinelor pentru analiza
capetelor amino-terminale4 i a fost mult folosit datorit simplitii metodei i
capacitii de a reaciona att cu aminele primare ct i cu cele secundare (spre
deosebire de metodele cu o-ftaladehid i furam). Mai mult, n contrast cu ali
reactivi fluoresceni, derivaii de dansil sunt stabil la hidroliza acid i prin urmare
pot fi utilizai pentru marcarea gruprilor amino nainte de hidroliz. Prin folosirea
acestei metode de derivatizare la separrilor prin cromatografia n faz inversat
sensibilitatea ajunge n domeniul picomolilor, fiind limitat datorit reaciilor
secundare care pot avea loc cu lizina i ntr-o msur mai mic cu histidina i
tirozina.
Clorura de dabsil (DBS-Cl) (4-N,N-dimetilaminoazobenzen-4-izotiociana5
tul) . Reacia aminoacizilor cu clorura de dabsil produce compui care pot fi
detectai n UV (436 nn) n cantiti de civa picomoli. Produsul este stabil la
temperatura camerei6. Totui metoda nu este la fel de popular ca cele cu oftalaldehid i clorura de dansil.
Diaminoazobenzenizotiocianatul (DABITC) (4-N,N-dimetilaminoazoben1
Zahou, E., Jornvall, H., Bergman, T., Anal. Biochem., 281 (2000) 115-122.
Heinrikson, R.I., Meredith, S.C., Anal. Biochem., 136 (1984) 35-74
3
Abe, Y., Fukui, S., Koshiji, Y., Kobayashi, M., Shoji, T., Sugata, S., Nishizawa,H., Suzuki, H., Iwata,
I., Biochim. Biophys. Acta-Protein Struct. Molec. Enzym., 1433 (1999) 188-197.
4
Gray, W.R., Hartley, B.S., Biochem. J., 89 (1963) 379-380
5
Schauer-Vukasinovic, V., Bur, D., Kitas, E., Schlatter, D., Rosse, G., Lahm, H.W., Giller, T., Eur. J.
Biochem., 267 (2000) 2573-2580.
6
Lin, CRC Handbook for the Separation of Amino Acids, Peptides and Proteins, vol. 1, 1984, pp.
359-366
2
100
VASILE OSTAFE
zen-4-izotiocianatul). Acest reactiv a fost folosit cu succes pentru secvenionalizarea proteinelor i peptidelor1. Detecia derivailor de tiohidantoin se poate face la
436 nm cu o sensibilitate n jur de 5 picomoli2.
cromatografie n faz normal
Zorbax NH2 (250 x 4,6
Coloana
mm)
Faza mobil
Gradient
Viteza
volumetric
Temperatura
Detecie
Proba
A: 10 mM KH2PO4, pH 4,3;
B: acetonitril-ap 50:7 (v/v)
Gradient conform schemei
2,0 mLmin1
35C
nm; em - 450 nm
1. Phe, 2. Leu, 3. Ile, 4. Met,
5. Tyr, 6. Val, 7. Pro, 8. ALa,
9. HyPro, 10. Thr, 11. Gly, 12.
Ser, 13. His, 14. Cys, 15. Arg,
16. Lys, 18. Glu, 19. Asp.
Selectivitatea diferit a aminoacizilor n faza normal comparat cu faza

inversat a permis realizarea unor separri dificile3,4. De exemplu, prin acest tip de
cromatografia au fost rezolvai toi aminoacizii prezeni ntr-un hidrolizat de
colagen i, ceea ce este mai important, hidroxi-lizil-norleucina i dehidroxi-lizilnorleucina au fost separate5.
1
Chang, J.Y., Brauer, D., Wittmann, J., Leibold, B., FEBS Lett., 93 (1980) 205-214
Lehmann, A., Wittmann, J., Leibold, B., FEBS Lett., 176 (1984) 360-364
3
Charlwood, J., Birrell, H., Camilleri, P., J. Chromatogr., B., 734 (1999) 169-174.
4
Yoshida, T., J. Chromatogr. A., 852 (1999) 607
5
Smolenski, K.A., Fallon, A., Light, N.D., Bailey, A.J., Biosci. Rep. J., 3 (1983) 93-100
2
101
G
DEE
CIID
UC
GLLU
Glucidele, zaharurile sau carbohidraii sunt polihidroxialdehide sau

polihidroxicetone sau un compus care poate hidrolizat la o astfel de structur. Cea
mai mic unitate care nu mai poate fi hidrolizat la astfel de structuri se numete
monozaharid. Glucoza este pe departe cel mai abundent membru al acestei clase
de compui. n funcie de numrul de atomi de carbon din molecul exist trioze,
tetroze, pentoze, hexoze, etc., formula general pentru monozaharide fiind (CH2O)n
cu n 3, motiv pentru care aceste substane se numesc carbohidrai1.
n funcie dac monozaharida este o aldehid sau o ceton molecula este
clasificat ca fiind aldoz sau cetoz. Monozaharidele cu 5 sau mai muli atomi de
carbon pot adopta conformaii ciclice, cele mai comune fiind ciclurile de 5 sau de 6
atomi de carbon. n acest caz structurile se numesc furanozice, respectiv piranozice.
Structurile monozaharidelor se pot scrie cu lanul atomilor de carbon linear sau
1
Ostafe, V., S nvm Biochimia prin Teste: vol I, Biochimie Descriptiv, Ed. Brumar, Timioara,
1999
VASILE OSTAFE
formule de proiecie Haworth (care sunt cele mai folosite), dei cele mai corecte
reprezentri sunt conformaiile tip baie sau scaun.
Diferite moduri de scriere
monozaharidelor:
HO
OH
HC
H
OH
HO
OH
C
OH
HO
H
OH
HO
OH
OH
OH
OH
OH
H2C
C
CH2OH
OH
C
HO
H2C
OH
OH
O
C
OH
HO
OH
C
H C OH
O 2
C OH
C
HO C
C OH
HO
CH2
OH
C
HO
H2C
H2C
C
HOH2C
H2C
Formule lineare,
Proiecii Haworth
Conformaii tip baie sau
scaun
H
C
CH2OH
OH
C
O
C
C
C
C
O
H2C OH
Dou monozaharide unite printr-o legtur glicozidic formeaz un diglucid

(dizaharid). Cel mai comun dizaharid este zaharoza (zahrul de buctrie).
Oligozaharidele (pn la 10-15 uniti monozaharidice) au denumiri specifice1.
Dintre polizaharide cele mai cunoscute sunt celuloza, amidonul i glicogenul.
Carbohidraii sunt una din cele patru categorii majore de substane (alturi de
proteine, lipide i acizi nucleici) ce se gsesc n toate organismele vii. Zaharurile
sunt o parte constituent important a diferitelor tipuri de hran, fiind prezente n
cantiti mari n semine i vegetale. Hainele pot fi fabricate din produse bogate n
carbohidrai: celuloza, bumbacul, iar lemnul, bogat n celuloz, are foarte multe
aplicaii.
Biosinteza carbohidrailor ncepe cu producerea glucozei din dioxid de
carbon i ap n timpul fotosintezei planatelor. Glucoza poate apoi s fie convertit
fie n celuloz - un polizaharid de structur, fie n amidon - un polizaharid de
1
1999
103
GLUCIDE
rezerv. Cnd amidonul (i la unele specii chiar i celuloza) sunt digerate de

animale, glucoza rezultat este fie folosit ca surs direct de energie (glicoliza), fie
stocat sub form de glicogen (polizaharidul de rezerv major din animale).
Anumite cantiti din glucoz pot fi convertite n lipide sau sunt utilizate pentru
formarea glicoproteinelor.
Glicoproteinele sunt componente ale membranelor i pereilor celulari i
funcioneaz ca receptori i markeri celulari.
Avnd o rspndire ubicvent i formnd structuri de mare importan
biologic analiza glucidelor s-a bucurat de mare atenie din partea cercettorilor.
Printre metodele utilizate de timpuriu n analiza glucidelor se numr i
cromatografia pe hrtie i cromatografia de gaze. Prima are dezavantajul de a fi o
metod calitativ. Varianta modern, cromatografia n strat subire, chiar dac este
de mare performan, n cel mai bun caz poate fi considerat semicantitativ. n ce
privete cromatografia de gaze, cerina de a se folosi produi volatili impunea
folosirea de metode de derivatizare pre-coloan. Printre reactivii utilizai se numr
esterii de trimetilsilan1, acidul butil boronic2, derivai de acid benzen boronic3, etc.
Cu toate c uneori s-au obinut rezultate spectaculoase, tehnica gaz-cromatografic
nu este prea popular datorit timpului prea mare dedicat pregtirii probelor,
instabilitii produilor i posibilitii reacionrii incomplete.
HPLC a fost folosit foarte mult pentru separarea mono- i oligozaharidelor
nc din anii '704 Aceast tehnic ofer o cuantificare precis i timpul de analiz
este foarte scurt5. Principalul "dezavantaj" al folosirii HPLC pentru analiza
glucidelor este faptul c zaharidele nu conin grupri cromofore i detecia cu
sisteme UV standard necesit derivatizarea presau post-coloan. Deoarece nc
Wood, P.J., Sidiqui, I.R., Carbohydr. Res., 19 (1971) 283-286

Eisenberg, F., Jr., Carbohydr., Res., 19 (1971) 135-138
3
Crowell, E:P., Burnett, B.B., Anal. Chem., 39 (1967) 121-124
4
Thiem, J., Schwenter, J., Karl, H., Sievers, A., Reimer, J., J. Chromatogr., 155 (1978) 107-118
5
Krull, I.S., Sebag, A., Stevenson, R., J. Chromatogr. A., 887 (2000) 137-163.
2
104
VASILE OSTAFE
din anii '70 s-au comercializat detectoare indice de refracie1, detecia glucidelor nu
mai constituie o "problem" pentru analizele HPLC.
Silicagelul nemodificat este prea polar pentru a fi eficient pentru rezolvarea

amestecurilor de glucide. Problema poate fi rezolvat prin derivatizare precoloan2. Separrile zaharidelor prin HPLC s-au realizat pe o mare varietate de
tipuri de coloane, printre care amintim:
Suporturi amino sau nitril3
Silicagel modificat in situ cu amine4
Rini schimbtoare de ioni5
Suporturi n faz inversat.
n marea majoritate a cazurilor simpla extracie apoas la temperaturi ridicate

este suficient pentru a extrage zaharidele cu mas molecular mic din produsele
alimentare. n situaii mai dificile se poate recurge la extracia cu solveni organici
i triturarea omogenizarea probei6. Adesea, aceste extracte sunt acide i se
recomand tratarea cu carbonat de calciu (cu urme de octanol pentru se reduce
spumarea) pentru a le neutraliza. Extractele pot fi clarificate cu acetat neutru de
Palmer, J.K., Anal. Lett., 8 (1975) 215-224

Wannet, W.J.B., Hermans, J.H.M., van der Drift, C., den Camp, H.J.M.O., J. Agric. Food Chem., 48
(2000) 287-291.
3
D'Amboise, M., Noel, D., Hanai, T., Carbohydr. Res., 79 (1980) 1-10
4
Aitzetmuller, K., J. Chromatogr., 156 (1978) 354-358
5
Verhaar, L.A.Th., Kuster, B.F.M., J. Chromatogr., 220 (1981) 313-322
6
Wilson, C.W., Shaw, P.E., Campbell, C.W., J. Sci. Food Agric., 33 (1982) 777-780
2
105
GLUCIDE
plumb dup care sunt filtrate (i deionizate). Diluarea cu acetonitril i filtrarea sau
centrifugarea probei sunt, de obicei ultimile etape naintea analizei HPLC. Se
recomand utilizarea unei coloane de protecie (guard) pentru a se proteja coloana
analitic de potenialii contaminani, cum ar fi proteinele.
Solubilitatea oligozaharidelor n acetonitril scade odat cu creterea masei
moleculare. Monozaharidele suport pn la 75% acetonitril, dar n cazul
oligozaharidelor cu pn la 15 uniti glucidice concentraia acetonitrilului nu
trebuie s depeasc 55%.
n general, buturile nealcoolice, vinurile i sucurile de fructe pot fi injectate
direct, dup etapa de filtrare. Polizaharidele necelulozice din pereii celulari pot fi
eliberate din celule prin hidroliza acid (acid trifluoracetic 2M, timp de 1 or, la
120C) urmat de deionizare (pe un schimbtor de ioni sau pe un cartu de extracie
n faz solid - SPE)1.
Oligozaharidele complexe din urin pot fi separate de sruri i metabolii prin
adsorpie pe crbune activ2 i eluarea ulterioar cu o soluie apoas de etanol.
Glicoproteinele conin oligozaharide complexe legate covalent de partea
proteic. Analiza HPLC a acestor oligozaharide poate fi realizat dup eliberarea
oligozaharidelor prin hidrazinoliz controlat.
Procedeele moderne de pregtire a probelor de glucide recomand utilizarea
cartuelor de extracie n faz solid (SPE), cum ar fi Sep-Pak C18 sau Oasis
(Waters). Prin aceast operaie se ndeprteaz contaminanii, cum ar fi lipidele i
se mrete timpul de via (folosire) al coloanei analitice. n cazul folosirii
cromatografiei de schimb ionic pentru analiza glucidelor, probele trebuie deionizate
pentru a se evita interaciile i elurile aleatorii. Dificultile legate de deionizare
pot fi rezolvate uor dac se folosete ionul format care poate fi ndeprtat prin
liofilizare3.
Barton, F.E., Windham, W.R., Himmelsbach, D.S., J. Agric. Food Chem., 30 (1982) 1119-1123
Warren, C.D., Schmidt, A.S., Jeanloz, R.W., Carbohydr. Res., 116 (1983) 171-182
3
Baust, J.G., Lee, R.E., James, H., J. Liq. Chromatogr., 5 (1982) 767-779
2
106
VASILE OSTAFE
Una dintre principalele probleme ale analizei zaharidelor este lipsa de grupri
cromofore care s absoarb la lungimi de und mai mari de 200 nm. Cel mai uor
glucidele sunt monitorizate cu detectorul indice de refracie. Totui, n unele situaii
sensibilitatea limitat a acestui tip de detector face ca analiza s nu fie practic i
pentru a se evita operaiile de concentrare a probei, operaii consumatoare de timp
i bogate n surse de erori se recomand derivatizarea pre-coloan1.
Derivatizarea pre-coloan a glucidelor are ca scop obinerea unui derivat care
Se obine uor, reproductibil i cu randament mare;
Are un coeficient de absorbie ridicat la o lungime de und convenabil;
Este compatibil cu sistemul de solveni ales pentru cromatografiere;
Permite recuperarea uoar a precursorului;
Este potrivit pentru eventualele analize ulterioare, cum ar fi RMN sau MS2.
Literatura de specialitate menioneaz mai multe tipuri de derivai ai
zaharidelor, printre care amintim acetaii3, benzoaii, 4-nitrobenzoaii4, benziloxim
perbenzoaii5, derivaii de fenildimetilsilan6 i derivaii alchilai7
Pentru analiza oligozaharidelor complexe care, cel mai adesea, sunt prezente
n probe n concentraii mici, marcarea radioactiv cu borohidrura de sodiu tritiat
este o metod ce trebuie luat n considerare datorit sensibilitii i preciziei n
cuantificare8.
1
Kratschmar, D., Wallner, S., Florenski, M., Schmid, D., Kuhn, R., Chromatographia., 50 (1999)
596-600.
2
White, C.A., Vass, S.W., Kennedz, J.F., Large, D.G., J. Chromatogr., 264 (1983) 99-109
3
Wells, G.B., Lester, R.L., Anal Biochem., 97 (1979) 184-190
4
Nachtmann, F., Budna, K.W., J. Chromatogr., 136 (1978) 279-287
5
Thompson, R.M., J. Chromatogr., 166 (1978) 201-212
6
7
McGinnis, G.D., Fang, P., J. Chromatogr., 153 (1978) 107-114
8
Warner, T.G., Robertson, A.D., O'Brien, J.S., Clin. Chim. Acta, 127 (1983) 313-326
107
GLUCIDE
n general, procedurile de derivatizare reduc polaritatea compuilor i

uureaz separarea lor pe silicagel nederivatizat folosind faze mobile organice1.
Formele anomerice pot fi separate dup acetilare sau benzoilare cu toate c mrirea
numrului de peak-uri datorit acestor forme anomerice necesit timpi mai lungi de
eluare i duce la obinerea de cromatograme mai complexe. Peak-uri unice se obin
cnd derivatizarea duce la deschiderea ciclurilor, cum ar fi n cazul reactivilor
oxim2.
O alternativ la detecia glucidelor cu detectorul indice de refracie, a crui

sensibilitate este redus (n domeniul 1040 g) i la derivatizarea pre-coloan, este
derivatizarea post-coloan3. Cea mai popular metod de acest tip este tratarea cu
tatrazolium blue care permite detecia la 530 nm4. Reacia poate avea loc numai cu
zaharidele reductoare, fiind astfel excluse zaharoza i inulina. n aceste cazuri
tratarea probei cu -fructozidaz va duce la conversia zaharozei n glucoz i
fructoz. Pentru inulin se recomand hidroliza acid blnd5. Alte metode de
derivatizare post-coloan sunt producerea de complex glucid-cupruamoniu care
poate fi detectat la 295 nm6, reacia cu periodatul i detecia prin dispariia
absorbanei la 260 nm7, reacia cu 2-ter-butilantrachinona i detecie de
fluorescen8 i reacia cu ceriu (IV) i detecie de fluorescen1.
1
Thompson, R.M., J. Chromatogr., 166 (1978) 201-212
3
596-600
4
D'Amboise, M., Noel, D., Hanai, T., Carbohydr. Res., 79 (1980) 1-10
5
Wight, A.W., van Niekerk, P.J., Food. Chem., 10 (1983) 211-224
6
Grimble, G.K., Barker, H.M., Taylor, R.H., Anal. Biochem., 128 (1983) 422-428
7
Nordin, P., Anal. Biochem., 131 (1983) 492-498
8
Gandelman, M.S., Birks, J.W., Anal. Chim. Acta, 155 (1983) 159-171
2
108
VASILE OSTAFE
Termenul de zaharide simple este folosit n prezentul context pentru

moleculele formate din 1 - 6 uniti monozaharidice, incluznd compui ca
fructoza, glucoza, lactoza, maltoza, zaharoza, galactoza i arabinoza.
COLOANE
ALCHIL-AMINO MODIFICATE CHIMIC
Coloanele alchil-amino modificate chimic sunt fazele staionare cele mai

folosite pentru separarea zaharidelor i sunt, n general eluate cu faze mobile
constnd din amestecuri de acetonitril - ap. Aceast compoziie s-a dovedit a fi
mult superioar altor amestecuri, cum ar fi de exemplu metanol - ap2, sau acetat
de etil - etanol - ap3. S-a constatat c pe msur ce coninutul de ap al fazei
mobile crete, retenia glucidelor scade.
Analiza oligozaharidelor folosind coloane amino
Coloana
Spherisorb S5 NH2 (250 x 4.6mm)
Faza mobil Acetonitril - ap (60:40)
Gradient
Nu
Viteza
2,0 mLmin1
volumetric
Temperatura Camerei
Detecie
Indice de refracie
Proba
Analiza unui extract din rdcin de
cicoare. Numrul de lng peak-uri
se refer la lungimea lanului
oligozaharidelor eluate.
Mrochek, J.E., Dinsmore, S.R., Waalkes, T.P., Clin. Chem., 21 (1975)1314-1322

Rabel, F.M., Caputo, A.G., Butts, E.T., J. Chromatogr., 126 (1976) 731-740
3
Binder, H., J. Chromatogr. 189 (1980) 414-420
2
109
GLUCIDE
Coloanele tip amino pot fi folosite att ca schimbtori slabi de anioni, fie ca
faze staionare pentru cromatografia n faz inversat sau n faz normal. n
ultimile dou cazuri este greu de apreciat dac separarea se ncadreaz n faz
normal sau inversat. Totui, pentru c retenia glucidelor scade, de obicei, odat
cu creterea coninutului de ap al fazei mobile, putem considera c este vorba de
cromatografie n faz normal.
Analiza oligozaharidelor folosind coloane amino
Coloana
Spheri-5 amino (100 x 4.6mm)
Faza mobil Acetonitril - ap (75:25)
Gradient
Nu
Viteza
2,0 mLmin1
volumetric
Temperatura Camerei
Detecie
Indice de refracie
Proba
1. Glucoz, 2. Zaharoz, 3.
Maltoz, 4. Lactoz, 5. Melibioz,
6. Maltotrioz.
COLOANE
AMINO MODIFICATE FIZIC
n aceast tehnic o mic cantitate dintr-o alchil-amin este adugat la faza

mobil astfel nct perlele de silicagel se vor acoperi prin adsorpie1. Printre
aminele folosite pentru acoperirea silicagelului amintim amine polifuncionale2,
diamine i monoamine3 i tetraetilenpentamina, care este i cea mai folosit.
Concentraia tipic a tetraetilenpentaminei folosit n faza mobil este 0,01%, cu
1
White, C.A., Corran, P.H., Kennedy, J.F., Carbohydr. Res., 87 (1981) 165-173
Aitzetmuller, K. Koch, J., J. Chromatogr., 145 (1978) 195-202
3
Wheals, B.B., White, P.C., J. Chromatogr., 176 (1979) 421-426
2
110
VASILE OSTAFE
toate c pre-echilibrarea se poate realiza la 0,1%1. Deoarece pH-ul rezultat este 9,2
pentru a se evita dizolvarea silicagelului se recomand folosirea unei coloane de
protecie sau saturarea fazei mobile cu silicagel.
Optimizarea unor astfel de sisteme implic studiul compoziiei fazei mobile2,
influenei pH-ului3, a concentraiei modificatorului aminic, a viteze volumetrice,
etc.4
Figura alturat prezint un exemplu de separare a oligozaharidelor dintr-un
extract de plante. n condiiile experimentale reaciile chimice nedorite dintre
modificatorul aminic i componentele probei au fost neglijabile5.
Analiza oligozaharidelor folosind coloane
amino modificate fizic
Coloana
LiChrosorb Si 60 5 m (250 x 4.0
mm)
Faza mobil Acetonitril - ap (75:25) ce coninea 0,01% modificator aminic
Gradient
Nu
Viteza
3,0 mLmin1
volumetric
Temperatura Camerei
Detecie
Indice de refracie
Proba
Ri - riboz, X - xiloz, F - fructoz,
G - glucoz, S - zaharoz, Ma maltoz, L - lactoz, Mb melibioz, Mt - maltotrioz.
Aitzetmuller, K., Chromatografia., 13 (1980) 432-436

