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Laboratorio de Bioqumica Clnica

INSTITUTO POLITCNICO
NACIONAL
UNIDAD PROFESIONAL
INTERDISCIPLINARIA DE BIOTECNOLOGA
DEPARTAMENTO DE CIENCIAS BSICAS
ACADEMIA DE BIOQUMICA

MANUAL DE LABORATORIO
DE BIOQUMICA CLNICA

ELABORARON:
Biol. Leonor Patricia Rodrguez Pascual
Biol. Gerardo Rodrguez Muoz
Q.B.P. Martha Morales Martnez
M. en C. Rodrigo Martnez Ziga

2da. edicin. Enero 2014


Nombre del alumno_______________________________ Grupo _________
EQUIPO_________________

Laboratorio de Bioqumica Clnica

NDICE
Prctica 1. Seguridad en el laboratorio
6
Prctica 2. Desarrollo de un mtodo espectrofotomtrico para la determinacin de protenas en
suero humano.
13
Prctica 3. Electroforesis de suero.
23
Prctica 4. Uso de enzimas en el diagnstico clnico: perfil cardiaco y perfil heptico
29
Prctica 5. Curva de calibracin para la determinacin de glucosa en suero humano.
37
Prctica 6. Obtencion de valores de referencia de triglicridos y colesterol en suero humano
Prctica 7. Determinacin de urea, creatinina y acido urico.
Prctica 8. Determinacin de hormona gonadotropina corinica.
Prctica 9. Potenciometra

45
55
61
67

Apndice A. Uso de las pipetas automticas

74

Apndice B. Cmo se elabora el reporte?

75

Apndice C. Preparacin de Reactivos

80

Laboratorio de Bioqumica Clnica

PROLOGO
El curso de laboratorio de Bioqumica Clnica, tiene como objetivo capacitar al estudiante en el
manejo de sustancias, mtodos y equipos utilizados en el rea de Bioqumica, de manera que al
finalizar el curso pueda desarrollar procesos bioqumicos y en el futuro pueda implementarlos en su
vida profesional.
El manual est integrado por prcticas representativas y secuenciales de las unidades del
curso terico. Los criterios que se tomaron en cuenta para seleccionar el material incluido en este
manual fueron:
1)

Que el experimento ilustrara un principio fundamental terico.

2)

Que fuera lo ms simple posible permitiendo al alumno llevarlo a cabo en un tiempo de 3h.

3)

Que fuera de utilidad para sus cursos posteriores y para su vida profesional.

Cada una de las prcticas contiene la metodologa necesaria para el desarrollo experimental
de la prctica, as como los antecedentes tericos necesarios para la comprensin de cada uno de
los experimentos. Se pretende adems que el estudiante sea capaz de analizar e interpretar el
significado de los resultados obtenidos, de una manera crtica y racional.
Para alcanzar estos objetivos es necesario que el estudiante:
a.

Lea sus experimentos antes de ejecutarlos.

b.

Realice cuidadosamente sus experimentos, procurando entender el porqu de los hechos.

c.

Realice observaciones minuciosas y crticas de los experimentos.

d.

Anote sus observaciones y busque la explicacin cientfica.

e.

Que debe recurrir a sus libros de consulta, normas, instructivos de funcionamiento, etc., para
aclarar dudas y comprender el porqu de las operaciones que se han de ejecutar.

Con el fin de realizar anlisis y discusin de sus resultados, el estudiante puede consultar las
referencias recomendada al final de cada prctica o bien la sugerida al inicio del curso.
Este manual no sustituye a la participacin y gua de los profesores en el desarrollo
experimental, ni a la discusin de los resultados obtenidos.
ORGANIZACIN CON LOS ALUMNOS
1.- Se impartir una sesin por semana de 3 horas, cada sesin principiar y terminar a la hora
indicada.
2.- Antes de iniciar la sesin prctica, el alumno deber leer en el Manual de Prcticas, la introduccin
terica, y el desarrollo de la prctica, de manera que est enterado de las actividades que realizar
en el laboratorio. Para verificar esto, el profesor realizar una actividad con los alumnos antes de
iniciar la prctica.
3.- Para asistir al laboratorio el alumno deber traer:

Una bata limpia y con botones, de preferencia debe ser de algodn, manga larga y blanca.

Este manual de laboratorio.

La hoja de registro de laboratorio con foto (en la primera sesin)


4.- Por equipo debern traer:

Un rollo de masking tape


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Un marcador indeleble

Un metro de franela

Encendedor o cerillos

El material extra que indique el profesor al inicio del curso


DEL HORARIO Y COMPORTAMIENTO DE LOS ALUMNOS.
1.- Se pasar lista cada da al empezar la prctica.
2.- La asistencia al laboratorio es obligatoria, ya que uno de los objetivos del trabajo prctico es que el
alumno adquiera habilidades y destrezas mediante estas experiencias.
3.- La lista de asistencia se efectuara a la hora indicada para la prctica, con una tolerancia de 10
min.
4.- No habr retardos y se pondr falta a quien no llegue a la hora establecida con la bata
debidamente abrochada. En caso de llegar tarde no se permitir la entrada salvo causas de fuerza
mayor.
5.- Cuando el alumno abandone el laboratorio antes de terminar la prctica y sin consentimiento del
profesor, se considera que no asisti a la prctica.
6.- Las faltas al laboratorio se calificarn con cero.
7.- El alumno utilizar el manual de laboratorio, obligatoriamente en cada sesin, apegndose a la
metodologa a seguir, as como a las instrucciones del profesor.
8.- Utilizar como bitcora el manual de laboratorio en cada sesin para anotar todos los datos
obtenidos en el momento de la prctica.
9.- Se debe guardar el comportamiento adecuado para evitar accidentes, ya que el laboratorio es un
lugar de trabajo.
10.- Durante el desarrollo de la prctica, queda prohibida la entrada a personas ajenas al grupo que
visiten a los alumnos.
11.- El alumno revisar el material que reciba antes de entregar el vale y reportar cualquier anomala
antes de iniciar el trabajo prctico para evitar que se le responsabilice del material deteriorado que se
le entregue.
12.- El material biolgico se manejar con precaucin extrema. Todo el material contaminado con
sangre se depositar en el lugar en el lugar asignado para su esterilizacin y/o se tratar con
desinfectante (benzal o cloro).
13.- El alumno deber lavarse las manos al inicio y al final de cada prctica.
14.- Por razones de seguridad, queda estrictamente prohibido fumar, comer, ingerir bebidas y
masticar chicle dentro del laboratorio.
15.- Est prohibido el uso de celular durante la prctica, por lo que se le pide al alumno que lo apague
durante la explicacin, desarrollo y discusin de la misma.
16.- En la sesin de discusin de resultados el estudiante deber traer sus datos y los clculos que
solicite el manual.
17.- El reporte se entregar una semana despus de realizada la discusin.
18.- Despus de terminada la prctica, el material deber ser entregado limpio, a la persona
encargada del almacn del laboratorio, y deber limpiar la mesa al iniciar y terminar la prctica.
19.- El material y equipo roto, deteriorado o extraviado, deber ser repuesto por la persona o
personas responsables de l.
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EVALUACIN
1.-El laboratorio representa el 30% de la calificacin del curso, la cual solo se registrar en el SAES si
se presenta el examen de teora del parcial.
2.- Para aprobar el curso de laboratorio se requiere haber asistido al 80% de las sesiones prcticas y
obtener un promedio mnimo de seis.
3.- Las faltas al laboratorio se calificarn con cero. Si un alumno no asiste a una sesin tendr cero
en la actividad que se realiza en esa sesin. Si justifica la falta no se cuenta la falta para el computo
final de asistencias, pero la calificacin se mantiene.
4.-El laboratorio se evala como sigue:
Trabajo en la sesin
Discusin.

3.5 puntos
3.0 puntos

Reporte de la prctica 3.5 puntos


5.- Si el alumno no cumple con alguno de los tres aspectos, se le calificar con cero en la parte
correspondiente.
6. En el trabajo se evalan:
Antecedentes (elaboracin del diagrama de flujo*)

0.5 puntos

Limpieza en todos los aspectos

0.5 puntos

Organizacin (para trabajar en equipo)

1.0 puntos

Habilidad

1.0 puntos

Resultados obtenidos y registrados al momento 0.5 puntos


*Elaborar y llevar el diagrama de flujo del desarrollo prctico el da de la sesin de laboratorio. Despus,
pegar este diagrama firmado en el reporte de la prctica.

7. El reporte de la prctica se elabora con tinta, en un cuaderno tamao profesional forrado del
color que indique el profesor, con una etiqueta grande en la parte superior derecha con el equipo, y
en la parte inferior con el nombre de los integrantes del equipo, subrayando el nombre del propietario
del cuaderno.
8. En el reporte se evala:
Objetivo y referencias consultadas

0.5 puntos

Manejo de resultados

1.5 puntos

Discusin

1.0 puntos

Conclusiones

0.5 puntos

9. Cada profesor elegir un reporte para evaluarlo y revisar que todos los alumnos miembros del
equipo hayan elaborado el reporte. Si no es as, el alumno que no lo presente tendr cero en el
reporte.
10. Se asignar un punto extra a la tercera calificacin parcial de laboratorio, a los alumnos que
hayan entregado el 100% de los reportes completos.
11. En el apndice B se dan las instrucciones para la elaboracin correcta de un reporte y la
forma correcta de referenciar la bibliografa.
12. Es requisito aprobar el curso de laboratorio para aprobar la asignatura de Bioqumica Clnica

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PRCTICA No. 1
SEGURIDAD EN EL LABORATORIO
UNIDAD I: Introduccin a la bioqumica clnica y estructura celular.
1. OBJETIVOS
1.1. Objetivo general
El alumno:
1.1.1. Aplica las normas y medidas de seguridad en el laboratorio clnico.
1.2. Objetivos especficos.
1.2.1. Identifica las normas mexicanas que tienen relacin con la seguridad en un laboratorio clnico.
1.2.2. Aplica las normas en el manejo de residuos biolgicos infecto contagiosos.
1.2.3. Aplica las normas para evitar daos al equipo y mejorar la calidad del trabajo
2. INTRODUCCIN
Las personas que trabajan en laboratorios con sustancias qumicas, residuos biolgicos o
materiales potencialmente infecciosos deben conocer los posibles riesgos y tambin deben estar
capacitados y ser expertos en las tcnicas requeridas para manipular dichos materiales en forma
segura. La persona a cargo del laboratorio es responsable de brindar u organizar la capacitacin
adecuada del personal.
La Ley General del Equilibrio Ecolgico y la Proteccin al Ambiente, define como residuos
peligrosos a todos aquellos residuos que por sus caractersticas corrosivas, reactivas, explosivas,
txicas, inflamables y biolgico-infecciosas, que representan un peligro para el equilibrio ecolgico o
el ambiente; mismos que sern manejados en trminos de la propia ley, su Reglamento y las Normas
Oficiales Mexicanas que expida la Secretara de Medio Ambiente y Recursos Naturales,
correspondindole a la citada SEMARNAT su regulacin y control.
La NOM-087-ECOL-SSA1-2002 es de observancia obligatoria para los establecimientos que
generen residuos peligrosos biolgico-infecciosos y los prestadores de servicios a terceros que
tengan relacin directa con los mismos, as mismo tambin debemos de seguir la ley general de salud
sobre todo en el artculo 1128 que establece los productos biolgicos que requieren de control.
Asimismo la NOM La Norma Oficial Mexicana NOM-018-STPS-2000, proporciona la normatividad
vigente para la identificacin de peligros y riesgos por sustancias qumicas peligrosas en los centros
de trabajo. Esta Norma proporciona la codificacin para identificar y sealizar correctamente estas
sustancias a fin de evitar accidentes. Asimismo proporciona las hojas de datos de seguridad para tal
efecto. La Norma Oficial Mexicana NOM-026-STPS-1998, indica el cdigo de identificacin que
debern emplear los laboratorios y centros de trabajo en las tuberas que conducen fluidos, excepto
para las plantas potabilizadoras de agua.
La OMS en su tercera edicin del Manual de bioseguridad en el laboratorio de 2005 alienta a los
pases a aceptar y aplicar conceptos bsicos en materia de seguridad biolgica y a elaborar cdigos
nacionales de prcticas para la operacin de los laboratorios clnicos, biolgicos y qumicos. En este
manual se establece una clasificacin del nivel de bioseguridad de los laboratorios, basada en una
combinacin de las caractersticas de diseo, construccin, medios de contencin, equipo, prcticas y
procedimientos de operacin necesarios para trabajar con agentes patgenos de los distintos grupos
de riesgo. Los niveles van desde nivel 1 al nivel 4.
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A continuacin se presenta un Resumen de las prcticas y los procedimientos de laboratorio


esenciales en materia de seguridad que recomienda la OMS.
Acceso
1. El smbolo y signo internacional de peligro biolgico (figura 1) deber colocarse en las puertas de
los locales donde se manipulen microorganismos del grupo de riesgo 2 o superior.

2. Slo podr entrar en las zonas de trabajo del laboratorio el personal autorizado.
3. Las puertas del laboratorio se mantendrn cerradas.
4. No se autorizar ni permitir la entrada de nios en las zonas de trabajo del laboratorio.
Proteccin personal
1. Se usarn en todo momento batas o uniformes especiales para el trabajo en el laboratorio.
2. Se usarn guantes protectores apropiados para todos los procedimientos que puedan entraar
contacto directo o accidental con sangre, lquidos corporales y otros materiales potencialmente
infecciosos o animales infectados. Una vez utilizados, los guantes se retirarn de forma asptica y a
continuacin se lavarn las manos.
3. El personal deber lavarse las manos despus de manipular materiales y animales infecciosos, as
como antes de abandonar las zonas de trabajo del laboratorio.
4. En las zonas de trabajo estar prohibido comer, beber, fumar, aplicar cosmticos o manipular
lentes de contacto.
5. Estar prohibido almacenar alimentos o bebidas para consumo humano en las zonas de trabajo del
laboratorio.
Procedimientos
1. Estar estrictamente prohibido pipetear con la boca.
2. Todos los procedimientos tcnicos se practicarn de manera que se reduzca al mnimo la
formacin de aerosoles.
3. Se limitar el uso de jeringuillas y agujas hipodrmicas, que no se utilizarn en lugar de
dispositivos de pipeteo ni con ningn fin distinto de las inyecciones por va parenteral o la aspiracin
de lquidos de los animales de laboratorio.
4. Todos los derrames, accidentes y exposiciones reales o potenciales a materiales infecciosos se
comunicarn al supervisor del laboratorio. Se mantendr un registro escrito de esos accidentes e
incidentes.
5. Se elaborar y seguir un procedimiento escrito para la limpieza de todos los derrames.
6. Los lquidos contaminados debern descontaminarse (por medios qumicos o fsicos) antes de
eliminarlos por el colector de saneamiento. Puede ser necesario un sistema de tratamiento de
efluentes, segn lo que indique la evaluacin de riesgos del agente con el que se est trabajando.
Zonas de trabajo del laboratorio
1. El laboratorio se mantendr ordenado, limpio y libre de materiales no relacionados con el trabajo.
2. Las superficies de trabajo se descontaminarn despus de todo derrame de material
potencialmente peligroso y al final de cada jornada de trabajo.
3. Todos los materiales, muestras y cultivos contaminados debern ser descontaminados antes de
eliminarlos o de limpiarlos para volverlos a utilizar.

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Gestin de la bioseguridad
1. Incumbir al director del laboratorio (la persona que tiene responsabilidad inmediata respecto del
laboratorio) garantizar la elaboracin y la adopcin de un plan de gestin de la bioseguridad y de un
manual de seguridad o de operacin.
2. El supervisor del laboratorio (que depender del director) velar por que se proporcione
capacitacin peridica en materia de seguridad en el laboratorio.
3. Se informar al personal de los riesgos especiales y se le exigir que lea el manual de seguridad o
de trabajo y siga las prcticas y los procedimientos normalizados. El supervisor del laboratorio se
asegurar de que todo el personal los comprenda debidamente. En el laboratorio estar disponible
una copia del manual de seguridad o de trabajo.
Diseo e instalaciones del laboratorio. Caractersticas de diseo
1. Se dispondr de espacio suficiente para realizar el trabajo de laboratorio en condiciones de
seguridad y para la limpieza y el mantenimiento.
2. Las paredes, los techos y los suelos sern lisos, fciles de limpiar, impermeables a los lquidos y
resistentes a los productos qumicos y desinfectantes normalmente utilizados en el laboratorio. Los
suelos sern antideslizantes.
3. La iluminacin ser adecuada para todas las actividades. Se evitarn los reflejos y brillos molestos.
4. El mobiliario debe ser robusto y debe quedar espacio entre mesas, armarios y otros muebles, as
como debajo de los mismos, a fin de facilitar la limpieza.
5. Habr espacio suficiente para guardar los artculos de uso inmediato, evitando as su acumulacin
desordenada sobre las mesas de trabajo y en los pasillos. Tambin debe preverse espacio para el
almacenamiento a largo plazo, convenientemente situado fuera de las zonas de trabajo.
6. En cada sala del laboratorio habr lavabos, a ser posible con agua corriente, instalados de
preferencia cerca de la salida.
7. Las puertas irn provistas de mirillas y estarn debidamente protegidas contra el fuego; de
preferencia se cerrarn automticamente.
8. En el nivel de bioseguridad 2 se dispondr de una autoclave u otro medio de descontaminacin
debidamente prximo al laboratorio.
9. Los sistemas de seguridad deben comprender medios de proteccin contra incendios y
emergencias elctricas, as como duchas para casos de urgencia y medios para el lavado de los ojos.
Material de bioseguridad indispensable
1. Dispositivos de pipeteo para evitar que se pipetee con la boca. Existen muchos modelos diferentes.
2. Cmara de Seguridad Biolgica, que se utilizarn siempre que se manipule material infeccioso.
3. Autoclaves u otros medios apropiados para esterilizar el material contaminado.
4. Pipetas de Pasteur de plstico desechables, cuando estn disponibles, en sustitucin del vidrio.
Vigilancia mdica y sanitaria
La entidad que emplea al personal del laboratorio tiene la obligacin de cerciorarse, por medio del
director de ste, de que la salud de dicho personal est sometida a la debida vigilancia. El objetivo de
esa vigilancia es detectar posibles enfermedades
Capacitacin
Los errores humanos y las tcnicas incorrectas pueden poner en peligro incluso las mejores medidas
destinadas a proteger al personal de laboratorio. En consecuencia, la formacin continua en el
servicio acerca de las medidas de seguridad es primordial. La capacitacin del personal debe
comprender siempre la enseanza de mtodos seguros para utilizar procedimientos peligrosos que
habitualmente afectan a todo el personal de laboratorio y que entraan los siguientes riesgos:
Manipulacin de desechos
Se considera desecho todo aquello que debe descartarse. En los laboratorios, la descontaminacin y
la eliminacin de desechos son operaciones estrechamente relacionadas. En el trabajo cotidiano, son
pocos los materiales contaminados que es preciso retirar del laboratorio o destruir. La mayor parte de
la cristalera, los instrumentos y la ropa del laboratorio vuelve a utilizarse o se recicla.
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El principio bsico es que todo el material infeccioso ha de ser descontaminado, esterilizado en


autoclave o incinerado en el laboratorio.
Descontaminacin
El tratamiento en autoclave de vapor constituye el mtodo de eleccin para todos los procesos de
descontaminacin. El material destinado a la descontaminacin y eliminacin debe introducirse en
recipientes (por ejemplo en bolsas de plstico resistentes al tratamiento en autoclave) que tengan un
cdigo de color para indicar si el contenido ha de pasar a la autoclave o a la incineracin.
Procedimientos de manipulacin y eliminacin de material y desechos contaminados
Deber adoptarse un sistema de identificacin y separacin del material infeccioso y sus recipientes.
Se seguirn las normas nacionales e internacionales y se tendrn en cuenta las siguientes
categoras:
1. Desechos no contaminados (no infecciosos) que puedan reutilizarse o reciclarse o eliminarse como
si fueran basura en general (algodones con poca sangre
2. Objetos cortantes y punzantes contaminados (infecciosos): agujas hipodrmicas, bisturs, cuchillas,
vidrio roto; se recogern siempre en recipientes a prueba de perforacin dotados de tapaderas y
sern tratados como material infeccioso.
3. Material contaminado destinado al tratamiento en autoclave que despus pueda lavarse y volverse
a utilizar o reciclarse.
4. Material contaminado destinado al tratamiento en autoclave y a la eliminacin.
5. Material contaminado destinado a la incineracin directa.
Material contaminado (potencialmente infeccioso) para ser eliminado
Aparte de los objetos cortantes y punzantes mencionados ms arriba, todo el material contaminado
(potencialmente infeccioso) debe ser introducido en recipientes impermeables (por ejemplo en bolsas
de plstico que resistan el tratamiento en autoclave marcadas con un cdigo de color) y tratado en
autoclave antes de proceder a su eliminacin. Despus de pasar por la autoclave, el material puede
colocarse en recipientes apropiados para ser transportado al incinerador.
Si es posible, el material procedente de actividades relacionadas con la atencin sanitaria no debe
desecharse en vertederos, ni siquiera despus de haber sido descontaminado.
El material contaminado se coloca en recipientes especialmente marcados (por ejemplo, bolsas con
un cdigo de color) y se transporta directamente al incinerador.
Cuando se utilicen desinfectantes, los materiales de desecho deben permanecer en contacto ntimo
con stos es decir, durante el tiempo apropiado.
Cada laboratorio est obligado a desarrollar o adoptar un manual de operaciones o de
bioseguridad que identifique los riesgos que se encontrarn o puedan producirse, y que especifique
las prcticas y procedimientos destinados a minimizar o eliminar las exposiciones a estos riesgos. Se
debe alertar al personal acerca de los riesgos especiales y se le debe exigir que lea y cumpla las
prcticas y procedimientos requeridos.
3. MATERIAL Y REACTIVOS
NOM-087-ECOL-SSA1-2002. Proteccin ambiental salud ambiental residuos peligrosos
biolgico infecciosos- clasificacin y especificaciones de manejo.
NOM-005-STPS-1998. Condiciones de seguridad e higiene en los centros de trabajo para el
manejo, transporte y almacenamiento de sustancias qumicas peligrosas.
NOM-018-STPS- 2000. Sistema para la identificacin y comunicacin de peligros y riesgos por
sustancias qumicas peligrosas en los centros de trabajo..
NOM-026-STPS-2008. Colores y seales de seguridad e higiene, e identificacin de riesgos por
fluidos conducidos en tuberas.
NOM-007-SSA3-2011. Para la organizacin y funcionamiento de los laboratorios clnicos.
Diferentes reactivos qumicos.
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Instalaciones del laboratorio.


