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Tcnicas laboratoriais

Pesquisa de helmintos

Tcnicas Laboratoriais
Pesquisa de Helmintos
Pesquisa de Protozorios

Disciplina: Parasitologia Clnica


Profa Msc.Meire Cristina Alves de Castro Pauleto
Prof Meire Cristina Alves de Castro Pauleto
Diagramao: Elsa Minami Kume
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Tcnicas laboratoriais
Pesquisa de helmintos

Diagramao: Elsa Minami Kume


2009 - 2014

ndice
AULA PRTICA 1 Mtodo de Hoffman, Pons e Janer ou HPJ.............................2
AULA PRTICA 2 Mtodo de Willis...................................................................2
AULA PRTICA 3 Mtodo de anal swab............................................................3
AULA PRTICA 4 Mtodo de Baerman..............................................................4
AULA PRTICA 5 Mtodo de Rugai...................................................................5
AULA PRTICA 6 Mtodo de Tamisao...........................................................5
AULA PRTICA 7 Mtodo de Kato Katz.............................................................6
AULA PRTICA 8 Mtodo de
Stoll.....................................................................7
AULA PRTICA 9 Mtodo de Faust...................................................................9
AULA PRTICA 10 Mtodo de Ritchie...............................................................9
AULA PRTICA 11 Mtodo de Hematoxilina Frrica.......................................10
COLORAO ACID-FAST................................................................................12
COLORAO DE KINYOUN................................................................................13
COLORAO DE SAFRANINA.............................................................................14
COLORAO DE TRICRMIO.............................................................................15
COLORAO DE GRAM CHROMOTROPE.............................................................17
COLORAO DE LEISHMAN..............................................................................19

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EXAME MICROSCPICO DO EXAME COPROLGICO..........................................21


PESQUISAS DE HELMINTOS NAS FEZES
PESQUISAS DE OVOS NAS FEZES
AULA PRTICA 1 Mtodo de Hoffman, Pons e Janer ou HPJ (ou mtodo de
sedimentao espontnea), para pesquisa de ovos pesados de helmintos.
Utilizao: inquritos epidemiolgicos, principalmente em reas esquistossomticas.
Tcnica:
1) Tomar 2 a 4 gramas de fezes, coloc-los em frasco Borrel e desmanch-los em
gua com auxlio de um basto de vidro ou plstico;
2) Coar a emulso atravs de gaze dobrada em 4 ou uma tela de plstico ou metal
limpa, para dentro de um clice de sedimentao cnico;
3) Completar o volume do clice juntando mais gua e misturando bem o contedo;
4) Deixar sedimentar por 2 horas;
5) Com uma pipeta Pasteur, retirar pequena amostra de sedimento do vrtice do
clice, coloc-la sobre uma lmina e cobrir com lamnula. No necessrio corar
os ovos, mas se houver interesse em reconhecer tambm os cistos de
protozorios, juntar um pouco de lugol.
6) Para identificao dos ovos, usar quadro 1 (em anexo).

AULA PRTICA 2 Mtodo de Willis (ou flutuao).


Utilizao: ovos leves de helmintos, devido baixa densidade, flutuam quando se
encontram em uma soluo saturada de cloreto de sdio. Este o melhor mtodo para
demonstrao de ovos de Ancylostoma sp, sendo pouco eficiente para Schistosoma
mansoni, Fasciola hepatica e ovos infrteis de Ascaris lumbricoides, que possuem
densidade relativamente alta.
Tcnica:
1) Dissolver sal de cozinha (NaCl) em gua quente at que esta fique saturada
(densidade deve chegar a 1.200);
2) Estando a amostra fecal em um recipiente de boca larga (frasco Borrel de 3cm de
dimetro), desfaz-la com a soluo saturada de sal, na proporo de um (1) para
10 ou 20 volumes;

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3) Completar depois o volume para que a superfcie lquida chegue at a borda do


recipiente;
4) Colocar uma lmina sobre a boca do recipiente de modo que sua face inferior seja
banhada pelo lquido;
5) Esperar uns trs minutos (ou mais), suspender a lmina bruscamente e invert-la,
cuidando para no derramar a pelcula lquida que ficou aderida e onde esto
concentrados os ovos e cistos;
6) Corar com lugol, para melhor visualizao dos cistos, cobrir com lamnula e
examinar ao microscpio com aumento mdio.