Krull, I.S., Sebag, A., Stevenson, R., J. Chromatogr. A., 887 (2000) 137-163.
3
Vendrell-Pascuas, S., Castellote-Bargallo, A.I., Lopez-Sabater, M.C., J. Chromatogr. A., 881 (2000)
591-597.
4
Hendrix, D.L., Lee, R.E., Baust, J.G., James, H., J. Chromatogr., 210 (1981) 45-53
5
Wight, A.W., van Niekerk, P.J., Food. Chem., 10 (1983) 211-224
2
111
COLOANE
GLUCIDE
SCHIMBATOARE DE CATIONI
Multe firme de specialitate comercializeaz kit-uri ce conin coloane i faze

mobile "speciale" pentru separarea glucidelor. Aceste coloane sunt de fapt polimeri
micti reticulai stiren-divinilbenzen la care s-au ataat grupri acide ce
funcioneaz ca schimbtori puternici de cationi (cel mai adesea sulfo-propil).
Coloanele pot opera pe un domeniu larg de pH i la temperaturi de pn la 85C.
Contraionul cel mai des folosit este Ca2+. Coloanele sunt mai nti echilibrate cu
faza mobil ce conine 1 mM acetat de calciu (timp de echilibrare de aproximativ
12 ore), dup care se trece la o concentraie de numai 0,1 mM acetat de calciu. n
unele cazuri faza mobil conine diferite concentraii de acetonitril (ajungnd chiar
i la 80%). Schimbarea contra-ionului ofer o selectivitate diferit care poate fi
benefic pentru anumite tipuri de probe1.
Analiza oligozaharidelor folosind coloane schimbtoare de ioni
Coloana
Polypore CA (220 x 4.6 mm)
Faza mobil ap
Gradient
Nu
Viteza
0,3 mLmin1
volumetric
Temperatura 85C
Detecie
Indice de refracie
Proba
1. Maltotrioz, 2. Maltoz,
3. Glucoz, 4. Fructoz, 5.
Manitol, 6. Riboz.
Acest tip de cromatografie, numit uneori i cromatografie de schimb de

ligand, are largi aplicaii n special n analiza buturilor rcoritoare i a produselor
dietetice. Furanozele i piranozele sunt legate de ionii metalici prin intermediul
unor compleci de coordinare. Stabilitatea complecilor de coordinare este
1
Kawamoto, T., Okata, E., J. Chromatogr., 258 (1983) 284-288
112
VASILE OSTAFE
determinat de aranjamentul steric al gruprilor hidroxi ale carbohidrailor i de

cationul metalic. Afinitatea pentru carbohidrai crete n ordinea Na+ < Ca2+ < Pb2+.
Pentru separarea carbohidrailor i a polialcoolilor eluarea se face cu ap, n sistem
presurizat, la temperaturi de 80 - 90C.
Pentru separarea mono- i dizaharidelor, ct i a polialcoolilor se utilizeaz n
special forma "calciu" (cum ar fi Polyspher CH CA) sau "plumb" (Polyspher, CH
PB). Faza "sodiu" (Polyspher CH NA) are o selectivitate special pentru separarea
oligozaharidelor pn la 8 uniti monoglucidice. Oligozaharidele sunt separate
printr-un mecanism de excludere molecular.
Dac contraionul este OH (ca n Polyspher CH OH), suportul de polistiren divinilbenzen sulfonat trebuie eluat cu o soluie de NaOH.
Pentru detecia monozaharidelor, amino-glucidelor i a derivailor amino ai
polialcoolilor, pe lng detectorul refractometric se poate folosi i detectorul
electrochimic cu puls amperometric. Acesta are o sensibilitate mult mai bun dect
detectorul indice de refracie i astfel, principalul inconvenient al deteciei directe a
glucidelor este n bun parte eliminat.
Analiza oligozaharidelor folosind
coloane schimbtoare de ioni
Coloana
Polyspher CH CA (300 - 6.5 )
Faza mobil Ap
Gradient
Nu
Viteza
0,5 mLmin1
volumetric
Temperatura 90C
Detecie
Indice de refracie
Proba
1. Maltotrioz, 2. Zaharoz, 3.
Glucoz, 4. Galactoz, 5.
Fructoz, 6. Manitol, 7
Arabinol, 8.Sorbitol.
113

Coloana
Polyspher CH PB (300 - 7.8 )
Faza mobil Ap
Gradient
Nu
Viteza
0,4 mLmin1
volumetric
Temperatura 90C
Detecie
Indice de refracie
Proba
1. Zaharoz, 2. Maltoz 3.
Glucoz, 4. Xiloz, 5.
Galactoz, 6. Arabinoz, 7.
Manoz.

Coloana
Polyspher CH NA (300 - 7.8 )
Faza mobil Ap
Gradient
Nu
Viteza
0,3 mLmin1
volumetric
Temperatura 75C
Detecie
Indice de refracie
Proba
Determinarea oligozaharidelor
din sirop de porumb
114
GLUCIDE
VASILE OSTAFE

Coloana
Polyspher CH OH (150 - 6.5 )
Faza mobil 0,01 N NaOH
Gradient
Nu
Viteza
0,5 mLmin1
volumetric
Temperatura 85C
Detecie
Puls amperometric
Proba
1. Zaharoz, 2. Glucoz, 3.
Arabinoz,
COLOANE
N FAZ INVERSAT
HPLC n faz inversat este doar ocazional folosit pentru cromatografierea

zaharidelor1,2. Deoarece coloanele n faz inversat fiind cel mai des folosite este de
presupus c exist n oricare laborator ce deine un sistem HPLC. Dac analiza de
glucide nu este o analiz de rutin, atunci nu se justific achiziionarea unei coloane
speciale pentru glucide i se poate folosi coloana n faz inversat. HPLC n faz
inversat a fost folosit n special pentru separare oligozaharidelor i separarea est
dependent de gradul de polimerizare3. Pentru a crete capacitatea i selectivitatea
pentru zaharide se pot folosi modificatori organici, cum ar fi n-alchilaminele4.
Tian, Q.G., Ding, X.L., J. Chromatogr. A., 874 (2000) 13-19.

596-600.
3
Cheethan, N.W.H., Sirimanne, P., Day, W.R., J. Chromatogr., 207 (1981) 739-444
4
Lochmuller, C.H., Hill, W.B.Jr., J. Chromatogr., 264 (1983) 215-222
2
115
GLUCIDE
Analizele HPLC ale oligozaharidelor din esuturile animale sau din fluidele
biologice au fost folosite pentru determinarea distribuiei masei lor moleculare1.
Majoritatea separrilor oligozaharidelor complexe au fost realizate folosind att
coloane amino care separ moleculele pe baza lungimii lanului (ca cele menionate
mai sus sau Aminex 87C, 7 m, 200 x 7,8 mm, forma calciu) ct i coloane n faz
inversat. Sistemele n faz inversat sunt n special utile deoarece sunt sensibile la
diferenele stereochimice ale moleculelor2. Multe oligozaharide care sunt prezente
ca pri ale glicoproteinelor sunt ncrcate negativ datorit prezenei resturilor de
acid sialic, fosfat sau sulfat. n acest caz se poate utiliza cu succes HPLC de schimb
anionic.
n cazul coloanelor amino, eluarea se face cu amestec ap - acetonitril ce
conine 3% acetat de trietilamoniu (pH 5,5). n acest caz glicoproteinele sunt
separate n funcie de coninutul net de carbohidrai. Adugarea de sare duce la
supresia ionic3.
Printre aplicaiile care au beneficiat de analize HPLC ale glucidelor se
numr separarea oligozaharidelor izomerice din glicoproteine4, cuantificarea
acidului hialuronic5, diagnosticul unor boli ereditare lizozomale prin evidenierea n
urin a unor cantiti mari de manoz6, sau de galactozil oligozaharide1, etc.
1
Urashima, T., Kawai, Y., Nakamura, T., Arai, I., Saito, T., Namiki, M., Yamaoka, K., Kawahawa, K.,
Messer, M., Comp. Biochem. Physiol. C-Pharmacol. Toxicol. Endocrinol., 124 (1999) 295300.
2
Arbatsky, N.P., Likhosherstov, L.M., Serebryakova, M.V., Brusov, O.S., Shibaev, V.N.,
Derevitskaya, V.A., Kochetkov, N.K., Bioorg. Khim., 26 (2000) 51-60.
3
Mellis, S.J., Baenziger, J.U:, Anal., Biochem., 114 (1983) 276-280
4
Bergh, M.L.E., Koppen, P.L., Van den Eijnden, J., Anarp, J., Lonngren, J., Carbohydr. Res., 117
(1983) 275-278
5
Nebinger, P., Koel, M., Franz, A., Werries, E., J. Chromatogr., 265 (1983) 19-25
6
Warren, C.D., Schmidt, A.S., Jeanloz, R.W., Carbohydr. Res., 116 (1983) 171-182
116
VASILE OSTAFE
Multe proteine sunt modificate post-translaional prin adugarea de

oligozaharide cu structuri complicate. Aceste oligozaharide pot avea efecte drastice
asupra proprietilor chimice i biologice ale proteidei. Analiza prii glucidice este
destul de dificil de realizat, fiind necesare analize speciale i personal de nalt
calificare. Multe firme comercializeaz kit-uri speciale pentru analiza
carbohidrailor glicoproteinelor. Acest kit-uri sunt concepute pentru a putea fi
folosite cu aparatura comun din laboratoarele de cercetare biochimic.
O prim etap n analiz prii
glucidice a glicoproteinelor este eliberarea enzimatic a oligozaharidelor. n
majoritate cazurilor glucidele sunt legate
de protein printr-o legtur amidic de
azotul unei asparagine. Hidroliza se realizeaz cu o peptid-N-glicozidaz (cum
ar fi peptid-N-glicozidaza F, notat
PNG-aza F). Aceast reacie convertete
Asn n Asp. Oligozaharidele libere sunt
marcate cu 2 molecule de 1-fenil-3metil-5-pirazolona (PMP) la poziia
reductoare anomeric. PMP este un
cromofor permind detecia uoar a
glucidelor astfel marcate. n contrast cu
condiiile dificile cerute de ataarea 2aminopiridinei i a altor reactivi de
derivatizare a carbohidrailor, condiiile
blnde cerute de derivatizarea cu PMP
rein activitatea biologic a resturilor de
acid sialic. Derivaii PMP pot fi separai
i analizai prin HPLC.
1
Warner, T.G., Robertson, A.D., O'Brien, J.S., Clin. Chim. Acta, 127 (1983) 313-326
117
GLUCIDE
a) Separarea HPLC a
-1,4-poliglucozei
derivatizat cu fenilmetil pirazolon.
b) Separarea HPLC a
oligozaharidelor
marcate cu fenil-metilpirazolon
din
ribonucleaza B.
Separrile s-au realizat
pe coloan CHO C-18,
5 m (220 x 2,1 mm)
a)
118
b)
N
DEE
TIID
OT
CLLEEO
NU
UC
Una dintre primele aplicaii ale cromatografiei de lichide a fost separarea

nucleozidelor1 i aceste rezultate au ajutat mult rapida dezvoltare i nelegere a
biochimiei acizilor nucleici. Analizele HPLC ale componentelor acizilor nucleici
pot fi mprite n mai multe seciuni n funcie de natura chimic a acestor componente.
Nucleotidele sunt structurile chimice de baz ce formeaz acizii nucleici2. O
nucleotid este format din trei elemente principale: o baz azotat (purinic adenin, guanin, sau pirimidinic - citozin, timin, uracil), ataat printr-o
covalen pornind de la unul din atomii de azot, direct de atomul de carbon 1' al
unei pentoze (riboza sau dezoxiriboza) care la rndul su formeaz prin intermediul
hidroxilului din poziia 5' (uneori i n alte poziii, cum ar fi 3' sau 2') esteri
fosforici. Nucleozidele conin doar baza azotat i pentoza (nu i gruprile fosfat).
Acizii nucleici sunt formai din niruirea nucleotidelor legate prin legturi
1
2
Cohn, W.E., Science, 109 (1949) 377-378

1999
NUCLEOTIDE
fosfodiesterice 5' - 3'. Timina, sau 5-metiluracilul, se gsete n ADN, dar de obicei
nu i n ARN, n timp ce uracilul este prezent n ARN, dar foarte rar n ADN.
Celelalte baze azotate se gsesc n ambele tipuri de acizi nucleici.
O alt diferen ntre ADN i ARN este dat de pentoza din structura
nucleotidelor: 2-dezoxi-D-riboza i respectiv D-riboza.
Exist un numr destul de mare de derivai modificai chimic ai
nucleotidelor. Ei au importante funcii biologice, iar unii dintre aceti compui sunt
folosii n tratamentul infeciilor virale i al cancerului.
Pentru separarea bazelor azotate, nucleozidelor, nucleotidelor (i chiar a
acizilor nucleici) s-au folosit n special trei dintre cele mai comune tehnici HPLC:
cromatografia de schimb ionic, cromatografia n faz inversat i cea perechiionice.
Valorile pK' ale bazelor nucleozidelor
Valorile pK' pentru baze azotate i
joac un rol important n alegerea
nucleotide
tipului de cromatografie i a
pKa
pKb
condiiilor de lucru.
Baze
Adenina
4,15
9,8
Adenina
NH
O Guanina
Guanina
3,20
9,6
Dezoxiriboza
C
C
N
N
C
N
C
NH
Hipoxantina
2,00
8,9
O
HC
HC
C
CH
C
C
N
Xantina
0,80
7,5
NH
CH
HO
P
O
N
NH
N
O
Citozina
4,45
12,2
HC
OH
CH
O
CH
CH
Timina
Uracil
3,40
9,5
HC
C
OH
C
NH
Timina
9,9
Acid dezoxidenozin monofosforic
HC
C
Nucleozide
O
NH
NH
Citozina
Adenozina
3,50
12,5
C
O
HC
N
Guanozina
1,60
9,2
O
C
HC
C
Inozina
1,20
8,8
HC
NH
N
O
P
CH
HO
O
O
HC
C
Xantozina
<2,50
5,7
HC
CH
OH
O
NH
Citidina
4,15
12,5
CH
CH
Uracil
Riboza
Uridina
9,2
OH
OH
Acid citozin monofosforic
Timidina
9,8
2
120
VASILE OSTAFE
Extracia nucleotidelor i nucleozidelor din probele biologice este, n mod

convenional, realizat prin omogenizare n acid percloric, la temperatura de 0C.
Dei mai puin folosit, acidul tricloracetic este adesea menionat1. Aceti acizi au
avantajul c precipit proteinele din probele biologice, lsnd nucleotidele
nealterate n supernatant, de unde pot fi separate prin centrifugare. Supernatantul
poate fi apoi neutralizat cu o soluie alcalin. Alternativ, proteinele pot fi
ndeprtate prin tratarea probei cu acetonitril la 0C. Proteinele pot fi ndeprtate i
prin ultrafiltrare, eliminnd i mai mult riscul de a altera nucleotidele sau
nucleozidele de interes.
Dezoxiribonucleozidele pot fi separate de ribonucleozide folosindu-ne de
faptul c au pri glucidice diferite. Acidul periodic reacioneaz cu gruprile
hidroxil vicinale (cis-diol) ale ribonucleozidelor asigurnd ndeprtarea lor2.
Alternativ, ribonucleozidele pot fi adsorbite pe o coloan boronat (ex. Affi-Gel
601) la pH bazic i eluate cu acid formic 0,1 M3.
Metoda clasic pentru identificarea peak-urilor eluate ale nucleozidelor este

de a folosi timpii de retenie i de a suplimenta (spiking) proba cu compui standard
de referin. n plus, tratamentul chimic cu periodat poate fi folosit pentru
identificarea ribonucleozidelor prin observarea peak-urilor care nu mai apar pe o a
doua cromatogram4.
1
Maybaum, J., Klein. F.K., Sadee, W., J. Chromatogr., 188 (1980) 149-158
Garrett, C., Santi, D.V., Anal. Biochem., 99 (1979) 153-177
3
Colonna, A., Russo, T., Esposito, F., Salvator, F., Cimino, F., Anal. Biochem., 130 (1983) 19-26
4
Hartwick, R.A., Krstulovic, A.M., Brown, P.R., J. Chromatogr., 186 (1979) 659-676
2
121
Similar, modificarea enzimatic

poate fi de ajutor ntr-un numr
de cazuri specifice1. Dispariia
unui peak, sau scderea ariei
peak-ului corespunztor substratului sau creterea ariei peak-ului
corespunztor produsului pot
ajuta la identificarea compuilor.
Rapoarte spectrale
Compus
A254/A280
Adenozina
4,71
1-metiladenozina
4,33
Citidina
0,92
3-Metilcitidina
0,33
5-Metilcitidina
0,51
Guanozina
1,60
1-Metilguanozina
1,84
2-Metilguanozina
1,80
7-Metilguanozina
1,36
Inozina
5,89
1-Metilinozina
3,66
Pseudouridina
2,17
4-Tiouridina
1,736
Uridina
2,55
NUCLEOTIDE
Folosirea modificrii enzimatice

Enzima
Substrat
Produs
Fosfataza alcalin
Nucleozid
monofosfatul
Nucleotid
Nucleozid
Fosfataza acid
Nucleotid
Nucleozid
Xantin oxidaza
Hipoxantina
Xantina
Xantin oxidaza
Adenozin
deaminaza
Guanaza
Xantina
Acid uric
Adenozina
Inozina
Guanina
Xantina
Adenozin kinaza
Adenozina
AMP
5'-Nucleotidaza
Nucleozid
Raportul spectral - raportul valorilor absorbanelor la

2 lungimi de und este o modalitate alternativ mult
folosit pentru identificarea compuilor. n cazul nucleotidelor i nucleozidelor se folosete raportul spectral A254/A280. Cteva valori caracteristice ale celor
mai des ntlnite nucleotide sunt prezentate n tabelul
alturat. Derivaii nucleozidelor obinui din probe
biologice sunt, cel mai adesea, n concentraii foarte
mici, ceea ce ridic probleme att la identificarea ct
i la cuantificarea lor. Pentru a crete sensibilitatea
metodei se folosesc diferite metode de derivatizare.
Cloroacetaldehida reacioneaz specific cu adenina i
compuii nrudii, iar produsul de reacie - 1,N6etenoadenina emite o puternic fluorescen la 410
nm.
Zakaria, M., Brown, P.R., J. Chromatogr., 226 (1981) 167-290
122
VASILE OSTAFE
Bazele azotate din structura acizilor nucleici sunt adesea analizate n prezena
nucleozidelor corespunztoare, deoarece metodele cromatografice pot discrimina
ntre cele dou categorii de substane. Dei iniial separarea acestor substane se
fcea prin cromatografie de schimb ionic datorit gruprilor ionizabile1 actualmente
cromatografia n faz inversat este tot mai des folosit2.
Analiza unor baze azotate purinice i pirimidinice
prin cromatografie n faz inversat
Inertsil 5 ODS-2, 150 x 4.6mm
Coloana
0,1 M H3PO4 + 0,2 M NaClO4, pH
Faza
2.0
mobil
Gradient
Nu
Viteza
1 mLmin1
volumetric
Temperatura
Detecie
Proba
40C
UV@260 nm
1. citozin 2. uracil 3. Guanin 4.
adenin 5. citidin 6. Uridin 7.
timin 8. Adenozin 9. Guanozin
10. Timidin
Investigaii exhaustive privind comportamentul cromatografic al bazelor

azotate din acizi nucleici ct i a altor compui ce absorb n domeniul ultraviolet au
indicat separarea a 86 de compui3. Folosind o coloan ODS i un gradient tampon
1
Floridi, A., Palmerini, C.A., Fini, C., J. Chromatogr., 138 (1977) 203-212
Ichishima, E., Biosci. Biotechnol. Biochem., 64 (2000) 675-688.
3
Hartwick, R.A., Krstulovic, A.M., Brown, P.R., J. Chromatogr., 186 (1979) 659-676
2
123
NUCLEOTIDE
fosfat - metanol s-au separat 28 de compui i s-au stabilit relaii ntre structurile
chimice i timpii de retenie ai derivailor din seriile purinic i pirimidinic ceea ce
a permis prezicerea timpilor de retenie din structura chimic.
Determinarea exact a concentraiilor metaboliilor purinici i pirimidinici
ntr-o mare varietate de lichide biologice a permis studierea unui mare numr de
boli i sugerarea unor abordri terapeutice. Probele de urin a fost filtrate i
analizate direct. Serul i plasma au fost deproteinizate prin precipitare cu acid
percloric i neutralizate nainte de injectare. S-au folosit diferite tipuri de coloane
ODS-2 i eluii cu tampoane fosfat (0,05M, pH 5,6) n amestec cu metanol, sau
sulfat de amoniu (pH 3,5) cu metanol sau acetonitril. n separarea bazelor azotate
tampoanele acetat dau eficiene mai sczute dect cele fosfat.
prin cromatografie n faz inversat perechi ionice
Bondapak C18, 300 x 4mm
Coloana
0,1N Formiat de amoniu: acetonitril
Faza
100:1
mobil
Tampon A: 0,1 mM tetrabutilamonium
Gradient
hidrogen sulfat (C16), 2,5 mM
0-30 min
30-50 min
tetraetilamoniu bromur (C8) i 2%

metanol n 2 mM acetat de sodiu, 1,5
mM tampon fosfat, pH 6,0.
Tampon A + 30 mM fosfat
Viteza
1 mLmin1
volumetric
Temperatura Camerei
Detecie
UV@254 nm
FU - fluorouracil, FUR - fluorouracil ribozid,
FUdR - Fluorouracil dezoxiribozid, FUMP fluorouridin 5'-monofosfat, 5'dFUR - 5'-dezoxifluorouracil ribozid, FdUMP - dezoxifluorouridin monofosfat, UDPG - uridin
difosfoglucoz, UDP - uridin difosfat, dUDP dezoxiuridin monofosfat , UTP - uridin
trifosfat.
124
VASILE OSTAFE
Cromatografia n faz inversat este adecvat pentru majoritatea separrilor

bazelor azotate, dar n cazul unor baze modificate chimice rezoluia fa frontul
solventului poate deveni o problem. Aceasta este rezolvat prin folosirea
cromatografiei n faz inversat perechi-ionice. Astfel, folosind o faz mobil ce
coninea 5 mM acid heptan-sulfonic (pH 5,6) s-a rezolvat separarea citozinei i 5metilcitozinei.
Separarea nucleozidelor i a bazelor azotate corespunztoare a fost realizat
i pe coloane de silicagel nemodificat, folosind amestecuri de diclormetan, metanol
i tampoane n mediu apos. Solubilitatea sczut a nucleozidelor n astfel de
sisteme a redus aplicabilitatea la probe foarte diluate.
Coloana
PHRP Polymer Reverse