Tubos vacutainer con gel
Agujas verdes para vacutainer
Torundas, ligadura y adaptador

4. DESARROLLO EXPERIMENTAL
4.1. Por equipo leer cada una de las normas y realizar un breve resumen para exponer y discutirse en
grupo.
4.2 Un equipo expondr la forma de obtener muestras sanguneas con sistema Vacutainer y
precauciones necesarias para su uso.
4.4 El profesor te proporcionar 4 frascos de diferentes reactivos qumicos. Busca el cdigo de
rectngulo y el cdigo de rombo.
4.5 Anota los nmeros y colores que aparecen en el frasco, y de acuerdo a la NOM-018-STPS-2000
determina las caractersticas de cada sustancia en relacin a la Salud, Inflamabilidad, Reactividad, y
el Equipo de Proteccin que debe usarse para su manipulacin. Antalos en el cuadro 5.1. Si el
reactivo no tiene la informacin disea el sealamiento que debera tener de acuerdo a la norma.
4.6 Se te proporcionarn un conjunto de hojas de seguridad de los reactivos que se usarn en el
laboratorio, identifica en ellas los riesgos de las sustancias, as como la forma en que se desechan.
4.7 Ahora revisa los sealamientos que tiene el laboratorio en materia de seguridad como marca la
NOM-026-STPS-2008. Determina cules estn y cules no estn. Antalos en la tabla 5.2. Elabora
los sealamientos faltantes en el tamao que marca esta norma.
4.8 De acuerdo a la NOM-005-STPS-1998, indica si el botiqun del laboratorio cumple la norma y
toma nota de lo que se requiere. Antalos tambin en la tabla 5.2.
4.9 Revisa la NOM-007-SSA3-2011 e indica que puntos de la norma competen al Laboratorio de
Bioqumica Clnica de la UPIBI, cules de ellos se cumplen y cules no.
4.10 De acuerdo al Cdigo recomendado por la OMS, elabora un cuadro sinptico de las medidas de
seguridad que se debern en el laboratorio de Bioqumica Clnica.
5. MANEJO Y ANLISIS DE RESULTADOS
5.1 Llena los datos de los reactivos revisados en la tabla siguiente:
Tabla 5.1
Nombre del
Reactivo

Salud

Inflamabilidad

Reactividad

Equipo de
proteccin

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Tabla 5.2
Sealamientos presentes

Sealamientos ausentes

Materiales presentes en el botiqun

Materiales ausentes necesarios en el botiqun

5.2 Elabora en el tamao adecuado los sealamientos necesarios que no se encuentren en el


laboratorio.
5.3 Incluye en tu reporte los puntos de la PROY-NOM-007-SSA3-2009 que competen al Laboratorio
de Bioqumica Clnica de la UPIBI, cules de ellos se cumplen y cules no.
5.4 Tambin elabora un cuadro sinptico de las normas de seguridad que la OMS recomienda para
los laboratorios como el de Bioqumica Clnica de la UPIBI.
5.5. Realiza esquemas de los diferentes pasos que se necesitan para la toma de muestra sangunea
empleando en sistema Vacutainer, resaltando las precauciones que debes tener en este
procedimiento
6. DISCUSIN
Discutir los resultados obtenidos considerando la importancia de la aplicacin de las normas en el
laboratorio clnico y el papel del ingeniero biomdico en el laboratorio clnico.
7. CONCLUSIONES
7.1 En funcin de tus resultados y la discusin que realizaste, elabora tus conclusiones y verifica si se
cumplieron los objetivos planteados.
8. REFERENCIAS
8.1. MXICO. SECRETARA DE SALUD. Reglamento de la ley general de salud en materia de
control sanitario de actividades, establecimientos, productos y servicios. Diario Oficial de la
Federacin. 18 de enero de 1988.
8.2. MXICO. SECRETARA DE MEDIO AMBIENTE Y RECURSOS NATURALES. Norma Oficial
Mexicana NOM-087-ECOL-SSA1-2002, Proteccin ambiental Salud ambiental Residuos
peligrosos biolgico infecciosos- Clasificacin y especificaciones de manejo. NOM-087-ECOLSSA1-2002. Diario Oficial de la Federacin. 17 de febrero de 2003.
8.3. MXICO. SECRETARA DE TRABAJO Y PREVISIN SOCIAL. Norma Oficial Mexicana NOM005-STPS-1998, Relativa a las condiciones de seguridad e higiene en los centros de trabajo para
el manejo, transporte y almacenamiento de sustancias qumicas peligrosas. NOM-005-STPS1998. Diario Oficial de la Federacin. 2 de febrero de 1999.
8.4. MXICO. SECRETARA DE TRABAJO Y PREVISIN SOCIAL. Norma Oficial Mexicana NOM018-STPS-2000, Sistema para la identificacin y comunicacin de peligros y riesgos por
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sustancias qumicas peligrosas en los centros de trabajo. NOM-018-STPS-2000. Diario Oficial de


la Federacin. 27 de octubre de 2000.
8.5. MXICO. SECRETARA DE TRABAJO Y PREVISIN SOCIAL. Norma Oficial Mexicana NOM026-STPS-1998, Colores y seales de seguridad e higiene, e identificacin de riesgos por fluidos
conducidos en tuberas. NOM-026-STPS-2008. Diario Oficial de la Federacin. 25 de noviembre
de 2008.
8.6. MXICO. SECRETARA DE SALUD. Norma Oficial Mexicana NOM-007-SSA3-2011, Para la
organizacin y funcionamiento de los laboratorios clnicos. NOM-007-SSA3-2011. Diario Oficial
de la Federacin. 27 de marzo de 20012

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PRCTICA No. 2
DESARROLLO DE UN MTODO ESPECTROFOTOMTRICO
PARA LA DETERMINACIN DE PROTENAS EN SUERO
HUMANO.
UNIDAD I: Introduccin a la Bioqumica clnica y estructura Celular.
1. OBJETIVOS
1.1 Objetivo general
El alumno:
1.1.1. Desarrolla un mtodo espectrofotomtrico para la determinacin de protenas en suero
humano.
1.2 Objetivos especficos
El alumno:
1.2.1. Calibra un espectrofotmetro, empleando los fundamentos tericos de su uso y diseo.
1.2.2. Determina los factores que afectan el desarrollo de color de un mtodo de anlisis.
1.2.3. Establece las condiciones ptimas para realizar un mtodo para determinacin de protenas en
clnica.
2. INTRODUCCIN
En bioqumica clnica es de suma importancia el anlisis de sustancias en los pacientes, para la
determinacin de estados de salud o enfermedad. Muchas enfermedades tienen su origen en
alteraciones del metabolismo celular o en la fisiologa corporal y el diagnstico de estas se apoya en
pruebas bioqumicas. Las pruebas bioqumicas son importantes en la diagnosis, prognosis y
monitorizacin de las enfermedades. Se entiende por prognosis a la determinacin de la probabilidad
de que se desarrolle una enfermedad basndose en pruebas bioqumicas. La monitorizacin de una
enfermedad es el seguimiento del curso de una enfermedad.
Es por esto que una de las funciones ms importantes de la Bioqumica Clnica es la de disear,
realizar e interpretar pruebas bioqumicas, que proporcionen informacin relevante y significativa en el
diagnstico de enfermedades. Muchas de estas pruebas bioqumicas emplean mtodos
espectrofotomtricos para su realizacin.
En un anlisis espectrofotomtrico se aprovecha la absorcin selectiva que tiene una sustancia
sobre una longitud de onda especfica del total del espectro.
La absorcin de las radiaciones ultravioleta, visibles e infrarrojas depende de la estructura de las
molculas, y es caracterstica para cada sustancia qumica. Cuando una molcula es sometida a una
radiacin electromagntica, absorbe parte de la energa de la radiacin y se excita, es decir aumenta
su estado energtico. Del total de radiacin policromtica, (luz de varios colores, es decir de muchas
longitudes de onda) se absorbe solo un tipo preferente de longitud de onda, que depende de la
naturaleza molecular de la sustancia, (de las partculas subatmicas, del tipo de enlaces y de la
distribucin de electrones). sta energa es despus emitida con menos energa (longitud de onda
mayor). Se puede analizar el espectro de radiacin que absorbe la molcula, con lo que se tendr un
espectro de absorcin, o se puede estudiar el espectro de la radiacin que emite, para obtener un
espectro de emisin. Como parte de la radiacin de una longitud de onda determinada se absorbe, su
intensidad disminuye, y se puede medir la cantidad de luz que ha sido absorbida.
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Cuando se realiza un anlisis espectrofotomtrico se emplea la longitud de onda de mxima


absorcin, pues as se tiene una mayor sensibilidad en el mtodo, que se refleja en una mayor
absorcin.
La espectroscopia es la medicin e interpretacin de la radiacin electromagntica absorbida o
emitida por las molculas o tomos de una muestra. Un espectrofotmetro es un equipo conformado
generalmente de una fuente de radiacin, un monocromador, un contenedor de la muestra
(portaceldas), un fotodetector y el dispositivo de lectura.
Las fuentes de radiacin empleadas para la regin visible son filamentos incandescentes
(tungsteno o tungsteno halgeno) que suministran la energa radiante necesaria para el anlisis y
mantienen la energa y densidad de flujo de la luz durante el tiempo de operacin. Para el espectro de
luz ultravioleta se emplean lmparas de descarga de hidrgeno o deuterio, que operan a bajas
presiones y voltajes reducidos (40 V aprox.) y que trabajan muy bien en el rango de 380 160 nm.
Los monocromadores tienen como funcin proporcionar un haz de luz con un valor especfico de
longitud de onda y ancho determinado de una banda del espectro. Ya que la fuente de luz emite una
ancho de banda de toda la radiacin del visible, es necesario, para el anlisis de muestras, el uso de
luz monocromtica, es decir de una sola longitud de onda. Entre la fuente de luz y el monocromador y
entre este y el contenedor de la muestra existen un sistema de espejos que actan de colimadores
para hacer paralelos a los haces de luz y mejorar las determinaciones. Tambin existen filtros
despus del monocromador para mejorar la definicin de la longitud de onda saliente.
Una vez que sale el haz de luz monocromtico, de estrecho intervalo espectral, ste incide sobre
la muestra, colocada en una celda dentro del contenedor. Las celdas empleadas son de vidrio para el
uso de luz visible y de cuarzo para el empleo de luz UV. El vidrio absorbe la radiacin por abajo de
350 nm, y por ello no debe emplearse para las determinaciones con luz UV.
Un detector es un transductor que transforma la radiacin (luz) en flujo de corriente elctrica y si se
hace necesario, amplifica esa seal. Los detectores pueden ser celdas fotovoltaicas, fotodiodos de
estado slido, tubos fotoemisores y tubos fotomultiplicadores. Los tubos fotoemisores al vaco estn
formados de un ctodo sensible a la luz como un semicilindro de metal y un nodo de alambre
situado a lo largo del eje del cilindro, encerrado en una cubierta al vaco. Cuando la radiacin incide
sobre la cubierta sensible del ctodo, se emiten electrones que son captados por el nodo,
constituyndose una corriente. La corriente generada se evidencia en un mdulo de lectura, que
puede ser analgica o digital, y que nos permite establecer la cantidad de luz que fue absorbida por la
muestra, o la de luz transmitida, segn se desee determinar absorbancia o transmitancia, y que
estar en funcin de la concentracin y naturaleza de la muestra.
Antes de emplear un espectrofotmetro para determinaciones del laboratorio, es necesario
calibrarlo, para evitar errores en las determinaciones. El equipo puede descalibrarse por fallas en el
sistema ptico, sobre todo espejos sucios, rayados o movidos. Si la lmpara est sucia o pierde
potencia, puede generar problemas en las lecturas. El sobrecalentamiento o las variaciones del
voltaje tambin pueden descalibrar el espectrofotmetro.
La absorbancia (As) o densidad ptica (DO), de una luz monocromtica (de una sola longitud de
onda), se define como el logaritmo decimal de la relacin entre la intensidad de la radiacin no
absorbida (It) y la intensidad de la radiacin incidente (I0).

A = - log It / I0
Y de qu depende la magnitud de la absorcin de radiacin de una sustancia? Depende de la
cantidad de molculas que haya. Dicho en otros trminos la cantidad de luz absorbida depende de la
concentracin de la muestra. Esto lo describi Beer en 1852. Pero tambin depende del espesor de la
capa que atraviese la luz, o la distancia que sta recorra, como describieron Bouguer y Lambert
(1730-1760). Combinando ambos factores se obtiene lo que se conoce como la Ley Bsica de
espectrofotometra o Ley de Bouguer Beer Lambert (BBL), la cual indica que la relacin entre la
14

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intensidad de luz incidente y transmitida depende de la concentracin de la muestra ( c) y el dimetro


de la celda, esto es la distancia que la luz atraviesa por el cuerpo (l)

It = I0 10-cl

log I0 / It = cl

Generalmente se emplean celdas de un centmetro de paso y la concentracin se expresa en


moles/L; entonces el factor se convierte en o coeficiente de absorcin molar.
La relacin I0 / It se llama transmitancia y es representada como T, expresndose en porcentaje
(%). La relacin -log I0 / It se llama absorbancia y se representa As, expresndose en numerales. Por
lo tanto la absorbancia ser proporcional al dimetro de la celda y la concentracin de la muestra.

As = c l
Como el dimetro de la celda (l) generalmente es de 1cm, podemos decir que la absorcin
depende de la concentracin de la muestra (c). Esta relacin se emplea para la determinacin de
concentracin de sustancias en el laboratorio clnico, y lo que hay que conocer es el coeficiente de
extincin o absorcin molar.
Comparando la longitud de onda y la intensidad del mximo de absorcin de luz de una muestra
contra la de soluciones estndar es posible determinar la identidad y la concentracin de los
componentes de una muestra. Los mtodos de anlisis basados en los principios de la absorcin
antes mencionados se conocen como mtodos colorimtricos y espectrofotomtricos. Las ventajas de
los mtodos espectrofotomtricos son varias: son rpidos, precisos, verstiles, fciles de usar y
eficientes en costo. Por ello, la determinacin de la presencia y concentracin de sustancias de
importancia clnica emplea en muchos casos stos mtodos.
Es necesario establecer las condiciones exactas del mtodo: la longitud de onda a la que absorbe
la sustancia; cuando la sustancia en cuestin no absorbe el espectro visible o UV, es necesario llevar
a cabo una reaccin colorimtrica para evidenciarla, entonces es necesario establecer muy bien las
condiciones de la reaccin y cules son los factores fisicoqumicos que la afectan. Tambin es
necesario determinar la especificidad, sensibilidad y exactitud del mtodo, as como su rango de uso.
La especificidad se refiere a si la reaccin, el mtodo o la empleada son exclusivos de la
sustancia a determinar o existen varias sustancias que se pueden medir con este mtodo. La
sensibilidad se refiere a observar una variacin en la absorbancia, cuando se presenta una variacin
en la concentracin. La exactitud se refiere a establecer la concentracin real o verdadera de la
sustancia sin temor a cometer errores, o con mrgenes confiables de determinacin. La linearidad se
refiere a las concentraciones entre las cules el mtodo es til.
La precisin tiene que ver con la concordancia que se presentan en los valores obtenidos en
diferentes ensayos o por diferentes personas; tambin se conoce como reproducibilidad. La precisin
esta influida por el error aleatorio del mtodo. Se determina al realizar varias rplicas del mtodo, y se
expresa como la dispersin de los datos, o desviacin estandar (s). Para saber la significancia de
este valor se tienen que analizar en funcin del valor medio ()
Finalmente se debe saber la estabilidad de la reaccin que genera color. Como siempre se
presentan pequeas variaciones debidas a la eficiencia de cada aparato, a difracciones por defectos
en las celdas, a errores de pipeteo en la toma de muestra, es necesario en todo momento elaborar
una curva de calibracin. Una curva de calibracin se elabora con varios de tubos con
concentraciones conocidas (casi siempre en orden ascendente) de la muestra, que darn valores
ascendentes en las lecturas de absorcin.
Una vez que se tiene el mtodo apropiado es necesaria una interpretacin de los datos que ste
mtodo est produciendo, esto es, que resultados de un paciente pueden ser considerados sanos, y
cuales significativamente diferentes enfermos, y si las diferencias entre estos son consistentes.
Todos los datos presentan cierta variacin, y las variables biolgicas muestran, por lo general, una
distribucin Gaussiana, tambin llamada Normal. Se considera un intervalo normal o de referencia
15

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aquel que se encuentra entre la media +/- dos veces la desviacin estndar, la cual abarca el 95% de
los datos.
La consideracin de un resultado como enfermo, depende de la precisin y exactitud del ensayo,
as como de la variabilidad biolgica natural, por lo que es necesario considerar la desviacin
estndar global, que incluya tanto la biolgica como la analtica.
En esta prctica se establecer un mtodo espectrofotomtrico para determinar protenas en suero
humano, y los parmetros que lo caracterizan. La albmina es la ms abundante de las protenas
sricas. Su funcin en el cuerpo es transportar substancias tales como medicamentos, antibiticos,
bilirrubina y cidos y sirve como almacn de protenas de estructura, necesarias para el crecimiento
de los tejidos. Los niveles bajos de albmina se presentan en enfermedades como el sndrome
nefrtico, enfermedades hepticas, infecciones agudas y mala nutricin haciendo as a las
determinaciones de albmina de primordial importancia. Muchos mtodos han sido descritos para
determinar a la albmina srica. La reaccin de la albmina humana con el prpura de bromocresol
(BCP) se usa ampliamente y se basa en la capacidad de la albmina srica de copularse con
colorantes, en este caso con el BCP.
3. MATERIAL Y REACTIVOS
3.1 EQUIPO Y MATERIAL

Espectrofotmetro visible
Centrfuga clnica
Celdas de 1 cm de paso
Tubos vacutainer con gel
Agujas verdes para vacutainer
Torundas, ligadura y adaptador
Tubos de ensaye de 13 X 100 mm
Pipetas de 2 mL
Pipetas de 5 mL
Micropipetas automticas de 100 L
Puntas para micropipeta automtica de 100 L

3.2 REACTIVOS Y MATERIAL BIOLGICO


Prpura de Bromocresol (BCP) 80 molar, pH 4.9 - 5.2.
Soluciones de Albmina Humana de 4 mg/mL, 6 mg/mL, 10 mg/mL, 20 mg/mL, 40 mg/mL, 60
mg/mL 100 mg/mL, 160 mg/mL, 200 mg/mL, en ssf.
Albmina de huevo 60 mg/mL en ssf.
Glicina 60 mg/mL en ssf.
Solucin de albmina humana 60 mg/mL emulsionada con aceite de oliva (3:1 albmina:aceite
de oliva).
Solucin de albmina humana 60 mg/mL emulsionada con ampicilina 1 mg/mL (1:1
albmina:ampicilina).
Solucin de albmina humana 60 mg/mL emulsionada con hemoglobina (9:1, albmina :
hemoglobina).
Suero humano.

16

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4. DESARROLLO EXPERIMENTAL
PRIMERA SESIN.
A. CALIBRACIN DE ESPECTROFOTMETRO
1.
Encender el equipo 5 minutos antes de usarlo, este se calibrar automticamente. Cuando
haya terminado presiona la tecla Test para visualizar el men principal.
B. MTODO ESPECTROFOTOMTRICO. SELECCIN DE LA DE As MXIMA.
2.
Preparar dos tubos de 13 x 100 mm como marca la tabla 4.1. Emplear la micropipeta para
tomar los microlitros (L).
Tabla 4.1
Tubo
Prpura de bromocresol
Sol. Tipo de Albmina
Agua
(BCP)
de 60 mg/mL (L)
(L)
(mL)
Blanco
2.0
20 L
1
2.0
20 L
3.
4.
5.
6.
7.

Permitir el desarrollo de color a temperatura ambiente (18 30 C) durante 5 minutos.


Calibrar con el tubo blanco el intervalo de , que es de 400 650 nm (visible) usando la opcin
de barrido del espectrofotmetro, leyendo cada 10 nm (opcin turbo)
Leer la As del tubo 1 de 400 650 nm (visible). Anotar los datos en la tabla 5.1.
Releer el tubo en los 10 nm alrededor de la As mxima, nanmetro por nanmetro (opcin
lenta), para determinar la de absorcin mxima con exactitud, y anotar ese valor.
Una vez que hayas determinado la de absorcin mxima, seleccinala en el
espectrofotmetro e introduce una celda con agua destilada y ajustar a cero de As y 100% de
T. Despus introducir blanco y observar la lectura que da en As.

C. MTODO ESPECTROFOTOMTRICO. LINEARIDAD, RANGO UTIL, SENSIBILIDAD,


EXACTITUD Y PRECISION DEL MTODO.
8.
Previo a este experimento se obtendr el suero de uno de los alumnos del equipo, a partir de
5 mL de sangre perifrica empleando tubos Vacutainer con gel. Centrifugar a 3000 rpm
durante 5 minutos.
9.
Preparar una serie de tubos como marca la tabla 4.2.
Tabla 4.2
Tubo

Prpura de bromocresol
(BCP)
(mL)

20 L de una Solucin de
Albmina de la
concentracin siguiente

Agua
(L)

Blanco

2.0

20 L

2.0

4 mg/mL

2.0

6 mg/mL

2.0

10 mg/mL

2.0

20 mg/mL

2.0

2.0

40 mg/mL
60 mg/mL

2.0

100 mg/mL

2.0

160 mg/mL

Este tubo se emplear como calibrador

17

Laboratorio de Bioqumica Clnica

2.0

200 mg/mL
Tabla 4.2 (continuacin)

Tubo

Prpura de bromocresol
(BCP)
(mL)

20 L de suero

Agua
(L)

Suero*

2.0

(se calcular la
concentracin de albmina)

* El Suero no se emplear en la construccin de la curva de calibracin.

10.
11.

12.
13.

Permitir el desarrollo de color a temperatura ambiente (18 30 C) durante 5 minutos.


Tomar la lectura del blanco a la max seleccionada y anotarla en la tabla 5.2. Despus calibrar a
cero de As y 100% de T con ese mismo blanco (Este paso se realizar solo para esta prctica,
pues en condiciones normales, la lectura del blanco no se realiza, sino que se ajusta
directamente)
Determinar la As y el % de T de cada tubo a la max seleccionada en el punto A.
Anotar los resultados en la tabla 5.2. Adems se utilizarn los datos de varios equipos.

SEGUNDA SESIN
C. ESPECIFICIDAD DE LA REACCIN.
14.
Preparar una serie de tubos como marca la tabla 4.3
Tabla 4.3

Blanco

Prpura de bromocresol
(BCP) (mL)
2.0

2.0

2.0

Tubo

15.
16.
17.

20 L de solucin de
Albmina de huevo
60 mg/mL
Glicina 60 mg/ mL

Agua
(L)
20
-

Permitir el desarrollo de color a temperatura ambiente (18 30 C) durante 5 minutos.


Determinar la As de cada tubo a la max seleccionada en el punto A, empleando el blanco para
calibrar a cero de As.
Anotar los resultados en la tabla 5.5.

D. INTERFERENCIAS CON EL MTODO.


18.
Preparar una serie de tubos como marca la tabla 4.7.

19.

Tubo

Prpura de
bromocresol (BCP) mL

Blanco

2.0

2.0

2.0

2.0

Tabla 4.7
20 L de Sol. de Albmina
de 60 mg/mL
Emulsionada con aceite de
oliva
Emulsionada con ampicilina
Emulsionada con
hemoglobina

Agua
20 L
-

Desarrollar color por 5 minutos y leer la absorbancia, empleando el blanco para calibrar.
18

Laboratorio de Bioqumica Clnica

20.
21.

El testigo positivo es el tubo 1 del experimento D, de modo que habr que registrar esa lectura
para este experimento.
Anotar los resultados en la tabla 5.6.

5. MANEJO Y ANLISIS DE RESULTADOS.


A. Seleccin de la de As mxima.
5.1 Explica para que se realiza el ajuste o calibracin con agua destilada, y con el blanco a 100 % T y
0 de As.
5.2 Indica cules son las posibles causas de descalibracin del equipo
5.3 Anota los las lecturas de As obtenidas en la Tabla 5.1
Tabla 5.1

As

400
410
420
430
440
450
460
470
480
490
500
510
520

As

530
540
550
560
570
580
590
600
610
620
630
640
650

Tabla 5.1 b
(Relectura de los 10 nm alrededor de la de mxima absorbancia)

As

19

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5.4 Sealar la de mxima absorbancia Para qu sirve este dato? De igual forma anota la As del
blanco a esta longitud de onda, qu significa este dato?
de mxima absorbancia= ____________
absorbancia del blanco=___________
5.5 Elabora la grfica de barrido, poniendo la As en el eje Y (ordenadas) contra en el eje X
(abscisas).
B. Linearidad, Rango til, Sensibilidad, Exactitud y Precisin del mtodo.
5.6 Anota los resultados en la Tabla 5.2
Tabla 5.2
Tubo
Concentracin de
As
albmina mg/mL
=
Blanco
1
2

4
6

10

20

40

60*

100

160

200

%T

Suero3
* Este tubo acta como calibrador

5.7 Anotar en la tabla a que longitud de onda (en nm) se hizo la determinacin ().
5.8 Elaborar la curva tipo colocando en las ordenadas la Absorbancia (a la seleccionada) y en las
abscisas la concentracin de albmina en mg/mL:
5.9 Anota la ecuacin obtenida con esta grfica, as como el coeficiente de correlacin. Determinar si
la relacin es lineal y porque se conoce esto.
5.10 Sigue ste mtodo la ley de Bouger Beer Lambert? Explica porque.
5.11 Marcar dos puntos en el eje Y de As, con una separacin de 0.01 de As, e interpolar cada uno
en la grfica. Obtener la diferencia en concentracin. Esta es la sensibilidad. Anotar la sensibilidad
obtenida en la tabla 5.4
5.12 Cmo se define la sensibilidad?
5.13 Con tus resultados calcular lo que se pide en la tabla 5.3
Tabla 5.3
Tubo
Concentracin de
Logaritmo de la
As
%T
Absortancia
Estos datos ya los
albmina mg/mL*
concentracin
(100 %T)
tienes de la tabla
anterior.

