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2007
4. Coletar 1 colnia e transferir para a pequena gota de gua na lmina. Espalhar bem
com movimentos suaves evitando a quebra dos agrupamentos bacterianos;
5) Secar a temperatura ambiente;
6) Aps o esfregao ficar completamente seco, com auxilio da pina de madeira, fix-lo
na chama do bico de Bunsen, passando a lmina 2 a 3 vezes pela chama; aguardar at o
resfriamento da lmina
7) Realizar a colorao.
B - TCNICA DE COLORAO:
1. Cobrir o esfregao com soluo Violeta de Genciana por 1 minuto.
OBS.:ATENO PARA NO COLOCAR A LMINA INVERTIDA!!!!!!!!
E. coli
Bacillus sp
Staphylococcus sp
Streptococcus sp
3 tubos de ensaio contendo culturas bacterianas de: Escherichia coli K12 (linhagem J53 e
linhagem BB) e Salmonella dublin.
2. Trs tubos de ensaio com meios de cultura: (a) meio mnimo sem adio de leucina; (b) meio
mnimo com adio de leucina; (c) meio rico feito com extrato de levedura.
3. Placa com gar MacConkey acrescida de lactose.
4. Alas para inoculao.
IV) Procedimento
1.Flambar a ala de platina e efetuar a coleta de uma amostra ( uma alada) para cada um dos
tubos com meios diferenciais. Repetir o procedimento com as outras 2 bactrias.
2.Dividir a placa com Meio McConkey em 3 e semear por esgotamento , uma bactria em cada
um das 3 reas marcadas da placa.
3.Incubar os tubos e as placas em estufa bacteriolgica a 37C por 24 horas.
4.Avaliar o crescimento das bactrias.
V) Resultados
1. Anotar o crescimento de cada uma das bactria fornecidas nos trs meios de cultura lquidos.
2. Verificar a colorao das colnias cultivadas nas placas de gar MacConkey.
2. Semear as culturas de K12 e MG031 nos espaos destinados em meio slido Mac
Conkey contendo os diversos antibiticos (conforme indicado abaixo);
K12
MG
K12
Mist. Conj.
Meios: MC
MG
K12
MG
Mist. Conj.
Mist. Conj.
MC+Tc
MC+Nal
K12
MG
Mist. Conj .
MC+Tc+Nal
Meio seletivo
( K12)
( mist.conj.)
Prtica 4 - Antibiograma.
I) Introduo / Objetivo
O antibiograma um teste que permite a verificao in vitro da sensibilidade de uma bactria
aos antibiticos. Esta sensibilidade demonstrada pela zona ou halo de inibio de crescimento
que se forma em volta do disco de antibitico. De acordo com o tamanho do halo de inibio dizse que a bactria sensvel, pouco sensvel ou resistente (quando no h formao do halo).
II) Procedimento
1. Depositar 0,1 ml da cultura no centro da placa de Petri (E. coli ou S. aureus)
2. Espalhar uniformemente com ala de Drigalski ou zaragatoa.
3. Deixar secar a superfcie.
4. Colocar os discos de antibiticos usando a pina.
5. Incubar a 37oC durante 24 horas.
6. Ler e registrar os resultados (verificar se h ou no halo de inibio de crescimento em torno
de cada disco).
Sigla
AMP
AMP
CFL
CFO
CTX
ERI
GEN
SUT
TOB
VAN
resistente
28 ou 13 ou 14 ou 14 ou 14 ou 13 ou 12 ou 10 ou 12 ou 9 ou -
Intermedirio
14 a 16
15 a 17
15 a 17
15 a 22
14 a 22
13 a 14
11 a 15
13 a 14
10 a 11
Sensvel
29 ou +
17 ou +
18 ou +
18 ou +
23 ou +
23 ou +
15 ou +
16 ou+
15 ou +
12 ou +
E.coli
S.aureus
V) Resultados
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No gnero Bacillus, encontramos vrias bactrias que tm como habitat o solo, o ar e a gua.
Entre os patognicos para os animais e para o homem se destaca o B. anthracis causador no gado
do carbnculo hemtico e, no homem do antrax, ou anthrax (antraz no a denominao
correta). A importncia deste agente aumentou consideravelmente nos dias atuais, devido s
ameaas do bioterrorismo. Outra bactria do gnero que pode causar intoxicaes alimentares no
homem o B. cereus. A maioria dos bacilos cresce rapidamente em meios simples formando
colnias grandes em meio slido. Geralmente, quando se observam as bactrias coradas pelo
mtodo de Gram, possvel visualizar-se estruturas intracelulares arredondadas que no se coram
correspondentes aos esporos.
II) Material
Em cada laboratrio sero colocados dois grupos de materiais constitudos por:
1. Uma jarra do tipo Gaspak para demonstrao de como se proceder para cultivos de bactrias
anaerbias. Acompanham dois envelopes de ANAEROGEN.