Column, 150 x 4.6mm
Faza mobil

100:1
Gradient
Nu
1 mLmin1
Viteza
volumetric
Temperatura
Detecie
Proba
Phase
Camerei
UV@254 nm
1.
citozin
2.
uracil
3.
hipoxantin, guanin, xantin 4.
adenin 5. timin
125
NUCLEOTIDE
Nucleozidele joac un rol vital un majoritatea sistemelor biologice, nu numai

ca precursori ai ADN i ARN dar i ca regulatori metabolici. Prin urmare,
cuantificarea i analiza HPLC a nucleozidelor n fluidele biologice pot s furnizeze
informaii preioase asupra funciei lor. Analiza componentelor majore i minore ale
ADN i ARN este cel mai convenabil realizat la nivelul nucleozidelor1.
n trecut, separrile HPLC ale nucleozidelor se realizau n diferite moduri,
inclusiv cromatografia schimbtoare de anioni2 sau de cationi1. Totui, n ultima
vreme se folosete tot mai mult cromatografia n faz inversat. Condiiile
cromatografice tipice pentru separarea nucleozidelor includ folosirea de tampoane
fosfat diluate, cu modificatori organici ca metanolul sau acetonitrilul pe faze
staionare ODS.
Analiza unor nucleozide prin cromatografie
n faz inversat
Coloana
pHRP Polymer Reverse

Column, 150 x 4.6mm
Faza
mobil
Gradient

100:1
Viteza
volumetric
Temperatura
Detecie
Proba:
(10 L)
1
2
Phase
Nu
1 mLmin1
Camerei
UV@254 nm
1. citidin 2. uridin 3. inozin 4.
guanozin 5. xantozin 6.
timidin 7. adenozin
Davis, G.E., Gehrike, C.W., Kuo, K.C., Agris, P.F., J. Chromatogr., 173 (1979) 281-298
Floridi, A., Palmerini, C.A., Fini, C., . J. Chromatogr., 138 (1977) 203-212
126
VASILE OSTAFE
Efectul pH-ului
Variaia pH-ului ntre 4 i 8 nu influeneaz major timpii de retenie ai
nucleotidelor. Exist o uoar tendin de mrire a timpilor de retenie pe msur ce
pH-ul crete, dar efectele sunt mai vizibile la nucleozidele al cror pK' se afl n
acest domeniu de pH2. De exemplu, 3-metilcitidina, 5-metilcitidina, 1metiladenozina, adenozina i 7-metilguanozina au urmtoarele valori de pK'a 8,7;
4,3; 7,6; 3,5 i respectiv 7,1 i prin urmare timpii lor de retenie se vor schimba
disproporional, pe msur ce ctig sau pierd sarcina lor. Deci, pH-ul poate fi
folosit pentru a se modifica selectivitatea sistemului cromatografic.
Efectul modificatorului organic
Creterea concentraiei solventului organic n faza mobil de la 0 la 100%
scade retenia nucleotidelor comune ntr-o manier logaritmic. Nucleotidele au
fost mprite n patru grupe n funcie de rspunsul lor fa de creterea
concentraiei metanolului; n interiorul fiecrei grupe exist o mic variaie a
selectivitii3.
Efectul Temperaturii
Timpii de retenie ai nucleozidelor scad ca o funcie liniar odat cu creterea
temperaturii pe domeniul 25 - 55C. Eficiena coloanei crete odat cu creterea
temperaturii.
Folosirea cromatografiei de afinitate cu acid boronic s-a dovedit a fi util
pentru separarea ribonucleozidelor i ribonucleotidelor, care conin grupri 2',3'-cisdiol de moleculele ce nu conin hidroxili vicinali cum sunt dezoxiribonucleozide i
nucleozidele 2',3'-ciclic-fosfai. La pH alcalin moleculele ce conin grupri hidroxil
1
Breter, H.J., Seibert, G., Zahn, R.K., J. Chromatogr., 140 (1977) 251-256
Ostafe, V., Chiriac., A., Jastorff, B., Annals of Western University of Timisoara, ser.chim. 4 (1995) 116.
3
Gehrke, C.W., Kuo, K.C., Zumwalt, R.W., J. Chromatogr., 188 (1980) 129-147
2
127
NUCLEOTIDE
vicinale vor forma un complex cu gruprile boronat de pe faza staionar1. Prin

scdere pH-ului fraciile adsorbite pot fi eluate iar tampoanele volatile sunt apoi
ndeprtate pentru a se permite liofilizarea probelor2. Tehnica a fost adaptat pentru
folosirea coloanelor HPLC prin ataarea de grupri benzen-boronice prin
intermediul unor brae spaiatoare3. Exist i suporturi comerciale gata preparate,
cum ar fi Bio-Rad Affi-Gel 601.
Separarea de Nucleozide din probe biologice
Relativ puine articole au raportat estimri ale nucleozidelor n celulele
animale folosind HPLC. Totui, starea metabolic a celulelor poate fi determinat n
acest fel i monitorizat evoluia unor boli.
n prezena unor cantiti mari de nucleotide (ca n cazul celulelor inimii)
determinarea nucleozidelor poate fi realizat dup o purificare pe un schimbtor de
anioni. Separarea nucleotidelor poate fi apoi realizat prin cromatografie n faz
inversat.
Majoritatea moleculelor de ADN, att de origine procariot sau eucariot,
conin unele baze minore metilate ca produi ai unor procese post-replicaionale. 5Metilcitozina i N6-metiladenina apar adesea n procariote, pe cnd n eucariotele
superioare apare doar primul dintre ele4. Coninutul acestor baze minore variaz
ntre 0,05% i 7% n funcie de organism. Metilarea ADN prin diferii ageni este
suspectat a fi implicat n formarea tumorilor i prin urmare determinarea
nucleozidelor metilate n probele de ADN este foarte important. Metodele bazate
1
Hageman, J.H., Kuehn, G.D., Anal. Biochem., 80 (1977) 547-554

Buck, M., Connick, M., Ames, B.N., Anal. Biochem., 129 (1983) 1-13
3
Glad, M., Ohlsen, S., Hansson, L., Mansson, M.-O, Mosbach, K., J. Chromatogr., 200 (1980) 254260
4
Hall, R.H., in "The Modified Nucleosides in Nucleic Acids", Columbia University Press, New York,
NY, 1971, p. 281-294
2
128
VASILE OSTAFE
pe cromatografia pe hrtie i strat subire au fost treptat nlocuite cu cromatografia

de schimb ionice i HPLC n faz inversat.
Analiza unor nucleozide prin cromatografie
n faz inversat
Zorbax TMS (6 m, 250 x
Coloana
4,6 mm)
Faza
mobil
2% metanol n 4 mM fosfat de
amoniu monoacid i 4 mM
fosfat de amoniu diacid, pH 4,0
Gradient
Nu
1 mLmin1
Viteza
volumetric
Temperatura
Detecie
Proba:
35C
UV@254 nm
1. Citidin, 2. Dezoxicitidin, 3.
Inozin, 4. Guanozin 5. 5-Metildezoxicitidin, 6. Dezoxiinozin, 7. Dezoxiguanozin, 8. 7Metilguanozin, 9. Timidin,
10. Adenozin, 11. 1-Metilguanozin, 12. 7-Metildezoxiguanozin, 13. 6-Metiladenozin,
14.
1-Metildezoxiguanozin,
15. 2,2-dimetilguanozin, 16. 6Metiladenozin, 17. 2,2-Dimetildezoxiguanozin, 18. 6-Metildezoxiadenozin.
Componentele majore i minore ale ADN pot fi separate prin eluare

izocratic pe o coloan de trimetilsilan (Zorbax TMS). Practic n 14 minute marea
majoritate a componentelor sunt eluate.
129
NUCLEOTIDE
Baze modificate apar n mod natural n multe tipuri de ARN i n mod

particular n ARNt, unde pot reprezenta 25% din numrul total al nucleozidelor.
Bazele minore apar n ARNt prin modificri post-transcripionale, dar funcia lor nu
este clar. Deoarece nucleozidele modificate nu sunt salvate prin procesele naturale,
cuantificarea lor n probele biologice poate fi considerat o modalitate de
monitorizare a anomaliilor metabolice ale acizilor nucleici. Eliberarea
componentelor nucleozidelor din ARNt se poate realiza prin hidroliz cu nucleaza
P1 i fosfataz alcalin.
Nucleotidele sintetice i-au gsit interesante aplicaii n tratamentul
diferitelor boli. De exemplu, nucleozidele pirimidinice 5-substituite sunt folosite ca
ageni antivirali, iar arabinocitidina este folosit n terapia cancerului. Cuantificarea
acestor compui i a metaboliilor lor n probele biologice este esenial pentru
optimizarea tratamentelor. Separarea amestecurilor de ribozil, dezoxiribozil i
arabinozil-purine se poate realiza fr folosirea acidului periodic sau a acidului
boric.
Nucleotidele joac un rol central n reglare cilor metabolice i cuantificarea

lor n probele biologice are o foarte mare importan practic. Exist o mare
varietate de nucleotide (de exemplu cele patru nucleozide majore i derivaii lor
mono-, di-, tri- tetra- sau ciclic-fosfai) i separarea, identificarea i cuantificarea lor
este dificil deoarece ele sunt foarte similare din punct de vedere fizico-chimic.
Influena chimic dominant provine din prezena gruprilor fosfat care sunt
ionizate pe un domeniu larg de pH, motiv pentru care multe separri de nucleotide
s-au realizat prin cromatografie de schimb ionic. Totui, actualmente exist o
tendin tot mai mare de a se folosi cromatografia n faz inversat pentru separarea
nucleotidelor datorit mai marii flexibiliti i a opiunilor n alegerea fazei mobile
n acest tip de cromatografie1.
1
Brockstedt, U., Pfau, W., Chromatographia., 50 (1999) 547-552.
130
VASILE OSTAFE
HPLC schimb ionic

Tipic, nucleotidele pot fi separate pe un schimbtor puternic de anioni, cum
este Partisil 10-SAX, folosind ca faz mobil un tampon ce conine acid fosforic.
De exemplu, pe o coloan Partixil 10-SAX folosind un gradient de la 0,007 M
KH2PO4 (pH 4,0) la 0,25 M KH2PO4 (pH 4,5) pe o perioad de 80 minute s-au
separat mono-, di-, i trifosfaii adenozinei, citozinei, guanozinei, inozinei, uridinei
i timidinei1.
Selectivitatea cromatografiei de schimb-ionic pentru separrile de nucleotide
este puternic influenat de modificrile de pH ale fazei mobile i prin urmare
acesta poate fi modificat pentru a se asigura separarea corespunztore a amestecului
analizat2. Cea mai bun selectivitate se obine la valori de pH ntre 3,5 i 5,53. n
cazul separrilor preparative se recomand folosirea unui tampon volatil cum ar fi
carbonatul de amoniu sau acetatul de amoniu4.
Analiza unor nucleotide prin cromatografie de schimb ionic
Partisil 10-SAX (250 x 4,6
Coloana
mm)
Faza
mobil
Gradient
Viteza
volumetric
Temperatura
Detecie
Proba:
Tampon A: 7 mM fosfat
monosodic, pH 3,8; tampon B:
250 mM fosfat monosodic, pH
4,5
A pentru 6 min; gradient linear
pentru 30 min; B pentru 10 min.
3 mLmin1
Camerei
UV@254 nm
1. CMP, 2. AMP 3. UMP, 4.
GMP; 5. 5-UDP, 6. CDP, 7.
ADP, 8. GDP, 9. UTP, 10. CTP,
11. ATP, 12. GTP
Hartwick, R.A., Brown, P.R., J. Chromatogr., 112 (1975) 695-657

Kmiec, Z., Smolenski, R.T., Zych, M., Mysliwski, A., Acta Biochim. Pol., 47 (2000) 349-353.
3
Ericson, A., Niklasson, F., De Verdier, C.-H., Clin. Chim. Acta, 127 (1983) 47-59
4
Linz, U, J. Chromatogr., 260 (1983) 161-163
2
131
NUCLEOTIDE
HPLC n faz inversat

La valori de pH folosite n mod uzual n cromatografia n faz inversat
nucleotidele sunt ncrcate negativ i acest mod de cromatografie este folosit mai
ales pentru "separri de grup" n care proba conine componente ce difer mult ntre
ele n ce privete proprietile lor fizico-chimice. Nucleotidele individuale nu sunt
reinute pe fazele staionare n cromatografia n faz inversat1. Folosirea apei ca
faz mobil face ca nucleotidele monofosforilate n poziiile 2' sau 3' s fie eluate n
void, iar nucleotidele ciclice (AMPc) sunt slab reinute. Creterea triei ionice a
fazei mobile (adugare de acid fosforic la tamponul de eluare) duce la creterea
reinerii nucleotidelor individuale i rezolvarea lor. Prin adugarea de modificator
organic (metanol, acetonitril) n concentraii mici (5 10%) la tamponul fosfat (pH
5) se crete rezoluia separrii, cu meninerea unei linii de baz stabil2.
Analiza unor nucleotide prin cromatografie
n faz inversat
Ultrasphere 5m ODS (250
Coloana
x 4,6 mm)
Faza
mobil
Gradient
0,05 M fosfat diacid de amoniu,

pH 5,0 n metano-ap (10:90)
Viteza
volumetric
Temperatura
1,9 mLmin1
Detecie
Proba:
1
2
Nu
Camerei
UV@254 nm
1. 5'-ATP i 5'-ADP, 2. 5'-AMP
3. 2'-AMP, 4. 2',3'-AMPc, 5. 3'AMP, 6. 3',5'-AMPc, 7.
Adenozi
Brockstedt, U., Pfau, W., Chromatographia., 50 (1999) 547-552.

Debetto P., Bianchi, V., J. High Res. Chromatogr. Commun., 6 (1983) 117-122
132
VASILE OSTAFE
HPLC n faz inversat perechi-ionice

HPLC n faz inversat1 are n mod evident multe limitri (retenie redus i
rezoluie slab) n cazul separrii nucleotidelor, datorit faptului c majoritatea
nucleotidelor prezint sarcini negative la valorile de pH folosite n mod normal n
acest tip de cromatografie. Aceste probleme pot fi eliminate prin adugarea unui
reactiv ce formeaz perechi-ionice cu nucleotidele2. Astfel, folosirea unui gradient
de faz mobil ce coninea sulfat monoacid de tetra-n-burtilamoniu s-a reuit
separarea a 12 nucleotide3.
O comparaie ntre cromatografia de schimb ionic i cea n faz inversat
perechi-ionice indic faptul c nucleotidele sunt mai bine separate prin ce-a de-a
doua metod. n cazul analizei nucleotidelor din celulele bacteriene rezoluia
obinut a permis analiza efectelor condiiilor de cretere asupra nivelului
intracelular a nucleotidelor4.
Condiiile optime pentru separarea nucleotidelor folosind cromatografia n
faz inversat perechi ionice folosesc ca faz mobil tamponul fosfat (50 120
mM) ce conine fosfat de tetrabutilamoniu (0,5 2,0 mM). Concentraii mai mari
de 2,0 mM a contra-ionului duce la creterea pronunat a timpilor de retenie fr a
se mbunti rezoluia. Prin adugarea unui solvent organic (n special acetonitril)
se reduce timpii de retenie fr a se afecta semnificativ rezoluia. Variaia pH-ului
fazei mobile poate duce la modificarea selectivitii nucleotidelor nrudite
structural.
Su, Y., Hen, Y.Y., Chu, Y.Q., Van de Poll, M.E.C., Relling, M.V., J. Chromatogr. B., 732 (1999) 459468.
2
Monkkonen, H., Moilanen, P., Monkkonen, J., Frith, J.C., Rogers, M.J., Auriola, S., J. Chromatogr.
B. 738 (2000) 395-403.
3
Hoffman, N.E., Liao, J.C., Anal. Chem., 49 (1977) 2231-2235
4
Payne, S.M., Ames, B.N., anal Biochem., 123 (1982) 151-161
133
NUCLEOTIDE
Analiza unor nucleotide prin HPLC n faz inversat perechi-ionice

Ultrasphere 5m ODS (250
Coloana
x 4,6 mm)
Faza
mobil
Gradient
Viteza
volumetric
Temperatura
Detecie
Proba:
Tampon A: 5 mM fosfat de
tetrabutilamoniu, 4% acetonitril
i 50 mM fosfat diacid de
potasiu, pH 6,0
040% B pe o perioad de 60
min.
1,5 mLmin1
Camerei
UV@254 nm
1. 5'-ATP i 5'-ADP, 2. 5'-AMP
3. 2'-AMP, 4. 2',3'-AMPc, 5. 3'AMP, 6. 3',5'-AMPc, 7.
Adenozi
HPLC faz normal

Nucleotidele naturale sunt prea polare pentru a putea fi separate
corespunztor prin cromatografia n faz normal, dar nucleotidele modificate
chimic, care sunt folosite ca precursori pentru sinteza ADN, sunt mult mai puin
polare. n aceste molecule sintetice situsurile reactive sunt blocate i per ansamblu
moleculele sunt neutre, cu un caracter hidrofob destul de pronunat. n aceste cazuri
se poate folosi i cromatografia n faz normal1, dar datorit avantajelor legate de
uurina dezvoltrii metodei, cromatografia n faz inversat este de preferat. n
plus, fa de cromatografia n faz normal, ea are o serie de avantajele cum ar fi
selectivitatea i rezoluia foarte bun2.
Seliger, H., Bach, T.C., Gortz, H.H., Harpp, E., Holluirek, M., Seemann-Preising, B., Schiebel,
H.M., Schulten, H.R., J. Chromatogr., 253 (1982) 65-79
2
Wei, Y.N., Marino, M., Thompson, B., Girard, J.E., J. Chromatogr. A., 864 (1999) 49-57.
134
VASILE OSTAFE
Purificarea att a materialelor genetice naturale ct i cele sintetice este de

importan fundamental pentru cercetarea ADN recombinant1. De exemplu,
generarea fragmentelor de ADN de restricie prin digestia enzimatic iniial i
purificarea ulterioar permite analiza secvenelor sau a produsului de recombinare
genetic ce urmeaz a fi obinut2. n plus, separarea preparativ a fraciilor de
ARNm este foarte important pentru producerea i clonarea secvenelor
complementare de ADN3. De asemenea, de mare importan practic este separarea
oligonucleotidelor de produii secundari n procesul de sintez chimic a acizilor
nucleici.
Caracteristica predominant a acizilor nucleici n soluii apoase este natura
lor ionic datorit gruprilor fosfat, fcnd din aceste molecule candidai ideali
pentru separarea prin cromatografie de schimb ionic. Se folosesc i separrile n
faz inversat, care se bazeaz pe natura slab hidrofob a bazelor azotate din
structura acizilor nucleici. Deoarece acizii nucleici naturali apar n clase distincte
din punctul de vedere al maselor moleculare (ntre ARN ribozomal i ARN de
transfer) n multe situaii se poate aplica cu succes cromatografia de cernere
molecular.
HPLC DE SCHIMB IONIC
Separarea acizilor nucleici folosind schimbtori anionici puternici ca faze
staionare este o metod mult folosit1. Separrile depind de ncrcarea moleculelor
i de interacia lor cu gruprile amoniu teriare ataate de suportul de silicagel.
Metoda este ndeosebi util pentru separarea moleculelor relativ mici
1
Shaw-Bruha, C.M., Lamb, K.A., Biotechniques., 28 (2000) 794-797.