1
2
3
4
5
20

Laboratorio de Bioqumica Clnica

6
7
8
9
5.14 Elaborar en papel milimtrico la grfica de Ringbom, colocando en la ordenadas la
absortancia y en las abscisas el logaritmo de la concentracin.
5.15 Sealar en esa grfica los puntos de inflexin de la misma, es decir los puntos donde la
grfica deja de ser lineal. Para ello, sobre la grfica (que seguramente es un poco curva), trazar
una lnea recta de diferente color, que incluya la mayor parte de los puntos posible. Los valores de
concentracin fuera de la lnea recta indican los valores de concentracin donde el mtodo ya no
sigue la Ley de BBL, es decir no es lineal. Los puntos de inflexin proporcionan el Rango til de
Concentracin del mtodo. Anotar este rango en la tabla 5.4
5.16 Ahora calcula la sensibilidad del mtodo de la siguiente manera: En la zona de la grfica de
Ringbom que es lineal, calcula la ecuacin de la recta. En esta recta elige dos puntos de
absortancia que tengan una diferencia de 0.1 y con la ecuacin interpola los valores para obtener
la concentracin. La variacin en la concentracin entre estos dos puntos es la sensibilidad
5.17 Anotar la sensibilidad obtenida en la tabla 5.4. Explica si corresponde con la obtenida en la
curva tipo.
Tabla 5.4
Sensibilidad con la curva tipo
Sensibilidad con la grfica de Ringbow
Rango til de concentracin del mtodo
% de error
Desviacin estndar (SD)
5.18 Anota el valor de As obtenido con el calibrador de albmina.
5.19 Empleando la ecuacin de la Curva tipo y este valor de As, calcula la concentracin del
calibrador y anotarla ____________ Corresponde con la concentracin terica?
5.20 Calcula el % de desviacin obtenida, considerando la concentracin terica, que es de 60
mg/mL como el 100%. Anotar el % de desviacin en la tabla 5.4. La desviacin debe ser menor al
10% para considerar un mtodo con buena exactitud. Consideras que ste mtodo tiene buena
exactitud? Explica porque.
5.21 Tomando los datos empricos de concentracin del calibrador de todo el grupo, se calcular la
media ( x ) y la desviacin estndar (SD) del mtodo para todo el grupo. Anotar la SD en la
tabla 5.4
5.22 Para considerar un mtodo preciso la SD no debe ser mayor al 10%. Segn tus resultados
explica si ste mtodo tiene buena precisin.
5.23 En la tabla 5.2 se anot el valor de As obtenida para el suero humano. Empleando la ecuacin
de la curva tipo, calcula la concentracin de albmina en ese suero y antala en la misma tabla
5.2.
5.24 Explica si consideras ste mtodo til para determinar la concentracin de albmina en suero
humano.
C. Especificidad de la reaccin.
5.25 Anota los resultados en la tabla 5.5.
Tubo

Tabla 5.5
Protena

As
21

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5.26 Explica la diferencia en los resultados obtenidos entre el colgeno (protenas) y la glicina
(aminocido) y el calibrador de albmina.
D. Interferencias con el mtodo.
5.27 Anotar los resultados obtenidos en este experimento en la tabla 5.6
Tabla 5.6
Tubo
Condicin
1
2

Albmina + lpido
Albmina + amp

Albmina + Hb

Tubo calibrador

Albmina sola

As

5.28 Explica la diferencia entre los datos obtenidos en los diferentes tubos con los del calibrador,
diras que hay interferencias? Ante estas interferencias que debe hacerse al realizar la tcnica?
6. DISCUSIN
Discutir los resultados obtenidos considerando los siguientes aspectos:
La importancia de la calibracin de un equipo espectrofotomtrico en un laboratorio clnico, los
cuidados que deben tenerse con un equipo espectrofotomtrico para evitar que se descalibre. Los
aspectos a tomarse en cuenta cuando se va a implementar un mtodo espectrofotomtrico para un
anlisis clnico y si el mtodo usado en la prctica cumple con estas especificaciones.
7. CONCLUSIONES
7.1
En funcin de los resultados y la discusin que se realiz, elaborar las conclusiones de la
prctica.
8. REFERENCIAS
8.1. Skoog, D., Holler, J. y Crouch, S. 2006. Principios de anlisis instrumental. 6a. edicin. Ed.
Mc Graw-Hill Co. Mxico.
8.2. Willard, H., Merritt, L., Dean, J. y Settle, F. 1991. Mtodos Instrumentales de Anlisis. 7a.
edicin. Grupo Editorial Iberoamericana, Mexico.
8.3. Kaplan, L. y Pesce, A. 2002. Qumica clnica: Mtodos. 4a. edicin. Ed. Mdica
Panamericana.
8.4. Louderback, A., Mealy, E. y Taylor, NA. 1968. A new dye binding technique using bromocresol
purple for determination of albumin in serum. Clin. Chem. 14: 793.
8.5. Murray, R. K., Bender, D. A., Botham, K. M., Kennedy, P. J., Rodwell, V. M. y Weil, P. J. 2010.
Harper Bioqumica Ilustrada. 28a. ed. Mc Graw Hill. Mxico.

22

Laboratorio de Bioqumica Clnica

PRCTICA No. 3
ELECTROFORESIS DE SUERO.
UNIDAD VII: Equipos empleados en la clnica para el estudio del metabolismo.
1. OBJETIVOS
1.1 Objetivo general
El alumno:
1.1.1. Desarrolla la electroforesis vertical en gel de poliacrilamida para separar las protenas del suero
humano.
1.2 Objetivos especficos
El alumno:
1.2.1. Determina los principios de operacin de la tcnica y el equipo de electroforesis PAGE.
1.2.2. Determina el peso molecular de las principales protenas que se encuentran en el suero y
plasma.
2. INTRODUCCIN
De la fase lquida de la sangre, el 90% es agua, y del 10 % restante el 70% corresponde a
protenas, las cuales son de gran importancia en la Bioqumica Clnica, ya que estas varan sus
concentraciones en diferentes condiciones fisiolgicas. Existen ms de 100 protenas con una funcin
fisiolgica en el plasma, las funciones que tienes estas protenas van desde transporte (Albmina,
Apolipoprotena, Transferrina), inmunidad (Inmunoglobulinas), mantenimiento de presin osmtica
(todas, especialmente la Albmina), inhibidores de proteasas (Antitripsina 1), regulacin del pH, etc.
Algunas protenas plasmticas son enzimas (Renina, Factores de coagulacin) principalmente
plasmticas, pero tambin se encuentran de origen intracelular debido al reciclaje celular normal, o a
dao celular.
La electroforesis es una tcnica analtica que permite separar sustancias en funcin de su carga
elctrica, para separar una mezcla de protenas en muestras biolgicas. Debido a que una protena
est cargada cuando se encuentra en un pH diferente de su punto isoelctrico (pI), sta migrar en
un campo elctrico de un modo dependiente de su densidad de carga.
Las principales propiedades que determinan la migracin de una protena bajo condiciones dadas
en una tcnica electrofortica son: tamao, carga neta, forma e hidrofobicidad relativa). La separacin
es llevada a cabo en un medio de soporte para contrarrestar los efectos de la conveccin y difusin
que ocurren durante la electroforesis, y para facilitar la inmovilizacin de las protenas separadas,
entre los materiales de soporte o matrices se pueden mencionar el almidn, agarosa, acetato de
celulosa, as como poliacrilamida, cuya aplicacin se denota como PAGE (electroforesis en gel de
poliacrilamida).
La acrilamida-bisacrilamida son compuestos que polimerizan en presencia de iones catalizadores
(persulfato o TEMED), formando una malla o red con poros. El tamao de estos poros depende de la
concentracin de bisacrilamida. Por estos poros podrn pasar molculas, como protenas, segn su
tamao. As el gel de poliacrilamida se comporta como un tamiz (coladera) molecular.

23

Laboratorio de Bioqumica Clnica

La electroforesis se puede realizar en condiciones no desnaturalizantes como desnaturalizantes, la


primera permite retener la actividad biolgica y propiedades enzimticos, en contraste, la segunda
implica condiciones ms vigorosas, desnaturalizantes y comunes para separar protenas menos
solubles, implica la participacin del detergente dodecil sulfato de sodio (SDS-PAGE) y de Mercaptoetanol, con esto se logra la adquisicin de carga negativa y una forma homognea de todas
las protenas presentes en la muestra as como la separacin de las cadenas polipeptdicas que
forman parte de una protena por la ruptura de los puentes disulfuro. Las protenas tratadas de esta
manera se comportan como si tuvieran una forma similar y una relacin carga/masa idntica, lo que
da como resultado que la movilidad electrofortica est nicamente relacionada con el peso
molecular de la protena a causa de la accin del gel como tamiz molecular.
Si una serie de protenas de peso molecular conocido son sometidas a electroforesis, se separan
en una serie de bandas y la representacin grfica de la distancia recorrida en funcin del logaritmo
del peso molecular da una recta. De este modo, si una protena de peso molecular desconocido es
sometida a una electroforesis de modo simultneo con protenas de peso molecular conocido, el de
aquella se puede calcular con una exactitud variable entre el 5 y el 10%.
La electroforesis para el fraccionamiento de protenas ha resultado ser una valiosa tcnica de
separacin y cuantificacin en el laboratorio clnico, para anlisis de protenas sricas o plasmticas
as como para el anlisis de lquido cefalorraqudeo y para anlisis de lipoprotenas, se puede hacer
la evaluacin de las diferentes fracciones proteicas en diversos estados patolgicos.
3. MATERIAL, EQUIPO Y REACTIVOS
3.1 EQUIPO Y MATERIAL

Bao mara a ebullicin


Cmara de Electroforesis para Poliacrilamida
Parrilla con agitador magntico
Una fuente de poder de 100 V
Soporte universal completo
Un bao Maria
Mechero
Pipeta Pasteur
Pipeta automtica de 10 L
Pipeta automtica de 20 L
Pipeta automtica de 100 L
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Laboratorio de Bioqumica Clnica

Puntas para pipetas automticas


Agitador magntico
Agujas para vacutainer
Tubos vacutainer con gel y con EDTA
Torundas, ligadura y adaptador
2 matraces de 125 ml
Agitador de vidrio

3.3 REACTIVOS

Amortiguador 4X a pH 8,8 (Tris HCl 1.5 M)


Amortiguador 4X a pH 6.8 (Tris HCl 0.5M)
Acrilamida- bisacrilamida 29:1%
TEMED
Solucin buffer de Fosfatos Salina pH 7.4 (PBS: NaCl 137mM, KCl 2.7mM, Na 2HPO4 10mM,
KH2PO4 1.8mM)
Persulfato de amonio 10%
Amortiguador de Laemmli 2x (Tris-HCl 120mM, glicerol 20%, SDS 2 %, EDTA 2 mM, azul de
bromofenol 0.02%, ditiotreitol 0.2 M). Puede contener mercaptoetanol
Fibringeno srico 1 mg/mL en PBS 10 mM, pH 7.5
Albmina humana 1 mg/mL (usar de la prctica anterior)
Marcador de peso molecular para protenas
Solucin de trabajo para la tincin de protenas en el gel de poliacrilamida con Azul de
Coomassie
Solucin desteidora (metanol al 50%, cido actico glacial al 10%)
Buffer de corrimiento 1X. (Tris-HCl 25mM, Glicina 192mM, SDS 0.1%)

3.3 MUESTRA BIOLGICA


5 ml de sangre

25

Laboratorio de Bioqumica Clnica

4. DESARROLLO EXPERIMENTAL
A. ENSAMBLADO DEL EQUIPO Y PREPARACIN DEL GEL
4.1 Se ensamblan los componentes del sistema (vidrios) en el soporte para tal efecto, de acuerdo a
las instrucciones del profesor.
4.2 Preparar el gel separador (al 10%) en un vaso de precipitados mezclando con agitador magntico
y de acuerdo a lo que indica el cuadro:
Amortiguador 4x pH 8,8 (1,5M)

1.5 ml

Acrilamida-bisacrilamida al 29:1%

1.98 ml

H2O destilada

2.54 ml

TEMED 8.4%

30 L

Persulfato de amonio 10% (PSA)

60 L

4.3 Inmediatamente al adicionar el PSA y homogenizar. Con ayuda de una pipeta Pasteur transferir la
mezcla al sistema para gelificacin. Dejar reposar 15 minutos.
4.4 Una vez formado el gel separador preparar el gel concentrador considerando los cuidados
anteriores y de acuerdo a la siguiente tabla.
Amortiguador 4x pH 6.8 (0.5M)

0.5 ml

Acrilamida-bisacrilamida al 29:1%

0.33 ml

H2O destilada

1.16 ml

TEMED 8,4%

13 L

Persulfato de amonio 10| % (PSA)

27 L

4.5 Preparada la mezcla vaciarla al sistema.


4.6 Colocar el peine y dejar gelificar.
4.7 Ensamblar el sistema de gelificacin al sistema de sujecin que tiene a los electrodos, y colocarlo
en la cmara de electroforesis.
4.8 Retirar el peine y llenar la cmara con amortiguador de corrida.

B. PREPARACIN DE LA MUESTRA
4.9 En condiciones aspticas, obtener 5 mL de sangre perifrica de un solo alumno en un tubo
vacutainer con gel. Centrifugar a 3000 rpm durante 5 minutos para obtener el suero. De otro
alumno realizar el mismo procedimiento usando tubo vacutainer con EDTA, despus de obtener la
sangre homogeniza lentamente para mezclar el anticoagulante con la muestra, de tal forma que al
centrifugar se obtenga plasma.
4.10 Con la muestra de suero o plasma que le haya tocado a tu equipo, realiza una dilucin con la
solucin buffer de fosfatos (PBS) 1:20.
26

Laboratorio de Bioqumica Clnica

4.11 Mezclar 10L de las diluciones de suero o plasma con 50 L de amortiguador de Laemmli.
Considerar que se prepararn muestras con Laemmli sin mercaptaetanol, para el gel normal, y
muestras en Laemmli con mercaptoetanol para el gel en condiciones desnaturalizantes.
4.12 Mezclar 10L de fibringeno con 10L de amortiguador de Laemmli sin mercaptoetanol para el
gel normal, y Laemmli con mercaptoetanol para el gel desnaturalizante. Hacer lo mismo, con las
mismas cantidades, para la albmina humana.
4.13 Las muestras con Laemmli adicionado de mercaptoetanol se calientan en bao mara a
ebullicin durante 5 minutos.
4.14 Usar las muestras para cargar el gel de poliacrilamida.
C. CARGADO DEL GEL
4.15 Con ayuda de la pipeta automtica colocar en el primer carril 10 L el marcador de peso
molecular, en el segundo carril cargar 10L de fibringeno (1mg/mL), en el tercer carril colocar 10
L de albmina (de la prctica anterior). En los otros carriles cargar 5-10 L de las muestras de
suero o plasma calentadas con el amortiguador de Laemmli con o sin mercaptoetanol.
4.16 Colocar la tapa de la cmara de electroforesis y conectar las terminales a la fuente de poder.
4.17 Aplicar un voltaje de 100 V
D. TINCIN DEL GEL
4.18 La corriente se mantendr hasta que el frente del colorante del amortiguador de Laemmli
alcance hasta un centmetro antes del final del gel, cuando pase esto apagar la fuente, y retirar el
gel siguiendo las instrucciones del profesor.
4.19 Colocar el gel en la solucin de azul de Coomassie, y dejarlo en agitacin durante toda una
noche.
4.20 Desteir el gel agitando en la solucin de Metanol al 50% y cido actico al 10% poniendo en
agitacin de una a dos horas.
4.21 Poner el gel en una solucin de metanol al 7% y metanol actico al 10% para finalizar el
proceso.
5. MANEJO Y ANLISIS DE RESULTADOS
5.1 Realizar un esquema detallado del gel obtenido sealando clara y de manera precisa la posicin
de las diferentes bandas evidenciadas, al cual llamamos electroferograma. De ser posible incluye
la fotografa del gel.
5.2 Medir con regla la distancia recorrida para cada una de las bandas del marcador de PM midiendo
desde el extremo del gel en donde se cargo la muestra, e identifica a que protena corresponde
cada una de ellas de acuerdo a la informacin que te proporcione el profesor. En la tabla 5.1
anota de las protenas que tiene el marcador de Peso Molecular y la distancia recorrida en el gel.
Tabla 5.1
Distancia recorrida Peso Molecular
Protena
log PM
(mm)
(kd)

5.3 Con estos datos graficar el log peso molecular de las diferentes protenas que componen al
marcador de peso molecular contra la distancia recorrida en el gel, colocando la distancia
recorrida en el eje de las x, y el log del PM en el eje y.
27

Laboratorio de Bioqumica Clnica

5.4 De esta grfica realizar la regresin lineal, misma que utilizars para determinar el peso molecular
de las protenas evidenciadas en el gel.
Regresin Lineal

5.5 En cada uno de los carriles que tengan muestras diferentes, mide las distancias en tu esquema
de las diferentes bandas que observes, tanto en el gel nativo como en el gel desnaturalizante.
Compara las diferencias del corrimiento entre estos.
5.6 En el carril donde se coloc la albmina determina el peso molecular de la misma usando la
regresin previamente calculada. Es la misma que la terica? A qu se debe esta diferencia?
5.7 Este mismo procedimiento realzalo en el carril que cargaste el fibringeno, comparando la
diferencia entre el gel nativo y el desnaturalizante A qu se atribuyen estas diferencias?
5.8 En un carril de suero y otro de plasma determina el peso molecular de las diferentes bandas que
puedas identificar claramente
5.9 Ahora buscar en la bibliografa principales protenas que se encuentran en el suero y el plasma,
as como su peso molecular y comparar con los pesos moleculares obtenidos en el gel para
determinar a qu protena puede corresponder cada banda. Indica tambin la intensidad de la
banda que obtuviste en el gel con la concentracin en la que se encuentra en el suero.
6. DISCUSIN
Discutir los resultados obtenidos considerando la importancia de la electroforesis en poliacrilamida,
mencionando su aplicacin tanto en el rea clnica como en la investigacin biomdica con ejemplos
reales y especficos. Discutir los resultados obtenidos, comprando lo obtenido entre suero y plasma, y
que significan estas diferencias.

7. CONCLUSIONES
7.1 Con los resultados obtenidos, el anlisis y la discusin, los objetivos de la prctica y a la
bibliografa consultada elaborar las conclusiones de esta prctica.
8. REFERENCIAS
8.1. Hames, B. D. and D. Rickwood. 1990. Gel Electrophoresis of Proteins. 2nd. edition. Irl Press.
New York, USA.
8.2. Nelson, D. L., M. M. Cox y C. M. Cuchillo. 2001. Lehninger Principios de Bioqumica. 2.
edicin. Omega. Barcelona, Espaa.
8.3. Murray, R. K., Bender, D. A., Botham, K. M., Kennedy, P. J., Rodwell, V. M. y Weil, P. J. 2010.
Harper Bioqumica Ilustrada. 28a. ed. Mc Graw Hill. Mxico.

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Laboratorio de Bioqumica Clnica

PRCTICA 4
USO DE ENZIMAS EN EL DIAGNSTICO CLNICO: PERFIL
CARDIACO Y PERFIL HEPTICO
Unidad II. Aminocidos, protenas y enzimas.
1. OBJETIVOS
1.1 Objetivo general.
El alumno:
1.1.1. Determina los niveles sricos de las enzimas empleadas en el diagnstico cardiaco y heptico.
1.2 Objetivos particulares:
El alumno:
1.2.1. Ensaya mtodos espectrofotomtricos cinticos para determinar actividad enzimtica.
1.2.2 Realiza la determinacin cuantitativa de las enzimas ALT y AST, LDH y CK en suero humano
haciendo uso de un kit de diagnstico clnico.
1.2.2. Evala la importancia de los resultados obtenidos de las muestras sanguneas procesadas en
la determinacin de las enzimas y su contribucin en las pruebas de laboratorio para la
determinacin de afecciones cardiacas y hepticas.
2. INTRODUCCIN
La enzimologa encuentra aplicacin prctica en el laboratorio clnico, en la medicin de los niveles
enzimticos y de las concentraciones de sustrato en plasma y tejidos de los pacientes para la
determinacin de los estados de salud. Los cambios en los niveles enzimticos en el plasma reflejan
alteraciones en un tejido u rgano especfico.
Las enzimas plasmticas son de dos tipos: las que estn presentes en altas concentraciones en el
plasma y tienen una funcin especfica, como las enzimas asociadas a la coagulacin de la sangre
(trombina, plasmina, etc) y las que se encuentran normalmente en muy bajas concentraciones y no
tienen una funcin en el plasma. Estas son importantes en la determinacin de las enfermedades de
los tejidos y los rganos ya que un proceso patolgico puede provocar cambios en la permeabilidad
de la membrana celular o incrementar la muerte celular, lo que da origen a la liberacin de enzimas
intracelulares en el plasma. Las enzimas citoslicas aparecen en el plasma antes que las enzimas
mitocondriales y cuanto sea mayor la cantidad de tejido daado, mayor ser el incremento en la
sangre.
En el diagnstico de un proceso patolgico sera ideal poder identificar enzimas especficas para
cada rgano, aunque el metabolismo de todos los tejidos es muy parecido. Sin embargo la
concentracin de diferentes enzimas vara de tejido a tejido, y la cintica de aparicin y desaparicin
de determinadas enzimas en el plasma, permite un diagnstico de un rgano especfico. Como
ejemplos, la enzima creatinfosfocinasa (CPK) se encuentra en el msculo cardiaco, esqueltico y
cerebro, la enzima lactato deshidrogenasa (LDH) en el msculo cardiaco, esqueltico e hgado, y la
enzima aspartato amino transferasa (AST o TGO) en el hgado y corazn, lo que implica que la
alteracin de cualquiera de stos rganos o tejidos provocar una alteracin de los niveles de las
enzimas plasmticas mencionadas.
En esta prctica se realizarn los ensayos enzimticos de las principales enzimas involucradas en
el infarto al miocardio y en la lesin heptica, en lo que constituye el Perfil Cardiaco y Perfil
Heptico.
29

Laboratorio de Bioqumica Clnica

El infarto del miocardio es la muerte celular de las miofibrillas, causada por falta de aporte
sanguneo a una zona del corazn, que es consecuencia de la oclusin (taponamiento) aguda y total
de la arteria que irriga dicho territorio. La causa de la oclusin coronaria, en la mayora de los casos,
es debida a la trombosis (cogulo) consecutiva a la fractura de una placa de ateroma. Tambin puede
ocurrir cuando existe una obstruccin significativa de una arteria coronaria por una placa de ateroma
y los cambios de tono normales de la arteria pueden obstruirla completamente, con o sin ruptura de la
placa.
La isquemia (falta de oxgeno) aguda y total o casi total comienza a producir reas de necrosis en
el tejido cardiaco dentro de la primera hora posterior a la falta de sangre en la regin. Despus de las
primeras 3 horas posteriores a la oclusin coronaria comienzan a aparecer extensiones de la necrosis
hacia el tercio medio de la pared en la regin isqumica. La figura 1 muestra la cintica de liberacin
de enzimas cardiacas despus de un infarto al miocardio. Este perfil permite establecer cundo ha
tenido lugar el ataque y si el tratamiento es efectivo.

Fig. 1. Cintica de liberacin de enzimas cardiacas despus de un infarto

El sntoma caracterstico del infarto es el dolor retro esternal (85% de los casos), opresivo, intenso,
con sensacin de muerte inminente, que se proyecta hasta el cuello, hombros, maxilar inferior, brazo
izquierdo o ambos brazos. Habitualmente dura ms de 30 minutos, puede prolongarse por varias
horas. No se alivia ni con el reposo ni con los vasodilatadores. Las mujeres tienden a experimentar
sntomas marcadamente distintos que los de los hombres. Los sntomas ms comunes en las
mujeres son la disnea, debilidad, fatiga e incluso somnolencia, por lo que el dolor de pecho puede ser
menos predictivo de una isquemia coronaria que en los hombres. Sin embargo, existen otras
enfermedades en las que se presenta dolor torcico, como en la pericarditis aguda, el reflujo
gastroesofgico, y otras, por lo que son necesarias pruebas especficas para cada enfermedad. Estas
pruebas son: electrocardiograma, revisin de sntomas clnicos, y el uso de marcadores bioqumicos
de dao al msculo cardiaco.
La determinacin de stos marcadores bioqumicos es lo que se concoe como Perfil Cardiaco. La
elevacin en la concentracin de las enzimas creatinfosfoquinasa (CPK), la transaminasa glutmico
oxaloactica o aspartato amino transferasa (TGO, AST) y la deshidrogenasa lctica (LDH), y
protenas como la Troponina son las que tienen valor diagnstico.
La enzima que se eleva primero es la CPK, lo hace en las primeras 8 horas, alcanza su mximo a
las 24 horas y regresa a las cifras normales de 48 a 72 horas. Sin embargo esta enzima tambin se
eleva en miopatas, diabetes, intoxicacin etlica, trauma muscular, ejercicio exagerado e infarto
pulmonar. Se eleva incluso por la administracin de inyecciones intramusculares. De ah que sea ms
especfica la medicin de la fraccin miocrdica (MB) de la CPK, o CPK-2 que es una isoenzima de la
CPK, presente en el corazn. La actividad de la fraccin CK-MB se encuentra entre 6 -25% de la
actividad total de la CK.