AULA PRTICA 3 Mtodo de anal swab


Utilizao: consiste em aplicar sobre a pele da regio perianal uma fita adesiva
transparente para pesquisa de ovos de Enterobius vermicularis. Os ovos quando
presentes, aderem superfcie gomada da fita.
Tcnica:
Para a comodidade de manuseio, uma poro de fita adesiva (medindo aproximadamente
2 X 6 cm) emendada por suas extremidades a duas tiras de papel e colada lmina de
vidro. No momento de usar ela destacada da lmina, puxando-se pelas tiras de papel;
dobrada sobre uma esptula com a parte gomada para fora e aplicada contra o nus. As
ndegas, que deviam estar bem separadas so, agora, aproximadas de encontro fita
adesiva para assegurar perfeito contato desta coma pele; colar novamente a fita adesiva
na lmina de vidro e levar o conjunto ao microscpio.

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Pesquisa de helmintos

PESQUISA DE LARVAS DE HELMINTOS NAS FEZES


AULA PRTICA 4 Mtodo de Baerman.
Utilizao: baseia-se no hidrotropismo + e termotropismo das larvas e na tendncia
destas a sedimentar, quando se encontram na gua.
Tcnica:
O equipamento necessrio consiste em um funil de vidro com aproximadamente 10 cm
de dimetro, a cujo extremo inferior prende-se um tubo de borracha curto fechado por
uma pina de presso, e de um suporte para manter o funil em posio adequada sobre
a mesa.
No interior do funil, colocar a peneira metlica, com cerca de 7 cm de dimetro, e
forr-la com gaze.

Isolamento de larvas de Strongyloides stercoralis e Ancylostoma sp

1) Depositar cerca de 10 gramas de amostra fecal sobre a gaze, espalhando tanto


quanto possvel;
2) Colocar no funil gua aquecida a 45C, at que sua superfcie entre em contato
com as fezes;
3) Depois de uma hora, abrir a pina de presso e deixar escorrer para um vidro
relgio 3 a 5 ml de lquido;
4) Examinar com pequeno aumento ao microscpio ou lupa estereoscpica larvas
vivas. Os detalhes estruturais tornam-se mais evidentes aps a colorao feita
com uma gota de lugol.

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AULA PRTICA 5 Mtodo de Rugai.


Utilizao: consiste na simplificao da tcnica precedente, que se torna mais prtica
quando as fezes vm para o laboratrio acondicionadas em recipientes rasos, fornecidos
aos pacientes pelo prprio laboratrio.
Tcnica:
1) Envolver o recipiente, sem tampa, em gaze dobrada em duas e coloc-la com a
abertura voltada para baixo em um clice de sedimentao;

2) Encher o clice com gua aquecida a 45C, at que o nvel da gua alcance a
massa fecal contida no recipiente emborcado;
3) Uma hora depois, pipetar o sedimento que se acumulou no vrtice do clice de
sedimentao, colocar em uma lmina ou em vidro relgio e examinar ao
microscpio ou lupa.
4) Usar o quadro 63.2 (em anexo) para identificao das larvas.

AULA PRTICA 6 Mtodo de Tamisao


Utilizao: tcnica para pesquisa de proglotes e vermes adultos de helmintos.
Tcnica:
O bolo fecal deve ser desmanchado em gua e depois passado em peneira de malhas
finas para reter as proglotes.
Para o diagnstico de espcie, as proglotes grvidas sero comprimidas fortemente entre
duas lminas grossas de vidro e o conjunto submerso em cido actico, para clarear.
Depois de dissolvidas as concrees calcrias do parnquima, a conformao do tero e
de suas ramificaes tornam-se aparentes e permitem a distino.

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AULA PRTICA 7 Mtodo de Kato Katz (ou quantitativo de Kato).


Utilizao: tomar uma quantidade de fezes (por exemplo, 50 mg pesados ou estimados
pelo volume) e conta-se a quantidade de ovos existentes na lmina. A partir da, se
calcula o nmero de ovos por grama de fezes que o paciente est eliminando e,
indiretamente, pode-se fazer idia da carga de helmintos presente no intestino.
Tcnica:
A maneira mais simples de chegar a esse objetivo tomar um volume constante e
conhecido de matria fecal e:
1) Colocar sobre a lmina uma placa perfurada (molde de plstico ou de outro material,
tendo no centro um orifcio cujo volume conhecido);
2) Com o aplicador, preencher o volume do orifcio com as fezes raspadas sobre a tela de
nilon, eliminando em seguida todo o excesso;
3) Retirar o molde, deixando sobre a lmina um pequeno cilindro de matria fecal, de
volume definido. Tambm se pode saber o peso exato desta amostra, levando-se a
lmina balana, antes e depois de colocar nela o material, e calcular o peso deste por
diferena.
4) Cobrir com a lamnula de celofane embebida em glicerina e comprimi-la para que o
material se espalhe bem;
5) Contar a totalidade de ovos de cada espcie que encontrar na lmina, separadamente.
6) Multiplicar o nmero obtido para cada espcie por um fator constante que depende do
orifcio do molde. O kit Kato-Katz comercializado no Brasil, cujo molde fornece um
volume de fezes correspondente a 41,7 miligramas, deve-se multiplicar o resultado da
contagem por 24 para se ter o nmero de ovos.
OBS: ovos de Ascaris lumbricoides e Trichuris trichiura conservam-se por
semanas ou meses;
ovos de Ancylostoma sp difceis de ver aps uma hora do preparo da lmina;
Schistosoma mansoni melhores ao fim de 24 horas;
Strongyloides stercoralis no so visveis por esta tcnica.