Jiang, P.H., Chany-Fournier, F., Chany, C., Biochimie., 81 (1999) 701-707.
3
Topp, H., Schoch, G., Pediatr. Res., 47 (2000) 163-168.
2
135
NUCLEOTIDE
(oligonucleotide ce conin mai puin de 25 nucleotide)2, deoarece rezoluia relativ

a ntre termenii n i n+1 descrete cu creterea lungimii lanului (n). forele
hidrofobe dintre solut i gruparea teriar de amoniu a fazei staionare pot s
influeneze separarea dar pot fi minimizate prin adugarea unui solvent organic la
faza mobil apoas. Trebuie avut n vedere i faptul c recuperarea moleculelor
lungi de pe coloanele schimbtoare de anioni este relativ redus datorit legrilor
ireversibile cu faza staionar.
Dei tampoanele fosfat dau bune rezultate, n separrile preparative ale
oligodezoxiribonucleotidelor, unde se impune eliminarea srurilor, trebuie avut n
vedere folosirea unor sruri volatile pentru obinerea fazelor mobile. Mai mult, n
cazul tampoanelor fosfat pot aprea probleme asociate interaciilor intra i
intermoleculare (legturi de hidrogen). Eliminarea acestora poate fi realizat prin
adugarea n faza mobil a formamidei3 sau a acetatului de trietilamoniu care poate
fi eliminat prin liofilizare i n care aceste interacii moleculare sunt limitate.
Modificarea in situ a silicagelului cu polietilenimin a indicat o cretere a
rezoluiei ce a permis separarea oligonucleotidelor lungi de pn la 35 nucleotide4.
Introducerea schimbtorilor de ioni sub form de microparticule cu pori mari a
extins utilizarea HPLC schimb ionic pentru molecule de pn la 500 nucleotide,
cum sunt fragmentele de ADN5.
O comparaie a cromatografiilor de schimb ionic, faz inversat i faz
inversat perechi-ionice pentru separarea fragmentelor mici de oligonucleotide a
indicat c cea mai bun rezoluie se obine n cazul schimbului ionic, dei timpul de
via al coloanelor pare s fie destul de redus6.
1
McLaughlin, V.L:, Romanuik, E., Anal. Biochem., 124 (1982) 37-44

Sato, H., Akama, K., Kojima, S., Miura, K., Sekine, A., Nakano, M., Protein Expr. Purif., 16 (1999)
454-462.
3
Newton, C.R., Greene, A.R., Heathcliffe, G.R., Atkinson, T.C., Holland, D., Markham, A.F., Edge,
M.D., Anal. Biochem., 129 (1983) 22-30
4
Pearson, J.D., Regnier, F.E., J. Chromatogr., 255 (1983) 137-149
5
Kato, Z., Nakamura, K., Hashimoto, T., J. Chromatogr., 266 (1983) 385-390
6
Haupt, W., Pingoud, A., J. Chromatogr., 260 (1983) 419-427
2
136
VASILE OSTAFE
Analiza unor oligonucleotide prin HPLC schimb ionic

Partisil 10 SAX (500 x 9,4
Coloana
mm)
Faza
mobil
Gradient
Tampon A: 1 M acetat de
trietilamoniu, pH 4,9; tampon
B: 4 M tampon A.
0100% B pe o perioad de 30
min.
Viteza
volumetric
Temperatura
3,0 mLmin1
Detecie
Proba:
50C
UV@254 nm
Un amestec de oligonucleotide
rezultat n urma unei sinteze
chimice. Peak-ul X corespunde
unei oligonucleotide ce conine
19 nucleotide.
HPLC N FAZ INVERSAT

Retenia oligonucleotidelor n cromatografia n faz inversat este
dependent de interaciile hidrofobe dintre bazele azotate i faza staionar.
Deoarece aceste interacii independente de natura bazelor, retenia este determinat
de sarcina relativ a moleculelor1. Cu ct aceast ncrcare este mai mare cu att
eluarea are lot mai rapid.
Separarea ribo- i dezoxiribonucleotidelor se poate realiza folosind un
gradient linear de acetonitril sau metanol e la 5% la 30% ntr-un tampon diluat de
acetat de trietilamoniu, la pH 7,52
Cromatografia n faz inversat poate fi utilizat la separarea
oligonucleotidelor sintetizate chimic, lsnd n mod deliberat o grupare protectoare
hidrofob pe oligonucleotida de interes, care n acest fel va fi reinut puternic i va
1
2
Huber, C.G., Krajete, A., Anal. Chem., 71 (1999) 3730-3739.

Schott, H., Mezer, H.D., Bazer, E., J. Chromatogr. , 280 (1983) 297-311
137
NUCLEOTIDE
putea fi separat de ceilali produi de reacie, mult mai polari. Ulterior, structura
naturalpoate fi regenerat prin ndeprtarea chimic a gruprii hidrofobe
protectoare1.
HPLC N FAZ INVERSAT PERECHI-IONICE
n cromatografia n faz inversat perechi-ionice sarcinile negative ale
gruprilor fosfat ale oligonucleotidelor sunt neutralizate prin adugarea ionilor
ncrcai pozitiv de alchilamoniu2. Cromatografierea se realizeaz pe o faz
staionar tip ODS. Metoda a fost aplicat i pentru determinarea lungimii
oligonucleotidelor dup digestia enzimatic iniial cu o fosfodiesteraz3.
HPLC DE EXCLUDERE MOLECULAR
n general, HPLC de excludere molecular nu este folosit pentru separarea
oligonucleotidelor ce conin mai puin de 100 de baze datorit rezoluiei sczute n
comparaie cu cromatografia de schimb ionic sau cea n faz inversat4. Totui,
cromatografia de excludere molecular a fost utilizat pentru separarea moleculelor
mari5, cum ar fi ARNt, ARNr i fragmente de ADN, cu toate c electroforeza n gel
de poliacriamid este preferat pentru astfel de separri.
Ike, Z., Ikuta, S., Sato, M., Huang, T., Itakura, K., Nucleic Acids Res., 11 (1983) 477-488
Huber, C.G., Krajete, A., Anal. Chem., 71 (1999) 3730-3739.
3
Crwother, J.B., Caronia, J.P., Hartwick, R.A., Anal.Biochem., 124 (1982) 65-73
4
Bijsterbosch, M.K., Rump, E.T., De Vrueh, R.L.A., Dorland, R., van Veghel, R., Tivel, K.L.,
Biessen, E.A.L., van Berkel, T.J.C., Manoharan, M., Nucleic Acids Res., 28 (2000) 27172725.
5
Graeve, L, Goemann, W., Foldi, P., Kruppa, J., Biochem. Biophys., Res. Commun., 107 (1982) 1559
2
138
LLIIPPIID
DEE
Lipidele sunt biomolecule insolubile n ap, ce se pot extrage din celule cu

ajutorul solvenilor nepolari (cloroform, benzen, eter, etc.). Exist mai multe clase
i subclase care cuprind o mare varietate de compui, numii generic lipide. Dei
diferite structural, toate i datoresc proprietile lor caracteristice naturii de
hidrocarbur pe care o are cea mai mare parte din structura lor.
Lipidele au cteva funcii biologice importante printre care includem1:
Componente structurale ale membranelor biologice;
Forme de depozitare i transport al combustibilului metabolic;
nveli protector al suprafeei multor organisme i al pereilor celulari ai unor
bacterii;
Componente ale suprafeei celulare implicate n recunoaterea celular,
specificitatea de specie i imunitatea tisular;
Coenzime n reacii enzimatice.
1
1999
LIPIDE
Dei exist i ca molecule libere, lipidele pot fi combinate, fie covalent, fie
prin legturi slabe, cu compui din alte clase de biomolecule, formnd molecule
hibride, cum ar fi glicolipidele i lipoproteinele.
Fiind o clas foarte eterogen, nici un tip de clasificare nu este perfect.
Simplist, putem clasifica lipidele n lipide complexe (care n urma hidrolizei
alcaline elibereaz sruri ale acizilor grai, operaie numit i saponificare) i lipide
simple care nu conin acizi grai (i deci nu sunt saponificabile).
Pn de curnd gaz cromatografia a fost cea mai folosit metod pentru

identificarea i cuantificarea acizilor grai. Datorit apariiei unor metode de
derivatizare simple i sigure i mai ales a unor detectoare HPLC foarte sensibile
(PDA, MS1), tehnicile HPLC sunt tot mai mult folosite pentru determinarea acizilor
grai din probe complexe. Metoda cea mai folosit este cromatografia n faz
inversat cu sau fr derivatizare pre-coloan. Alternativ s-e folosete i tehnica
argintrii, n special pentru separarea izomerilor geometrici i de poziie a acizilor
grai polinesaturai.
n cazul cromatografiei n faz inversat2 se folosesc suporturile fenil sau
C18 (ODS), cu excepia unor cazuri izolate cnd se utilizeaz suporturi cu brae
alchil mai scurte.
Faza mobil cel mai des folosit este fie amestec metanol - ap fie acetonitril
- ap. Uneori se adaug i tetrahidrofuran.
Mai jos se prezint separarea unui amestec complex de acizi grai pe o
coloan cu grupri fenil legate covalent de matrice. Separarea se realizeaz n
ordinea creterii numrului atomilor de carbon. Acizii grai nesaturai elueaz
naintea analogilor saturai. Pentru un anumit numr de atomi de carbon i o
1
2
Giuffrida, A., de Fonseca, F.R., Piomelli, D., Anal. Biochem., 280 (2000) 87-93.
Browne, R.W., Armstrong, D., Clin. Chem., 46(2000) 829-836.
140
VASILE OSTAFE
configuraie a catenei, cu ct nesaturarea este mai mare cu att eluarea se face mai
repede.
Separarea acizilor grai prin cromatografie n faz inversat
Coloana
Free Fatty Acid HP (fenil) (4 m,
150 x 3.9)
Faza mobil CN3CN:THF:H2O 45:20:55
Gradient
Nu
Viteza
0,5 mLmin1
volumetric
Temperatura Camerei
Detecie
Indice de refracie
Proba
1. Acid capric, 2. Acid lauric, 3.
Acid miristic, 4. Acid palmitic, 5.
Acid stearic, 6. Acid nonadecanoic,
7. Acid arahidic, 8. Acid
heneicosanoic, 9. Acid behenic.
Separarea acizilor grai prin cromatografie
n faz inversat
Coloana
Radial Pak C18 (5 m, 100 x 8)
Faza mobil CN3CN:H2O: AcOH 89:11:0,2
Gradient
Nu
Viteza
1,0 mLmin1
volumetric
Temperatura Camerei
Detecie
UV@214 nm
Proba
1. acid eicosapentaenoic 20:5,5,8,11,14,17,
2. acid arahidonic 20:4,5,8,11,14,
3. acid eicosatrienoic 20:3,8,11,14,
5. acid eicosadienoic 20:2,11,17,
6. acid eicosaenoic 20:1,11
141
LIPIDE
n figura de mai sus se prezint separarea a 6 acizi grai cu 20 atomi de

carbon, ce difer prin numrul i poziia dublelor legturi, pe o coloan ODS. Dup
cum se constat, peak-urile 3 i 4 nu sunt separate. Prin modificarea fazei mobile i
a vitezei volumetrice, se pot separa i cei doi acizi eicosatrienoici.
Separarea acizilor grai prin cromatografie
n faz inversat
Coloana
Radial Pak C18 (5 m, 100 x 8)
Faza mobil CN3CN:H2O: AcOH 80:20:0,2
Gradient
Nu
Viteza
2,0 mLmin1
volumetric
Temperatura Camerei
Detecie
UV@214 nm
Proba
4. acid eicosatrienoic 20:3,11,14,17
Similar cu coloana fenil i n cazul coloanei ODS separarea acizilor grai se

realizeaz n ordinea invers a saturrii. Cu ct gradul de nesaturare a acizilor grai
a fost mai mare cu att timpul de retenie a fost mai mic. Prin variaia polaritii
fazei mobile s-au putut separa i izomerii de poziie1.
Detectoarele cele mai frecvent folosite pentru monitorizarea acizilor grai
nederivatizai eluai sunt detectorul indice de refracie2 i detectoarele UV la
lungimi de und mici3. Cnd natura probei cere o sensibilitate mrit se recurge la
derivatizarea pre- i post-coloan1.
1
Batta, A.K., Dayal, V., Colman, R.W., Sinha, A.K., Shefa, S., Salen, G., J. Chromatogr., 284 (1984)
257-260
2
Bailie, A.G., Wilson, T.D., O'Brien, R.K., Beebe, J.M., McCosh-Lilie, E.J., Hill, D.W., J.
Chromatogr. Sci., 20 (1982) 466-470
3
Van Rollins, M., Aveldano, M.I., Sprecher, H.W., Horrocks, L.A., Methods, Enzymol., 86 (1982)
518-530
142
VASILE OSTAFE
Printre reactivii cel mai des folosii pentru derivatizare pre-coloan a acizilor
grai menionm: derivaii benzil2, de 2-naftacil3, de o- i p-nitrobenzil4, de fenacil5,
de p-bromofenacil6, de metoxifenacil7, de 1-naftilamid8, etc. Derivaii de
nitrobenzil, fenacil, p-bromofenacil, metoxifenacil, 1-naftilamida pot fi monitorizai
cu detectoarele UV la 254 nm, cu sensibiliti pn la 4 ng acid gras. Derivaii de 2naftacil pot fi detectai prin fluorescen, cu lungimea de und de excitare la 290
nm i emisie la 450 nm9.
Cromatografierea derivailor acizilor grai se realizeaz, de obicei, tot pe
coloane ODS cu faza mobil metanol - ap sau acetonitril - ap. n acest caz
concentraia modificatorului organic este mai mare dect n cazul cromatografiei
acizilor grai nederivatizai. Ordinea de eluarea a acizilor grai derivatizai este
aceeai cu cea observat la speciile nederivatizate, adic timpul de retenie crete
odat cu lungimea lanului atomilor de carbon i descrete odat cu creterea
gradului de nesaturare.
Dei mult mai puin folosite i alte tehnici HPLC sunt uneori utilizate. De
exemplu, pentru separarea p-bromofenacil esterilor acizilor grai cu caten scurt
din artropode s-a folosit cromatografia n faz normal, cu silicagel ca faz
staionar i eluare cu un gradient de amestec de cloroform - hexan10.
Cromatografia de argintare a fost utilizat pentru separarea izomerilor geometrici ai
1
Akasaka, K., Ohrui, H., Biosci. Biotechnol. Biochem., 63 (1999) 1209-1215.

Polizer, I.R., Griffin, G.W., Dowty, B.J., Laseter, L., Anal. Lett., 6 (1983) 539-540
3
Cooper, M.J., Anders, M.W., Anal. Chem., 46 (1974) 1849-1852
4
Knapp, D.R., Krueger, S., Anal. Lett., 8 (1985) 603-606
5
Borch, R.F., Anal. Chem., 47 (1975) 2437-3439
6
Durst, H.D., Milano,H., Kikta, E.J., Connelllz, S.A., Grushka, E., Anal. Chem., 47 (1975) 17971799
7
Miller, R.A., Bussell, N.E., Riketts, C., J. Liq. Chromatogr., 1 (1978) 291-304
8
Ikeda, M., Shimada, K., Sakaguchi, T., J. Chromatogr., 272 (1983) 251-259
9
Distler, W., J. Chromatogr., 192 (1980) 240-246
10
Weatherston, J., MacDonald, L.M., Blake, T., Benn, M.H., Yuang, Y.Y., J. Chromatogr., 161 (1978)
347-351
2
143
LIPIDE
esterilor metil ai acizilor grai1. n acest caz faza staionar a fost o coloan de
silicagel echilibrat cu soluie diluat de azotat de argint. Faza mobil a fost
haxanul, la care s-a adugat o mic cantitate dintr-un modificator organic mai polar
i anume acetonitrilul.
Aceast clas de compui include mono-, di- i triacilglicerolii, compui la

care gruprile hidroxil ale moleculei de glicerin au fost esterificate cu una, dou,
respectiv trei molecule de acid gras.
Tehnica cromatografic cel mai des folosit pentru separarea speciilor
individuale de acilgliceroli este cromatografia n faz inversat2, dei iniial s-a
folosit cromatografia n faz normal.
Un exemplu interesant de separare prin HPLC faz normal, utiliznd
silicagelul ca faz staionar, a unui amestec complex de lipide neutre este prezentat
n figura urmtoare. Toate speciile de acilgliceroli au fost separate de steroli, esteri
steroidici, esteri triterpenici i acizi grai liberi. Faza mobil pentru separare a fost
un gradient, care la momentul iniial coninea toluen - hexan (1:1) i n final se
ajungea la toluen - acetat de etil (3:1) plus 1,2% acid formic. Peak-urile eluate au
fost analizate cu un detector de ionizare n flacr cu fir colector3. Detecia se poate
realiza i cu detector indice de refracie, dar limita de detecie este n domeniul 0,5 -
Scholfield, C.R., J. Am. Oil Chem. Soc., 56 (1979) 510-516

Blaha, V., Solichova, D., Cernohorsky, D., Bratova, M., Vyroubal, P., Zadak, Z., J. Pharm. Biomed.
Anal., 22 (2000) 563-572.
3
Hammond, E.W.,J. Chromatogr., 203 (1981) 397-403
2
144
VASILE OSTAFE
1,0 g per peak. S-au raportat separri prin faza normal a lipidelor serice1, din
uleiul de soia sau linte2 sau a unor amestecuri complexe de acilgliceroli3 i acizi
grai4. n ultimul caz faza mobil a fost 2,2,4-trimetilpentan - tetrahidrofuran - acid
formic (90:10:0,5).
Separarea acilglicerolilor prin
Coloana
Lichrosorb Si60 (5 m, 100 x 4
mm)
Faza mobil A: toluen - hexan (1:1)
B: toluen - acetat de etil (3:1) plus
1,2% acid formic
Gradient
Conform schemei
Viteza
1,5 mLmin1
volumetric
Temperatura Camerei
Detecie
Ionizare n flacr cu fir transportor
Proba
MG - mongliceride,
DG - digliceride,
FFA - acid gras liber,
TG - trigliceride
n figura urmtoare se prezint un exemplu de HPLC cu argintare. Sistemul a

permis separarea unor izomeri de poziie ai triacilglicerolilor. Faza staionar,
silicagel perlat, a fost echilibrat cu azotat de argint 10%. Faza mobil a fost
benzenul sau toluenul. Rezoluia coloanei pare s se mbunteasc pe msur ce
1
Aitzetmuller, K., Koch, J., J. Chromatogr., 145 (1978) 195-202

Plattner, R.D., Payne-Wahl, K., Lipids, 14 (1979) 152-153
3
Retterstol, K., Haugen, T.B., Christophersen, B.O., BBA-Mol. Cell. Biol. Lipids., 1483 (2000) 119131.
4
Greenspan, M.D., Schroeder, E.A., Anal. Biochem, 127 (1982) 441-448
2
145
LIPIDE
temperatura scade, motiv pentru care experimentele s-au realizat la temperatura de

6C.
Separarea triacilglicerolilor prin
Coloana
Partisil (10 m, 250 x 4 mm)
saturat cu 10% AgNO3.
Faza mobil Toluen
Gradient
Nu
Viteza
1,0 mLmin1
volumetric
Temperatura 6C
Detecie
Indice de refracie
Proba
SSS - trisaturai, SES - 2-elaido1,3-distearina, SOS - 2-mononesaturat, SSO - 3-mononesaturat,
PLP - 2-linoleoil-1,3-dipalmitoilglicerol, -SOO - 2,3-dinesaturat.
n cazul folosirii cromatografiei n faz inversat eluarea se realizeaz, de

obicei cu amestecuri de aceton-acetonitril1. Ocazional s-au raportat i folosirea
amestecurilor acetonitril - tetrahidrofuran - hexan (224:123,2:29,6; m/m/m)2,
clorur de metilen - acetonitril (40:60), tetrahidrofuran - acetonitril (40:60)3,
proprionitril - acetonitril4 (proprionitrilul trebuie distilat pe pentaoxid de fosfor
pentru a se ndeprta impuritile alcaline), metanol - 2-propanol (3:1) plus 0,05 N
clorur de argint5, etc. n aceste sisteme, separarea trigliceridelor individuale s-a
realizat n funcie de lungimea acizilor grai esterificai i a gradului de nesaturare.
Cu ct lungimea acizilor grai este mai mare cu att i timpii de retenie sunt mai
1
Tsimidou, M., Macrae, R., J. Chromatogr., 285 (1984)178-181

Jensen, P., J. Chromatogr., 204 (1981) 407-411
3
Parris, N.A., J. Chromatogr., 157 (1978) 161-170
4
Marai, L., Myher, J.J., Kuksis, A., Can. J. Biochem. Cell Biol., 61 (1983) 840-849
5
Vonach, B., Schomburg, G., J. Chromatogr., 149 (1978) 417-430
2
146
VASILE OSTAFE
mari. n schimb introducerea unei duble legturi duce la scurtarea reteniei

echivalent cu aproximativ 2 uniti metilenice. Mai exact, o legtur dubl
echivaleaz cu 2,2 atomi de carbon cnd faza mobil este amestec metanol aceton i 2,4 cnd se elueaz cu amestec acetonitril - aceton. Trigliceridele ce
conin acizi grai hidroxilai, cum ar fi acidul ricinoleic sunt eluate doar cu puin
nainte de trigliceridele normale1, iar prezena gruprilor epoxi n acizii grai duce
la scderea drastic a reteniei2. Caracteristicile fazei staionare s-au dovedit a
influena i ele rezoluia, aceasta crescnd odat cu ncrcarea cu carbon a matricei
i cu scderea dimensiunilor particulelor.
O atenie deosebit trebuie acordat alegerii solventului de extracie n etapa
de pregtire a probelor, deoarece urmele de ali solveni pot afecta grav rezoluia.
Cel mai bine ar fi ca extracia s se realizeze n aceton, sau n cel mai ru caz,
nainte de injectare ceilali solveni trebuie evaporai i proba reluat n aceton.
Cloroformul, eterul etilic i tetrahidrofuranul trebuie evitai cu strictee deoarece au
efecte negative asupra eficienei coloanei3.
Separarea trigliceridelor prin cromatografie
n faz inversat
Coloana
Pecosphere C18 (83 x 4.6)
2 coloane legate n serie
Faza mobil Aceton - acetonitril (70:30)
Gradient
Nu
Viteza
0,5 mLmin1
volumetric
Temperatura Camerei
Detecie
Indice de refracie
Proba
OOO - triolein.
Plattner, R.D., Spencer, G.E., Kleiman, R., J. Am. Oil. Chem., Soc., 54 (1977) 511-515
Plattner, R.D., Wade, K., Kleiman, R., J. Am. Oil. Chem., Soc., 55 (1978) 381-383
3
Tsimidou, M., Macrae, R., J. Chromatogr., 285 (1984)178-181
2
147
LIPIDE
Separarea trigliceridelor prin cromatografie

n faz inversat
Coloana
Pecosphere C18 (83 x 4.6)
2 coloane legate n serie
Faza mobil Aceton - acetonitril (70:30)
Gradient
Nu
Viteza
0,5 mLmin1
volumetric
Temperatura Camerei
Detecie
Indice de refracie
Proba
OOO - triolein, L - acid linoleic, P
- acid palmitic, S - acid stearic.
De la introducerea HPLC pentru izolarea i cuantificarea fosfolipidelor, vasta

majoritate a separrilor au fost realizate prin cromatografie n faz normal pe
coloane de silicagel folosind diferite faze mobile1. nc din anii '70 s-au raportat
separri ale derivailor difenilcarbonil ai fosfoatidiletanolaminei, fosfatidilserinei,
lizofosfatidiletanolaminei i etanolaminei folosind o coloan de silicagel avnd ca
faz mobil amestecul diclormetan - metanol - 15 M soluie apoas de amoniac
(92:8:1 sau 80:15:3)2, sau a sfingomielinelor i fosfatidilcolinei nederivatizate pe o
faz staionar de silicagel n combinaie cu o faz mobil coninnd acetontril metanol - ap (65:21:14)3. Observaia c includerea fie a unui acid sau a unei baze
1
Ramstedt, B., Slotte, J.P., Anal. Biochem., 282 (2000) 245-249.