30

Laboratorio de Bioqumica Clnica

La LDH se eleva en el suero a las 24 o 48 horas alcanzando su mximo a los 4 o 6 das


descendiendo a cifras normales en 1 o 2 semanas despus del infarto.
La troponina es un componente del aparato contrctil del msculo, y los niveles arriba de lo normal
son un buen marcador de dao cardiaco en enfermedades como infarto, miocarditis, angina y ciruga
cardiaca. Sus niveles aumentan a las 4-6 horas despus del infarto, con un pico a las 24 h, y
permanecen altos por 7-10 das dando un margen mas amplio que la CK-MB para determinar dao
cardiaco.
El perfil heptico es un conjunto de exmenes de sangre que indican si el hgado est
funcionando normalmente. El hgado se encuentra en el abdomen y est ubicado cerca del estmago.
Es un rgano muy importante, porque descompone y almacena sustancias como azcares, grasas y
vitaminas. El hgado tambin remueve las drogas y otros qumicos del cuerpo. La ictericia (piel y ojos
amarillos) casi siempre es causada por problemas en el hgado. Una lista comn de exmenes
incluye la bsqueda de enzimas hepticas que provienen de los tejidos hepticos daados. Otras
pruebas pueden buscar las sustancias producidas o cambiadas por el hgado, como la bilirrubina.
Las Aminotransferasas o transaminasas, son las enzimas ms tiles en reconocer la enfermedad
heptica aguda. La Aspartato aminotransferasa AST (GOT) se localiza en mitocondria y citoplasma
del hepatocito y en otros tejidos (corazn y msculo). La Alanina aminotransferasa ALT (GPT), con
vida media ms corta, slo en citoplasma, y es indicador ms sensible y especfico de dao
hepatocelular.
Las pruebas bioqumicas realizadas para el diagnstico de enfermedad heptica incluyen otras
como:
Enzimas de necrosis: ALT, AST, LDH.
Enzimas de colestasis: FA, GGT.
Enzimas de masa ocupante: GGT, LDH.
Enzimas de sntesis: CHE
Enzimas de fibrinognesis: GGT
Estudio metablico:
Proteico: Albmina, Igs, Alfafetoprotena.
Lipdico: Colesterol, TG, Bilirrubina y cidos biliares.
Coagulacin: Factores dependientes de vitamina K, (IP) Fibringeno.
La utilidad es la deteccin de una lesin heptica, aunque sea leve, y establecer un diagnstico
especfico, dar seguimiento a la enfermedad, hacer una evaluacin del tratamiento, determinacin de
la gravedad y pronstico. Ninguna prueba cubrir todos los aspectos, siendo precisa la utilizacin
conjunta de varias de ellas.
Un buen ensayo enzimtico se basa en el control de temperatura y pH, as como de las
concentraciones saturantes de sustratos, y cofactores. Para obtenerse esto ltimo debe de conocerse
la Km, y las condiciones de pH y fuerza inica, que van a utilizarse en el ensayo. Se recordar que la
Km es la concentracin de sustrato a mitad de la velocidad mxima (1/2 V mx), para asegurarse que el
sistema est saturado, la concentracin de sustrato se incrementa entre 5 y 10 veces sobre la K m.
Con la saturacin de la enzima por el sustrato, la reaccin es de orden cero. En estas condiciones los
cambios de velocidad son proporcionales a la concentracin de la enzima. En el laboratorio clnico las
condiciones de ensayo se optimizan de manera rutinaria para las determinaciones enzimticas. En
estos anlisis las enzimas que utilizan a las coenzimas NAD +, NADP+ y FAD (reacciones acopladas)
son fciles de medir gracias a sus propiedades pticas. El NADH presenta un mximo de absorcin a
340 nm y el FAD absorbe fuertemente a 450 nm.
Fundamento de los mtodos de determinacin de enzimas y metabolitos empleados en clnica.

31

Laboratorio de Bioqumica Clnica

En bioqumica clnica la determinacin de enzimas y metabolitos puede llevarse a cabo mediante dos
mtodos bsicos:

Mtodos qumicos colorimtricos: En ellos el metabolito se hace reaccionar con un


compuesto para producir un derivado colorido que pueda detectarse
espectrofotomtricamente, ya que la intensidad del color ser directamente proporcional a la
concentracin de la sustancia a determinar. La reaccin general sera:

Metabolito + Reactivo cromgeno

Producto colorido

Estas reacciones pueden ser de:

punto final, si la reaccin ocurre y se concluye en un solo momento,

cinticos, si se lee a diferentes tiempos.

Mtodos enzimticos: en estos, la enzima reacciona con el sustrato (s) y se obtienen


productos. Estos mtodos tambin pueden ser de punto final, o cinticos.
Enzima

Sustrato 1 + Sustrato 2

Producto 1 + Producto 2

La determinacin de los productos, puede ser:


o

colorimtrica, en donde el producto de la enzima se hace reaccionar con un compuesto


para dar un derivado colorido. Las reacciones tipo Trinder son las mas usadas.

espectrofotomtricos, donde generalmente se emplea la luz UV para detectar el


producto.

reacciones acopladas, en donde el producto de la enzima se acopla a otra reaccin


enzimtica (es decir acta como sustrato de otra enzima, para dar el producto 2). En
estos casos, lo que se detecta es el producto 2, ya sea por mtodos colorimtricos o
espectrofotomtricos.
Enzima 1

Sustrato

Producto 1
Enzima 2

Producto 1

Producto 2

La reaccin que cataliza la AST es la siguiente:


ASAT

-Cetoglutarato + Aspartato

Glutamato + Oxalacetato

Valores de referencia*: Hombres hasta 19 U/L , Mujeres hasta 16 U/L a 25C


La reaccin que cataliza la ALT es la siguiente:
ALAT

L-Alanina + 2-Oxoglutarato

Piruvato + L Glutamato

Valores de referencia*: Hombres hasta 22 U/L , Mujeres hasta 18 U/L a 25C


La reaccin que cataliza la LDH es la siguiente:
32

Laboratorio de Bioqumica Clnica


LDH

Piruvato + NADH + H+

Lactato + NAD +

Valores de referencia*: 120-240 U/L a 25C


La reaccin de la CPK es como sigue:
CPK

Fosfocreatina + ADP
Valores de referencia*:

Creatina + ATP

CK: Hombres hasta 80U/L, Mujeres hasta 70U/L a 25C


CK-MB > 10U/L a 25C

*Estos valores debern servir solamente como gua. Se recomienda que cada laboratorio establezca su propio intervalo
de valores normales ya que existen diferencias entre instrumentos, laboratorios y poblacin local.

La actividad de stas enzimas se determinar por alguno de los mtodos arriba descritos. En el caso
de la CPK, se determinar la fraccin CK-MB, y para determinar sta se empelan anticuerpos que
inhiben la actividad de las otras fracciones. Generalmente se emplean los mtodos enzimticos
espectrofotomtricos.

3. MATERIAL Y REACTIVOS
3.1 EQUIPO Y MATERIAL

Espectrofotmetro visible
Centrfuga clnica
Bao maria a 25 -30 C
Celdas de 1 cm de paso
Tubos vacutainer con gel
Torundas, ligadura y adaptador
Aguja para vacutainer
Gradilla para tubos
Tubos de ensaye de 13 X 100 mm
Pipetas de 2 mL
Pipetas de 1 mL
Micropipetas automticas de 100 L
Puntas para micropipeta automtica de 100 L

3.2 REACTIVOS Y MATERIAL BIOLGICO

Kit Spinreact ALT/GPT


Kit Spinreact AST/GOT
Kit Spinreact LDH.
Kit Spinreact CPK
Kit Spinreact CK-MB

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Laboratorio de Bioqumica Clnica

4. DESARROLLO EXPERIMENTAL
A. OBTENCIN DEL SUERO HUMANO.
4.1 En condiciones aspticas, obtener aproximadamente 5 mL de sangre perifrica en un tubo
vacutainer con gel.
4.2 Dejar que se contraiga el coagulo durante 5 minutos.
4.3 Centrifugar durante 5 minutos a 3000 rpm.
B. DATOS DEL PACIENTE
4.4 Anotar los datos generales del paciente en la tabla 5.1, antes de tomar la muestra.
C. DETERMINACIN DE LA ACTIVIDAD DE LAS ENZIMAS ASPARTATO AMINO TRANSFERASA
(AST), ALANINA AMINOTRANSFERASA (ALAT) , LACTATO DESHIDROGENASA (LDH) Y
CREATINA FOSFOQUINASA-FRACCIN MB (CK-MB).
Dependiendo de la marca del Kit que se tenga para la prctica, las concentraciones, cantidades y condiciones
de las reacciones pueden variar.

4.5 En los kits, el sustrato y las enzimas y reactivos usados se encuentran liofilizados y deben ser
reconstituidos, es decir solubilizados, para su uso. Esto lo realizar el profesor previo a la prctica.
4.6 Seguir las instrucciones que indique el inserto de cada uno de los kits que sern proporcionadas
por el profesor, y revisar en ellos:
4.6.1
Como se prepara el blanco de reactivos
4.6.2
como se procesar la muestra de suero obtenida y la temperatura del ensayo
4.6.3
a que longitud de onda () de realiza la determinacin
4.6.4
como se realizarn los clculos para determinar el nivel de enzimas
4.6.5
como se define una Unidad de enzima
4.6.6
el fundamento de las reacciones que se usan para determinar la actividad de las enzimas.
4.6.7
las interferencias, precisin y exactitud del mtodo
4.7 Calibrar el espectrofotmetro con agua destilada.
4.8 Tomar las lecturas cada 30 segundos durante 5 minutos, a 340 nm, segn las instrucciones del
inserto y las indicaciones del profesor.
4.9 Anotar los resultados en la tabla 5.2

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Laboratorio de Bioqumica Clnica

5. MANEJO Y ANLISIS DE RESULTADOS


A. DATOS DEL PACIENTE
5.1 Anotar los datos del paciente en la tabla 5.1
Tabla 5.1
Sexo
Edad
Condicin de salud o fisiolgica
Toma algn medicamento (cul)
Ayuno

B. DETERMINACIN DE ENZIMAS AST, ALT, LDH, CK


5.2 Anotar los resultados obtenidos desde tiempo 0 a 5 minutos en la tabla 5.2
Tabla 5.2
As 340 nm
Tiempo
(min)

AST

ALT

LDH

CK

0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
3.0
3.5
4.0
4.5
5.0
As/minut
o

5.3 Elaborar las grficas de As contra tiempo para cada enzima.


5.4 Para cada curva determinar la zona que se comporta de forma lineal, y delimitarla. De esta zona,
determinar la ecuacin y anotar la pendiente.
5.5 Calcular las unidades de enzima empleando la pendiente de la ecuacin obtenida por el factor
que indica el inserto del kit.
U/L =

pendiente X

FACTOR

5.6 Ahora realizar el clculo usando el A/min que se calcul en la tabla 5.2
U/L =

A/min

Volumen Total
35

Laboratorio de Bioqumica Clnica

Absortividad
U/L =

A/min

Volumen de la muestra
FACTOR

5.7 Anotar los valores obtenidos de unidades de enzima por litro U/L obtenidas por los dos mtodos
en la tabla 5.3
Tabla 5.3
Mtodo usado en
AST
ALT
LDH
CPK
el clculo
Pendiente de la
grfica
A/min
5.8 Existieron diferencias entre los valores de la Unidades de Enzima obtenidos entre ambos
mtodos de clculo? Explica porque.
5.9 Qu significan los valores obtenidos de cada enzima? Indicar si son valores normales y
considera los datos anotados del paciente.
5.10
Cul es la importancia clnica de estas enzimas? Explicar en relacin con el perfil heptico y
el perfil cardiaco.
5.11
Qu otras determinaciones se pueden realizar en el perfil cardiaco y en el perfil heptico,
adems de las realizadas en la prctica?
5.12
Mencionar 3 estados patolgicos en donde se vean alterados los valores de las enzimas LDH,
AST, ALT y CPK
5.13
Anotar las reacciones que se llevan a cabo en los mtodos empleados para la determinacin
de actividad de cada enzima e indicar cul es el principio en el que se basa esta deteccin
(qumico, enzimtico, punto final, cintico, espectrofotomtrico o colorimtrico).
6. DISCUSIN
Discute los resultados obtenidos considerando los siguientes aspectos:
Los resultados obtenidos, as como los mtodos utilizados. Para qu sirven los valores de referencia.
La importancia del uso de las enzimas en el diagnstico clnico.
7. CONCLUSIONES
7.1 Con los resultados obtenidos, anlisis y discusin y en base a los objetivos de la prctica y la
investigacin bibliogrfica, realizar las conclusiones.
8. REFERENCIAS
8.1. Davidson I., Henry J. B. 1979. Todd-Sanford. Diagnstico clnico por el laboratorio. 6.
edicin. Salvat editores. Barcelona, Espaa.
8.2. Devlin. T. M. 1997. Bioqumica con aplicaciones clnicas. Tomo I y II. 3 edicin. Editorial
Revert. Espaa.
8.3. Murray, R. K., Bender, D. A., Botham, K. M., Kennedy, P. J., Rodwell, V. M. y Weil, P. J. 2010.
Harper Bioqumica Ilustrada. 28a. ed. Mc Graw Hill. Mxico.
8.4. Canto JG, Goldberg RJ, Hand MM. 2007. Symptom presentation of women with acute
coronary syndromes: myth vs. reality. Arch. Intern. Med. 167 (22): 240513.

36

Laboratorio de Bioqumica Clnica

PRCTICA 5
CURVA DE CALIBRACIN PARA LA DETERMINACIN DE
GLUCOSA EN SUERO HUMANO.
Unidad III. Carbohidratos y su metabolismo.
1. OBJETIVOS
1.1 Objetivo general.
El alumno:
1.1.1. Elabora una Curva de Calibracin para la determinacin de glucosa en sangre.
1.2 Objetivos particulares:
El alumno:
1.2.1. Emplea un mtodo enzimtico para la cuantificacin de glucosa en sangre.
1.2.2 Evalua la importancia de los resultados obtenidos de las muestras sanguneas y su contribucin
en las pruebas de laboratorio para la determinacin de patologas como la diabetes.
2. INTRODUCCIN
La glucosa es la principal fuente de energa de todos los organismos, la cual es utilizada para el
sostenimiento de todos los procesos vitales del individuo as como para su perpetuacin.
En los seres humanos la concentracin de glucosa en sangre considerada normal se encuentra
entre los valores de 70 a 100 mg/dL. Los valores por fuera de estos lmites, se deben a y provocan
alteraciones en la fisiologa del organismo propios de la hipoglucemia (valores bajos) o de la
hiperglicemia (valores altos). Si bien la hipoglicemia puede convertirse en algn momento en un
problema grave, la hiperglicemia, es la condicin ms comn en la poblacin mundial y sus efectos
sobre quien la padece son ms severos.
La enfermedad es conocida como diabetes y es una alteracin metablica que afecta a varios
rganos y tejidos del cuerpo, por lo que la cuantificacin de la glucosa en sangre es primordial para
establecer un diagnostico o para evaluar la efectividad del tratamiento aplicado. El diagnstico
temprano de la enfermedad es de suma importancia para evitar problemas crnicos y efectos
secundarios muchos de los cuales terminan con la vida del paciente.
Se tiene diabetes cuando la concentracin de la glucosa del plasma en ayunas es mayor que, o
igual a 126 mg/dL y se tiene una concentracin de glucosa del plasma casual (tomada a cualquier
hora del da) igual o mayor a 200 mg/dL. El valor del examen oral de la tolerancia a la glucosa (sus
siglas en ingls son OGTT) es mayor que, o igual a 200 mg/dL cuando se mide en un intervalo de dos
horas. El OGTT es dado sobre un periodo de tres horas. Los niveles entre 100 y 126 mg/dL se
denominan como alteracin de la glucosa en ayunas o prediabetes.
Las causas de la diabetes no estn bien definidas, es posible que alteraciones genticas y los
factores ambientales, como pueden ser las malas costumbres de las personas (alimentacin,
sedentarismo, obesidad, estrs) sean la causa de que una tolerancia normal a la glucosa se convierta
en patolgica, desarrollando la diabetes.
Si bien es posible hacer el anlisis en plasma, es ms comn realizarlo en suero. La determinacin
de glucosa en suero puede llevarse a cabo por mtodos qumicos o enzimticos, sin embargo, los
mtodos qumicos han cado en desuso en la mayora de los laboratorios de anlisis clnicos y los
mtodos enzimticos han tomado su lugar, e incluso se han automatizado lo que permite
determinaciones rpidas. Los mtodos enzimticos son altamente especficos y se emplean
37

Laboratorio de Bioqumica Clnica

diferentes enzimas, con reacciones acopladas, en las que la determinacin del analito es indirecta
pues lo que propiamente es evaluado por el aparato es el producto final de la reaccin que puede ser
una sustancia colorida o no, pero que tiene una absorcin especfica a cierta longitud de onda.
En el mtodo de la glucosa-oxidasa, esta enzima reacciona sobre la glucosa para transformarla en
cido glucnico y producir perxido de hidrgeno. El perxido de hidrgeno reacciona con un aceptor
de oxgeno cromognico (por ej. la aminofenazona) en una reaccin catalizada por la peroxidasa.
Glucosa Oxidasa

Glucosa + O2

No enzimtico

D- Gluconolactona + H2O2

Acido glucnico

Peroxidasa

2 H2O2 + p - hidroxibenzoato + 4-Aminofenazona

Quinominina colorida

Este aceptor cambia de color y la intensidad del mismo se puede determinar por el
espectrofotmetro, siendo el color directamente proporcional a la concentracin de glucosa presente
al inicio de esta cadena de reacciones. El mtodo tiene algunas interferencias como sera la
presencia de cido rico, creatinina, cido ascrbico y sustancias reductoras en general. El mtodo
del electrodo de glucosa oxidasa-oxgeno determina la concentracin de la glucosa mediante un
electrodo, en el que el perxido generado se elimina por reaccin con etanol y yodo, lo que evala el
electrodo es la tasa de consumo de oxgeno. El mtodo es preciso y lineal y carece de interferencias.
Todo anlisis qumico requiere ciertas consideraciones antes de realizarlo, entre otras; las
condiciones de obtencin de la muestra para el anlisis, el tratamiento de la muestra, la preparacin
de materiales y la utilizacin de estndares de referencia.
Para tener la certeza que el mtodo dar el resultado correcto, el mtodo se prueba con muestras
en composicin similar y con un contenido de analito exactamente conocido.
Curva tipo, Curva estndar o Curva de Calibracin
La determinacin de cualquier sustancia, puede ser evaluada utilizando un equipo o instrumento.
En el laboratorio de anlisis clnicos el instrumento ms comnmente usado es el espectrofotmetro
el cul determina la Transmitancia (%T) o la Absorbancia (As). El % de T o la As obtenida son
proporcionales a la cantidad o concentracin de x presente en la muestra (Cx). Esto se expresa en la
ecuacin 4.1:

As o %T = KCx + b

Ec. 4.1

Donde K es una constante de proporcionalidad, indicada por la pendiente de la recta, que entre
mayor sea, indica una mayor sensibilidad del mtodo. Es muy posible que an si la concentracin de
x (Cx) es igual a cero de todos modos se genere una respuesta aunque muy pequea (es la
respuesta en blanco b).Es claro que el aparato no da valores de Cx sino que da valores de As o %T,
por lo que para conocer Cx se deben emplear estndares de referencia o patrones.
Los estndares de referencia que contienen la sustancia X se preparan en las mismas condiciones
que la muestra de tal manera que cubran el rango que se supone para Cx en la misma. Adems se
incluye un blanco que contiene todos los reactivos empleados en la prueba, excepto la sustancia X. El
instrumento se ajusta a cero con agua destilada (blanco) y determina la As o el %T para la serie de
patrones. Un paso previo al ajuste del instrumento es la seleccin de la longitud de onda (), que
debe ser aquella que proporcione los resultados con la mxima absorbancia, para asegurar una
mayor sensibilidad.
Con los resultados obtenidos a partir de los estndares se construye una grfica de Cx vs As (o
%T) Curva de calibracin y se debe obtener una ecuacin como la 4.1. A partir de la ecuacin y una
vez calculadas las constantes m y b, podemos despejar el valor de Cx:

Cx = As b / m
38

Laboratorio de Bioqumica Clnica

Una curva estndar ideal es aquella donde los puntos de la grfica se encuentran en una lnea
recta, sin desviacin y con una b igual a cero. Las curvas estndar o de calibracin reales deben
encontrarse cerca de este ideal, para lo cual se determina el coeficiente de correlacin r y el valor de
b. El coeficiente de correlacin determina la relacin lineal entre dos variables, en este caso entre la
As y la concentracin de nuestro analito, la glucosa y es un indicativo de la desviacin de cada punto
de la recta ideal. Un r igual a 1.0 indica una correlacin perfecta entre ambas variables, y si una varia,
la otra lo hace en la misma proporcin. Si r es 0 (cero) no existe correlacin. Para nuestros fines se
busca lo ms cercano a este ideal y que sera un r de 0.9 o mayor y una b cercana a 0.
En esta prctica construiremos una curva tipo de glucosa y se emplear en la determinacin de
glucosa en sangre mediante una tcnica enzimtica.
3. MATERIAL Y REACTIVOS
3.1 EQUIPO Y MATERIAL

Espectrofotmetro visible
Bao Maria a 37C
Dos celdas de vidrio para el espectrofotmetro.
Agujas para vacutainer
Tubos vacutainer con gel
Torundas, ligadura y adaptador
8 tubos de ensaye de 13x100
1 pipeta serolgica de 2ml.
Pipetas automticas de 10uL

3.2 REACTIVOS Y MATERIAL BIOLGICO


Kit para determinacin de glucosa, por el mtodo de glucosa oxidasa (GOD)
Muestra biolgica: suero
Serie estndares de referencia de glucosa de 30 mg/dL, 60 mg/dL, 90 mg/dL, 120 mg/dL y 150
mg/dL
Control o Patrn de glucosa de 100 mg/dL

39

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4. DESARROLLO EXPERIMENTAL
A. OBTENCIN DEL SUERO HUMANO.
4.1 En condiciones aspticas, obtener aproximadamente 5 mL de sangre perifrica en un tubo
vacutainer con gel.
4.2 Dejar que se contraiga el coagulo durante 5 minutos.
4.3 Centrifugar durante 5 minutos a 3000 rpm.
B. ELABORACIN DE LA CURVA TIPO DE GLUCOSA.
4.4 Rotular una serie de 6 tubos de ensayo de 13 x 60 como indica la tabla 4.1
4.5 Seguir las instrucciones de la misma tabla para adicionar los reactivos.
Tabla 4.1
Tubo

Adicionar 10 L de:

Estndar de glucosa de 30 mg/dL

Reactivo para color


(mL)
1

Estndar de glucosa de 60 mg/dL

Estndar de glucosa de 90 mg/dL

Estndar de glucosa de 120 mg/dL

Estndar de glucosa de 150 mg/dL

Patrn del kit de 100 mg/dL

Muestra de suero

Blanco (agua)

4.6 Colocar los tubos en Bao Mara a 37C durante 10min.


4.7 Dejarlos enfriar y leer la absorbancia a 505nm en el espectrofotmetro. Ajustar a cero de As con el
blanco.
4.8 Registrar los resultados en la tabla 5.1

40

Laboratorio de Bioqumica Clnica

5. MANEJO Y ANLISIS DE RESULTADOS


5.1 Anotar los resultados de la curva tipo de los otros equipos en la tabla 5.1.
Tabla 5.1

As de los tubos
3

Patrn
4

Serie del equipo


1
Serie del equipo
2
Serie del equipo
3
Serie del equipo
4
Serie del equipo
5
Serie del equipo
6
Serie del equipo
7
Serie del equipo
8
Serie del equipo
9
Serie del equipo
10
Serie del equipo
11

5.2 Observar los datos. Algunos se alejan mucho de un valor promedio. Esto son datos dispersos.
Para estos datos realizar la prueba de Q segn la siguiente frmula y rechazar o aceptar esos
datos.
(Valor sospechoso) (Valor de vecino ms cercano)
QR =
(Valor ms alto) (Valor ms bajo)
El valor sospechoso es aquel dato que est muy alejado del promedio. Si QR < Q para N nmero
de datos el resultado se acepta, para este caso N = 5 y Q = 0.76. Sombrear en rojo los datos
rechazados. Consultar la tabla 5.3, de los valores crticos de Q.
5.3 Con los datos aceptados calcular la media y la desviacin estndar para cada concentracin y
anotar los resultados en la tabla 5.2.