2. Placas de TSA (Tryptic Soy Agar) semeadas com Bacillus subtilis.
3. Dois grupos de 3 tubos contendo meio de tioglicolato.
4. Culturas de Escherichia coli (anaerbio facultativo), Pseudomonas aeruginosa (aerbio
estrito) e Clostridium perfringens.
III) Procedimento
1. Demonstrao de como se incuba para anerobiose com jarra Gaspak;
2. Fazer esfregaos das culturas de B. subtilis semeada no meio TSA e realizar a colorao de
Gram, procurando verificar se existem esporos (zonas no coradas dentro do corpo bacteriano);
3. Semear como indicado pelo professor os meios de tioglicolato, com cada uma das 3 bactrias
(Cl. perfringens, P. aeruginosa e E. coli).
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--------------------------
--------------------------------
coagulase/DNase
hemlise
S. faecalis
novobiocina
--------------
bacitracinaS
S. pyogenes
S
S. epidermidis
optoquinaS
S. pneumoniae
R
S. saprophyticus
II) Procedimento
1. Realizar a colorao de Gram das culturas;
2. Realizar a prova da catalase em lminas de todas as culturas;
3.
4.
5.
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c) UREASE
Prova positiva: base azul.
Prova negativa: base amarela ou inalterada.
d) TRIPTOFANO DESAMINASE
Prova positiva: superfcie verde escuro.
Prova negativa: superfcie azulada, amarela ou inalterada.
3. Meio de MILi (Motilidade, Indol e Lisina-descarboxilase): os testes de Motilidade e LLisina descarboxilase so verificados na base e o teste do Indol feito, adicionando-se
algumas gotas do reativo de Kovacs (dietilaminobenzaldedo) na superfcie do meio,
retirando-se o tampo de algodo.
a) MOTILIDADE
Prova positiva: meio turvo.
Prova negativa: meio lmpido ou crescimento s no local do inculo.
b) INDOL
Prova positiva: colorao vermelha.
Prova negativa: colorao amarela.
c) L-LISINA
Prova positiva: colorao roxa.
Prova negativa: colorao amarela.
2. gar CITRATO DE SIMMONS
Prova positiva: colorao azul
Prova negativa: colorao do meio inalterada
Observe que quando no ocorre utilizao do citrato, na prova negativa, no temos crescimento
bacteriano.
TABELA PARA IDENTIFICAO BIOQUMICA DAS ENTEROBACTRIAS
EPM
Bactrias
Escherichia coli
Klebsiella pneumoniae
Enterobacter cloacae
Citrobacter freundii
Arizona
Shigella sp
Edwardsiella tarda
Salmonella sp
Serratia marcescens
Proteus mirabilis
Providencia rettgeri
Yersinia enterocolitica
Lactose
+
+
+
- /+
+
-
Glicose
com
produo
de gs
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
-
H2S
- /+
+
- /+
+
-/+
-
CITRATO
MILI
Urease
L-TD
+
- /+
- /+
- /+
+
+
+
+
-
Motili- Indol
dade
- /+
+
+
+
+
+
+
+
+
- /+
+
-/+
- /+
+
- /+
+
-/+
Lisina
Citrato
Descarbo
-xilase
+
+
- /+
+
+
+
+
-
+
+
+
+
+
+
- /+
+
- /+
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EPM
Glicose
Bactria
Fermenta
glicose
produo de
cido vira
indicador para
amarelo
formiase
Bactria
Fermenta
glicose
produo de
cido frmico
enzima
formiase
desdobra c.
Frmico em
CO2 e H2 bolhas
Urease
Tiossulfat
o-redutase
Bactria produz
tiossulfato
redutase age
no tiossulfato
de Na produz
H2S. H2S reage
com Fe do
Citrato de Fe
amoniacal
sulfeto de Fe
(precipitado
negro)
Bactria produz
urease - age
sobre a uria
formando CO2
e NH3. NH3
dissolve-se sob
forma de
carbonato de
amnia
alcaliniza o
meio - azul
L-triptofanodesaminase
Bactria produz
LTD que provoca
desaminao de
a.a., convertendoos em -cetocidos. No caso do
L-triptofano, formase cido indol
pirvico reage
com sais de Fe
origina composto
cclico de cor verde
escura
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Motilidade
Motilidade amostras
mveis se difundem
partir do inculo inicial
turvando o meio.
Amostras imveis
somente crescem no
local onde foram
semeadas
Lisina
descarboxila
se
Descarboxilases
promovem remoo
de CO2 dos a.a.
produz amina
alcalinizando o meio
cor prpura
Se a.a. no utilizado,
atravs da
fermentao da
glicose, acidifica-se o
meio amarelo nos
2/3 inferiores
Triptofanas
e
Citrato de
Simmons
Amostras que utilizam citrato
como nica fonte de C tambm
utilizam sal de amnia como
nica fonte de Ni libera o Na.
Na junta-se com H2O e forma
NaOH alcaliniza o meio, que
vira indicador azul de bromotimol
para azul
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IV) Resultados
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