Jungalwala, F.B., Turel, R.J., Evans, J.F., McCluer, R.H., Biochem. J., 145 (1975) 517-526
3
Jungalwala, F.B., Evans, J.E., McCluer, R.H., Biochem.J., 155 (1976) 55-60
2
148
VASILE OSTAFE
n faza mobil duce la mbuntirea separrii fosfolipidelor n cromatografia n

strat subire pe silicagel a dus la folosirea acestor faze mobile i n HPLC. n figura
urmtoare se prezint un exemplu de separare a fosfolipidelor prin cromatografie n
faz normal. Rezoluia tuturor componentelor fosfolipidice majore dintr-un extract
tisular s-a realizat ntr-o singur cromatografiere pe o coloan de silicagel cu eluare
izocratic cu acetonitril - metanol - acid fosforic 85% (130:5:1,5; v/v)1.
Separarea fosfolipidelor prin cromatografie n faz normal
Coloana
Micro-Pak SI-10 (300 x 4.0)
Faza mobil Acetonitril - metanol - 85% acid
fosforic (130:5:1,5; v/v/v)
Gradient
Nu
Viteza
1,0 mLmin1
volumetric
Temperatura Camerei
Detecie
UV@203 nm
Proba
LPC - lizofosfatidilcolina, LPE lizofosfatidiletanolamina, LPS lizofosfatidilserina, PA - acid
fosfatidic, PE - fosfatidiletanolamina, PG - fosfatidilglicerol, PI fosfatidilinozitol, PMME - fosfatidilmonometiletanolamina, PS fosfatidilserina, SF - frontul de
solvent, SPH - sfingomielina.
Pentru a nu interfera eluarea cardiolipinei cu lipidele neutre sau cu

fosfatidilinozitolul, n special n cazul deteriorrii coloanei, se recomand ca
aceasta s fie splat zilnic cu 30 mL din urmtoarele soluii: (a) metanol - ap
(1:1), (b) metanol, (c) dicloretan i pstrare peste noapte n (d) hexan. Deoarece
includerea de acid fosforic n faza mobil ar putea crete probabilitatea de eroare n
cuantificarea fosfolipidelor prin coninutul de fosfor s-a propus urmtoarea faz
Chen, S.S.-H., Kou, A.Y., J. Chromatogr., 227 (1982) 25-31
149
LIPIDE
mobil: acetonitril - metanol - acid sulfuric (100: 3: 0,05). n acest fel s-a reuit
separarea fosfatidilinozitolului, fosfatidilcolinei, lizofosfatidilserinei, fosfatidiletanolaminei, fosfatidilcolinei, lizofosfatidilcolinei i sfingomielinei1. Reducerea
coninutului de acid fosforic duce la creterea reteniei fosfatidilserinei,
fosfatidiletanolaminei i fosfatidilcolinei, iar omiterea acidului sulfuric face ca
aceste componente s nu mai elueze deloc. Creterea coninutul de metanol a dus la
scderea reteniei fosfolipidelor, motiv pentru care probele au fost pregtite n
cloroform - dietileter (1:1) pentru a se evita modificarea concentraiei metanolului
n faza mobil.
Alte combinaii de soluii folosite pentru faza mobil sunt: hexan - propanol 2
ap , cloroform - propanol - acid acetic - ap (50:55:2,5 - 5: 5 - 10)3, cloroform metanol (95:5)4.
Folosind eluarea n gradient, pornind de la 96% 2-propanol - hexan (1:1) 4% ap i ajungnd n 15 minute la 8% ap s-au separat fosfatidilglicerolul,
fosfatidiletanolamina, fosfatidilinozitolul, acidul fosfatidic, fosfatidilserina,
lizofosfatidilcolina.
Folosirea pentru perioade lungi de timp a unor faze mobile ce conin cantiti
mari de ap sau de metanol poate duce la instabilitatea fazei staionare de silicagel.
Aceasta poate fi evitat prin folosirea unor faze staionare schimbtoare de ioni.
Cum ar fi Bodnapak-NH2 ca faz normal i eluare cu gradient pornind de la
cloroform pn la metanol - ap (25:1 sau 25:4)5. n acest caz ordinea de eluare a
fost acid fosfatidic, fosfatidilglicerol, fosfatidilserina, fosfatidilcolina. Pe o coloan
Ultrasil-NH2 cu eluare n gradient de hexan - 2-propanol (11:16) i hexan - 21
Kaduce, T.L., Norton, K.C., Spector, A.A., J. Lipid Res., 24 (1983) 1398-1403
Geurts van Kessel, W.S.M., Hax, W.M.A:, Bemel, R.A., de Gier, J., Biochim. Biophys. Acta, 486
(1977) 524-529
3
Blom, C.P., Deierkauf, F.A., Riemersma, J.C., J. Chromatogr., 171 (1979) 331-338
4
Paton, R.D., McGillivray, A.I., Speir, T.F., Whittle, M.J., Whitfield, C.R., Logan, R.W., Clin. Chim.
Acta, 113 (1983) 97-110
5
Kiuchi, K., Ohata, T., Ebine, H., J. Chromatogr., 133 (1977) 226-230
2
150
VASILE OSTAFE
propanol - metanol - ap (11:16:2:3) ordinea de eluare a fost colesterol,

cerebrozida, fosfatidilcolina, lizofosfatidiletanolamina1.
Deoarece ordinea de eluare a fosfatidilcolinei i fosfatidiletanolaminei sunt
inverse pe coloanele de silicagel i respectiv amino, rezult c mecanismele de
absorbie sunt diferite pe cele dou tipuri de faze staionare.
La pH neutru majoritatea lipidelor membranare conin o sarcin pozitiv sau
o amin cuaternar i deci separarea lor se poate realiza folosind coloane
schimbtoare de cationii. Pe o astfel de coloan, Whatman PXS 10/25 SCX,
folosind ca faz mobil acetonitril - metanol - ap (400:100:34) s-au separat
fosfatidiletanolamina, lizofosfatidiletanolamina, fosfatidilcolina, sfingomielina i
lizofosfatidilcolina2. Limitarea acestui sistem provine din faptul c fosfolipidele
polare care nu conin o grupare amino sunt eluate n void datorit polaritii
solventului folosit.
Cromatografia n faz inversat a fost i ea utilizat pentru separarea
fosfolipidelor. Pe coloane ODS cu faze mobile incluznd metanol - 1 mM tampon
fosfat, pH 7,4 (95:5)3, cloroform - ap - metanol (10:10:100)4 sau 20 mM clorhidrat
de colin n metanol - ap - acetonitril (181:14:5)5 s-au separat fosfolipidele n
funcie de numrul atomilor de carbon din molecul i de gradul de nesaturare a
acizilor grai.
n ce privete detecia, cea mai popular metod este monitorizarea
absorbanei la 200 - 206 nm. Absorbana lipidelor la aceste lungimi de und se
datoreaz n special prezenei dublelor legturi carbon-carbon, dei i alte grupri
pot contribui ntr-o msur mai mic. Sensibilitatea deteciei UV este n jur de 1
nmol de fosfatidilcolin, dac molecula conine cel puin o dub legtur6.
1
Hanson, V.L., Park, J.Y., Osborn, T.W., Kiral, R.M., J. Chromatogr., 205 (1981) 393-400
Gross, R.W., Sobel, B.E., J. Chromatogr., 197 (1980) 79-85
3
Smith, M., Jungalwala, F.B., J. Lipid Res., 22 (1981) 697-704
4
Porter, N.A., Wolf, R.A., Nixon, J.R., Lipids, 14 (1979) 20-24
5
Patton, G.M., Fasulo, J.M., Robins, S.J., J. Lipid Res., 23 (1982) 190-195
6
Jungalwala, F.B., Evans, J.E., McCluer, R.H., Biochem.J., 155 (1976) 55-60
2
151
LIPIDE
Detecia n UV, dei n general sensibil i precis, n cazul lipidelor ridic

probleme datorit gradului diferit de nesaturare a acestora i deci a coeficienilor lor
de extincie foarte diferii. Aceste probleme pot fi rezolvate ntructva printr-una
din urmtoarele ci:
Peak-urile eluate pot fi colectate i analizate prin metode chimice (dozare de
fosfor);
Folosirea de standarde externe specifice i realizarea de curbe de etalonare
pentru fiecare fosfolipid n parte.
Realizarea de derivatizri pre-coloan.
Folosirea altor tipuri de detectoare: MS1, chemiluminiscen2, PDA3, etc.
Fosfolipidele ce conin grupri amino primare pot forma derivai
bifenilcarbonil. Metoda a fost aplicat pentru detecia fosfatidilserinei,
fosfatidiletanolaminei i lizofosfatidiletanolaminei, unde limita de detecie a fost de
10 - 13 pmoli4.
Similar, fosfolipidele ce conin o grupare amino primar pot fi derivatizate cu
clorura de 1-dimetilaminonaftalen-5-sulfonil (DNS-Cl). Derivaii DNS sunt
puternic fluorescenii i folosind o lungime de und de excitaie de 342 nm i
emisie la 500 nm, limita de detecie este n jur de 20 pmoli5.
Destul de des fosfolipidele sunt detectate cu detector indice de refracie6,
limita de detecie fiind n jur de 0,5 moli/L pentru fosfatidiletanolamina i 55
moli/L pentru lizolecitin.
1
Hansen, H.H., Hansen, S.H., Schousboe, A., Hansen, H.S., J. Neurochem., 75 (2000) 861-871.
Kinoshita, M., Oikawa, S., Ayasaka, K., Sekikawa, A., Nagashima, T., Toyota, T., Miyazawa, T.,
Clin. Chem., 46 (2000) 822-828.
3
Pfefferle, C.M., Breinholt, J., Olsen, C.E., Kroppenstedt, R.M., Wellington, E.M.H., Gurtler, H.,
Fiedler, H.P., J. Nat. Prod., 63 (2000) 295-298.
4
Jungalwala, F.B., Turel, R.J., Evans, J.E., McCluer, R.H., Biochem.J., 145 (1975) 517-526
5
Chen, S.S.-H., Kou, A.Y., Chen, H.-H.Y., J. Chromatogr., 208 (1981) 339-346
6
Paton, R.D., McGillivray, A.I., Speir, T.F., Whittle, M.J., Whitfield, C.R., Logan, R.W., Clin. Chim.
Acta, 133 (1983) 97-110
2
152
VASILE OSTAFE
Compusul de baz caracteristic pentru toate sfingolipidele este ceramida,

compus cu dou catene lungi nepolare. Toate sfingolipidele conin trei uniti
constituente caracteristice: o molecul de acid gras, o molecul de sfingozin sau
un derivat al acesteia i o grupare polar care formeaz capul polar1. Sfingozina (4sfingenina) este cel mai comun din cei peste 30 de aminoalcooli cu lan lung care
au fost identificai n sfingolipidele izolate din diferite specii. Aminoalcoolul poate
fi eliberat prin hidroliz i derivatizat pentru a forma specii care pot fi separate prin
HPLC n faz normal2, faz inversat3 i detectate UV, prin fluorescen4 sau MS5.
S-a raportat dozarea sfingolipidelor prin derivatizare pre-coloan cu clorura
de dabsil (clorura de 4-dimetilaminoazobenzen-4-sulfonil)6 i separate pe o coloan
Zorbax CN i faz mobil un gradient de acetonitril - 17,5 mM acetat de sodiu
(90:60), pH 6, ce a fost crescut la 90% acetonitril. Folosind monitorizarea la 430
nm limita de detecie a fost de 5 pmoli.
Derivatizarea cu derivai de bifenilcarbonil a bazelor sfingoidice dup
hidroliza sfingolipidelor urmat de separarea pe Ultrasphere ODS cu o faz mobil
de tetrahidrofuran - metanol - ap (25:40:20) sau metanol - ap (94:6) i detecie la
1999
2
Sugawara, T., Miyazawa, T., Lipids., 34 (1999) 1231-1237.
3
Gerdt, S., Dennis, R.D., Borgonie, G., Schnabel, R., Geyer, R., Eur. J. Biochem., 266 (1999) 952963.
4
Zhou, J.Y., Chaminade, P., Gaudin, K., Prognon, P., Baillet, A., Ferrier, D., J. Chromatogr. A., 859
(1999) 99-105.
5
Kalhorn, T., Zager, R.A., Am. J. Physiol.-Renal Fluid Electrolyte Physiol., 277 (1999) F723-F733.
6
Rosenfelder, G., Chang, J.-N, Braun, D.G., J. Chromatogr., 272 (1983) 21-27
153
LIPIDE
280 nm limita de detecie a fost mai mic de 1 nmol1.

Derivaii de p-nitrobenzoil i benzoil au fost separai pe coloane ODS n
combinaie cu o faz mobil coninnd cloroform - metanol i monitorizai la 260
nm, cu o limit de detecie de 50 pmoli2.
Separarea unor glicozilceramide prin
Coloana
Silicagel
Faza mobil Acetat de etil n ap
Gradient
2 - 17% acetat de etil n ap n
10 min.
Viteza
2 mLmin1
volumetric
Temperatura Camerei
Detecie
UV@280 nm
Proba
1. Glc-Cer,
2. Lac-Cer,
3. Gal-Lac-Cer,
4. Globozida.
Glicosfingolipidele conin ca grupare polar de cap una sau mai multe

glucide i deci nu au ncrcare electric, motiv pentru care se mai numesc
glicosfingolipide neutre. Cele mai simple dintre ele sunt cerebrozidele care au capul
polar format dintr-un monozaharid legat -glicozidic de gruparea hidroxil a
ceramidei. n creier se gsesc i esterii sulfat ai galactocerebrozidelor care se
numesc sulfatide.
Cea mai comun tehnic HPLC pentru separarea i detecia
1
Kadowaki, H., Bremer, E.G., Evans, J.E., Jungalwala, F.B., McCluer, R.H., J. Lipid Res., 24 (1983)
1389-1397
2
Do, U.H., Per, P.T., Miinard, R.D., Lipids, 16 (1983)855-862
154
VASILE OSTAFE
glicozilceramidelor implic derivatizarea pre-coloan1, de obicei cu derivai Oaceilbenzoici, separare prin cromatografie n faz normal pe silicagel i detecie
UV la 230 nm.
Prima derivatizare raportat a fost cu clorura de benzoil2, dar i ali derivai
de benzoil au fost folosii. Faza mobil const, de obicei, din: gradiente cu creterea
concentraiei de dioxan n hexan3, sau din acetat de etil n hexan4. Sistemul a permis
separarea mono-, di-, tri- i tetraglicozilceramidelor.
Glicozil i galactozilceramidele au fost separate pe coloan Micropak NH210, cu gradient de faz mobil ciclopentan - 2-propanol (98/5:1,5)5.
Fr derivatizare, clicosfingolipidele neutre au fost detectate att prin UV la
230 nm ct i radioactiv, dup eluare de pe silicagel cu gradient coninnd diferite
proporii de metanol i ap n cloroform6.
Gangliozidele sunt glicospingolipide ce conin n capul lor polar, unul sau

mai muli radicali de acid sialic, ceea ce confer gruprii polare a gangliozidelor o
sarcin negativ net la pH 7,07.
Tehnica HPLC folosit nc de timpuriu pentru separarea i cuantificarea
gangliozidelor utilizeaz derivatizarea pre-coloan pentru formarea de perbenzoil
gangliozide i separare prin cromatografie n faz normal8. Gradientul de 7 - 23%
1
Zhou, J.Y., Chaminade, P., Gaudin, K., Prognon, P., Baillet, A., Ferrier, D., J. Chromatogr. A., 859
(1999) 99-105.
2
Evans, J.E., McCluer R.H., Biochim. Biophys. Acta, 270 (1972) 565-569
3
Lee, D.P., J. Chromatogr., 20 (1982) 203-208
4
Ullman, M.D., McCluer, R.H., J. Lipid Res., 18 (1977) 371-378
5
McCluer, R.H., Evans, J.E., J. Lipid Res., 17 (1976) 412-418
6
Kniep, B., Hunig, T.G., Fitch, F.W., Heurer, J., Kolsch, E., Muhlradt, P.F., Biochemistry, 22 (1983)
251-255
7
1999
8
Bremer, E.G., Gross, S.K., McLuer, R.H., J. Lipid Res., 20 (1979) 1028-1035
155
LIPIDE
dioxan n hexan permite separarea monosialogangliozidelor majore GM1, GM2,

GM3, GM4 ct i a polisialogangliozidelor GD3, GD1a i GD1B. Limita de detecie a
fost de 50 pmoli la 230 nm.
Folosirea cromatografiei n faz inversat a permis separarea gangliozidelor
prin realizarea de derivai de p-nitrobenzoilamin. Eluarea s-a fcut cu gradieni
cloroform - metanol - ap sau numai metanol - ap (50:50 - 70:30). Detecia s-a
fcut fie la 254 nm, fie prin fluorescen la 525 nm. Limita de detecie n ultimul
caz a fost de 100 ng gangliozid1.
n ultima vreme analiza gangliozidelor se realizeaz prin derivatizare precoloan, separare prin cromatografie n faz inversat i detecie n fluorescen2.
1
2
Traylor, T.D., Koontz, D.A., Hogan, E.L., J. Chromatogr., 272 (1983) 9-20
Hikita, T., Tadano-Aritomi, K., Iida-Tanaka, N., Toyoda, H., Suzuki, A., Toida, T., Imanari, T., Abe,
T., Yanagawa, Y., Ishizuka, I., Anal. Biochem., 281 (2000) 193-201.
156
S
OIIZZII
RO
STTEER
n clasa compuilor steroizi sunt

cuprini o mare varietate de substane a cror
17
12
16
13
11
19
proprieti chimice difer foarte mult. Pn n
D
C
15
14
anii 80 tehnicile folosite pentru analiza
1
9
steroizilor erau dominate de cromatografia n
2
8
10
strat
subire
(TLC
thin
layer
B
A
5
3
7
chromatography) i cromatografia n faz
6
4
gazoas1.
Steroizii sunt derivai ai hidrocarburii saturate tetraciclice perhidrociclopentanofenantren (v. structura n figura alturat). Ei se deosebesc prin numrul i
poziia dublelor legturi, prin tipul, locul de legare i numrul gruprilor
funcionale substituite, prin configuraia ( sau ) a legturilor dintre gruprile
substituite i nucleu i prin configuraia ciclurilor unul fa de altul, ntruct
Heftman, E., Lin, J.-T., J. Liq., Chromatogr., 5 (Suppl. I) (1982) 121-173
STEROIZI
hidrocarbura de baz are 6 centre de asimetrie1. Punctele principale de substituie

sunt carbonul 3 din ciclul A, carbonul 11 din ciclul C i carbonul 17 din ciclul D.
Toi steroizii provin din triterpena linear squalen, care se ciclizeaz uor. Primul
produs steroidic important al acestei ciclizri este lanosterolul, care n esuturile
animale este precursorul colesterolului, steroidul cel mai abundent la animale.
Ambii sunt membri ai unei subgrupe mari de steroizi numit steroli2.
Sterolii sunt alcooli steroidici care conin o grupare hidroxil la carbonul 3 din
ciclul A i un bra alifatic ramificat de cel puin 8 atomi de carbon la C17 din ciclul
D. Ei se gsesc fie ca alcooli liberi, fie sub form de esteri ai gruprii hidroxil de la
carbonul 3 cu acizi grai cu caten lung.
Pentru analiza sterolilor s-au folosit tehnicile HPLC n faz inversat3, n
faz normal4, argintarea5 i combinaii ale acestora. Majoritatea separrilor n faz
inversat au fost realizate cu faze staionare de tip ODS iar ca faz mobil s-au
folosit amestecuri apoase de diferii solveni organici. Avantajul major al folosirii
tehnicilor n faz inversat const n faptul c separarea depinde de numrului
atomilor de carbon ct i de numrul legturilor duble carbon-carbon ale sterolilor
supui separrii.
Majoritatea separrilor n faz inversat au fost realizate pe faze staionare
ODS, eluarea realizndu-se cu faze mobile apoase ce conineau un modificator
organic. Avantajul major al tehnicii n faz inversat este c rezoluia sterolilor
1
1999
2
Evrard D.A., Harrison B.L., Annual Reports in Medicinal Chemistry, 34. (1999) 1-10.
3
Sicard, F., Vaudry, H., Braun, B., Chartrel, N., Leprince, J., Conlon, J.M., Delarue, C.,
Endocrinology., 141 (2000) 2450-2457.
4
Grizard, G., Sion, B., Bauchart, D., Boucher, D., J. Chromatogr. B., 740 (2000) 101-107.
5
Ruan, B.F., Wilson, W.K., Pang, J.H., Schroepfer, G.J., Steroids., 65 (2000) 29-39.
158
VASILE OSTAFE
depinde att de numrul atomilor de carbon din molecul ct i de prezena i

numrul dublelor legturi. Folosind un amestec acetonitril - ap (88:12) s-a reuit
separarea sterolilor n funcie de prezena sau absena unei legturi duble 24 n
catena lateral. De exemplu, 5-colesterolul a fost separat de 5,24-colestadienol.
Similar, o grupare metil la C4, cum ar fi n 4-metil-8-colesterol permite separarea
de 8-colesterol. Totui, condiiile menionate nu au dus la separarea compuilor ce
aveau o grupare n C14 de sterolii fr grupare n C14, sau a izomerilor sterolilor cu
o dubl legtur la C27, dei astfel de separri s-au fcut folosind faza normal1.
Pentru multe separri de substane amfipatice care nu sunt satisfctoare n
faz inversat pot fi rezolvate n faz normal. De exemplu, folosind o faz mobil
cu 2,2,4-trimetilpentan - ciclohexan - toluen (5:3:2) s-au separat izomerii de poziie
ai legturii duble din C27 a sterol-acetailor sau a celor ce aveau sau nu o grupare
metil n C14.
Condiii cromatografice similare, cu dou coloane de silicagel n tandem i
eluare cu sisteme binare, cum ar fi: hexan 2-propanol (99:1; 24:1 sau 9:1), hexan butanol (99:1) sau 2,2,4-trimetilpentan 2-propanol (499:1) au permis separarea
unui numr de produi de auto-oxidare ai colesterolului2.
Folosirea cromatografiei n faz inversat n absena apei (NARP - nonaqueous reversed phase) permite separarea i cuantificarea colesterolului total din
ser. Ca faz mobil se poate folosi amestecul 2-propanol acetonitril3, cu toate c i
fazele mobile cu coninut de ap dau rezultate bune, mai ales cnd se dorete i
cuantificarea colesterolului esterificat4.
n general, separarea n faz inversat depinde att de umrul atomilor de
carbon ct i de numrul dublelor legturi; astfel cu ct numrul atomilor de carbon
este mai mare cu att esterii steroidici elueaz mai trziu, n timp ce la numr egal
de atomi de carbon, compuii cu mai multe duble legturi elueaz mai devreme.
1
Hansbury, E., Scallen, T.J., Chromatogr. Sci., 16 (1982) 253-276