41

Laboratorio de Bioqumica Clnica

Tabla 5.2
As de los tubos
3

Serie del equipo 1


Serie del equipo 2
Serie del equipo 3
Serie del equipo 4
Serie del equipo 5
Serie del equipo 6
Serie del equipo 7
Serie del equipo 8
Serie del equipo 9
Serie del equipo 10
Serie del equipo 11

x
S

5.4 Con los promedios de los datos aceptados elaborar en papel milimtrico una grfica colocando
en el eje de las X el valor de concentracin de los estndares y en el eje de las Y el valor
promedio de las As a 505nm.
5.5 Realizar el anlisis matemtico para determinar la ecuacin que describe la mejor curva
estndar.
5.6 Escribir en el cuadro la ecuacin calculada en trminos de As y la concentracin de glucosa [Glc].
Recordar que Y = As y que X = [Glc].

5.7 Calcular el valor de la concentracin de la muestra problema y del patrn empleando esa grfica.
Comparar los valores con los obtenidos a partir del clculo con la ecuacin.
5.8 Con los datos de As obtenidos a partir del anlisis de las muestras problema llenar la tabla 5.3.
Tabla 5.3
[Glc] calculada
[Glc] calculada con
No de
As del suero
grficamente
la ecuacin mg/dL
equipo
mg/dL
1
2
3
4
5
6

x
S

42

Laboratorio de Bioqumica Clnica

5.9 Anotar tambin el valor del patrn empleado y verificar que el valor calculado a partir de la
ecuacin coincide con el valor real de concentracin.
As del patrn

[Glc] calculada con


la ecuacin mg/dL

[Glc] real
mg/dL

5.10
Calcular el % de error que se tuvo en la concentracin de glucosa del patrn con la siguiente
ecuacin:
% Error =

Valor obtenidovalor real


valor real

x 100

5.11 Cul es el papel del blanco en la curva tipo?


5.12 Qu es un control o patrn en bioqumica clnica?
5.13 Mencionar cinco causas de error en los resultados experimentales.
5.14 Explicar que es un error sistemtico y que un error aleatorio. Da ejemplos tanto de errores
sistemticos como aleatorios en los experimentos realizados.

Tabla 5.3 Valores crticos de Q para el Test de Dixon en funcin del


nmero de determinaciones y el nivel de confianza.
CL
70%
80%
90%
95%
98%
99%
SL

4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22

30%
0,3
0,7351
0,5244
0,4208
0,3589
0,3177
0,2883
0,266
0,2483
0,2341
0,2223
0,2125
0,2039
0,1965
0,19
0,1843
0,1791
0,1744
0,1703
0,1664

20%
0,2
0,8226
0,6147
0,502
0,4328
0,3858
0,3519
0,326
0,3054
0,2886
0,2747
0,2632
0,253
0,2443
0,2365
0,2297
0,2235
0,2178
0,2128
0,2083

10%
0,1
0,9105
0,7281
0,6098
0,5332
0,4793
0,4404
0,4102
0,3857
0,366
0,3496
0,3357
0,3236
0,3129
0,3037
0,2952
0,2878
0,281
0,2747
0,2692

5%
0,05
0,955
0,8064
0,6916
0,6111
0,5539
0,5114
0,4778
0,451
0,4291
0,4111
0,3955
0,3819
0,3698
0,3594
0,35
0,3418
0,334
0,3271
0,3207

2%
0,02
0,982
0,8762
0,7722
0,6918
0,6321
0,5876
0,5509
0,5215
0,4977
0,478
0,4605
0,4456
0,4322
0,4204
0,4102
0,401
0,3926
0,3847
0,3776

1%
0,01
0,991
0,912
0,8185
0,7399
0,6808
0,6346
0,5972
0,5663
0,5412
0,5208
0,5026
0,4868
0,4723
0,4595
0,4495
0,4395
0,4303
0,422
0,4143

99,50
%
0,50%
0,005
0,9955
0,9376
0,8544
0,7812
0,7226
0,6757
0,6375
0,6055
0,5796
0,5581
0,5396
0,5229
0,508
0,4945
0,4845
0,4734
0,4639
0,4551
0,4472

43

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6. DISCUSIN
Discutir los resultados obtenidos considerando los siguientes aspectos:
La importancia de la curva tipo en los anlisis clnicos, y con los equipos automatizados. Para que se
hizo el anlisis estadstico en sta prctica, y cul es su importancia en el laboratorio clnico.
7. CONCLUSIONES
7.1 En funcin de los resultados y la discusin que se realiz, elaborar las conclusiones y verificar si
se cumplieron los objetivos planteados.
8. REFERENCIAS
8.1. Bernard H, John. 1988. Todd-Sanford-Davidson: Diagnostico y Tratamiento Clnicos por
el Laboratorio. Tomo I. 8 edicin. Salvat Editores. Barcelona, Espaa.
8.2. Murray, R. K., Bender, D. A., Botham, K. M., Kennedy, P. J., Rodwell, V. M. y Weil, P. J. 2010.
Harper Bioqumica Ilustrada. 28a. ed. Mc Graw Hill. Mxico.
8.3. Day R. A. and Underwood A. L. 1997. Qumica Analtica Cuantitativa. 5a edicin. Prentice
Hall Latinoamrica. Mxico.
8.4. Ramette W, Richard. 1983. Equilibrio y Anlisis Qumico. Fondo Educativo Interamericano.
E.U.A.
8.5. Dean, R.B. y Dixon, W. J. 1951. Simplified statistics for small number of observations.
Analytical chemistry. 23: 4, 636-638.

44

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PRCTICA No. 6
OBTENCION DE VALORES DE REFERENCIA DE
TRIGLICRIDOS Y COLESTEROL EN SUERO HUMANO
UNIDAD IV: Lpidos y su metabolismo.
1. OBJETIVOS
1.1 Objetivo general
El alumno:
1.1.1. Determina experimentalmente valores de referencia de triglicridos y colesterol..
1.2 Objetivos especficos
El alumno:
1.2.1. Realiza el anlisis enzimtico de triglicridos y colesterol en suero humano
1.2.2. Obtiene valores de referencia con base a las determinaciones realizadas
1.2.3. Analiza la relacin entre los valores obtenidos y las hiperlipidemias.
2. INTRODUCCIN
Los lpidos son un conjunto heterogneo de molculas orgnicas compuestas principalmente por
carbono, hidrgeno y oxgeno, y cuya caracterstica principal el ser hidrofbicas o insolubles en agua
y solubles en solventes orgnicos como el benceno, cloroformo, ter, etc.
Los lpidos tienen diferentes funciones en el organismo, entre las cuales estn las siguientes:
1.- Estructural.
2.- Reserva energtica.
3.- Transporte de algunos compuestos energticamente activos (lipoprotenas)
4.- Vitaminas (vitamina D) y hormonas (progesterona, testosterona, estrgenos, corticoides).
5.- Aislante trmico y como proteccin alrededor de ciertos rganos.
Los cidos grasos se almacenan como triglicridos (TG). Para utilizar la energa de los cidos
grasos, primero deben ser liberados de los triacilgliceroles (TAG), y despus ser transportados de los
tejidos perifricos a las mitocondrias para su degradacin metablica. El catabolismo se realiza por la
va de la -oxidacin, que es un proceso de cuatro etapas que genera acetil CoA. Este compuesto
posteriormente contina su degradacin en el ciclo de Krebs.
Otro lpido importante es el colesterol, el cul es un esteroide presente en las clulas de los tejidos
animales, hidrofbico, poco soluble en medio acuoso, donde se puede encontrar libre o esterificado
con cidos grasos. Se une a diversas protenas formando las lipoprotenas plasmticas. La
determinacin de la concentracin plasmtica de colesterol tiene gran inters clnico, pues est
demostrada la relacin entre los niveles altos de colesterol y la incidencia de aterosclerosis y
cardiopata isqumica.
Los lpidos se transportan en la sangre como complejos lipoprotecos, los cuales se componen de
protenas especficas y de combinaciones de triacilglicridos, colesterol y steres de colesterol,
denominadas lipoprotenas o apolipoprotenas. Los lpidos y las protenas estn asociados como
complejos hidrosolubles no covalentes.
Las principales lipoprotenas se clasifican en:

45

Laboratorio de Bioqumica Clnica

Quilomicrones: Estas lipoprotenas son las menos densas y se componen de 98 a 99% de


lpidos, principalmente de TAG. Se pueden considerar como gotas de grasa cubiertas con una capa
de protenas y lpidos polares. Estos se ensamblan en el intestino con los lpidos de la dieta y se
absorben al torrente sanguneo para ser transportados a los tejidos perifricos. Ah, una lipoprotena
lipasa libera los cidos grasos de los TAG.
Lipoprotenas de muy baja densidad (VLDL): Son agregados moleculares que se forman en el
hgado con los TAG que ah se sintetizan, su funcin es llevarlos hacia el tejido adiposo y otros tejidos
perifricos para ser almacenados o para utilizarse como fuente de energa. Los cidos grasos se
liberan por accin de la lipasa.
Lipoprotenas de baja densidad (LDL): Estas partculas son las principales transportadoras de
colesterol en la sangre, movilizan a los steres de colesterol del hgado donde se sintetizan, hacia los
tejidos perifricos. Los lpidos predominantes son los steres de colesterol que contiene un cido
graso poli insaturado (cido linoleico).
Lipoprotenas de alta densidad (HDL): stas son las que tienen mayor contenido de protenas
de todas las lipoprotenas (55% de protena, 45% de lpidos) por lo que son ms densas. Los
principales lpidos que transportan son el colesterol y steres de colesterol, y a diferencia de las LDL,
movilizan al colesterol en direccin contraria, es decir, desde el tejido perifrico hacia el hgado.
Durante su recorrido por el torrente sanguneo atrapan el exceso de colesterol y lo llevan al hgado. A
las HDL, se les conoce como el colesterol bueno porque disminuyen los niveles plasmticos de
este.
En la siguiente tabla se resumen las propiedades fsicas y composicin de las principales
lipoprotenas:
Composicin (% peso)
Lipoprotena

Densidad
(g/ml)

Dimetro
()

Protenas

Colesterol

Fosfolpidos

Triacilglicroles
TAG

Quilomicrones

<0.95

800-5000

85

VLDL

0.95-1.0

300-800

10

20

20

50

LDL

1.0-1.063

180-280

25

45

20

10

HDL

1.063-1.2

50-120

55

17

24

Implicaciones clnicas.
Sabemos que el colesterol es necesario para el adecuado crecimiento y desarrollo celular, pero en
exceso es potencialmente daino. Su transporte por las lipoprotenas y la captura por las clulas est
regulado. El proceso de captacin inicia con la unin de las LDL que contienen colesterol con lugares
de unin especficos en las clulas, conocidos como receptores proteicos de la membrana
plasmtica. Las LDL se invaginan en la membrana plasmtica y se fusionan como parte de ella para
formar una vescula endoctica. Dentro de la clula, la vescula se fusiona con los lisosomas, y las
enzimas lisosomales catalizan la hidrlisis de los steres de cido graso dejando al colesterol libre
para la construccin de membranas.
Una de las causas de hipercolesterolemia (niveles elevados de colesterol sanguneo hasta de 700
mg/100 ml) es un defecto gentico donde las personas carecen de receptores de LDL funcionales y
desarrollan el sndrome conocido como hipercolesterolemia familiar. El colesterol se deposita como
placas en las arterias y provoca aterosclerosis (endurecimiento de las arterias). Muchas de las
personas que padecen esta enfermedad mueren jvenes e ataques cardiacos.
La aterosclerosis es una de las principales causas de muerte en el mundo occidental. Existe una
correlacin entre los niveles de colesterol sanguneo y la concentracin de lipoprotenas. Los
46

Laboratorio de Bioqumica Clnica

individuos con altos niveles sricos de LDL con respecto a las HDL tienen una mayor incidencia de
ataques cardiacos. Los niveles altos de HDL se relacionan en forma inversa, es decir a mayor
concentracin de HDL es menor el riesgo de sufrir enfermedades cardiacas.
Determinacin de lpidos y valores de referencia.
La determinacin de TG y Colesterol en suero se realiza mediante mtodos enzimticos. Es
necesaria una interpretacin de los datos obtenidos para determinar si un paciente puede ser
considerado sano, y cul enfermo, y si las diferencias entre estos son consistentes.
Todos los datos presentan cierta variacin, y las variables biolgicas muestran, por lo general,
una distribucin Gaussiana, tambin llamada Normal. Se considera un intervalo normal o de
referencia aquel que se encuentra entre la media +/- dos veces la desviacin estndar, la cual abarca
el 95% de los datos.

Un resultado fuera de este intervalo indica la probabilidad de enfermedad, pero existe un 2.5%
de los valores de personas sanas que pueden caer fuera del lmite, a estos se les conoce como falsos
positivos. Por otro lado la enfermedad tiene su propia distribucin normal, que puede traslaparse al
intervalo de referencia, a estos se les conoce como falsos negativos. Con base en esto se establecen
dos conceptos que permiten determinar la eficiencia del intervalo de referencia para identificar una
enfermedad, especificidad y sensibilidad. La especificidad nos indica la capacidad de nuestro
estimador de dar como casos negativos los casos que son realmente sanos, esto es que los sanos
sean identificados como sanos, por otro lado la sensibilidad es la capacidad de la prueba para dar
casos como positivos los individuos que realmente estn enfermos.
Matemticamente la sensibilidad se define como:
Donde VP es verdaderos positivos y FN falsos negativos.
La especificidad de una prueba representa la probabilidad de que un sujeto sano tenga un
resultado negativo en la prueba. La especificidad se define como:
Donde VN, seran los verdaderos negativos; y FP, los falsos positivos.
El lmite que se establezca para determinar cules pacientes son sanos, y cuales enfermos se
establece de acuerdo a cul de los errores se considera ms importante, variando la especificidad y
sensibilidad de la prueba, de tal forma que si se intenta eliminar los falsos negativos, se tendr una
prueba con alta especificidad, y todos los sanos se identificarn como tales, pero baja sensibilidad, ya
que habr un mayor nmero de falsos positivos, y se pueden clasificar personas enfermas como
sanas.

47

Laboratorio de Bioqumica Clnica

Por otro lado si se eliminan los falsos positivos se tendr una prueba con baja especificidad y
alta sensibilidad, garantizando que todas las personas enfermas sean identificadas como tales, pero
aumenta la probabilidad de que a personas sanas se clasifiquen como enfermas.

Los lmites que se establezca para determinar el estado de salud o enfermedad se conocen
como valores de referencia y deben calcularse en cada poblacin.
Debido a esto debemos considerar que para considerar a un resultado como enfermo,
depende de la precisin y exactitud del ensayo, as como de la variabilidad biolgica natural, por lo
que es necesario considerar la desviacin estndar global, que incluya tanto la biolgica como la
analtica. Para que la prueba se vuelva consistente es necesario cotejar el resultado con otros datos
clnicos, para poder validar la efectividad de la prueba.
Fundamentos de los mtodos empleados:
Los mtodos empleados para la determinacin de Triglicridos (TG) y Colesterol (CHL) en general
son:

Mtodos enzimticos: emplean enzimas para la deteccin de stos metabolitos

Sustrato + Enzima

Producto

Del tipo de:


o

punto final, es decir, la reaccin ocurre y se concluye en un solo momento,

Y la determinacin de los productos, es:


o

colorimtrica, del tipo Trinder

48

Laboratorio de Bioqumica Clnica

Los primeros mtodos para la determinacin del colesterol se basaban en la formacin de


compuestos coloridos mediante reacciones qumicas del colesterol. No obstante, debido a los lquidos
corrosivos que utilizan, estos mtodos actualmente no se suelen emplear para los anlisis de rutina, y
se prefieren los mtodos enzimticos, especficos, de fcil manejo y de gran sensibilidad.
En estos mtodos enzimticos, la primera reaccin consiste en la hidrlisis de los steres de
colesterol por accin de esterasas bacterianas inespecficas con respecto al cido graso esterificado;
a continuacin se produce la oxidacin del colesterol (el formado en la reaccin anterior y el
preexistente, o colesterol libre en plasma) por una colesterol oxidasa, producindose H2O 2, el cual
con la participacin de peroxidasa da lugar a la formacin de un compuesto colorido. El esquema de
las reacciones acopladas es el siguiente:
CHE

CHOD

steres colesterol

Colesterol + O2

4-Colestenona + H2O2

POD

2 H2O2 + Fenol + 4-Aminofenazona + 4H

Quinonimina (Compuesto colorido)

CHE: Colesterol esterasa


CHOD: Colesterol oxidasa
POD: Peroxidasa

La intensidad del color formado es proporcional a la concentracin de colesterol presente en la


muestra ensayada.
Los triglicridos incubados con la enzima lipoprotein lipasa (LPL), liberan glicerol y cidos grasos
libres. El glicerol es fosforilado por la accin de la enzima glicerol quinasa (GK) para producir glicerol3-fosfato (G3P) y adenosina-5-difosfato (ADP). El G3P es convertido a dihidroxiacetona fosfato (DAP)
y perxido de hidrogeno (H2O2) por GPO. Al final, el perxido de hidrogeno (H2O2) reacciona con 4aminofenazona (4-AF) y p-clorofenol, reaccin catalizada por la peroxidasa (POD) dando una
coloracin roja, cuya intensidad es proporcional a la concentracin de triglicridos presentes en la
muestra:
LPL

Triglicridos + H2O

Glicerol + cidos grasos libres


Glicerol quinasa

Glicerol + ATP

G3P+ ADP
GPO

G3P + O2

H2O2+ DAP
POD

H2O2 + 4-AF + p-Clorofenol + H

Quinona (Complejo de color rojo)

LPL: Lipoproten lipasa


GPO: Glicerol -3- oxidasa
POD: Peroxidasa

49

Laboratorio de Bioqumica Clnica

3. MATERIAL Y REACTIVOS
3.1 EQUIPO Y MATERIAL

Bao mara a 25 o 30o C


Centrfuga clnica
Espectrofotmetro para luz UV
celdas espectrofotomtricas y portaceldas
gradilla
5 tubos de 13 x 100
2 pipetas de 2 ml
2 pipetas de 1 ml
Aguja para vacutainer
Tubo vacutainer con gel.
Torundas, ligadura y adaptador

3.2 REACTIVOS
Kit para la determinacin de Triglicridos en suero.
Kit para la determinacin de Colesterol en suero.

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Laboratorio de Bioqumica Clnica

4. DESARROLLO EXPERIMENTAL
A. OBTENCIN DEL SUERO HUMANO.
Para estas determinaciones el paciente deber guardar ayuno de al menos 6 horas, y evitar el
consumo de grasas durante 24 horas previas.
4.1 En condiciones aspticas, obtener aproximadamente 5 mL de sangre perifrica en un tubo
vacutainer con gel.
4.2 Dejar que se contraiga el coagulo durante 5 minutos.
4.3 Centrifugar durante 5 minutos a 3000 rpm.
B. DATOS DEL PACIENTE
4.4 Anotar los datos generales del paciente en la tabla 5.1
B. DETERMINACIN DE COLESTEROL Y TRIGLICRIDOS EN SUERO.
Dependiendo de la marca del Kit que se tenga en la prctica, las concentraciones, cantidades y
condiciones de las reacciones pueden variar.

4.5 En los kits, el sustrato y las enzimas y reactivos usados se encuentran liofilizados y deben ser
reconstituidos, es decir solubilizados, para su uso. Esto lo realizar el profesor previo a la prctica.
4.6 Seguir las instrucciones que indique el inserto de cada uno de los kits que sern proporcionadas
por el profesor, y revisar en ellos:
4.6.1 como preparar el blanco de reactivos
4.6.2 como se procesar la muestra de suero obtenida y la temperatura de reaccin
4.6.3 a que longitud de onda se realizar la lectura
4.6.4 como se calcula la concentracin de TG y CHL en el suero
4.6.5 el fundamento de las reacciones que se usan en la determinacin
4.6.6 interferencias, precisin y exactitud del mtodo
4.7 Calibrar el espectrofotmetro con agua destilada.
4.8 Tomar la lectura de acuerdo a las instrucciones del inserto y las indicaciones del profesor.
4.9 Anotar los resultados del equipo en la tabla 5.2
4.10 Se emplearn los datos obtenidos por todos los equipos del grupo, y datos de aos anteriores
para el anlisis estadstico, los cules sern proporcionados por el profesor.
5. MANEJO Y ANLISIS DE RESULTADOS
A. DATOS DEL PACIENTE
5.1 Anotar los datos del paciente en la tabla 5.1
Tabla 5.1
Sexo
Edad
Condicin de salud o fisiolgica
Ayuno
IMC
B. COLESTEROL
5.2 Anotar los resultados de las lecturas de As en la tabla 5.2.

51

Laboratorio de Bioqumica Clnica

Tabla 5.2
As 505 nm para
TG

Tubo

As 505 nm para
CHL

Patrn
Muestra de suero
5.3 Anotar las frmulas para el clculo de la concentracin de TG y CHL en el suero
5.4 Calcular la concentracin de colesterol y triglicridos en la muestra empleando la frmula
anterior.
5.5 Anotar el resultado en la tabla 5.3
Tabla 5.3
Tubo
Concentracin
de
Concentracin de
triglicridos mg/dL
colesterol mg/dL
Patrn
Muestra de suero
5.6 Cual es la importancia clnica de las determinaciones de colesterol y triglicridos?
5.7 Cules son las diferencias entre las HDL, LDL y VLDL?
5.8 Existe alguna correlacin entre el IMC y los valores de TG y CHL obtenidos?
5.9 Qu es un valor de referencia y para que se determinan?
5.10
Por qu es importante que cada laboratorio establezca sus valores normales y que tomaras
en cuenta para calcular estos valores?
5.11
Anotar los resultados obtenidos de cada equipo del grupo en la tabla 5.4, realiza el clculo de
la media x .
Tabla 5.4
mg/dL
TG

CHL

Valores del equipo 1


Valores del equipo 2
Valores del equipo 3
Valores del equipo 4
Valores del equipo 5
Valores del equipo 6
Valores del equipo 7
Valores del equipo 8
Valores del equipo 9
Valores del equipo 10
Valores del equipo 11

x
S
5.12 En funcin de estos resultados establecer los valores normales de cada sustancia en tu grupo
y anota los datos:
Colesterol
52

Laboratorio de Bioqumica Clnica

Triglicridos
5.13 El profesor te proporcionar los datos de otros aos de los alumnos de bioqumica clnica.
Determina la frecuencia de todos los datos (pasados y presentes) en los intervalos sealados en
la tabla 5.5
Tabla 5.5
Intervalo
de valores
0-9.9

Colesterol
Frecuencia
Intervalo
de valores
200-209.9

Frecuencia

Intervalo
de valores
0-9.9

Triglicridos
Frecuencia
Intervalo
de valores
200-209.9

10-19.9

210-219.9

10-19.9

210-219.9

20-29.9

220-229.9

20-29.9

220-229.9

30-39.9

230-239.9

30-39.9

230-239.9

40-49.9

240-249.9

40-49.9

240-249.9

50-59.9

250-259.9

50-59.9

250-259.9

60-69.9

260-269.9

60-69.9

260-269.9

70-79.9

270-279.9

70-79.9

270-279.9

80-89.9

280-289.9

80-89.9

280-289.9

90-99.9

290-299.9

90-99.9

290-299.9

100-109.9

300-309.9

100-109.9

300-309.9

110-119.9

310-319.9

110-119.9

310-319.9

120-129.9

320-329.9

120-129.9

320-329.9

130-139.9

330-339.9

130-139.9

330-339.9

140-149.9

340-349.9

140-149.9

340-349.9

150-159.9

350-359.9

150-159.9

350-359.9

160-169.9

360-369.9

160-169.9

360-369.9

170-179.9

370-379.9

170-179.9

370-379.9

180-189.9

380-389.9

180-189.9

380-389.9

190-199.9

390-399.9

190-199.9

390-399.9

Frecuencia

5.14 Una vez agrupados, realiza un histograma de frecuencias y calcula la media y la desviacin
estndar.
5.15
En el histograma, marca la media de los datos y seala, dos veces la desviacin estndar (S)
a ambos lados de la media. Con estos puntos representa la forma de la curva normal.
5.16 Los datos que queden fuera de esta curva se pueden considerar que no pertenecen a la
poblacin de personas sanas por lo que deben de descartarse para la determinacin de los
valores de referencia, tomando nicamente los datos que queden dentro de la curva determina la
media y el intervalo de referencia, solo que ahora para la poblacin de alumnos de la UPIBI.
5.17 Compara los valores de referencia obtenidos en tu grupo con los de la poblacin de alumnos
de la UPIBI. Son diferentes? Si lo son a qu se deben las diferencias?
6. DISCUSIN
Discutir los resultados obtenidos considerando los siguientes aspectos:
La importancia de las determinaciones de TG y CHL en clnica, los mtodos empleados en esas
determinaciones y su uso en equipos automatizados.
Que son y para qu sirven los valores de referencia en una poblacin y como se determinan. Los
valores de referencia que se obtuvieron con los datos proporcionados, de que poblacin son, y que
53

Laboratorio de Bioqumica Clnica

utilidad tienen. Los valores de referencia de la poblacin mexicana en relacin con los datos que se
obtuvieron en esta prctica.
7. CONCLUSIONES
7.1 Con el anlisis y discusin de los resultados obtenidos, y en base a los objetivos de la prctica y
la investigacin bibliogrfica, elaborar las conclusiones.
8. REFERENCIAS
8.1. Davidson I., Henry J. B.Todd-Sanford. 1979. Diagnstico clnico por el laboratorio. 6.
edicin. Salvat editores. Barcelona.
8.2. Devlin. T. M. 1997. Bioqumica con aplicaciones clnicas. Tomo I y II 3. Ed- Revert S.A.,
Espaa.
8.3. Boyer R. 1999. Conceptos en Bioqumica. International Thomson Editores. Mxico.
8.4. Murray, R. K., Bender, D. A., Botham, K. M., Kennedy, P. J., Rodwell, V. M. y Weil, P. J. 2010.
Harper Bioqumica Ilustrada. 28a. ed. Mc Graw Hill. Mxico.