* fezes muito duras (pacientes constipados) adicionar-lhes mistura glicerinada algum


tempo antes de preparar a lmina, e comprimir fortemente o material depois de colocada
a lamnula.

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AULA PRTICA 8 Mtodo de Stoll.


Utilizao: tcnica normalmente usada para contagem de ovos.
Tcnica:
Para medir uma quantidade fixa de matria fecal e dilu-la numa razo conhecida, utilizase um frasco do tipo Erlenmeyer que traz duas marcas no gargalo (frasco de Stoll): uma
indicando volume de 56 mL e outra o de 60 mL. Pode-se usar uma proveta graduada de
100 mL com rolha em lugar do fresco de Stoll, e tomar como referncias as marcas de 70
e 75 mL.

1) preencher o frasco com soda 0,10N at a marca inferior (56 mL);


2) colocar as fezes at que o contedo do frasco alcance a marca superior (60 mL);
3) introduzir no frasco de Stoll uma dezena de prolas de vidro, arrolhar bem e
agitar vagarosamente;
4) deixar agir a soda durante uma hora ou mais, para clarificar a preparao e tornar
a agitar fortemente. Obtm-se deste modo uma suspenso homognea, onde a
diluio da amostra fecal de 1 para 15;
5) Aps a agitao, pipetar 0,15 mL da suspenso, coloc-la sobre uma lmina,
cobri-la com lamnula (22 X 40mm) e levar ao microscpio para contagem;

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6) Percorrer toda a rea da lmina, contando o nmero de ovos de determinada


espcie a existente.

Contagem da lmina:

a) com aumento pequeno ou mdio, focalizar um dos ngulos da lamnula (anterior


esquerdo, por exemplo);
b) deslocar a preparao sempre no mesmo sentido, procedendo contagem at
alcanar o canto oposto (anterior direito);
c) deslocar a preparao para frente, de tal modo que o novo campo microscpico
seja tangente anterior (ou que as partculas que apreciam no extremo inferior
do campo passem a ser vistas no extremo superior);
d) deslocar a lmina em direo margem esquerda e assim sucessivamente.

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Pesquisa de protozorios

PESQUISA DE PROTOZORIOS NAS FEZES


PESQUISAS DE CISTOS
AULA PRTICA 9 Mtodo de Faust (ou centrfugo-flutuao no sulfato de zinco).
Utilizao: tcnica utilizada para pesquisa de cistos.
Tcnica:
Preparar uma soluo de sulfato de zinco 33%, cuja densidade igual a 1,180.
1) Desmanchar a amostra fecal em gua, na proporo de 1 para 10 partes,
aproximadamente, utilizando-se gua filtrada para evitar a contaminao com
protozorios de vida livre;
2) Filtrar e atravs da gaze dobrada em quatro, para um tubo de centrfuga e
centrifugar a 2,500 rotaes por minuto, durante um minuto;
3) Decantar o sobrenadante, ressuspender o sedimento em gua e centrifugar
novamente. Repetir esta operao at que o lquido sobrenadante fique
relativamente claro. Em geral, bastam trs lavagens;
4) Decantar a gua da ltima lavagem e ressuspender o sedimento na soluo de
sulfato de zinco. Centrifugar. Nesta operao, dada a densidade do meio, os cistos
de protozorios e algumas espcies de ovos de helmintos passam a flutuar e
concentram-se numa pelcula fina, situada na superfcie do lquido sobrenadante;
5) Com uma ala de platina, cujo aro estar disposto perpendicularmente ao cabo,
tocar levemente a superfcie do lquido para que a pelcula, aderindo a ala, possa
ser removida e transportada para uma lmina. Repetir este procedimento quatro
ou cinco vezes;
6) Adicionar preparao uma gota de lugol a fim de tornar os cistos e suas
estruturas internas mais visveis, cobrir com lamnula e examinar ao microscpio
(aumento mdio ou grande a seco).
AULA PRTICA 10 Mtodo de Ritchie (ou concentrao com formol-ter).
Utilizao: tcnica utilizada para pesquisa de trofozoitas e cistos.
Tcnica:
1) Desmanchar previamente a amostra fecal em gua filtrada na proporo de 1 para
10 partes (ou tomar 5 mL de mistura de fezes com o conservador MIF);
2) Filtrar em gaze, para um tubo de centrfuga de 15 mL, e centrifugar a 2,500 rpm;
3) Decantar o sobrenadante, tomar o sedimento e adicionar 10 mL da soluo de
formol a 10% (ou soluo fisiolgica, se o material j estava fixado), deixando em
repouso por 5 minutos para a fixao;