Ansari, G.A.S., Smith, L.L., J. Chromatogr., 175 (1979) 307-315
3
Perkins, E.G:, Hendren, D.J., Bauer, J.E., El-Hamdy, A.H., Lipids, 16 (1981) 609-613
4
Duncan, I.W., Culbreth, P.H., Burtis, C.A., J. Chromatogr., 162 (1979) 281-292
2
159
STEROIZI
Izomerii cis elueaz naintea celor trans.

Cromatografia n faz inversat pe coloane ODS, cu faz mobil 0,5% 2propanol n hexan permite separarea sterolilor cu substitueni n C27, C28 i C29,
inclusiv ergocalciferolul, sitosterolul, stigmasterolul, colesterolul i ergosterolul. Cu
faz mobil metanol acetonitril (25:75) s-au separat ergocalciferolul i
colecalciferolul de alte substane cu caracter hidrofob i rol vitaminic.
Separarea unor steroli i a altor compui
hidrofobi cu rol vitaminic,
Coloana
Inertisil 5 ODS-2 (150 x 4.6)
Faza mobil MeOH:MeCN (25:75)
Gradient
Nu
Viteza
1,5 mLmin1
volumetric
Temperatura 40C
Detecie
UV@280 nm
Proba
1. Menadiona, 2. Retinol, 3.
Ergocalciferol, 4. Colecalciferol, 5.
Tocoferol, 6. Tocoferolacetat, 7.
Filochinona.
Cromatografia cu argintare a fost folosit pentru obinerea unei separri

eficiente a unei serii de precursori ai colesterolului ce conineau un numr diferite
de legturi duble i aflate n poziii diferite1. n acest caz faza staionar a fost o
coloan de alumin care a fost echilibrat cu azotat de argint. Eluarea s-a fcut cu
gradient pornind de la hexan toluen (9:1) i ajungnd la (6:4). Cromatografia cu
argintare folosit cu coloane de silicagel a permis separarea izomerilor cis i trans a
sterol-acetailor2.
n concluzie, pentru separarea cromatografic a sterolilor se recomand
utilizarea iniial a cromatografiei n faz inversat i n cazul co-elurii se
1
2
Pascal, R.A., Faris, C.L., Schroepfer, G.J., Anal. Biochem., 101 (1980) 15-22
Colin, H., Guichon, G., Siouffi, A. Anal. Chem., 51 (1979) 1661-1666
160
VASILE OSTAFE
utilizeaz cromatografia n faz normal1. Pentru separri foarte specifice, cnd

utilizarea tehnicilor mai sus amintite nu dau rezultatele dorite, se poate folosi fie
cromatografia n faz inversat n absena apei, fie cromatografia cu argintare.
Sterolii sunt de obicei monitorizai att cu detectoare indice de refracie ct i
cu detectoare UV. Deoarece detectoarele indice de refracie au o sensibilitate
redus, detectoarele UV, i n special varianta arie de diode sunt de preferat.
Limitele de detecie la 254 nm pentru lanosterol, -stigmasterol i colesterol sunt de
aproximativ 600 nm i pentru egosterol de 40 ng. La 282 nm limitele de detecie pot
fi reduse pn la 700 pg, ajungnd la aceeai limit de detecie ca cea din gazcromatografia cu ionizare n flacr.
n aceast clas sunt incluse mai multe grupe de substane printre care
cortocosteroizii, hormonii gestrogeni, androgeni i estrogeni. nc de timpuriu au
fost publicate ample articole consacrate acestui subiect2,3.
Concentraia corticosterozilor n plasm i urin este un indicator al funciei

glandelor adrenocorticoide i prin urmare, cuantificarea acestor hormoni este de
mare importan clinic. n ultimii 20 de ani aceste analize se realizeaz aproape
exclusiv prin HPLC, cele mai populare tehnici fiind cromatografia n faz normal4
i n faz inversat5,6.
1
Yaku, K., Morishita, F., J. Biochem. Biophys. Methods., 43(1-3), (2000) 59-76
Nice, E.C., OHare, M.J., J. Chromatogr., 162 (1982) 401-407
3
Alvarez-Coque, M.C.G., Broch, S.C., J. Chromatogr. B. 736(1-2) (1999) 1-18
4
Bodor, N., Drustrup, J., Wu, W., Pharmazie., 55 (2000) 206-209.
5
Marquet, P., Lachatre, G., J. Chromatogr. B. 733(1-2) (1999) 93-118
6
Sicard, F., Vaudry, H., Braun, B., Chartrel, N., Leprince, J., Conlon, J.M., Delarue, C.,
Endocrinology., 141 (2000) 2450-2457.
2
161
STEROIZI
Prima separare a corticosteroizilor a fost realizat pe o coloan de silicagel,

eluarea fcndu-se cu cloroform dioxan (100:5) cnd s-au separat cortizolul,
cortizona i 11-deoxicortizolul1. Majoritatea separrilor folosind faze staionare
silicagel utilizeaz ca faze mobile amestecuri de:
Diclormetan etanol ap (93,6:4,7:1,7)2, cu care s-au separat prednisolonul,
cortizolul, prednisona, cortizona, corticosteronul, deoxicortizolul i 17-hidroxi-progesteronul;
hexan clorur de metilen etanol acid acetic (63,8:30:6:0,2)3;
1,5% metanol i 0,2% ap n cloroform, pentru determinarea cortizolului n
urin4;
diclormetan hexan etanol acid acetic (69:26:3,4:1)5 pentru separarea
cortizolului de metilprednisolon;
diclormetan metanol (97:3)5 pentru separarea corticosteronului, cortizonului
i cortizonei.
Alte tipuri de HPLC folosite n separarea corticosteroizilor sunt:
cromatografia n faz normal folosind faze staionare nitril, cu faze mobile
diclormetan 2-propanol ap (97,5:2,3:0,2)6 utilizat pentru determinarea
cortizolului n plasm;
cromatografia de afinitate folosit pentru purificarea i cuantificarea
cortizolului din plasm sau urin unde faza staionar a constat din anticorpi
anti-cortizol legai covalent de o matrice de silicagel7.
Touchstone, J.C., Wortmann, W., J. Chromatogr., 76 (1973) 244-247

Trefz, F.K., Byrd, D.J., Kochen, W., J. Chromatogr., 272 (1975) 9-20
3
Loo, J.C.K., Butterfield, A.G., Moffatt, J., Jordan, N., J. Chromatogr., 143 (1977) 275-280
4
Schwedt, G., Bussemas, H., J. Chromatogr., 285 (1977) 381-385
5
Ebling, W.F., Szefler, S.J., Jusko, W.J., J. Chromatogr., 305 (1984) 271-280
6
Van den Berg, J.H.M., Mol, C.R., Deeldr, R.S., Thijssen, J.H., Clin. Chim. Acta, 78 (1977) 165-172
7
Nilsson, B., J. Chromatogr., 276 (1983) 413-417
2
162
VASILE OSTAFE
Exist, de asemenea, multe variante de separare folosind cromatografia n

faz inversat. n acest caz, cele mai comune faze mobile sunt:
metanol ap (45:55 sau 60:40)1, folosite pentru separarea cortizolului i 11deoxicortizolului;
acetonitril ap (30:70)2 pentru separarea 20 i 20- sau 5- i 5hidrocortizolii;
ap acetonitril tetrahidrofuran 1 M tampon fosfat, pH 4,4 (63:28:8:1)
gradient acid formic acetonitril, pH 3, pentru analiza corticoizilor folosii
ilegal de sportivi3.
Detecia corticosteroizilor este uurat de absorbana puternic a structurii de
rezonan 4-en-3-on, care are un maxim de absorbie n jur de 240 nm4. La
aceast lungime de und, limita inferioar de detecie a corticosteroizilor este de
aproximativ 2 - 5 ng. La 254 nm limita de detecie este de aproximativ 10 ng.
Fluorescena indus de acizi a corticosteroizilor a fost folosit pentru a mri
sensibilitatea de detecie. Folosind o faz mobil tamponat la pH 4,4 i incubarea
steroizilor n amestec acid sulfuric - etanol nainte de cromatografiere aduce limita
de detecie la 500 pg (excitaie la 366 nm, absorbie la 488 nm)5.
S-au raportat i procedee de derivatizare a corticosteroizilor pentru a se mri
limita de detecie n fluorescen. Printre procedeele de derivatizare folosite
amintim folosirea dansilhidrazinei6, glicinamidei7 i a benzamidinei8.
Reardon, G.E., Caldarella, A.M., Canalis, E., Clin. Chem., 25 (1979) 122-126
Ulrick, S., Ramirez, L.C., New, M.I., J. Clin. Endocrinol., 44 (1977) 799-802
3
Bevalot, F., Gaillard, Y., Lhermitte, M.A., Pepin, G., J. Chromatogr. B., 740 (2000) 227-236
4
Engel, L.L. (ed.) The Physical Properties of Steroid Hormones, Pergamon Press, Oxford, 1963
5
Gotelli, G.R., Wall, J.H., Kabra, P.M., Marton, L.J., Clin. Chem., 27 (1981) 441-443
6
Kawasaki, T., Maeda, M., Tsuji, A., J. Chromatogr., 163 (1979) 143-150
7
Seki, T., Yamaguchi, Y., J. Liq. Chromatogr., 6 (1983) 1131-1138
8
Seki, T., Yamaguchi, Y., J. Chromatogr., 305 (1983) 188-193
2
163
STEROIZI
Separarea unor hormoni steroidici

Coloana
Inertisil 5 ODS-3V (150 x 4.6
mm)
Faza mobil MeCN:THF:H2O (35:8:57)
Gradient
Nu
Viteza
1,0 mLmin1
volumetric
Temperatura 40C
Detecie
UV@230 nm
Proba
1. -trenbolona 2. -trenbolona 3.
-zeararenol 4. testosteron 5.
zeranol 6. -zeararenol 7. 8. Zeararenona
9.
estradiol
dietilstilbestrol
Acest grup de hormoni steroidici este caracterizat de aceeai grupare

4-3ceto care se gsete n corticosteroizi i n general metodele de detecie
descrise pentru aceast din urm clas de compui se aplic i la progestine.
Majoritatea separrilor cromatografie folosite pentru separarea progestinelor
(progesteronilor) au utilizat fie cromatografia n faz normal fie cea n faz
inversat.
n cazul cromatografiei n faz normal se poate folosi ca faz staionar
silicagelul, iar ca faz mobil amestecul etanol diclormetan (0,25:99,75). n acest
fel s-a reuit separarea 3-dionelor (inclusiv a progesteronei) i 6-monohidroximonoketonelor (inclusiv a pregnenolonei) din seria preganului1. Tot pe coloane de
silicagel, dar cu faz mobil format din n-hexan metanol etanol (96:3:1) dou
perechi de derivai ai preganului, care erau epimeri la C20 au fost separai.
1
Lin, J.-T., Heftmann, E., Hunter, I.R., J. Chromatogr., 190 (1980) 169-174
164
VASILE OSTAFE
Perechile separate includeau 20- i 20-hidroxi-4-pregan-3-ona i 3-pregan-3,

20--diol i 5-pregnan-3-20-dil.
Pe coloane ODS cu faz mobil etanol ap (55:45)1 s-au separat 4 perechi
de epimeri ai pregnandiolilor2.
Ambele tipuri de HPLC, n faz normal i n faz inversat au fost folosite

pentru separarea androgenilor. n general cromatografia n faz normal folosind
silicagelul ca faz staionar este modul preferat de separare deoarece rezoluia este
mai bun pentru toi epimerii steroidici cu excepia 17-epimerilor3.
Separarea epimerilor monohidroxi ai testosteronului i androstandionei s-a r
ealizat folosind o faz mobil format din hexan tetrahidrofuran 2-propanol
(80:15:5) i ca faz staionar slilicagelul4.
Capacitatea HPLC n faz inversat de a separa androstanii este ntr-u ctva
limitat i se impune fie folosirea mai multor faze mobile izocratice sau a elurii n
gradient. De exemplu, folosind coloane ODS pentru separarea principalilor
metaboliilor hidroxilai ai testosteronului s-a pornit iniial cu o faz mobil format
din metanol ap (55:45) cnd s-au separat 2-, 6-, 7- i 16-hidroxitestosterona
i apoi s-a aplicat o a doua faz mobil, format din metanol ap acetonitril
(55:35:10) pentru a se elua testosterona i androstendiona5.
Tot prin cromatografie n faz inversat, pe coloane ODS, s-au separat patru
4-3-cetosteroizi testiculari, incluznd testosteronul, androstendione, 17-hidroxiprogesterona i progesterona, faza mobil fiind fie amestec tetrahidrofuran
1
Purdy, R.H., Durocher, C.K., Moore, P.H., Rao, P.N., Chromatogr. Sci., 234 (1982) 513-516
Liere, P., Akwa, Y., Weill-Engerer, S., Eychenne, B., Pianos, A., Robel, P., Sjovall, J., Schumacher,
M., Baulieu, E.E., J. Chromatogr. B., 739 (2000) 301-312.
3
Hunter, I.R., Walden, M.K., Heftman, E., J. Chromatogr., 176 (1979) 485-487
4
Kawalek, J.C., Hawang, K.K., Kelsey, M.I., Chromatographia, 14 (1981) 633-637
5
Van der Hoeven, J., J. Chromatogr., 196 (1980) 494-497
2
165
STEROIZI
metanol ap (16:28:56), fie metanol acetonitril ap (9:36:55)1.

Cea mai convenabil metod de detecie a androstanilor este absorbia n UV.
4-3-cetonele (inclusiv androstendiona i testosterona) au o puternic absorbie n
jur de 254 nm astfel c limta de detecie este de 30 ng pentru testosteron. 17cetosteroizii (inclusiv androsterona i etiocolanona) pot fi monitorizate la 280 nm,
ar sensibilitatea este de 5 ori mai sczut dect pentru 4-3-cetone2.
Petru a se mbunti limita de detecie se folosesc diferite metode de
derivatizare, cum ar fi folosirea 2,4-dinitrofenilhidrazinei pentru a forma hidrazone
ai steroizilor3 i clorura de p-nitrobenzoil4. n timp ce prin aceste metode se crete
sensibilitatea metodei, specificitatea ei scade datorit apariiei produilor
secundari5.
Determinarea cantitativ cu mare exactitate a estrogenilor este foarte

important n chimia clinic pentru a furniza informaii despre dezvoltarea sarcinii.
n ultimile luni de sarcin nivelul urinal al estriolului crete n mod normal, iar o
scdere ar indica o stare patologic. Estrogenii sunt n mod normal excretai n
urin ca i conjugai i n majoritatea analizelor se face o hidroliz nainte de
cromatografiere.
Cele mai folosite metode pentru hidroliz sunt hidroliza acid i cea
enzimatic. n primul caz, proba este nclzit la 110C timp de 30 minute.
Hidroliza enzimatic folosete de obicei o -glucuronidaz (din E. coli) i
incubarea are loc la 60C, timp de 30 minute, n mediu tamponat.6.
1
Darney, K.J., Wing, T.-Y, Ewing, L.I., J. Chromatogr., 257 (1983) 81-90
Hunter, I.R., Walden, M.K., Heftman, E., J. Chromatogr., 176 (1979) 485-487
3
Fitzpatrick, F.A., Siggia, S., Dingman, J., Anal. Chem., 44 (1972) 2211-2216
4
Fitzpatrick, F.A., Siggia, S., Anal. Chem., 45 (1973) 2310-2314
5
OHare, M.J., Nice, E.C., Chromatogr. Sci., 14 (1982) 277-322
6
Gotelli, G.R., Kabra, P.M., Marton, L.J., Clin. Chem., 23 (1977) 165-168
2
166
VASILE OSTAFE
Cele mai populare tehnici HPLC folosite pentru separarea estrogenilor sunt
cromatografia n faz inversat1,2 i cea n faz inversat perechi ionice3. Mult mai
puin folosite sunt cromatografia n faz normal i cea de schimb ionic.
n cazul cromatografiei n faz inversat, faza staionar cea mai folosit a
fost ODS, iar faza mobil amestecuri apoase de metanol i acetonitril. De exemplu,
cnd faza mobil a fost metanol 0,1% carbonat de amoniu (n ap) estriolul i
estradiolul au fost eluai succesiv. Cnd faza staionar a fost silicagelul i eluia s-a
fcut cu etanol n-heptan (5:95), ordinea de eluie a fost estrona, estradiolul i
estriolul.
Importana modificatorului organic n determinarea ordini de eluie n cazul
cromatografiei n faz inversat a fost demonstrat folosind o faz staionar ODS
i o faz mobil format din acetonitril - 0,5% fosfat monoacid de amoniu, pH 3,0
(1:2) pentru separarea 17-ceto i 17-hidroxi estrogenilor. Cnd metanolul a fost
substituit cu acetonitril s-a schimbat ordinea de eluare4.
n cromatografia n faz normal s-au folosit att faze staionare cu silicagel
ct i diol. Faza mobil a fost hexan etanol (9:1) pentru separarea estrogenilor
polari (estradiol, 6-cetoestradiol, 16-epiestriol, estriol, 16,17-estirol, 2-hidroxiestriol), iar pentru estrogenii mai puin polari s-a folosit hexan etanol (97:3)5.
Separarea epimerilor se realizeaz mai bine prin cromatografie n faz
normal, dar cnd compuii ce urmeaz a fi separai difer prin prezena unei
grupri ceto, hidroxi sau a unei duble legturi, se recomand cromatografia n faz
inversat.
Dei mult mai puin folosit, cromatografia de schimb ionic poate da
rezultate bune. S-au folosit schimbtori de anioni i faze mobile formate din 0,01 M
1
Hauptmann, H., Paulus, B., Kaiser, T., Luppa, P.B., Bioconjugate Chem., 11 (2000) 537-548.
Wolfling, J., Schneider, G., Peter, A., J. Chromatogr. A., 852 (1999) 433-440.
3
Johnsen, H.K., Tveiten, H., Willassen, N.P., Arnesen, A.M., Comp. Biochem. Physiol. B-Biochem.
Mol. Biol., 124 (1999) 355-362.
4
Shimada, K., Tanaka, M., Nambara, T., J. Chromatogr., 178 (1979) 350-354
5
Lin, J.-T, Heftmann, E., J. Chromatogr., 312 (1981) 239-244
2
167
STEROIZI
fosfat monopotasic, pH 4,2, sau 0,1 M clorur de sodiu, pH 5,0, sau 0,01 M tampon
fosfat pH 6,8 cu diferite concentraii de perclorat. Ordinea de eluie este estrioli,
estrani, estradiol, 17-hidroechilina, echilenina i dihidroechilenina. Conjugaii
inelului A sunt eluai naintea conjugailor inelului D. Conjugaii glucuronici sunt
eluai naintea fosfailor i sulfailor1.
n cromatografia n faz inversat perechi ionice s-au folosit coloane C2 i
C8, echilibrate cu 1-pentanol i folosind ca agent pentru formarea perechilor ionice
hidroxidul de tetrapropilamoniu2.
Separarea unor hormoni estrogeni,
Coloana
MetaSil AQ 5 (250 x 4.6)
Faza mobil MeOH:H2O (85:15)
Gradient
Nu
Viteza
1,0 mLmin1
volumetric
Temperatura 40C
Detecie
UV@200 nm
Proba
1. etilestradiol, 2. estrona.
Coloane ODS au fost folosite n cromatografia cu argintare, cu faz mobil

metanol 5% azotat de argint (60:40) pentru separarea estriolului, echilinei,
estronei i estradiolului.
Detecia estrogenilor se face att n UV ct i n fluorescen (nativ sau prin
derivatizare), dar i cu detectoare electrochimice.
Detecia n UV se datoreaz aromaticitii inelului A care absoarbe la 280
nm. Limita de detecie este de 10 ng, dar poate fi mbuntit dac se lucreaz la
200 nm.
1
2
Van der Wal, Sj., Huber, J.F.K., J. Chromatogr., 135 (1977) 305-321
Hermansson, J., J. Chromatogr., 152 (1978) 437-442
168
VASILE OSTAFE
Derivatizarea cu 2,4-dinitrofenilhidrazon (DNPH) duce la formarea unei

grupri carbonil cu o puternic absorban la 254 nm i la 365 nm. Folosirea
esterior p-iodobenzensulfonil duce la creterea sensibilitii deteciei la 254 nm1.
Monitorizarea fluorescenei naturale duce la o cretere considerabil a
sensibilitii. Astfel prin excitarea la 220 nm se obine o emisie primar la 310 nm
i una secundar la 608 nm. Msurarea la 310 nm duce la o limit de detecie de
100 pg2.
Detecia prin fluorescen a estrogenilor poate fi mbuntit prin
derivatizare cu grupri puternic fluorescente, cum ar fi clorura de dansil3 (excitare
la 350 nm, emisie la 540 nm), cu limita de detecie de 50 pg4.
Detecia electrochimic aplicat la estrogeni cu un potenial de electrod n
domeniul 0,7 0,86 V fa de un electrod de referin de Ag/AgCl5 a dus la o limit
de detecie de 5 ng pentru estriol i de 1 ng pentru 2-hidroxiestradiol.
Coloana
Gradient
Nu
Viteza
1,0 mLmin1
volumetric
Temperatura 40C
Detecie
UV@280 nm
Proba
1. -trembolon, 2. -estradiol, 3.
dietilstilbestrol.
Roos, R.W., J. Chromatogr. Sci, 14 (1978) 505-512

Taylor, J.T:, Knotts, J.G., Schmidt, G.J., Clin. Chem., 26 (1980) 130-132
3
Fishman, S., J. Pharm. Sci., 64 (1975) 674-680
4
Roos, R.W., J. Chromatogr. Sci, 14 (1978) 505-512
5
Prescott, W.R., Boyd, B.K., Seaton, J.F., J. Chromatogr., 234 (1982) 513-516
2
169

Coloana
Inertisil 5 ODS-3V (150 x 4.6)
Gradient
Nu
Viteza
1,0 mLmin1
volumetric
Temperatura 25C
Detecie
UV@280 nm
Proba
1. estradiol, 2.n-butil paraben.