54

Laboratorio de Bioqumica Clnica

PRCTICA No. 7
DETERMINACIN DE UREA, CREATININA Y ACIDO URICO.
UNIDAD V: Compuesto nitrogenados y su metabolismo.
1. OBJETIVOS
1.1 Objetivo general
El alumno:
1.1.1. Realiza la determinacin cuantitativa de urea, creatinina y cido rico en suero humano
mediante el empleo de kits de diagnstico clnico.
1.2 Objetivos especficos
El alumno:
1.2.1. Realiza el diagnstico clnico de las muestras sanguneas procesadas a travs del anlisis de
los resultados obtenidos.
2. INTRODUCCIN
Existen en circulacin en la sangre ms de 15 compuestos nitrogenados no proteicos diferentes,
como aminocidos, urea, cido rico, creatinina y amoniaco.
La urea es el principal compuesto nitrogenado no proteico del plasma (45% del total) y es el
metabolito resultante del metabolismo de las protenas. Se forma en el hgado a partir de la
destruccin de las protenas. Durante la digestin, las protenas son separadas en aminocidos; stos
contienen nitrgeno que se libera como in amonio, y el resto de la molcula se utiliza para generar
energa en las clulas y tejidos. El amonio se une a pequeas molculas para producir urea, la cual
aparece en la sangre y es eliminada por la orina. Si el rin no funciona bien la urea se acumula en la
sangre y se eleva su concentracin.
Puede aparecer la urea elevada en sangre (uremia) en:
Dietas con exceso de protenas
Enfermedades renales
Fallo cardiaco
Hemorragias gastrointestinales
Hipovolemia (quemaduras, deshidratacin)
Inanicin
Obstrucciones renales (piedras, tumores)
Puede aparecer la urea disminuida en:

Dieta pobre en protenas

Fallo heptico

Embarazo

Exceso de hidratacin

Malnutricin
55

Laboratorio de Bioqumica Clnica

La creatinina es el resultado de la degradacin de la creatina, que es un componente de los


msculos y no es reutilizable en el metabolismo del cuerpo. La creatinina puede ser transformada en
ATP que es una fuente de alta energa para las clulas. La formacin de la creatina es constante, y
los niveles suelen ser muy estables, teniendo una relacin directa con la masa muscular por lo que en
varones su concentracin es mayor que en mujeres. La creatina se filtra libremente por los
glomrulos en el rin y de modo normal no se reabsorbe. Actualmente se emplea la determinacin
de nitrgeno ureico y creatinina para evaluar la funcin renal.
Puede aparecer la creatinina elevada en sangre en:
Deshidratacin
Distrofia muscular
Eclampsia
Glomerulonefritis
Neuropata diabtica
Obstrucciones renales (piedras, tumores)
Pielonefritis
Problemas cardiacos
Puede aparecer la creatinina disminuida en:
Distrofia muscular avanzada
Miastenia gravis
El cido rico es el principal producto de degradacin de las purinas (partes de DNA y RNA). La
mayor parte de la formacin de cido rico se lleva a cabo en el hgado y se excreta por el rin, y un
poco por el sistema intestinal
Los valores normales de cido rico varan ampliamente por diversos factores tales como edad,
orgenes raciales, sexo, sociales y geogrficos, adems del mtodo analtico utilizado. Igualmente
numerosas enfermedades y alteraciones fisiolgicas modifican la concentracin de cido rico en la
sangre, siendo el aumento ms significativo lo que se denomina hiperuricemia. Cuando aumenta la
destruccin de los tejidos (como en diversos tipos de cncer) el cido rico aparece elevado en
sangre, aunque la causa ms comn de su elevacin es la gota.
Puede aparecer el cido rico elevado en sangre (hiperuricemia) en:
Dieta rica en purinas (carnes rojas, vsceras de animales, embutidos, mariscos, frutos
secos)
Eclampsia en el embarazo
Fallo renal
Diabetes mellitus
Gota
Hipoparatiroidismo
Alcoholismo
Quimioterapia del cncer
Puede aparecer el cido rico disminuido (hipouricemia) en:
Dietas bajas en purinas (protenas)
Sndrome de Faconi
Enfermedad de Wilson
Fundamento de los mtodos de determinacin de metabolitos.
En bioqumica clnica la determinacin de metabolitos como la UREA, la CREATININA y el ACIDO
RICO puede llevarse a cabo mediante dos mtodos bsicos:
56

Laboratorio de Bioqumica Clnica

Mtodos qumicos colorimtricos: En ellos el metabolito se hace reaccionar con un


compuesto para producir un derivado colorido que pueda detectarse
espectrofotomtricamente, ya que la intensidad del color ser directamente proporcional a la
concentracin de la sustancia a determinar. La reaccin general sera:

Metabolito + Reactivo cromgeno

Producto colorido

Estas reacciones pueden ser de:

punto final, si la reaccin ocurre y se concluye en un solo momento,

cinticos, si se lee a diferentes tiempos.

Mtodos enzimticos: en estos, la enzima reacciona con el sustrato (s) y se obtienen


productos. Estos mtodos tambin pueden ser de punto final, o cinticos.
Enzima

Sustrato 1 + Sustrato 2

Producto 1 + Producto 2

La determinacin de los productos, puede ser:


o

colorimtrica, en donde el producto de la enzima se hace reaccionar con un compuesto


para dar un derivado colorido. Las reacciones tipo Trinder son las mas usadas.

espectrofotomtricos, donde generalmente se emplea la luz UV para detectar el


producto.

reacciones acopladas, en donde el producto de la enzima se acopla a otra reaccin


enzimtica (es decir acta como sustrato de otra enzima, para dar el producto 2). En
estos casos, lo que se detecta es el producto 2, ya sea por mtodos colorimtricos o
espectrofotomtricos.
Enzima 1

Sustrato

Producto 1
Enzima 2

Producto 1

Producto 2

3. MATERIAL Y REACTIVOS
3.1 EQUIPO Y MATERIAL

Bao mara a 25 o 30C


Centrfuga clnica
Espectrofotmetro para luz UV
celdas espectrofotomtricas y portaceldas
cronmetro
gradilla
9 tubos de 13 x 100
2 pipetas de 5 ml
6 pipetas de 1 ml
6 Pipetas automticas de 100 L
Aguja para vacutainer
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Laboratorio de Bioqumica Clnica

Torundas, ligadura y adaptador


Tubo vacutainer con gel.
3.2 REACTIVOS
Kit para determinacin de Urea (BUN) en suero.
Kit para determinacin de Creatinina en suero.
Kit para la determinacin de cido rico en suero.

58

Laboratorio de Bioqumica Clnica

4. DESARROLLO EXPERIMENTAL
A. OBTENCIN DEL SUERO HUMANO.
4.1 En condiciones aspticas, obtener aproximadamente 5 mL de sangre perifrica en un tubo
vacutainer con gel.
4.2 Dejar que se contraiga el coagulo durante 5 minutos.
4.3 Centrifugar durante 5 minutos a 3000 rpm.
B. DATOS DEL PACIENTE
4.4 Anotar los datos generales del paciente en la tabla 5.1
B. DETERMINACIN DE UREA (BUN), CREATININA Y CIDO RICO EN SUERO.
Dependiendo de la marca del Kit que se tenga en la prctica, las concentraciones, cantidades y
condiciones de las reacciones pueden variar.

4.5 En los kits, los reactivos y/o enzimas usados se encuentran liofilizados y deben ser
reconstituidos, es decir solubilizados, para su uso. Esto lo llevar a cabo el profesor previo a la
prctica.
4.6 Seguir las indicaciones del profesor, as como las instrucciones que indique el inserto de cada
uno de los kits que sern proporcionadas por el profesor, y revisar en ellos:
4.6.1 como se prepara el blanco de reactivos
4.6.2 como se procesar la muestra de suero obtenida, el tiempo y la temperatura del ensayo
4.6.3 a que longitud de onda () de realiza la determinacin
4.6.4 como se realizarn los clculos para determinar la concentracin del metabolito
4.6.5 De qu tipo son las reacciones que se llevan a cabo en la determinacin de estos
metabolitos
4.6.6 las interferencias, precisin y exactitud del mtodo
4.6.7 la estabilidad del color desarrollado
4.7 Calibrar el espectrofotmetro con agua destilada.
4.8 Tomar las lecturas segn las instrucciones del inserto y las indicaciones del profesor.
4.9 Anotar los resultados en la tabla 5.2.

5. MANEJO Y ANLISIS DE RESULTADOS.


A. DATOS DEL PACIENTE
5.1 Anotar los datos del paciente en la tabla 5.1
Tabla 5.1
Sexo
Edad
Condicin de salud o fisiolgica
Ayuno
Toma medicamento (cul)

59

Laboratorio de Bioqumica Clnica

B. DETERMINACIN DE UREA (BUN).


5.2 Anotar los resultados de las lecturas de As en la tabla 5.2.
Tabla 5.2
Tubo
As 340 nm a
As 340 nm a
30 seg
60 seg
Patrn
Muestra
suero
5.3
5.4
5.5
5.6

As

de

Anotar la frmula que indica el inserto para calcular la concentracin de Urea


Calcular la concentracin de urea en la muestra empleando esa frmula.
Anotar los resultados de la concentracin de urea (BUN) en la tabla 5.5
Anotar los valores de referencia de Urea en la tabla 5.5

C. DETERMINACIN DE CREATINA.
5.7 Anotar los resultados de las lecturas de As en la tabla 5.3.
Tabla 5.3
Tubo
As 492 nm a
As 492 nm a
30 seg
90 seg
Patrn
Muestra
suero

As

de

5.8 Anotar la frmula que indica el inserto para calcular la concentracin de Creatinina
5.9 Calcular la concentracin de creatinina en la muestra empleando esa frmula
5.10
Anotar los resultados de la concentracin de creatinina en la tabla 5.5
5.11
Anotar los valores de referencia de Creatinina en la tabla 5.5
D. DETERMINACIN DE CIDO RICO
5.12
Anotar los resultados de las lecturas de As en la tabla 5.4.
Tabla 5.4
Tubo
As 520 nm a 30 seg
Patrn
Muestra de suero
5.13
5.14
5.15
5.16

Anotar la frmula que indica el inserto para calcular la concentracin de cido rico
Calcular la concentracin de cido rico en la muestra empleando esa frmula
Anotar los resultados de la concentracin de cido rico en la tabla 5.5
Anotar los valores de referencia de cido rico en la tabla 5.5

60

Laboratorio de Bioqumica Clnica

Tabla 5.5
Metabolito

Valores obtenidos en
suero mg/dL

Valores de referencia

Urea
Creatinina
cido rico
5.17
Comparando con los valores de referencia, que puedes decir de los valores obtenidos. Qu
relacin hay con su sexo y su estado de salud o fisiolgico?
5.18 Explica de donde provienen (metabolismo) la Urea, el cido rico y la Creatinina que aqu se
determinaron.
5.19 Cul es el fundamento de cada una de las tcnicas empleadas? Anota las reacciones que
ocurren en la determinacin.
5.20
Anota dos causas no patolgicas y dos causas patolgicas que originan un aumento en la
excrecin de cido rico.
5.21 Describe las posibles interferencias en las tcnicas empleadas con la presencia de:
Bilirrubinas, hemoglobina, amonio y cido ascrbico.
6. DISCUSIN
Discutir los resultados obtenidos considerando los siguientes aspectos:
Los valores obtenidos que significado tienen.
La importancia de estas determinaciones en el diagnstico clnico y en que patologas se alteran los
valores de estos metabolitos.
Discutir si existe correlacin entre los valores de las determinaciones.
Como se producen estos compuestos en el metabolismo.
7. CONCLUSIONES
7.1
Con los resultados obtenidos, anlisis y discusin y en base a los objetivos de la prctica y la
investigacin bibliogrfica, elaborar las conclusiones.
8. REFERENCIAS
8.1. Davidson I., Henry J. B.Todd-Sanford. 1979. Diagnstico clnico por el laboratorio. 6.
edicin. Salvat editores. Barcelona.
8.2. Devlin. T. M. 1997. Bioqumica con aplicaciones clnicas. Tomo I y II. 3. Ed- Revert S.A.,
Espaa.
8.3. Sampson, E.J., Baird, M.A., Burtis, C.A., et al.: A coupled equilibrium method for measuring
urea in serum: Optimization and evaluation of AACC Study Group on urea candidate reference
method. Clin. Chem., 26, 816-826, 1980.
8.4. Murray, R. K., Bender, D. A., Botham, K. M., Kennedy, P. J., Rodwell, V. M. y Weil, P. J. 2010.
Harper Bioqumica Ilustrada. 28a. ed. Mc Graw Hill. Mxico.

61

Laboratorio de Bioqumica Clnica

PRCTICA No. 8
DETERMINACIN DE HORMONA GONADOTROPINA
CORINICA.
UNIDAD V: Compuestos nitrogenados y su metabolismo.
1. OBJETIVOS
1.1 Objetivo general
El alumno:
1.1.1. Determina la presencia de la hormona gonadotropina corinica (hGC) en orina humanas.
1.2 Objetivos especficos
El alumno:
1.2.1 Conoce el uso de anticuerpos como una herramienta para identificar sustancias.
1.2.2. Realiza la determinacin cualitativa y semicuantitativa de la hormona hGC en orina a travs de
una prueba rpida y sensible basada en un inmunoensayo.
1.2.3. Evala el uso de la determinacin de hormonas para el diagnstico clnico.
2. INTRODUCCIN
Las hormonas son molculas producidas por las glndulas y que tienen como funcin la regulacin
del metabolismo corporal. Desde el punto de vista de su naturaleza qumica, las hormonas pueden
ser lpidos esteroides, derivados de aminocidos, pptidos o protenas. Son muchas las glndulas
que las producen, como las suprarrenales, las gnadas (ovarios y testculos), hipfisis, pncreas,
tiroides, etc. En general estas glndulas se encuentran reguladas por el hipotlamo en el encfalo.
Dado el papel de regulacin del metabolismo que juegan las hormonas, la alteracin en sus
niveles trae consecuencias patolgicas. Por ello en el laboratorio clnico se realiza la determinacin
de los niveles hormonales en el diagnstico de patologas o ciertos estados fisiolgicos.
La Gonadotropina corinica humana hGC es una hormona proteica producida por la hipfisis y por
las clulas trofoblsticas de la placenta durante el embarazo. La hGC es un dmero de peso
molecular aproximadamente de 28.000, compuesto de subunidades, y . En varones su funcin
consiste en estimular la produccin de espermatozoides en los testculos. En las mujeres tiene como
funcin favorecer la ovulacin y la implantacin del embrin al interior de la matriz. Durante el
embarazo, la hormona es producida por la placenta y tiene como funcin evitar la destruccin del
cuerpo lteo y mantener los niveles de progesterona para mantener el embrin implantado y asegurar
su nutricin y aporte de oxgeno.
Los niveles normales de hGC en hombres son de 8 -10 mIU/mL y en mujeres no embarazadas
son de 10 15 mIU/mL. Sin embargo, durante el embarazo los niveles pueden aumentar de 20 mIU/mL
en la primera semana de embarazo, hasta 250 000mIU/mL en la 13ava. Es por esto que la hormona
se emplea para el diagnostico de embarazo. Como la hormona se excreta en orina, se acostumbra
realizar la determinacin en esa muestra y as evitar sangrar a la paciente.
Adems de esta condicin, la hGC es secretada por varios tumores cancerosos, como teratomas,
cncer de testculo, en coriocarcinomas y en la mola hidatiforme, de manera que en estos casos la
deteccin se realiza en orina y en sangre, lo cual adems es un indicador de la eficiencia del
tratamiento de quimioterapia, pues la concentracin de la hGC disminuye cuando el tumor
desaparece. En los ltimos aos, y bajo la sospecha o antecedentes de defectos en el nacimiento, se
realiza una prueba a las 15 20 semanas de embarazo conocida como triple test, donde se miden los
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niveles de alfa-fetoproteina (AFP), de hGC, y de un estrgeno (estriol no conjugado uE3) y que


permite al clnico estimar la probabilidad de defectos en el recin nacido. Esta prueba ya se realiza en
Mxico.
Los niveles de hGC en orina y en suero correlacionan, como se ve en la fig. 1.

Fig. 1
Los niveles de esta hormona con respecto al tiempo de embarazo pueden observarse en la tabla 1,
donde tambin se observa que las variaciones de la hormona son muy amplias, por lo que no puede
emplearse para calcular el tiempo de embarazo, sin embargo si se tiene establecido las semanas de
embarazo, y el valor de esta hormona esta fuera de los limites puede sealar problemas en el
embarazo.
Tabla 1
Semana de la ltima
menstruacin

Niveles de hGC en mU/mL

5 50

5 426

18 7,340

1.080 56 500

7-8

7 650 229 000

9-12

25 700 288 000

13-16

13 300 254 000

17 24

4 060 165 400

25 40

3 640 117 000

No embarazadas: <5.0 mIU/ml

Postmenopausicas: <9.5 mIU/ml

En cerca del 85% de los embarazos normales, los niveles de hGC se duplican cada 48-72 h en las
primeras semanas. Despus, lo hacen cada 96 h. Alcanza su mximo a las 8-11 semanas, declina un
poco y despus se mantiene constante el resto del embarazo.
El mtodo ms usado actualmente para detectar la hormona es el de inmunoensayo. En esta
prueba se usa una tira de papel (fase slida) cubierta de ltex y que ha sido tratada con anticuerpos,
en tres zonas diferentes de la tira. Para hacer el ensayo, un extremo de la tira se sumerge en la orina
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o se le gotea la orina, y entonces el lquido recorre la tira por capilaridad y llega a la primera banda La
primera banda contiene anticuerpos anti hGC (cadena a) y que van a unir a las molculas de hCG
presentes en la orina. Este Ac anti hCG se encuentra unido a un colorante. Esta banda tambin
contiene IgG como control para asegurar que la tira trabaje correctamente. Despus el lquido
conteniendo los Ac unidos a la hCG de la orina continua ascendiendo por capilaridad y llegan a la
segunda banda. En ella se encuentra otro anticuerpo anti hCG (cadena b) que tambin se une a la
hCG formando un sndwich, y entonces el colorante cambia de color, dando como respuesta una
banda colorida. Luego la IgG continua ascendiendo y llega a la tercera banda donde se encuentra
una Ac anti IgG, y en donde tambin aparecer una banda colorida en la ventana de control.
Si en la tira se observan dos bandas coloridas (una de la banda de prueba y otra de la banda de
control) la prueba es positiva, y si la tira se emplea para la deteccin de embarazo, significa que la
paciente est embarazada. Si solo aparece una banda (en la banda control) la prueba de embarazo
es negativa. Si no aparece ninguna banda en la zona de control, la prueba no se realiz
correctamente y deber repetirse.
La sensibilidad de la prueba es de 25 mUI de hGC/mL o ms. Con esta prueba es posible detectar
los niveles de HGC que se encuentran normalmente en las mujeres embarazadas a partir del 8 da
de la menstruacin esperada en adelante. Tambin detecta la presencia de los tumores de los que se
habl antes, y se usa de manera cualitativa para seguimiento de la quimioterapia.
Otro sistema de inmunoensayo para la determinacin de hGC es el de aglutinacin en placa, esta
prueba de embarazo se basa en la aglutinacin rpida de partculas de ltex sensibilizadas por
anticuerpos monoclonales especficos con la hGC presente en la muestra.
La presencia de hGC en las muestras urinarias conduce a una aglutinacin que se diferencia
visualmente de la no aglutinacin del control negativo.
Este mtodo requiere de valores superiores a 200 mUI/ml para obtener un resultado positivo, es
decir un resultado positivo asegura que en la muestra hay al menos 200 mUI/ml de hGC. Este
sistema nos permite la realizacin de un procedimiento semicuantitativo en la determinacin de hGC
mediante dilucin de la muestra de orina, lo que permite a la vez hacer una estimacin del momento
de la gestacin en que se encuentra la embarazada.
3. MATERIAL Y REACTIVOS
3.1 EQUIPO Y MATERIAL

1 pipeta automtica de 10 a 100 L


cronmetro
gradilla
5 tubos de 13 x 100
Aplicadores de madera
1 pipeta de 1 ml
1 pipeta pasteur
Orina de mujer embarazada
Placa para prueba de hGC

3.2 REACTIVOS
Prueba casera, la cual contiene una membrana impregnada con anticuerpo anti-HGC y un cojn
de absorcin con Anticuerpo monoclonal anti-hGC conjugado y 0.05% Azida de Sodio como
preservativo.
Kit para la determinacin de hGC por aglutinacin en placa.

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4. DESARROLLO EXPERIMENTAL
A. OBTENCIN DE LA ORINA.
4.1 Utilizar un contenedor limpio y seco para recolectar la orina. Se puede utilizar orina recolectada
hasta con 24 horas de anticipacin. Las muestras de orina pueden ser refrigeradas (2 8 C) y
almacenadas hasta por 72 horas antes de ser evaluadas. Se requiere un volumen pequeo de la
misma.
4.2 Anotar las semanas de embarazo de la paciente de quin se obtuvo la muestra.
B. REALIZACIN DE LA PRUEBA CASERA.
4.3 Tanto la Prueba Casera como la muestra recolectada o cualquier otro material debern estar a
temperatura ambiente (20-30 C) antes de llevar a cabo la prueba.
4.4 Sacar la Tira de su empaque y seguir las instrucciones exactas del fabricante para la
determinacin.
4.5 Anotar el resultado obtenido en la tabla 5.1
C. REALIZACIN DE LA PRUEBA EN PLACA.
4.6 Los componentes del sistema como la muestra o cualquier otro material debern estar a
temperatura ambiente (20-30 C) antes de llevar a cabo la prueba.
Mtodo 1 Prueba directa.
4.6.1 Colocar una gota de la orina sobre el circulo de la placa.
4.6.2 Depositar una gota de la suspensin del reactivo de ltex al lado de la gota de la muestra.
4.6.3 Mezclar las gotas con ayuda de una punta de pipeta o con un aplicador de madera mediante
movimientos circulares y distribuyendo dentro del circulo de la placa.
4.6.4 Balancear la placa suavemente durante 2 minutos y observa la aglutinacin dentro del crculo.
No prolongar la incubacin mas all de 2 minutos para evitar errores de interpretacin (falsos
positivos).
4.6.5 Correr simultneamente un control negativo y un control positivo.
4.6.6 Anotar los resultados en la tabal 5.1
Mtodo 2 Prueba Semicuantitativa.
4.7 Si la prueba en placa result positiva, prepare las siguientes diluciones de la muestra en agua
destilada, en tubos limpios y secos: 1:5, 1:10, 1:20, 1:50 y 1:100
4.7.1 De manera secuencial, con cada dilucin repita el procedimiento en placa, hasta llegar a la
dilucin donde la prueba resulte negativa.
4.7.2 Al terminar la prueba enjuague la placa con agua corriente y agua destilada y secar al aire
libre.
4.7.3 Anotar los resultados en la tabla 5.2

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5. MANEJO Y ANLISIS DE RESULTADOS


5.1 Escribe las semanas de gestacin de la paciente _________________________________
5.2 Anotar el resultado de la pruebas de hGC en orina en la tabla 5.1
Tabla 5.1
RESULTADO
Prueba casera
Prueba en placa con ltex
5.3 En la tabla 5.2 registra los resultados de datos de la prueba semicuantitativa de una muestra
Tabla 5.2
Concentracin
DILUCIN
RESULTADO
Mnima (mUI/ml) de
hGC
1:1 (sin
200
dilucin)
1:5
1:10
1:20
1:50
1:100
5.4 Determinar entre que lmites se encuentra la concentracin de hGC en la muestra analizada e
indicar si corresponde con las semanas de embarazo de la paciente.
5.5 Describir un resultado falso positivo y dar un ejemplo.
5.6 Describir un resultado falso negativo y dar un ejemplo.
5.7 Explicar el fundamento de la prueba casera
5.8 Investigar de qu manera se hace la determinacin de otras hormonas de importancia clnica y
comntalas.
6. DISCUSIN
6.1 Discuta las diferencias entre los mtodos para cuantificar o identificar biomolculas empleados en
esta prctica con los empleados en las practicas previas.
6.2 Discutir la importancia de las pruebas inmunolgicas en el laboratorio clnico.
6.3 Discutir si esta prueba tiene solo uso en el diagnstico del embarazo.
7. CONCLUSIONES
7.1
En funcin de los resultados y la discusin que se realiz, elaborar las conclusiones y verificar
si se cumplieron los objetivos planteados.
8. REFERENCIAS
8.1.
Guyton Arthur C. 2002. Fisiologa Mdica. 5a. edicin. Editorial Interamericana. Mxico.
8.2. Amstrong, G. Ehrlich, P.H., Birken, S., Schlatterer, J.P., Siris, E. Hembree, C., and Canfield,
R.E. 1984. Use of a Highly Sensitive and Specific Immunoradiometric Assay for Detection of
Human Chorionic Gonadotropin in Urine of Normal, Nonpregnaiit, and Pregnant Individuals.
J.Clin. Endocrinol. Metab. 59, 867-874.
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8.3. Iles, R.K. Purkins, E. Ehitehead, P.C., Oliver, R.T.D., Leigh, I., and Chard, T., 1990. Expression of

beta human chorionic gonadotrophin by non-trophoblastic non-endocrine 'normal' and malignant


epithelial cells. Br. J. Cancer 61, 663-666.