Coloana
Faza mobil MeCN:1% CH2ClOOH, pH 3,
(60:40)
Gradient
Nu
Viteza
1,0 mLmin1
volumetric
Temperatura 40C
Detecie
UV@254 nm
Proba
1. estriol, 2. estradiol, 3. estrona.
170
STEROIZI
V
NEE
MIIN
AM
VIITTA
Vitaminele sunt o clas de substane foarte eterogen din punct de vedere

chimic, a cror nume, nsemnnd "amina vieii", a fost dat iniial unor substane ce
conineau grupri aminice care adugate n mici cantiti n dieta animalelor de
laborator sau a oamenilor duceau la eliminarea efectelor novice datorate lipsei
acestor substane. Dei denumirea s-a pstrat, n grupul vitaminelor intr i
substane care nu sunt amine. Vitaminele sunt substane ce nu sunt sintetizate de
majoritatea mamiferelor, dar sunt eseniale pentru procese biochimice vitale pentru
speciile respective i prin urmare trebuie obinute din surse exogene.
Convenional, vitaminele sunt mprite n dou grupe mari, hidrosolubile i
liposolubile. Cu excepia vitaminei C, celelalte vitamine hidrosolubile au funcii de
coenzime1. n ce privete vitaminele liposolubile, acestea sunt necesare n special
pentru animalele superioare. La microorganisme i plante nu s-a stabilit nc exact
1
1999
VITAMINE
care este rolul lor la nivel molecular.

Tabelul urmtor constituie o succint prezentare a rolului principalelor
vitamine hidro- i liposolubile.
Tipul
Forma activ sau coenzima
Vitamine hidrosolubile
Tiamin-pirofosfat (TPP)
Tiamina
Flavin mononucleotid (FMN)
Riboflavina
Flavin adenin dinucleotid (FAD)
Nicotin-adenin
dinucleotid
Acidul nicotinic
(NAD, NADP)
Acidul pantotenic Coenzima A (CoA)
Piridoxal fosfat
Piridoxina
Biocitina
Biotina
Acid tetrahidrofolic
Acidul folic
Vitamina B12
Coenzima B12
Acidul lipoic
Lipoillizina
Acidul ascorbic
Vitamine liposolubile
11-cis-retinal
Vitamina A
1,25-dihidroxicolecalciferol
Vitamina D
Vitamina E
Vitamina K
Funcia
Transferul grupei aldehid
Transferul atomului de hidrogen
(electron)
Transferul atomului de hidrogen
(electron)
Transferul grupei acil
Transferul grupei amino
Transferul grupei carboxil
Transferul grupelor cu un atom
de carbon
Deplasarea 1,2 a atomilor de
hidrogen
Transferul atomilor de hidrogen
i al grupei acil
Cofactor n hidroxilare
Ciclu vizual
Metabolismul
calciului
fosfatului
Antioxidant
Biosinteza protrombinei
Metodele convenionale de purificare a vitaminelor impun extracia iniial

dintr-o mare cantitate de esut deoarece vitaminele se afl n concentraii foarte
mici. Metodele de analiz de mare performan, pe de alt parte, necesit numai
172
VASILE OSTAFE
cantiti mici de material biologic. Ele mai trebuie s ndeplineasc i alte condiii,
cum ar fi:
Rapiditate;
Capacitatea de a evita expunerea vitaminelor la cantiti mari de cldur,
lumin UV sau surse de oxidare;
Utilizarea de sisteme sensibile de detecie, deoarece multe vitamine nu conin
grupri cromofore puternice.
HPLC ndeplinete toate aceste condiii i este folosit pentru analiza
vitaminelor din cele mai diverse tipuri de probe inclusiv esuturi animale, vegetale
sau produse alimentare1. Cele mai comune metode de separare a vitaminelor includ
cromatografia n faz inversat2, n faz inversat perechi ionice3, n faz normal4
i de schimb ionic5. Cromatografia de afinitate i gel-filtrare6 au o aplicabilitate
redus n cazul vitaminelor.
Multe vitamine sunt extrem de labile motiv pentru care trebuie luate msuri
speciale pentru a se mbunti stabilitatea lor n timpul extraciei i analizei HPLC.
nc de la nceputul existenei cromatografiei de lichide de nalt

performan, aceast tehnic a fost aplicat cu mult succes la analiza vitaminelor
Parrish, D.B., CRC Crit. Rev. Food Sci. Nutr., 13 (1980) 161-170
Gatti, R., Gioia, M.G., Cavrini, V., J. Pharm. Biomed. Anal., 23 (2000) 147-159.
3
Fraser, A.G., Woollard, G.A., J. Gastroenterol. Hepatol., 14 (1999) 1070-1073
4
Abidi, S.L., J. Chromatogr. A., 881 (2000) 197-216.
5
Sharpless, K.E., Margolis, S., Thomas, J.B., J. Chromatogr. A., 881 (2000) 171-181.
6
Juntunen, K., Rochel, N., Moras, D., Vihko, P., Biochem. J., 344 (1999) 297-303.
2
173
VITAMINE
hidrosolubile1. Dac la nceput se folosea pentru separarea vitaminelor

hidrosolubile mai ales cromatografia de schimb ionic, actualmente cel mai des
folosit este cromatografia n faz inversat i n special cea perechi ionice.
Contraionii folosii sunt acidul sulfonic, acidul trifluoroacetic i fosfatul anorganic.
Vitamina B1 exist fie n forma pirofosfat fie n forma ester. nainte de

analiz forma ester poate fi convertit enzimatic la acidul corespunztor folosind
fosfataza acid.
Analiza unor vitamine hidrosolubile prin cromatografie n faz inversat perechi
ionice
Coloana
Faza mobil A: 5mM SPS (pentan sulfonat de
sodiu)+ 0.1% H3PO4
B: Eluent "A" in 80% MeCN
Gradient
2.5%B 80%B n 20 minute
Viteza
1 mLmin1
volumetric
Temperatura 40C
Detecie
UV@254 nm
Proba
1. Acid L-ascorbic 6. Piridoxina 2.
Acid nicotinic 7. Tiamina
3.
Nicotinamida 8. Acidul folic 4.
Piridoxal 9. Ciancobalamina 5.
Piridoxamina 10. Riboflavina
Separarea cromatografic a vitaminei B1 din snge total, fluid cerebrospinal

i din lapte poate fi realizat prin cromatografie n faz inversat perechi ionice
folosind ca faz mobil tampon citrat de sodiu 0,05 M, pH 4,0 metanol (55:45)
Wittina, D.P., Hanley, W.G., n GLC and HPLC Analysis of Therapeutic Agents (Tsuji, M.,
Monowitch, W., eds.), Dekker, New York, NY, 1976
174
VASILE OSTAFE
plus 0,01 M octan-sulfonat de sodiu n combinaie cu o faz staionar ODS1.

Pentru a se mri selectivitatea, tiamina poate fi derivatizat post-coloan prin
oxidare cu fericianur de potasiu la tiocrom care este apoi detectat fluorimetric
(excitaie la 367 nm i emisie la 435 nm)
Alte exemple de faze mobile folosite pentru eluarea tiaminei n
cromatografia n faz inversat perechi ionice sunt:
0,001 M acid hexansulfonic n 1% acid acetic metanol (75:25), eluare
izocratic; cu aceast metod s-au separat tiamina, niacinamida, riboflavina i
prididoxina;
2% acid fosforic, 5 mM acid pentansulfonic metanol (90:10), izocratic; s-au
separat acidul D-ascorbic acid, acidul nicotinic, nicotinamida, acidul
pantotenic, piridoxalul, piridoxina, piridoxamina i tiamina.
2% acid fosforic, 5 mM acid hexansulfonic metanol (90:10), izocratic; s-au
separat acidul nicotinic, nicotinamida, acidul pantotenic, piridoxina, riboflavinfosfatul i tiamina.
Analiza unor vitamine hidrosolubile prin cromatografie n faz inversat perechi
ionice
Coloana
Inertsil 5 ODS-3V, 150 x 4.6mm
Faza mobil A: 5mM pentan sulfonat de sodiu +
0.1% H3PO4
B: MeCN cu 0.1% H3PO4 + 5mM
pentan sulfonat de sodiu
Gradient
3% B 45%B n 20 minute
Viteza
1 mLmin1
volumetric
Temperatura 40C
Detecie
UV@210 nm
Prob 1. acid ascorbic 2. acid nicotinic 3.
a
nicotinamida 4. piridoxal 5. piridoxamina
6. piridoxina 7. tiamina 8. ciancobalamina
9. riboflavina.
1
Wielder, Mink, (1983)
175
VITAMINE
Cromatografia n faz normal folosind ca faz staionar Lichrosorb-NH2 n

combinaie cu derivatizarea post-coloan a fost utilizat pentru detectarea tiaminei
i derivailor si. Folosind ca faz staionar acetonitril 90 mM fosfat de potasiu,
pH 8,4 (60:40) s-a obinut o bun separare a tiocromului i derivailor monofosfat,
pirofosfat i trifosfat cu o detecie la nivelul de 1 pmol1.
Cele mai comune forme ale vitaminei B2 sunt riboflavin 5-fosfatul (FMN) i
flavin adenin dinucleotidul (FAD), care sunt cunoscute datorit participrii lor ca n
calitate de cofactori enzimatici la lanul transportor de electroni. Aceti cofactorii
sunt de obicei legai de apoenzime prin gruprile fosfat i izolarea lor din esuturi
poate fi realizat prin hidroliz acid blnd sau hidroliz enzimatic cu fosfataze
acide. Exist i cazuri n care flavin nucleotidul este legat covalent de un rest
histidinic din lanul polipeptidic al enzimei (succinat dehidrogenaza) cnd este
necesar o hidroliz n condiii mai drastice.
Absorbia intrinsec a diferitelor forme ale vitaminelor B2 faciliteaz detecia
lor prin monitorizarea absorbanelor UV la 280 nm. Detecia prin fluorescen2
(excitaie la 450 nm, emisie la 520 nm) este mult mai sensibil i selectiv.
Separrile vitaminelor B2 se realizeaz de obicei prin cromatografie n faz
inversat3, n faz inversat perechi ionice i n faz normal.
Flavin nucleotidele din extractele de carne au fost determinate prin folosirea
ca faz staionar a silicagelului cu o faz mobil format din cloroform - metanol
(90:10)4
Pentru separarea vitaminelor B2 prin cromatografie n faz inversat perechi
1
Ishii, K., Sarai, K., Sanemori, H., Kawasaki, T., Anal. Biochem., 97 (1979) 191-195
Craig, I.D., Ashby, C.W., Brown, I., Crosby, N.T., Guffogg, S., et all., Analyst., 125 (2000) 353-360.
3
Gliszczynska-Swiglo, A., Koziolowa, A., J. Chromatogr. A., 881 (2000) 285-297
4
Ang, C.Y.W., Moseley, J., J. Agric. Food Chem., 28 (1980) 483-486
2
176
VASILE OSTAFE
ionice (a se vedea i exemplele de la vitamina B1) s-au propus diferite tipuri de faze
mobile:
metanol 0,1 M foarmat de amoniu, pH 3,7 (17:83);
metanol 5 mM format de tetrabutilamoniu, pH 3.5 (27:73);
metanol 0,1 % acid fosforic, 5 mM pentan sulfonat de sodiu (15:85)
A: 5mM pentan sulfonat de sodiu + 0.1% H3PO4; B: Eluent "A" in 80% MeCN,
eluare n gradient: 2.5%B pn la 80%B n 20 minute
Analiza vitaminei B2 (riboflavinei) prin cromatografie n faz inversat
perechi ionice
Coloana
Faza
MeCN:50mM KH2PO4 (pH 4
mobil
with H3PO4) 10:90
Gradient
Nu
Viteza
1 mLmin1
volumetric
Temperatura
Detecie
Proba
40C
UV@210 nm
1. Acid nicotinic (niacina) 2.
Amida acidului nicotinic 3.
Acidul pantotenic 4. Acidul folic
5. Necunoscut 6. D-biotina 7.
Riboflavina
FMN poate fi cromatografiat i pe schimbtori de ioni, cum ar fi DEAESephadex, TSK DEAE sau Mono Q i prin cromatografie de afinitate
177
VITAMINE
Vitaminele B6 exist sub 6 forme diferite: piridoxalul, piridoxina i

piridoxamina, mpreun cu esteri fosforici corespunztori. Funcia acestor compui
este de cofactori n numeroase reacii enzimatice, dar cele mai cunoscute sunt
reaciile de transaminare.
Extracia acestui grup de vitamine poate fi realizat prin aceleai metode ca
n cazul vitaminelor B2.
Dintre procedeele cromatografice1 cele mai folosite sunt cromatografia n
faz inversat (perechi ionice), cromatografia de schimb ionic.
Detecia vitaminelor B6 poate fi realizat prin monitorizare la 210 250 nm.
Alternativ, detecia prin fluorescen2 poate fi folosit pentru formele piridoxamin
i piridoxin cu excitare la 310 nm i emisie la 380 nm, iar pentru formele
piridoxalului cu excitare la 280 nm i excitare la 487 nm.
Analiza vitaminelor B6 prin cromatografie n faz inversat perechi ionice
Coloana
Inertsil 5 ODS-3V, 150 x
4.6mm
Faza mobil MeCN:0.2% H3PO4 + 5mM pentan
sulfonat de sodiu 10:90
Gradient
Nu
Viteza
1 mLmin1
volumetric
Temperatura 40C
Detecie
UV@210 nm
Proba
1. Acidul ascorbic, 2. Acid nicotinic
3. Amida acidului nicotinic 4.
Acidul pantotenic 5. Piridoxal 6.
Piridoxina 7. Piridoxamina 8.
Tiamina.
1
2
Fu, M.M., Silverman, R.B., Bioorg. Med. Chem., 7 (1999) 1581-1590

Vanderslice, J., Maire, C.E., J. Chromatogr., 196 (1980) 176-179
178
VASILE OSTAFE
Acidul nicotinic are mai multe forme active, pornind de la acidul nicotinic
liber i derivaii amidei sale, ct mai ales derivaii nucleotidici - nicotinamidadenin-dinucleotidul (NAD) i nicotinamid-adenin-dinucleotid fosfatul (NADP).
Acidul nicotinic i derivaii si sunt stabili la oxidare prin cldur, lumin,
acizi sau baze, ceea ce nseamn c extracia lor cu un sistem compatibil cu HPLC
este o sarcin uoar n comparaie cu alte vitamine. Extractele biologice sunt
obinute prin deproteinizare cu aceton, urmat de extracia cu acid clorhidric
diluat. Alternativ, se poate folosi acetatul de etil n combinaie cu acidul clorhidric.
Cea mai popular metod HPLC de separare a piridin nucleotidelor este
cromatografia n faz inversat1 perechi ionice (a se vedea i vitaminele B1, B2). De
exemplu, folosind o coloan ODS cu o faz mobil ap metanol (9:1) plus 0,05 M
tetrabutilamoniu fosfat ca agent de pereche ionic, s-a reuit eluarea consecutiv a
nicotinamid-N-oxidului, acidului 2-hidroxipiridin-5-carboxilic, nicotinamidei,
acidului nicotinic i acidului nicotinuric2.
Analiza niacinei i nicotinamidei prin cromatografie n faz inversat perechi
ionice
Coloana
Faza
MeCN:0.2% H3PO4 + 5mM
pentan sulfonat de sodiu 10:90
mobil
Gradient
Nu
Viteza
1 mLmin1
volumetric
Temperatura
Detecie
Proba
1
2
40C
UV@210 nm
1. Niacina, 2. Nicotinamida 3.
Pantotenat de calciu 4. Acidul
folic 5. B12 6. B2.
Albrecht, W., Storck, M., Pfetsch, E., Martin, W., Abendroth, D., Ther. Drug Monit., 22 (3) 283-294.
Hengen, N., Seiberth, V., Hengen, M., Clin. Chem., 24 (1978) 1740-1743
179
VITAMINE
Cu toate c piridin nucleotidele au absorbii caracteristice n ultraviolet,

pentru a se mbunti selectivitatea i sensibilitatea deteciei se pot utiliza i
metode de derivatizare:
Cuplare prin intermediul bromcianului cu p-aminoacetofenona i detecie de
fluorescen (excitaie la 435 nm i emisie la 500 nm);
N,N-diciclohexil-O-(7-metoxicumarin-4-il) metilizoureea permite detecia
acidului nicotinic n concentraii de 0,2 nmol/mL1.
Exist o mare varietate de metode disponibile pentru separarea derivailor

acidului pantotenic, incluznd cromatografia n strat subire, gaz-cromatografia i
HPLC. Printre variantele HPLC, cele mai comune sunt cromatografia n faz
inversat2, n faz inversat perechi ionice, n faz normal i schimb ionic.
Prin cromatografie n faz inversat pe coloane ODS, eluare cu faze mobile
ce conineau 0,9 M acid acetic s-a determinat concentraia pantotenatului de calciu
n preparate multivitaminice3.
Analiza acidului pantotenic prin cromatografie
n faz inversat perechi ionice
Coloana
Faza mobil MeCN:0.2% H3PO4 + 5mM pentan
sulfonat de sodiu 10:90
Gradient
Nu
Viteza
1 mLmin1
volumetric
Temperatura 40C
Detecie
UV@210 nm
Proba
1. Nicotinamida 2. Acid pantotenic 3.
Piridoxina 4. Riboflavin-fosfat 5.
Tiamina
Tsuruta, Y., Kohashi, K., Ishida, S., Ohkura, Y., J. Chromatogr., 309 (1984) 309-315
Okada, M., Kyoguchi, M., Nakayama, T., Hirota, R., Amachi, T., Ueda, T., J. Nutr. Sci. Vitaminol.,
46 (2000) 101-104.
3
Jonvel, P., Andermann, G., Bartholemy, J.F., J. Chromatogr., 281 (1985) 371-376
2
180
VASILE OSTAFE
Cromatografia n faz inversat asigur cea mai mare flexibilitate pentru

separarea intermediarilor pantotenai. Folosind o faz staionar C18 i o serie de
tampoane fosfat n metanol s-au separat CoA-SH, defosfo-CoA, acidul pantotenic,
acidul 4-fosfopantoteic, 4-fosfopantotenoil-1-cisteina i 4-fosfopanteina1.
Pentru cuantificarea coenzimei A s-a folosit i cromatografia de schimb ionic,
folosind ca suport un schimbtor de anioni puternic (Partisil SAX) i ca faz mobil
196 mM fosfat de potasiu, pH 3,9 izo-propanol tiodiglicol (98:2:0,05)2.
Detecia coenzimelor A se face prin monitorizarea absrobanelor n
ultraviolet, de obicei la 254 nm.
Metodele de analiz curente pentru detecia i analiza biotinei i a analogilor

si fie folosesc metode ELISA (enzyme-linked immunosorben assay), fie se bazeaz
pe marea afinitate a biotinei pentru avidin3.
Datorit absorbiei slabe a biotinei n domeniul UV, metodele HPLC de
analiz folosesc adesea derivatizarea presau post-coloan4. Pentru a permite
fluorescena, biotina i analogii si sunt derivatizai fie cu 2,4-dibromoacetofenona
(DBAB) fie 4-bromometil metoxicumarina (MCM) (excitare la 360 nm, emisie la
410 nm)5. Dup derivatizare, probele sunt mai nti cromatografiate pe silicagel
pentru a se ndeprta produii secundari ai procesului de derivatizare i apoi aplicate pe o coloan ODS. Eluarea se face cu gradient de tetrahidrofuran ap (de la
30:70 pn la 60:40). Detecia se poate realiza i n UV la 254 nm, cnd pentru deriva7ii DBAB se obine o limit a deteciei de 0,5 pmoliL1. Totui, sensibilitatea
poate crete cu un ordin de mrime dac detecia de face n fluorescen.
1
Halvorsen, O, Skrede, S., Anal. Biochem., 107 (1980) 103-108

Ingerbretsen, O.C., Normann, D.T., flatmark, T., Anal. Biochem., 96 (1979) 181-188
3
Wilbur, D.S., Pathare, P.M., Hamlin, D.K., Frownfelter, M.B., Kegley, B.B., Leung, W.Y., Gee,
K.R., Bioconjugate Chem., 11 (2000) 584-598
4
Shahdeo, K., Karnes, H.T., J. Pharm. Biomed. Anal., 21 (1999) 361-370.
5
Desbene, P.L., Coustal, S., Frappier, F., Anal. Bochem., 128 (1983) 359-362
2
181
VITAMINE
Acidul folic este compusul cel mai rspndit din grupul complex al
conjugailor pterinelor, avnd funcia de transfer a unor grupri cu un atom de
carbon. Tetrahidrofolatul (FH4) este un transportor intermediar al gruprilor
hidroximetil (CH2OH), formil (CHO) sau metil (CH3).
Folaii sunt foarte sensibili la oxidare prin cldur, lumin UV sau expunere
n mediu acid1, motiv pentru care trebuie luate precauiuni speciale n toate etapele
de separare i analiz.
Dintre metodele cromatografice cele mai folosite sunt cromatografia n faz
inversat2,3, cromatografia n faz inversat perechi ionice (a se vedea exemplele de
la vitaminele B1, B2 i piridin nucleotide) i cromatografia de schimb ionic.
Detecia se face de obicei prin monitorizarea UV ntre 285 - 305 nm, dar s-ar
raportat i detecia amperometric4.
Analiza acidului folic prin cromatografie
n faz inversat
Coloana
Faza
MeCN:10mM
NaH2PO4
+
mobil
10 mM acid citric (11:89)
Gradient
Nu
Viteza
1 mLmin1
volumetric
Temperatura
Detecie
Proba
30C
UV@302 nm
1. Acid folic 2. Metotrexat.
Baugh, C.M., Krundieck, C.I., Ann. N.Y. Acad. Sci., 186 (1971) 28-40
Stokes, P., Webb, K., J. Chromatogr. A., 864 (1999) 59-67.
3
Forssen, K.M., Jagerstad, M.I., Wigertz, K, Witthoft, C.M., J. Am. Coll. Nutr., 19 (2000) 100S-110S.
4
Birmingham, B.K., Green, D.S., J. Pharm. Sci., 72 (1983) 1306-1309
2
182
VASILE OSTAFE
Acidul lipoic poate exist liber dar i legat de partea proteic a enzimelor
prin intermediul gruprii epsilon amino a unui rest de lizin. Mai mult de 90% din
cofactorul legat poate fi regsit prin tratare cu 6 M HCl la 110C pentru 24 ore1.
Iniial, acidul lipoic se separa prin cromatografie n strat subire, dar astzi se
folosesc aproape exclusiv variantele HPLC2 - n faz inversat, faz inversat
perechi ionice i schimb ionic.
Folosind o coloan C18 i eluare n gradient de la 25% la 75% metanol n
acid acetic s-au separat 11 derivai ai acidului lipoic: acidul lipoic, acidul
dihidrolipoic lipoil glicinamida, 8-metil-lioatul, acidul 6,9-ditiononanoic, S-oxidul
metil tetranorlipoatului, acidul tetranorlipoic, acidul -hidroxi bis-norlipoic, acidul
bis-norlipoic i metil lipoatul3.
Acidul ascorbic este sensibil la oxidare i trece rapid n acid dehidroascorbic,

care la rndul su trece n specii inactive. Oxidarea poate fi evitat n timpul
extraciei i cromatografierii prin meninerea unui mediu cu pH slab acid. Aceasta
este o condiie potrivit pentru utilizarea suporturilor pe baz de silicagel i n
special a celor pentru cromatografia n faz inversat4 i schimb ionic5.
Cromatografia n faz normal a fost i fa utilizat pentru separarea formelor L- i
D- ale acidului ascorbic, folosindu-se o coloan Lichrosorb NH2 n combinaie cu o
faz mobil coninnd acetonitril 0,005 M fosfat de potasiu, pH 4,4 - 4,7 (75:25)6.
Totui, datorit uurinei realizrii cromatografiei n faz inversat, majoritatea
1
Bayer, E., Skutclsky, E., Wilchek, M., Methods Enzymol., 62D (1979) 308-338
Haj-Yehia, A.I., Assaf, P., Nassar, T., Katzhendler, J., J. Chromatogr. A., 870 (2000) 381-388.
3
Howard, S., McCormick, D.B., J. Chromatogr., 208 (1981) 129-134
4
Tsao, C.S., Salin, S.L., J. Chromatogr., 224 (1981) 477-486
5
Lieber, L-F-. Kuo, J., Krigel, R., Pille, E., Silber, R., Anal. Biochem. 118 (1981) 53-60
6
Bui-Nguyen, M.H., J. Chromatogr., 196 (1980) 163-165
2
183
VITAMINE
analizelor probelor ce conin vitamina C se realizeaz prin aceast metod1 i n

special n varianta perechi ionice (a se vedea exemplele de la celelalte vitamine
hidrosolubile)2.
Fazele mobile pentru cromatografia n faz inversat perechi ionice pentru
separarea vitaminei C conin 0,01 0,1 M acetat, pH 4 6 la care se adaug un
modificator organic ca metanol sau etanol. Cele mai folosite faze staionare sunt C8
i C18. Detecia se realizeaz fie n UV la lungimi de und cuprinse ntre 245 - 265
nm fie electrochimic.
Pentru mrirea sensibilitii deteciei s-a propus i conversia enzimatic a
acidului L-ascorbic la L-dehidroascorbic i cromatografiere n faz inversat3.
Urmeaz o derivatizare post-coloan n care acidul L-dehidroascorbic reacioneaz
cu o-fenilendiamina pentru a forma derivatul chinoxalinic. Acest derivat poate fi
monitorizat prin fluorescen (excitaie la 365 nm, emisie la 418 nm). n acest fel
acidul ascorbic poate fi cuantificat la niveluri mai sczute dect cele gsite n
probele de snge.
Importana determinrii vitaminei B12 pentru diagnosticarea multor boli,

mpreun cu recunoaterea faptului c un mare numr de analogi ai si sunt
biologic activi a dus la dezvoltarea multor metode cromatografice de analiz a
acestei vitamine.
Extracia vitaminei B12 i a derivailor si poate fi realizat folosind solveni
organici, cum ar fi amestec eter aceton (3:1)4.
Separrile analitice i preparative s-au realizat att prin cromatografie n faz
Ostafe, V., Brumaru, C., Papoe, G., Lupa, I., Annals West Univ. Timioara, Series of Biology, 2
(1999) 95-104
2
Fraser, A.G., Woollard, G.A., J. Gastroenterol. Hepatol., 14 (1999) 1070-1073
3
Speek, A.J., Schriver, J., Schreurs, W.H.P., Anal. Chem., 30 (1984) 1190-1205
4
Freukel, E., Prough, R., Kitchens, R.C., Methods Enzymol., 67 (1980) 31-40
184
VASILE OSTAFE
normal1, ct mai ales n faz inversat2, care se folosete cu predilecie i astzi, n

special n varianta perechi ionice.
n faz inversat3, separarea coenzimelor cobalaminice se realizeaz folosind
faze staionare ODS4 n combinaie cu faze mobile 50 mM fosfat de sodiu
metanol.
Interesul ridicat de studiul metabolismului vitaminelor B12 la microorganisme
a dus la dezvoltarea unor procedee ingenioase de izolare a lor. Pentru analiza
coenzimelor cobalaminice i corinoidice din Lactobacillus leichmannii, extractele
s-au preparat prin nclzirea celulelor la 70C n etanol 80%. Dup clarificare,
extractele au fost uscate prin evaporare i redizolvate n ap. Eluarea izocratic cu
acetonitril - 1 mM acetat de amoniu, pH 4,4 (3:7) de pe C8 sau C18 a dus la
separarea principalelor cobalamine naturale (sulfitcobalamina, cianocobalamina,
metilcobalamina i aquacobalamina). Cu eluare n gradient (tampon A: 0,05 M acid
fosforic, pH 3,0; tampon B: acetonitril) tot pe C8 sau C18 s-au separat n plus ali
cinci compui5.
Eluarea n gradient n HPLC n faz inversat a permis analiza cobalaminelor
prezente n Methanobacterium bryantii6. Dup o purificare iniial prin
cromatografie n faz inversat cu eluare izocratic la pH neutru, extractele au fost
cromatografiate pe C18 i eluate n gradient pornind de la 100 mM clorur de litiu
metanol (76:24) i ajungnd la 100 mM clorur de litiu metanol (52:48).
Detecia prin UV la 254 nm permite cuantificarea a cel puin 1 pmol de
ciancobalamin.
1
Snyder, L.R., Kirkland, J.J., Introduction to Modern Liquid Chromatography, Wiley-Interscience,

New York, NY, 1979
2
Jacobsen, D.W:, Green, R., Quadros, E.V., Montejano, Y.D., Anal. Biochem., 120 (1982) 394-403
3
Mizoguchi, K., Kagawa, M., Nakamura, M., Sato, K., J. Nutr. Sci. Vitaminol., 46 (2000) 97-100
Maggio-Hall, L.A., Escalante-Semerena, J.C.,Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 96 (1999) 11798-11803
Jacobsen, D.W:, Green, R., Quadros, E.V., Montejano, Y.D., Anal. Biochem., 120 (1982) 394-403
6
Whitman, W.B., Wolfe, R.S., Anal. Biochem., 137 (1984) 261-265
5
185
VITAMINE
Analiza vitaminelor B12 i C prin cromatografie

n faz inversat perechi ionice
Coloana
Faza
MeCN:5mM Hexan sulfonat de
mobil
sodiu +0.1% H3PO4 20:80
Gradient
Nu
Viteza
1 mLmin1
volumetric
Temperatura
Detecie
Proba
30C
UV@254 nm
1. Vitmaina C 2.Vitamina B.
Clasa vitaminelor A cuprinde un grup de molecule care sunt cunoscute sub

denumirea de retinoizi i mai include anumii caroteni care prezint activitate
similar vitaminei A (n mod particular -, - i -carotenii din plante). n plus,
aceti compui au muli derivai naturali formnd combinaii cu alcooli, acetatul i
palmitatul.
Alegerea metodei optime de cromatografiere a vitaminelor A este dictat de
condiiile folosite n etapa de extracie1. De exemplu, dac saponificarea pentru
ndeprtarea lipidelor este urmat de extracia cu solveni organici (cum ar fi
hexanul) compatibili cu folosirea de faz mobil apoas (0,5% acid acetic n
Schweigert, F.J., Hurtienne, A., Bathe, K., Int. J. Vitam. Nutr. Res., 70 (2000) 79-83.
186
VASILE OSTAFE
acetonitril) se poate folosi HPLC n faz inversat pe coloane C8 sau C181.

Analiza vitaminelor liposolubile prin cromatografie
n faz inversat
Coloana
Faza
MeOH:MeCN 75:25
mobil
Gradient
Nu
Viteza
1 mLmin1
volumetric
Temperatura
Detecie
Proba
40C
UV@280 nm
1. vitamina K3 2. vitamina A 3.
vitamina A Acetate 4. vitamina D2
5. vitamina D3 6. -tocoferol 7.
vitamina E acetate 8. vitamin K1
Cnd probele sunt extrase cu solveni organici necompatibili cu soluiile

apoase, cromatografierea se face n faz normal2. Aceast opiune este n mod
deosebit folosit n cazul cnd este necesar rezoluia izomerilor optici ai
vitaminelor A.
Detecia vitaminei A i a derivailor si se realizeaz cel mai bine prin
fluorescen, dei detecia n UV pe domeniul 310 - 330 nm este destul de des
folosit. Detecia carotenilor se poate realiza la 450 nm.
Analiza HPLC a vitaminelor D este destul de dificil datorit faptului c ele

sunt prezente n probele biologice doar n cantiti infime. S-au descris multe
1
2
Annesley, T., Grachero, D., Wilherson, K., Grekin, J., Ellis, C., J. Chromatogr., 305 (1984) 199-203
Noll, G.N., Becker, C., J. Chromatogr. A., 881 (2000) 183-188.
187
VITAMINE
metode de extracie, dar cea mai comun este saponificarea probei i extracia cu un
solvent organic (uzual hexan sau dimetilsulfoxid). Folosirea ca faz mobil a
eterului etilic n locul hexanului a fost recomandat deoarece acest solvent a permis
separarea vitaminelor D2, D3 i E din ficatul de pete1.
Principalii contaminani n analiza vitaminelor D2 i D3 sunt precursorii lor
metabolici, 7-dehidrocolesterolul i ergosterolul. Totui, att HPLC2 n faz
normal3 ct i n faz inversat4 pot duce la separri satisfctoare.
Detecia vitaminelor D se realizeaz, de obicei, la 254 nm.
Activitate vitaminic E au un numr larg de specii chimice clasificate ca

tocoferoli i tocotrienoli. Cele mai comune forme sunt -, -, - i -tocoferolii.
Separarea lor se poate realiza att prin HPLC n faz normal ct i n faz
inversat.
HPLC este acum larg acceptat ca metoda principal de analiz pentru
vitaminele E (tocoferolii) din extracte tisulare biologice5. Totui, dificultile legate
de extracia vitaminelor E nu las ntotdeauna probele ntr-un tampon convenabil
pentru etapa de cromatografiere.
Analiza extractelor tisulare coninnd vitamine E implic, n mod normal,
saponificarea, urmat de extracie cu solveni organici.
Pentru cazul folosiri HPLC n faz inversat extracia se poate face cu
aceton, iar eluarea cu amestecuri ap - metanol (cu procent foarte mic de ap)6.
Detecia -tocoferolului este cel mai bine realizat n fluorescen (excitaie
1
Stancher, B., Zonta, F., J. Chromatogr., 286 (1983) 93-98

Higashi, A., Shimada, K., Yakugaku Zasshi-J. Pharm. Soc. Jpn., 119 (1999) 898-920
3
Kissmeyer, A.M., Sonne, K., Binderup, E., J. Chromatogr. B. 740 (2000) 117-128.
4
Gamiz-Gracia, L., Jimenez-Carmona, M.M., de Castro, M.D.L., Chromatographia., 51 (2000) 428432.
5
Abidi, S.L., J. Chromatogr. A., 881 (2000) 197-216.
6
Zaspel, B.J., Saari-Csallany, A., Anal. Biochem., 130 (1983) 146-150
2
188
VASILE OSTAFE
la 295 nm, emisie la 340 nm). Detecia UV la 294 nm este, de asemenea posibil,
dar mult mai puin sensibil.
Analiza vitaminelor E prin cromatografie
n faz inversat
Inertsil 5 C8-3, 150 x 4.6mm
Coloana
Faza
MeOH:H2O 75:5
mobil
Gradient
Nu
Viteza
1 mLmin1
volumetric
Temperatura
Detecie
Proba
40C
UV@280 nm
1. vitamina K3 2. vitamina D3 3.
vitamina E 4. vitamina E acetat 5.
vitamina K1
Deoarece n produsele biologice exist doar cantiti foarte mici din

vitaminele K, metodele cromatografice iniiale folosite pentru analiza lor
cuprindeau dou etape: cromatografiere n faz normal urmat de cromatografiere
n faz inversat. Acest sistem cu 2 coloane era fcea utilizarea sa greoaie n special
pentru analize de rutin1.
Vitamina K poate fi extras in hexan i apoi supus cromatografierii att n
faz direct ct i n faz inversat.
Separarea vitaminelor K prin HPLC2,1 n faz normal, pe coloan de
silicagel, necesit eluarea izocratic cu 0,2% acetonitril n hexan.
1
2
Lefebre, M.D:, Leenheer, A.P., Claeys, A.E., J. Chromatogr., 186 (1979) 749-762
Iwase, H., J. Chromatogr. A., 881 (2000) 261-266.
189
VITAMINE
Detecia vitaminelor K se poate realiza prin monitorizare n UV la 248 - 254

nm. Sensibilitatea deteciei se poate mbunti la nivelul de subnanograme n
extractele plasmatice prin folosirea unui sistem de reducere colorimetric combinat
fie cu fluorescena2, fie cu detecia amperometric3. Detecia n fluorescen
permite cuantificarea a cel puin 25 pg vitamin A i poate fi combinat att cu
cromatografia n faz normal ct i cu cea n faz inversat4.
Analiza vitaminelor K prin cromatografie n faz inversat
Coloana
Faza
MeOH
mobil
Gradient
Nu
Viteza
1 mLmin1
volumetric
Temperatura
Detecie
Proba
40C
UV@280 nm
1. vitamina K3 2. vitamina E 3.
vitamina E acetat 4. vitamina K1
Bolton-Smith, C., Price, R.J.G., Fenton, S.T., Harrington, D.J., Shearer, M.J., Br. J. Nutr., 83 (2000)
389-399.
2
Miyakawa, T., Kajiwara, Y., Shirahata, A., Okamoto, K., Itoh, H., Ohsato, K., Jpn. J. Cancer Res.,
91 (2000) 68-74.
3
Iwase, H., J. Chromatogr. A., 881 (2000) 261-266.
Langenberg, J.P., Tjaden, U.R., J. Chromatogr., 305 (1984) 61-72
190

HPLC Ov PDF

Uploaded by

Document Information

Original Title

Copyright

Available Formats

Share this document

Share or Embed Document

Sharing Options

Did you find this document useful?

Is this content inappropriate?

Copyright:

Available Formats

HPLC Ov PDF

Uploaded by

Copyright:

Available Formats

Aplicaii ale

Cromatografiei de Lichide de nalt Performan

n amintirea D-lui Dr. Horst D. Schell,

D-lui Prof. Dr. B. Jarstorff,

Autorul mulumete tuturor celor ce au contribuit la

Glucide ................................................................................................................ 102

Nucleotide ......................................................................................................... 119

Lipide .................................................................................................................. 139

Steroizi .............................................................................................................. 157

Vitamine ............................................................................................................. 171

Prezentul curs de "Aplicaii ale Cromatografiei de Lichide de nalt

Cromatografia este un proces de separare n cascad n care

Fig. 1. Ilustrare a separrii cromatografice: (a) soluii A i B sunt adugai

n ultimii 50 de ani cromatografia ca tiin s-a dezvoltat

Cromatografia de lichide (LC) se refer la orice proces

Martin, A.J.P., Synge, R.L.M., Biochem. J., 35 (1941) 1358

pe hrtie, i cromatografia de lichide modern sunt toate

Probele trebuie s fie

Capacitatea excepional a cromatografiei de gaze (GC) de

macromolecule i specii ionice (de interes biomedical),

Avantaje ale HPLC fa

Exist 2 faze a cror

Cromatografia de lichide are unele avantaje fa de GC i

Exist o mare varietate de

Ridicarea la scal se face

n LC exist (cel puin pn acum) o mai mare

din urm este aplicat cu prioritate dac nu sunt de ateptat

BHT, BHA, THBQ

Timp de analiz lung

cromatografic tradiional i cel modern:

Ettre, L.S., LC Mag., 1 (1983) 108

AVANTAJE ALE HPLC

Coloanele pot fi refolosite de

Injectarea probelor se face

rate pentru fiecare component separat.

timpuri multiple de detectoare

timp de analiz redus, tipic

Pre ridicat al aparaturii,

perfect reproductibilitate a separrilor cromatografice1.

Ettre, L.S., LC Mag., 1 (1983) 108

Retenia unui amestec de solui pe o faz staionar are loc

VR volumul de retenie al solutului de interes (volumul

Fig. 3a. Un profil cromatografic tipic, prezentnd

unde F este viteza volumetric a fazei mobile,

Fig. 3b. Variabile folosite

(unde VS este volumul fazei staionare. n cromatografia de

Fig. 4. O band cromatografic Gaussian i

n procesul de trecere prin coloan moleculele de solut

Deviaia standard a benzii Gaussiene (Wb = 4) poate fi

Eficiena coloanei cromatografice depinde de N.

Noiunile de talere teoretice i teoria talerelor au

S considerm coloana mprit n multe talere teoretice

Cu ct valoarea lui N este mai mare cu att separarea va fi

N este direct proporional cu lungimea coloanei (L). O alt

Calitatea coloanei ca o msur a numrului de talere

proba const dintr-o substan cu mas molecular mic

Optimizarea procesului cromatografic implic realizarea

Rezoluia poate fi exprimat i n termenii cromatografici

Fazele staionare pot fi clasificate n funcie

Cele mai populare materiale cromatografice actuale sunt

economie de solvent (de

sensibilitate mrit (de

mai scurt, stabilitate mecanic mai mic i necesit timpi