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PRCTICA No. 9
POTENCIOMETRA
UNIDAD VII: Equipos empleados en la clnica para el estudio del metabolismo.
1. OBJETIVOS
1.1 Objetivo general
El alumno:
1.1.1. Emplea el potencimetro como modelos de sensor para valorar el poder amortiguador del
suero sanguneo.
1.2 Objetivos especficos
El alumno:
1.2.1. Realiza la calibracin de un potencimetro.
1.2.2. Compara el poder amortiguador del suero sanguneo con respecto a otros amortiguadores
qumicos.
2. INTRODUCCIN
La potenciometra es una tcnica analtica que se emplea para determinar la concentracin de una
especie electroactiva, generalmente iones, de una solucin casi siempre lquida. Con los equipos
empleados, es decir los potencimetros, lo que se determina es la actividad de esa especie inica,
que se encuentra relacionada directamente con su concentracin.
Cuando un metal se encuentra inmerso en una solucin electroltica, se tiene un potencial, o mejor
dicho an, una fem (fuerza electromotriz) que depende de la concentracin de los iones ah
presentes. Se puede meter un electrodo dentro de la solucin y uno fuera de la solucin, el cul
funcionara como una referencia, con lo cual mediramos el potencial de la solucin con respecto a un
medio diferente, es decir tendramos una medida de la diferencia de potencial. Es posible calcular la
concentracin de los iones de la solucin electroltica, como una medida de la actividad de dichos
iones. Con el fin de evitar problemas con estas determinaciones, ya que lo que se mide realmente es
la actividad del in, y no su concentracin, se realizan titulaciones potenciomtricas. Como el nombre
indica, en este caso lo que se hace es realizar una titulacin con un potencimetro a fin de llegar a un
punto final de equilibrio o neutralizacin. Por esto, cuando se realizan las mediciones, se debe
permitir alcanzar el equilibrio para tomar la medicin.
Para obtener mediciones analticas vlidas, el electrodo externo, es decir el electrodo de
referencia, deber tener un potencial constante. Los cambios se debern a cambios registrados en el
otro electrodo, o electrodo de trabajo. El electrodo de referencia tiene un potencial, o ms bien una
fem constante, es decir que el potencial depende de una especie cuya concentracin permanece
inalterada durante toda la determinacin.
Un electrodo de referencia est constituido por una hemicelda interna de referencia, un puente
salino o electrolito y un pequeo canal en la punta del electrodo a travs del cual fluye lentamente el
electrolito del puente salino y establece el contacto entre los componentes de la celda electroqumica,
es decir una solucin electroltica de sal, para que se pueda medir la fem de la celda. Los puentes
salinos pueden ser un tubo esmerilado, un puente de agar, una mecha de asbesto u otros. Los
empalmes lquidos, es decir estas soluciones de electrolitos que conectaran a los dos electrodos, son
de sales de alta fuerza inica, y la ms comn es la de KCl saturado, pero pueden ser mezclas de
sales de K, Na, Cl. La fem de la celda es la diferencia algebraica de los potenciales de los dos
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electrodos (el de referencia y el indicador). El electrodo de referencia en la mayora de los


potencimetros se comporta como un nodo.
Los electrodos de referencia generalmente son de Calomel (Cloruro de mercurio) o de Plata
(Cloruro de plata/Plata). Las caractersticas de este tipo de electrodos son:
Invariabilidad del potencial durante la medicin
Ajuste rpido y exacto
No debe alterarse con la temperatura
Existen electrodos de trabajo de distinto tipo tiles para distintos cationes o aniones. Cada vez son
ms usados los electrodos selectivos de iones (ESI) o electrodos de membrana. Uno de los ms
empleados, que se comenz a utilizar a principios del siglo XX, es el electrodo de pH (un electrodo de
vidrio). Los electrodos de primera clase contienen un metal sumergido en una solucin con iones de
la misma especie. Son generalmente electrodo de plata sumergido en nitrato de plata y mercurio. Los
electrodos de segunda clase son electrodos de metal recubiertos de una sal poco soluble o un
complejo de este metal inmerso en una solucin con un in de la misma especie. El potencial del
electrodo indicador est en funcin de la actividad de in activo, esto es el in para el cul el
electrodo es activo. Este valor se requiere para conocer la concentracin de la especie en estudio. Un
electrodo de trabajo debe tener las siguientes caractersticas:
Alta sensibilidad a la especie que va a ser determinada.
Alto grado de reproducibilidad.
Respuesta rpida a las variaciones de concentracin de la especie que se va a
determinar.
Los factores principales que determinan el potencial de electrodo con respecto a otro son: la
capacidad de ionizacin de la sal, la concentracin de la sal y la temperatura.. Los potenciales de
electrodo se consideran como la fem de las celdas constituidas por un electrodo patrn de hidrgeno,
el cual se considera una referencia para calcular los potenciales de otros electrodos de referencia.
El potencial

de cualquier electrodo est dado por la ecuacin de Nerst:

a
RT
ln
n F aox

en donde R es la constante de los gases (8.31 V/K), T es la temperatura en grados Kelvin, n es el


nmero de electrones transferidos en la reaccin del electrodo, F es la constante de Faraday (96,
485.33 coloumbs/mol) y ared y aox son las actividades de las formas reducidas y oxidadas. Si en la
ecuacin las actividades se sustituyen por la concentracin en moles, y se insertan valores numricos
en lugar de constantes, usando adems logaritmo decimal, a una temperatura de 25 C la ecuacin
se transforma en

0.05915 a
ln
nF
a ox

Eletrodos de pH
Los electrodos de pH son electrodos de membrana slida, en este caso vidrio de silicatos con
modificadores inicos, sensibles a iones hidrgeno. Estas membranas de vidrio pueden ser de dos
tipos:
Membrana T: Na2O - CaO - SiO2 (22:6:72)%

Membrana U: Li2O - Cs2O2 - BaO - La2O3 - SiO2 (28:2:4:3:63)%

Cuando el electrodo se pone el contacto con la solucin que se va a medir, se presenta un proceso
de intercambio inico entre los iones H+ de la solucin y el Na+ o Li+ de la membrana. Es muy
importante mantener el electrodo sumergido en agua, regulador diluido o KCl, de modo que se forme
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una capa de cohesin entre el vidrio y la solucin que se va a determinar, y evitar retrasos en la
determinacin por el transporte de iones, o una cada del voltaje por la resistencia del medio. El
electrodo de pH tiene un electrodo de referencia interna de plata (Ag/AgCl) sumergido en un
regulador de sales de Cl- (pH = 7.0) con una membrana de vidrio (Fig. 1).

Fig. 1

La determinacin de pH en clnica tiene relevancia para el diagnstico de ciertos estados


patolgicos. El pH de la sangre tiene un muy estrecho margen de variacin, entre 7.3 y 7.45 lo que
indica que existen controles muy rigurosos de este parmetro. El control tiene que ver con permitir el
funcionamiento de las enzimas del metabolismo y con su regulacin. Como consecuencia de los
procesos metablicos, se producen constantemente sustancias cidas: cido carbnico (el que se
produce en mayor cantidad), cido lctico, y muchos cetocidos como metabolitos intermediarios.
La regulacin del pH puede darse por 4 procesos: amortiguacin extracelular, amortiguacin
intracelular, amortiguacin respiratoria y la excrecin renal de la carga de H+. En la amortiguacin
extracelular, es decir de la sangre, el HC03- juega el papel ms importante, ya que posee una gran
capacidad para evitar cambios bruscos en el pH de la sangre arterial. En la amortiguacin respiratoria
se incrementa la ventilacin alveolar, y como resultado, la PC02 descender para volver el pH a la
normalidad. El rin desempea un papel crtico en el equilibrio cido-bsico a travs de la regulacin
del HCO3- plasmtico a travs de la reabsorcin de este in.
La acidosis metablica es un trastorno clnico caracterizado por un descenso en el pH arterial y en
la concentracin de HCO3- esta acidosis metablica se produce de dos maneras: por la adicin de
cido o por la prdida de HCO 3-. Las causas son insuficiencia renal o cetoacidosis metablica.
Tambin la ingesta de anticongelantes provoca un tipo de acidosis.
La alcalosis metablica es un trastorno en el cul el pH sanguneo aumenta. Puede deberse a
retencin de HCO3- o prdida gastrointestinal o renal de H+, por ejemplo en vmito y succin gstrica.
Tambin por el uso de diurticos, la ingestin excesiva de alcalinos y se encuentra asociada al
hipercorticismo.
Como se mencion anteriormente, la sangre tiene una gran capacidad amortiguadora, sobre todo
por la presencia de iones bicarbonato, pero tambin porque muchas protenas actan amortiguando
los cambios de pH. En esta prctica se realizar la titulacin de suero humano para probar esta
capacidad de amortiguacin del pH. Esto se observar en la grfica correspondiente, donde se podr
observar la zona donde no se modifica el pH de la solucin, an cuando se adicione lcali.
3. MATERIAL Y REACTIVOS
3.1 EQUIPO Y MATERIAL
Potencimetro con electrodo
Centrfuga clnica.
Aguja para vacutainer
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Torundas, ligadura y adaptador.


Tubos vacutainer de 5 mL con gel.
Vaso de precipitados de 15 mL
Pipeta Pasteur.
Bureta de 50 mL
Pizeta.

3.2 REACTIVOS

Solucin calibradora de pH 4.0


Solucin calibradora de pH 7.0
NaOH 0.01N
HCl 0.01 N
Regulador de fosfatos (Na2 HPO4 NaH2PO4) 0.0025N pH 7.35
Solucin salina fisiolgica (SSF)

4. DESARROLLO EXPERIMENTAL
A. OBTENCIN DEL SUERO HUMANO.
4.1 Obtener aproximadamente 5 mL de sangre perifrica en un tubo vacutainer con gel.
4.2 Dejar que se contraiga el coagulo durante 5 minutos.
4.3 Centrifugar durante 5 minutos a 3000 rpm.
4.4 Con ayuda de una pipeta Pasteur recuperar el suero y realizar una dilucin 1:20 del suero con
SSF, para obtener 20 mL de la dilucin.
4.5 . Colocarlo en un vaso de precipitados de 30 mL.
B. CALIBRACIN DEL POTENCIOMETRO.
4.6 Tomar el potencimetro y lavar el electrodo con agua destilada, para eliminar la solucin de KCl
que contiene. Con ayuda de un pao suave secar el exceso de agua de la punta del electrodo, sin
frotarlo.
4.7 Realizar la calibracin del equipo con dos reguladores (2 puntos) acorde al instructivo segn el
modelo de potencimetro que sea asignado.
4.8 Lavar nuevamente el electrodo con agua destilada y secar. El equipo est ahora listo para las
determinaciones de pH.
C. TITULACIN POTENCIOMTRICA DEL SUERO HUMANO.
4.9 Introducir el electrodo en 20 mL de la dilucin del suero y registrar el pH marcado.
4.10 Con una bureta, adicionar gota a gota, una solucin de NaOH 0.01 N, mientras el vaso se
mantiene con agitacin a baja velocidad.
4.11 Registrar el pH del suero cada 0.2 mL de gasto de sosa. Anotar estos datos en la tabla 5.1.
Detener la titulacin cuando el pH sea de 10.0
4.12 Otro equipo realizar la misma titulacin pero empleando HCl 0.01N como titulante. Detener la
titulacin cuando el pH sea de 2.0
4.13 Repetir el procedimiento pero empleando ahora 20 mL de agua destilada, para compararla con
la curva obtenida con el suero. Titular igualmente con NaOH 0.01N, y con HCl 0.01N. Anotar los
datos en la tabla 5.2
4.14
Finalmente, realizar la titulacin con 20 mL de una solucin de reguladora de fosfatos
0.0025N, pH 7.35. Titular con NaOH 0.01N, y con HCl 0.01N. Anotar los datos en la tabla 5.3

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CUIDADOS DEL POTENCIOMETRO DE pH.


Almacenamiento.
Los electrodos de pH se debern guardar siempre en un medio lquido, nunca secos.
En el caso de los electrodos de pH combinados en un electrolito de referencia o solucin
saturada de sales.
Limpieza del electrodo.
Si se realizan mediciones sistemticas de disoluciones de HCl u otros con Cl en baja
concentracin, puede precipitarse el AgCl. Debe entonces introducirse el electrodo en NH3
concentrado toda una noche y se lava con agua destilada.
Despus de cada lectura puede hacerse una lectura rpida con agua destilada.
Pueden emplearse soluciones limpiadoras comerciales.
Si se ha empleado agar, puede enjuagarse inmediatamente con agua destilada caliente.
5. RESULTADOS
5.1 Anotar el valor de pH inicial del suero __________________
5.2 Anotar el pH inicial del regulador de fosfatos ____________
5.3 Anotar el pH inicial del agua destilada __________________
5.4 Anotar los resultados de la titulacin de suero en la tabla 5.1. En las tablas 5.2 y 5.3 anotar los
datos de agua y de regulador de fosfatos.
mL de NaOH
gastados

Tabla 5.1 SUERO


pH
mL de HCl
gastados

pH

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mL de NaOH
gastados

mL de NaOH
gastados

pH

Tabla 5.2 AGUA


mL de HCl
gastados

Tabla 5.3 REGULADOR FOSFATOS


pH
mL de HCl
gastados

pH

pH

5.5 Realizar una grfica de pH (en las ordenadas) contra los mL de NaOH o HCl gastados (en las
abscisas).
5.6 En esta grfica marcar con rojo la zona donde el suero amortigua el pH, y que es donde se dice
que funciona como amortiguador o regulador. En qu intervalo de pH se encuentra esta zona?
5.7 Qu determina el valor de pH del suero sanguneo?
5.8 A qu se debe la capacidad amortiguadora del suero sanguneo?
5.9 En qu casos se debe determinar el valor de pH del suero de un individuo?
5.10

Cul es la importancia metablica y fisiolgica de regular el pH de la sangre?

5.11

Cules son los cuidados del potencimetro de pH?

5.12

Con que otros equipos se determina en clnica el pH sanguneo y en que condiciones?

73

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5.13

Cmo se puede automatizar la determinacin de pH de sangre?

6. DISCUSIN
Discute los resultados obtenidos considerando los siguientes aspectos:
La importancia y uso de la determinacin de pH de la sangre. Funcionamiento y cuidados del
potencimetro de pH.
La importancia de los electrodos en la medicin de metabolitos, dando ejemplos en el laboratorio
clnico.
7. CONCLUSIONES
7.1 En funcin de los resultados y la discusin que se realiz, elaborar las conclusiones y verificar si
se cumplieron los objetivos planteados.

8. REFERENCIAS
8.1 Skoog, D., Holler, J. y Crouch, S. 2006. Principios de anlisis instrumental. 6a. edicin. Ed. Mc
Graw-Hill Co. Mxico.
8.2 Willard, H., Merritt, L., Dean, J. y Settle, F. 1988. Mtodos Instrumentales de Anlisis. 7a.
edicin. Ed. Iberoamericana. Mxico.
8.3 Devlin, T. 2004. Bioqumica. Libro de texto con aplicaciones clnicas. 4a. edicin. Ed.
Revert. Barcelona, Espaa.
8.5. Murray, R. K., Bender, D. A., Botham, K. M., Kennedy, P. J., Rodwell, V. M. y Weil, P. J. 2010.
Harper Bioqumica Ilustrada. 28a. ed. Mc Graw Hill. Mxico.

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APENDICE A
USO DE LAS PIPETAS AUTOMTICAS
Las pipetas automticas son instrumentos delicados y costosos, que deben cuidarse dado que de ellos depende
gran parte de nuestro trabajo. Dichas pipetas son muy precisas si se las utiliza correctamente. Existen varios
tipos de pipetas y cada marca provee un juego para diferentes rangos de volmenes. Cada pipeta est rotulada
en el mbolo y posee un color distintivo, para su funcionamiento la mayora tiene caractersticas anlogas. A
continuacin se ejemplifican dos tipos de pipetas.
Ante la menor duda, consulte antes de usar. Es preferible
preguntar lo mismo veinte veces antes que romper una
pipeta.
Juego de pipetas tipo A
Una pipeta rotulada P-20 mide entre 2 l y 20 l.
Una pipeta rotulada P-200 mide entre 20 l y 200 l.
Una pipeta rotulada P-1000 mide entre 200 l y 1.000 l 0,2 y 1,0 ml.
Para poder tomar lquido con estas pipetas, deben tener en su extremos las puntas plsticas descartables (tips),
amarillas para P-20 y P-200, y azules para P-1000.
Antes de utilizar la pipeta asegrese conocer cmo fijar el volumen. La P-20 mide hasta la dcima de
microlitro. En la P-20 los dos nmeros superiores indican el volumen en microlitros, en tanto que el nmero
inferior es la cantidad fraccional La P-200 y P-1000 miden hasta el microlitro por lo tanto, el nmero superior
de la P-200 nunca debe superar el 2.
Por ejemplo:

En una p20 equivalen


a 3,8l

En una p200 equivalen


a 38l

En una p1000
equivalen a 380l

Recuerde que las micropipetas tienen dos topes, antes de tomar un volumen solamente debe bajar hasta el
primero, y cuando baje el volumen hgalo hasta el primer tope, en caso de que aun quede solucin en el tips
puede bajar hasta el segundo tope.

NUNCA
1- Nunca forzar la pipeta por encima del volumen indicado por su nombre. No mide ms de lo establecido y
descalibrar o romper la pipeta.
2- Nunca utilice la pipeta para medir un volumen menor a la dcima parte de su nombre. No es precisa.
3- Nunca utilice una pipeta sin su punta (tips) amarilla o azul.
4- Nunca utilice la pipeta con soluciones cidas concentradas. Los vapores pueden oxidar las partes metlicas
interiores de la pipeta.

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APENDICE B
CMO ESCRIBIR EL REPORTE?
Si un hombre puede organizar sus ideas, entonces el puede escribir"
Robert Louis Stevenson (1850-1894)

Son varios los elementos de los cuales se conforma un reporte, y en el caso de los laboratorios de la
academia de BIOQUMICA se incluyen los siguientes:
PRCTICA No. #
Ttulo de la Prctica
UNIDAD: Unidad de aprendizaje a la cual pertenece la prctica
1. OBJETIVOS:
1.1 Objetivo general
1.1.1. El principal objetivo que se busca al realizar la prctica
1.2 Objetivos especficos
1.2.1 Son los objetivos parciales que nos llevan a concluir el objetivo general
1.2.2
1.2.3
A continuacin se describe ms detalladamente cada una de las secciones.
OBJETIVO:
En el campo de la educacin, podemos decir, que un objetivo es el resultado que se espera logre el
alumno al finalizar un determinado proceso de aprendizaje, es decir, que un objetivo es el resultado que se
espera logre el alumno al finalizar un determinado proceso de aprendizaje.
Los objetivos se dividen en Objetivo General y Objetivo Especficos. El Objetivo General es el resultado
final que se quiere llegar. El Objetivo General, para ser llevado a cabo, usualmente puede y tiene que ser
desglosado en una serie de acciones o actividades particulares menores, sustancialmente diferentes unas de
otras. Estos son los Objetivos Especficos. Son como las dos, tres o cuatro partes bsicas en que se divide la
investigacin. Aunque este ya se encuentra impreso en la prctica, debes considerar que debe tener
congruencia con el ttulo, y que verdaderamente se estn cumpliendo con el trabajo experimental.
INTRODUCCIN:
Esta seccin le indica al lector cul es el problema, as como por qu y cmo se ha planeado la
prctica. Te proporciona el marco terico necesario para que puedas enriquecer los experimentos a realizar, y
poder lograr los objetivos.
EN EL REPORTE QUE SE SOLICITA EN EL LABORATORIO NO SE INCLUYE LA INTRODUCCIN,
LA CUL YA EST INCLUIDA EN CADA PRCTICA.

MATERIAL Y MTODOS:
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Laboratorio de Bioqumica Clnica


En esta seccin se responde a la pregunta de "cmo se ha hecho el estudio". La seccin de material y
mtodos debe ser lo suficientemente detallada como para que puedas realizar los experimentos de forma
independiente. Una vez ms esta se encuentra ya escrita dentro de tu prctica, por lo que NO es necesario que
lo copies, pero debes tenerla muy presente a la hora de elaborar tu reporte, incluyendo las modificaciones que
se hayan realizado durante la realizacin de la prctica, porque van a ser muy importantes durante los
resultados, discusin y las conclusiones.
RESULTADOS:
Los resultados deben cumplir dos funciones:
1. Expresar los resultados de los experimentos descritos en Material y Mtodos.
2. Presentar las pruebas que apoyan tales resultados, sea en forma de figuras, tablas, grficas o en el mismo
texto.
Los resultados deben poder ser vistos y entendidos de forma rpida y clara. Es por ello por lo que la
construccin de esta seccin debe comenzar por la elaboracin de esquemas, las tablas y figuras, as como
grficas, las que, por s solas, deben poder expresar claramente los resultados de todos los experimentos
realizados en la prctica. Recuerda que en el manual ya se encuentran tablas para poder organizar tus
resultados, utilzalas en el reporte.
Las graficas deben de llevar titulo, unidades y la escala debe ser congruente, las figuras y esquemas
deben de llevar un pie de figura indicando de lo que se trata, los esquemas deben ser de tipo biolgico
Tambin se incluye en esta seccin un Cuestionario, el cual debes de contestar apoyndote en
bibliografa, que adems de irte guiando en todos los resultados que debes presentar, estas preguntas te
servirn para centrar tus resultados dentro del marco terico.
ANLISIS DE RESULTADOS Y DISCUSIN:
Esta seccin incluye lo ms importante del reporte, por lo que es la seccin ms compleja de elaborar y
organizar. Aqu es donde se interpretan los resultados, se califican, y se les pone dentro del contexto del trabajo.
Gua al lector de forma que siga el proceso mental que se sigui para llegar a las conclusiones. Algunos puntos
especficos que se deben resaltar son:
1. Cualquier experimento realizado debe ser discutido. Bsate en como expresaste los resultados, analiza los
esquemas, tablas y grficas. Cmo se relacionan los datos dentro de una tabla? En qu se diferencian?
Cmo debera interpretarse en una grfica? Cul es el significado biolgico de la forma de la grfica,
pendiente, puntos de inflexin, mximos, mnimos o donde se interceptan las lneas?
2. Cmo se ajustan los resultados a las expectativas? Por ejemplo, las mediciones concuerdan con las
predicciones tericas o con las mediciones de otros experimentos? Cul es la explicacin para estas
diferencias?
3. Si una variable fue medida en varias formas, cmo se comparan las medidas y qu significa esta
comparacin?
4. Cules son las fuentes de error para el anlisis o para la recoleccin de datos? Los resultados estn
dentro del intervalo aceptable de error ya establecido? No debe decirse que los resultados estn dentro del
error esperado, a menos que se haya efectuado un anlisis de error. Si algo salio mal no se trata que digas
que sali mal sino que debes analizar todo el proceso y encontrar cuales son todas las fuentes probables
de ese error, y como podras identificar cual es la que verdaderamente fall y como corregirla.
5. No olvides siempre tratar de contextualizar esta discusin dentro de tu carrera, y las aplicaciones que le
podrs dar al conocimiento adquirido en tu rea.

Algunas sugerencias pueden ayudar

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Comienza la Discusin con la respuesta a la pregunta de tus objetivos, seguida inmediatamente con las
pruebas expuestas en los resultados que la corroboran.
Escribe esta seccin en presente ("estos datos indican que"), porque los hallazgos del trabajo se
consideran ya evidencia.
Saca a la luz y comente claramente, en lugar de ocultar resultados anmalos, dales una explicacin lo
ms coherente posible o simplemente diciendo que esto es lo que ha encontrado, aunque por el
momento no se vea explicacin.
Especule y teorice con imaginacin y lgica. Debes aprender a exponer ideas novedosas de forma
clara.
Incluye las recomendaciones que creas oportunas.
Y, por encima de todo, evita sacar ms conclusiones de las que sus resultados permitan, por mucho
que esas conclusiones sean menos espectaculares que las esperadas o deseadas.

En cuanto a la redaccin ten siempre en mente a un lector especfico, real o imaginario, cuando escriba
el reporte; y siempre asume que dicho lector es inteligente pero que no est informado de la situacin en
particular que se est reportando. Antes de empezar a escribir, entienda que la discusin tiene un objetivo, y
todas las partes en el deben contribuir a ese objetivo. El reporte deber reflejar un slido entendimiento de lo
que en el se presenta, y debera ser objetivo, por lo que nunca deben de expresarse opiniones personales.
Use lenguaje simple, preciso y familiar. El uso incorrecto del vocabulario y de los trminos
tcnicos nicamente evidencia que no tienes un buen conocimiento de los conceptos. Trata de ligar los
prrafos para que no se lean de manera inconexa, cada uno se debe de ir ligando y finalmente te deben
llevar a las conclusiones.
Use la tercera persona en voz pasiva. Los pronombres personales "yo", "a m", "t", "Ud.", "a nosotros",
no deben aparecer. La voz pasiva es utilizada debido a que los informes generalmente hablan de cosas que se
han hecho en el pasado; por ejemplo: "el potencimetro fue calibrado", en vez de "nosotros calibramos el
potencimetro".
Si se tienen problemas con una oracin, esto se debe probablemente a que se quieren unir dos ideas
que no estn relacionadas entre s. Detngase a pensar un momento en lo que est tratando de decir.
Encontrar que dos o ms oraciones ms cortas representarn la informacin con mayor claridad y harn que
este pasaje sea ms fcil de leer.
CONCLUSIONES:
La seccin de conclusiones es la culminacin de tu reporte, tus objetivos sealan adonde deberas
llegar, los resultados son la forma en que puedes llegar, la discusin te permite, junto con tus resultados, el
proceso para que cumplas con los objetivos, en esta parte del reporte debes de expresar a que llegaste de
manera concisa.
Las conclusiones se inician con una o dos oraciones que recuerden los objetivos. Dado que se pueden
sacar varias conclusiones de un estudio, una lista numerada es til frecuentemente. Cada conclusin debera
constar de una oracin breve y clara. Las conclusiones deben estar relacionadas con los objetivos.
Las conclusiones solo pueden ser de aquello que experimentaste, discutiste y que por lo tanto
ya deben estar claras en la persona que lee el informe, solo las debes de puntualizar . No pueden ser
apreciativas, ni repetir el enunciado de los objetivos en diferente verbo, sino que deben ser lo ms objetivas, de
acuerdo a lo que te indicaba el objetivo, por ejemplo si el objetivo es determinar la tasa de crecimiento del
microorganismo no puedes concluir aprendimos a determinar la tasas de crecimiento o se determin la tasa
de crecimiento, sino la tasa de crecimiento del microorganismo fue de X.
REFERENCIAS:
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Se deben incluit las referencias a todo el material que consultaste para la realizacin de la prctica, ya
sea para contestar el cuestionario, para buscar datos especficos, o para buscar los datos tericos, no debes
copiar aquella que presenta el manual, y que fue la usada para la elaboracin de la introduccin, a menos que
incluyas datos nuevos. Estas incluyen libros, artculos de revista, normas, leyes, e inclusive sitios electrnicos,
siempre y en cuando estos sean una fuente fidedigna y confiable, y no pginas de Internet cuestionables, esto
se puede corroborar por el respaldo que tiene una publicacin electrnica por una institucin de prestigio, esto
es universidades, institutos de investigacin, rganos gubernamentales organizaciones internacionales.
Tampoco es vlido la inclusin de enciclopedias como Encarta, o sitios de recopilacin de datos como lo es
Wikipedia, ya que todos sus datos no son generados por esos sitios, y siempre se debe buscar la fuente original
para poder certificar su veracidad.
A continuacin se presenta las diferentes fuentes que puedes usar en la bibliografa y la forma correcta
de citarlas de acuerdo a normas internacionales como son la norma ISO 690-1987 y su equivalente UNE 50104-94 para citar literatura convencional, y la norma ISO 690-2 especifica los elementos que hay que incluir en
las citas bibliogrficas de los documentos electrnicos.
* Los elementos sealados con un asterisco son opcionales.
** Los elementos sealados con dos asteriscos son obligatorios para los documentos en lnea.
LIBROS
APELLIDO(S), Nombre. Ttulo del libro. Mencin de responsabilidad secundaria (traductor; prologuista;
ilustrador; coordinador; etc.)*. N de edicin. Lugar de edicin: editorial, ao de edicin. N de pginas*.
Serie*. Notas*. ISBN
Ejemplo:
BOBBIO, Norberto. Autobiografa. Papuzzi, Alberto (ed. lit.); Peces-Barba, Gregorio (prol.); Benitez, Esther
(trad.). Madrid: Taurus, 1988. 299 p. ISBN: 84-306-0267-4 .
PARTES DE LIBROS
APELLIDO(S), Nombre. "Ttulo de la parte". En: Responsabilidad de la obra completa. Ttulo de la obra. Edicin.
Lugar de edicin: editorial, ao de edicin. Situacin de la parte en la obra.
Ejemplo:
SNAVELY, B.B. "Continuous-Wave Dye lasers I". En: SCHFER, F.P. (ed). Dye lasers. Berlin: Springer, 1990. p.
91-120.
ARTCULOS DE REVISTAS
APELLIDO(S), Nombre. "Ttulo del artculo". Responsabilidad secundaria. Ttulo de la publicacin seriada.
Edicin. Localizacin en el documento fuente: ao, nmero, pginas.
Ejemplo:
HARUTA S., Nakayama T., Nakamura K., Hemmi H., Ishii M., Igarashi Y., Nishino T. Microbial diversity in
biodegradation and reutilization processes of garbage. J. Biosci. Bioeng. 2005 99(1):1-11.
LEGISLACIN
Pas. Ttulo. Publicacin, fecha de publicacin, nmero, pginas.

79

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Ejemplo:
Mxico. Ley Orgnica del Instituto Politcnico Nacional. Diario Oficial de la Federacin. 29 de diciembre de
1981. 13p
NORMAS
ENTIDAD RESPONSABLE DE LA NORMA. Ttulo. N cdigo de la norma. Edicin. Lugar de publicacin:
editorial, ao de publicacin.
Ejemplo:
MXICO. SECRETARA DE SALUD. Norma Oficial Mexicana NOM-065-SSA1-1993, que establece las
especificaciones sanitarias de los medios de cultivo. Generalidades. NOM-065-SSA1-1993. Diario Oficial de la
Federacin. 27 de febrero de 1995.
CONGRESOS
APELLIDO(S), Nombre. Ttulo. Responsabilidades secundarias*. N de edicin. Lugar: editorial, ao de
publicacin. N de pginas o volmenes*. ISBN
Ejemplo:
Actas del I Congreso de Historia de la Lengua Espaola en Amrica y Espaa: noviembre de 1994-febrero de
1995. M. Teresa Echenique, Milagros Aleza y M. Jos Martnez (eds.).Valncia: Universitat, Departamento de
Filologa Espaola, 1995. 564 p. ISBN: 8480022698.
PONENCIAS DE CONGRESOS
APELLIDO(S), Nombre. "Ttulo de la parte". En: APELLIDO(S), Nombre. Ttulo de la obra completa.
Responsabilidades secundarias*. N de edicin. Lugar: editorial, ao de publicacin. Serie*. ISBN
Ejemplo:
CEREZO GALN, Pedro. "La antropologa del espritu en Juan de la Cruz". En: Actas del Congreso
Internacional Sanjuanista, (vila 23-28 de septiembre de 1991), v. III. [S.l.]: [s.n.], 1991. P. 128-154
TESIS NO PUBLICADAS
APELLIDO(S), Nombre. "Ttulo de la tesis". Direccin. Clase de tesis. [Tipo de documento]. Institucin
acadmica en la que se presenta, lugar, ao.
Ejemplo:
LASCURAIN SNCHEZ, Mara Luisa. "Anlisis de la actividad cientfica y del consumo de informacin de los
psiclogos espaoles del mbito universitario durante el perodo 1986-1995". Director: Elas Sanz Casado.
Universidad Carlos III de Madrid, Departamento de Biblioteconoma y Documentacin, 2001.
DOCUMENTOS ELECTRNICOS
TEXTOS ELECTRNICOS, BASES DE DATOS Y PROGRAMAS INFORMTICOS

80

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Responsable principal. Ttulo [tipo de soporte]. Responsables secundarios*. Edicin. Lugar de publicacin:
editor, fecha de publicacin, fecha de actualizacin o revisin, [fecha de consulta]**. Descripcin fsica*.
(Coleccin)*. Notas*. Disponibilidad y acceso**. Nmero normalizado*
Ejemplo (en norma ISO 690-2):
CARROLL, Lewis. Alice's Adventures in Wonderland [en lnea]. Texinfo ed. 2.1. [Dortmund, Alemania]:
WindSpiel, November 1994 [ref. de 10 de febrero de 1995]. Disponible en Web:
<http://www.germany.eu.net/books/carroll/alice.html>. Igualmente disponible en versiones PostScrip y ASCII
en Internet: <ftp://ftp.Germany.EU.net/pub/books/carroll/>
PARTES DE TEXTOS ELECTRNICOS, BASES DE DATOS Y PROGRAMAS INFORMTICOS
Responsable principal (del documento principal). Ttulo [tipo de soporte]. Responsable(s) secundario(s) (del
documento principal*). Edicin. Lugar de publicacin: editor, fecha de publicacin, fecha de actualizacin o
revisin [fecha de consulta]**. "Designacin del captulo o parte, Ttulo de la parte", numeracin y/o
localizacin de la parte dentro del documento principal*. Notas*. Disponibilidad y acceso**. Nmero
normalizado*
Ejemplos (en norma ISO 690-2):
CARROLL, Lewis. Alice's Adventures in Wonderland [en lnea]. Texinfo. ed. 2.2. [Dortmund, Alemania]:
WindSpiel, November 1994 [ref. de 30 marzo 1995]. Chapter VII. A Mad Tea-Party. Disponible en World Wide
Web: <http://www.germany.eu.net/books/carroll/alice_10.html#SEC13>.
CONTRIBUCIONES EN TEXTOS ELECTRNICOS, BASES DE DATOS Y PROGRAMAS INFORMTICOS
Responsable principal (de la contribucin). "Ttulo" [tipo de soporte]. En: Responsable principal (del documento
principal). Ttulo. Edicin. Lugar de publicacin: editor, fecha de publicacin, fecha de actualizacin o revisin
[fecha de consulta]**. Numeracin y/o localizacin de la contribucin dentro del documento fuente. Notas*.
Disponibilidad y acceso**. Nmero normalizado*
Ejemplos (en norma ISO 690-2):
MCCONNELL, WH. Constitutional History. The Canadian Encyclopedia [CD-ROM]. Macintosh version 1.1.
Toronto: McClelland & Stewart, c1993. ISBN 0-7710-1932-7.
PUBLICACIONES ELECTRNICAS SERIADAS COMPLETAS
Responsable principal. Ttulo [tipo de soporte]. Edicin. Designacin de los nmeros (fecha y/o nmero)*. Lugar
de publicacin: editor, fecha de publicacin [fecha de consulta]**. Descripcin fsica*. (Coleccin)*. Notas*.
Disponibilidad y acceso**. Nmero normalizado
Ejemplo (en norma ISO 690-2):
Journal of Technology Education [en lnea]. Blacksburg (Virginie): Virginia Polytechnic Institute and State
University,
1989[ref.
de
15
marzo
1995].
Semestral.
Disponible
en
Internet:
<gopher://borg.lib.vt.edu:70/1/jte>. ISSN 1045-1064.
ARTCULOS Y CONTRIBUCIONES EN PUBLICACIONES ELECTRNICAS SERIADAS
Responsable principal (del artculo). "Ttulo (del artculo)". Ttulo (de la publicacin principal) [tipo de soporte].
Edicin. Designacin del nmero de la parte. Fecha de actualizacin o revisin [fecha de consulta]**.
Localizacin de la parte dentro del documento principal. Notas*. Disponibilidad y acceso**. Nmero
normalizado
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Ejemplo (en norma ISO 690-2):
STONE, Nan. The Globalization of Europe. Harvard Business Review [en lnea]. May-June 1989 [ref. de 3
septembre 1990]. Disponible en BRS Information Technologies, McLean (Virginie).
BOLETINES DE NOTICIAS, LISTAS DE DISCUSIN
Ttulo [tipo de soporte]. Responsable(s) secundario(s). Lugar de publicacin: editor, fecha de publicacin [Fecha
de consulta]**. Notas*. Disponibilidad y acceso**
Ejemplo (en norma ISO 690-2):
PACS-L (Public Access Computer Systems Forum) [en lnea]. Houston (Tex.): University of Houston Libraries,
Junio 1989- [ref. de 17 mayo 1995]. Disponible en Internet: <listserv@uhupvm1.uh.edu>.

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APENDICE C
Preparacin de Reactivos
Nota: Elaborar las cantidades necesarias de reactantes en base al nmero de equipos de trabajo total por 1.5.
PRCTICA 1. SEGURIDAD EN EL LABORATORIO
No se emplean soluciones o reactivos preparados
PRCTICA 2. DETERMINACIN ESPECTROFOTOMTRICA DE BIOMOLCULAS.
1.1 Reactivo BCP Stock 40 mM
0.54 g de Prpura de bromocresol grado reactivo en 15 mL de etanol absoluto. Disolver y aforar a 25 mL
Almacenar en frasco mbar. El reactivo es estable 3 meses en la obscuridad y en refrigeracin.
1.2 Stock de cido actico
150 mL de cido actico glacial en un L de agua destilada.
1.3 Reactivo de trabajo de BCP 40 M
10 g de acetato de sodio 3H 2O en 800 mL de agua, disolver Adicionar 10 mL de la sol. Stock de cido
actico y 1 mL de la solucin stock de BCP. Ajustar el pH a 5.2 (con actico o con NaOH). Aforar a 1 L con
agua destilada. El reactivo debe ser de color amarillo verdoso. Esta solucin de trabajo es estable una
semana en obscuridad y refrigeracin.
1.4 Soluciones de Albmina Humana
200 mg/mL. Pesar 100 mg de albmina humana y disolver en 0.5 mL de ssf, con agitacin muy suave para
evitar la formacin de espuma. Puede usarse ssf ligeramente caliente (50-60C) para facilitar la disolucin.
160 mg/mL: Tomar 0.5 mL de solucin de albmina humana de 200 mg/mL y adicionar 0.125 mL de ssf.
Disolver agitando suavemente para evitar la formacin de espuma.
100 mg/mL: Tomar 0.5 mL de solucin de albmina humana de 200 mg/mL y adicionar 0.5 mL de ssf.
Disolver agitando suavemente para evitar la formacin de espuma.
60 mg/mL: Pesar 60 mg de albmina humana y disolver en 1 mL de ssf ligeramente caliente (50-60C)
agitando muy suavemente para evitar la formacin de espuma.
40 mg/mL: Tomar 0.5 mL de solucin de albmina humana de 60 mg/mL y adicionar 0.25 mL de ssf.
Disolver agitando suavemente para evitar la formacin de espuma.
20 mg/mL: Tomar 0.25 mL de solucin de albmina humana de 40 mg/mL y adicionar 0.25 mL de ssf.
Disolver agitando suavemente para evitar la formacin de espuma.
10 mg/mL: Tomar 0.25 mL de solucin de albmina humana de 20 mg/mL y adicionar 0.25 mL de ssf.
Disolver agitando suavemente para evitar la formacin de espuma.
6 mg/mL: Tomar 0.1 mL de solucin de albmina humana de 60 mg/mL y adicionar 0.9 mL de ssf. Disolver
agitando suavemente para evitar la formacin de espuma.
4 mg/mL: Tomar 0.1 mL de solucin de albmina humana de 40 mg/mL y adicionar 0.9 mL de ssf. Disolver
agitando suavemente para evitar la formacin de espuma.
NOTA: Guardar el sobrante de albmina de sta prctica para emplearlo en la siguiente (Electroforesis)
1.5 1 mg/mL en solucin salina fisiolgica.
Solucin salina fisiolgica (ssf)
0.85 g de NaCl en 100 mL de agua destilada
1.6 Colgeno (gelatina) 60 mg/mL en ssf.
60 mg de gelatina disolverlos en 1 mL de ssf..
1.7 Glicina 60 mg/mL en ssf.
60 mg de glicina disolverlos en 1 mL de ssf.
1.8 Solucin de albmina humana 60 mg/mL emulsionada con aceite de oliva.
Mezclar 1 mL de la solucin de albmina de 60 mg/ mL adicionarle 1 mL de aceite de oliva. Mezclar en
vortex 15 segundos antes de usarse.
1.9 Solucin de albmina humana 60 mg/mL con detergente comercial 60 mg/mL (1:1 albmina: detergente).
Mezclar 1 mL de solucin de albmina con 1 mL de la solucin de detergente comercial de 60 mg/mL y
mezclar sin hacer espuma.
1.10 Solucin de albmina humana 60 mg/mL con hemoglobina.
A 1 mL de sangre obtenida con anticoagulante, agregar un 1 mL de agua destilada, para lisar los eritrocitos.
A esta solucin adicionar 1 mL de la solucin de albmina de 60 mg/mL.

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PRCTICA 3. ELECTROFORESIS DE SUERO
3.1 Amortiguador 4X a pH 8.8 (Tris HCl 1.5 M)
Pesar 18.16g de de Tris-base, agregar 80 mL de agua bidestilada y ajustar el pH a 8.8 con HCl
concentrado (aproximadamente 1 mL) aforar a 100 mL con agua bidestilada.
3.2 Amortiguador 4X a pH 6.8 (Tris HCl 0.5 M)
Pesar 0.075g de Tris- base, 3.85 g de Tris-HCl y disolverlo en 50 mL de agua bidestilada.
3.3 Acrilamida Bisacrilamida 29:1 %
Pesar 29g de acrilamida y 1 g de bisacrilamida, disolver en 100 mL de agua destilada.
3.4 Persulfato de amonio 10 %
Pesar 100 mg de persulfato de amonio y disolverlo en 1 mL de agua bidestilada. Prepararlo siempre
fresco a la hora de preparar el gel.
3.5 Amortiguador de Laemmli 2x
Componentes
Tris- HCl 1M pH 6.8
Glicerol
SDS 10 %
Azul de bromofenol
(1%)
Ditiotritol 1M
EDTA 0.5 M
Agua bidestilada

Volumen (mL)

Concentracin final

1.2
2
2

120 mM
20 %
2%

0.2

0.02%

2
0.04
2.56

0.2 M
2mM
-

3.6 Fibringeno srico


Pesar 1 mg de fibringeno y disolverlo en 1 mL de regulador de fosfatos (PBS) 10 mM, pH 7.5
Nota: En el gel no cargar ms de 100 g totales de fibringeno
3.7 Albmina humana 1 mg/ mL
Usar la albmina de concentracin 4 mg/mL de la prctica anterior. Diluir 1:4 ssf
3.8 Solucin de azul de Coomasie para teir
Solucin madre: Pesar 2 g de azul de Coomasie R-250 y disolverlo en 200 mL de agua bidestilada
caliente. Filtrar con papel Wathman No.1 y conservar en frasco mbar a temperatura ambiente.
Solucin de trabajo: Agregar 31.3 mL de la solucin madre de azul de Coomasie, 125 mL de metanol,
25 mL de cido actico glacial y 68.7 mL de agua bidestilada. Mezclar bien, llevar a un volumen final de
250 mL, filtrar con papel Wathman No.1 y conservar en frasco mbar a temperatura ambiente.
3.9 Solucin desteidora
Mezclar 500 mL de metanol, 100 mL de cido actico glacial y 400 mL de agua bidestilada.
3.10 Buffer de corrimiento 1x
Concentracin
Pesar (g)
Componentes
final
Tris- base
3
25 mM
Glicina
14.4
192mM
SDS
1
0.1%
Aforar a 1 L con agua bidestilada, cuidando no hacer espuma
3.11 Solucin Buffer de fosfatos salina de pH 7.4 (PBS)
PBS puede prepararse como solucin 1X o 10X, para preparar 1L disuelve en 800 mL de agua destilada
los reactivos como se muestran en la siguiente tabla:
Cantidad
Concentracin
Cantidad
Concentracin
Reactivo
(para 1X)
Final (1X)
(para 10X)
Final (10X)
NaCl
8g
137 mM
80 g
1.37 M
KCl
0.2 g
2.7 mM
2g
27 mM
Na2HPO4
1.44 g
10 mM
14.4 g
100 mM
KH2PO4
0.24 g
1.8 mM
2.4 g
18 mM
Ajustar el pH a 7.4 (o 7.2 si es requerido) con HCl, y aforar a 1L con agua bidestilada. Se recomienda
alicotar y esterilizar en autoclavbe por 20 minutos a 15lb o por filtracin. Almacenar a temperatura
ambiente.

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PRCTICA 4. USO DE ENZIMAS EN EL DIAGNSTICO CLNICO: PERFIL HEPTICO Y PERFIL CARDIACO.

No se requiere de preparar soluciones y reactivos ya que se emplean kits de diagnstico.

PRCTICA 5. CURVA DE CALIBRACIN PARA LA DETERMINACIN DE GLUCOSA EN SUERO HUMANO

1.

Solucin patrn de glucosa de 100 mg/ mL


Emplear la solucin del kit de determinacin de glucosa

2.

Estndares de referencia de glucosa


150 mg/dL: Pesar 150 mg de glucosa grado reactivo y disolver en 50 mL de agua destilada. Aforar a 100
mL con agua destilada.
120 mg/dL: Tomar 50 mL de la solucin de glucosa de 150 mg/dL y adicionar 12.5 mL de agua
destilada.
90 mg/dL: Pesar 90 mg de glucosa grado reactivo y disolver en 50 mL de agua destilada. Aforar a 100
mL con agua destilada.
60 mg/dL: Tomar 50 mL de la solucin de glucosa de 120 mg/dL y aforar 50 mL de agua destilada.
30 mg/dL: Tomar 50 mL de la solucin de glucosa de 60 mg/dL y aforar 50 mL de agua destilada.
PRCTICA 6. OBTENCIN DE VALORES DE REFERENCIA DE TRIGLICRIDOS Y COLESTEROL EN
SUERO HUMANO.

No se requiere de preparar soluciones y reactivos ya que se emplean kits de diagnstico.

PRCTICA 7. DETERMINACIN DE UREA, CREATININA Y CIDO RICO.

No se requiere de preparar soluciones y reactivos ya que se emplean kits de diagnstico.

PRCTICA 8. DETERMINACIN DE HORMONA GONADOTROPINA CORINICA

Solucin salina fisiolgica: ver prctica 2

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PRCTICA 9. POTENCIOMETRA

1. Solucin calibradora de pH 4.0 y solucin calibradora de pH 7.0: Se emplean lsa comerciales.


2. NaOH 0.01N. Pesar 0.4 g de NaOh grado reactivo y disolver en 500 mL de agua destilada. Aforar a
1 L con agua destilada.
3. HCl 0.001 N. Medir 0.83 mL de HCl (37% pureza, grado reactivo) y disolver en 500 mL de agua
destilada. Aforar a 1 L con agua destilada.
4. Regulador de fosfatos 0.0025 N, pH 7.35:
5. Pesar 0.355 g de Na 2HPO4 y aforar 1 L con agua destilada. Pesar 0.3 g de NaH 2PO4 y aforar a 1 L
con agua destilada. Colocar el dibsico (Na2HPO4) en un vaso de precipitados de 2 L, y determinar
el pH con el electrodo del potencimetro (debe ser de 8.9-9.2). Ah mismo adicionar lentamente y
con agitacin el monobsico hasta obtener el pH deseado.
6. SSF: ver prctica 2

86