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Pesquisa de protozorios

4) Juntar 3 mL de ter sulfrico (comercial), tampar o tubo e misturar, agitando


fortemente;
5) Centrifugar a 1,500 rpm, durante 1 ou 2 minutos;
OBS: ao fim da operao, o tubo estar com 4 camadas: a primeira com ter, a segunda
com detritos slidos, a terceira aquosa e a quarta constituda de sedimento biolgico
(cistos e ovos de parasito). Descartar as camadas superiores, tomar os sedimento e
examin-lo ao microscpio com aumento mdio ou grande.

AULA PRTICA 11 Mtodo de Hematoxilina Frrica.


Tcnica: para a conservao das caractersticas morfolgicas dos trofozotos de e
cistos de protozorios, a fixao do material deve ser feita dentro de curto prazo aps a
evacuao (colher material no laboratrio ou entregar ao paciente frasco contendo o
fixador, e pedir-lhe que misture o lquido s fezes).
Fixador de Schaudinn - permite conservar o material durante semanas ou meses:
Bicloreto de mercrio em soluo saturada ----------------- 200 mL
lcool absoluto ------------------------------------------------- 100 mL
cido actico glacial -------------------------------------------

15 mL

Adicionar o cido soluo-estoque pouco antes de usar. Por ser uma soluo txica,
pode-se substituir pelo fixador de Junod (soluo aceto-formulado):
Acetato de sdio -----------------------------------------------

1,5 g

Formol (comercial) --------------------------------------------

4,0 mL

cido actico ---------------------------------------------------

2,0 mL

gua destilada -------------------------------------------------- 92,5 mL


Soluo de hematoxilina prepar-la dissolvendo a quente os cristais em lcool e
juntando gua aquecida:
Hematoxilina --------------------------------------------------

1g

lcool 95% ----------------------------------------------------

20 mL

gua destilada ------------------------------------------------- 180 mL


Deixar esfriar e filtrar. No us-la antes de decorrido trs dias.
OBS: Pode-se preparar uma soluo-me de hematoxilina a 10% em lcool a
95%, para dilu-la em gua no momento de usar.
Soluo mordente prepara uma soluo a 5% de sulfato frrico amoniacal,
selecionando os cristais cor de violeta:

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FeNH4(SO2)2 * 12H2O -------------------------------------

5g

gua destilada ------------------------------------------------- 100 mL


Fixao e colorao pela hematoxilina untar a lmina com um pouco de soro
sanguneo ou clara de ovo, para que o material adira na superfcie.
1) Quando a amostra fecal no est fixada, faz-se um esfregao (sobre a lamnula)
e, sem deixar que seque, coloca-se a lamnula horizontalmente no fixador, durante
dez minutos ou mais, com a preparao voltada para cima.

o excesso de bicloreto e os depsitos de mercrio reduzido so removidos por


passagem em lcool e em lcool iodado. Os tempos sugeridos no exigem muito
rigor, podendo ser prolongados.

2) Submergir a preparao no lcool a 50% durante 2 minutos. Colocar a lamnula


com a preparao para baixo, daqui para diante.
3) lcool 70% iodado por 2 minutos.
4) lcool 70% por 2 minutos.
5) lcool 50% por 2 minutos.
6) Lavar em gua corrente, durante 2 minutos;
7) Submeter mordenagem no almen de ferro a 2, por 5 a 10 minutos (ou 2
minutos se aquecido a 40C).
8) Lavar em gua corrente por 2 minutos.
9) Corar em soluo aquosa de hematoxilina a 0,5%, durante 5 minutos.
10)Lavar em gua corrente por 3 minutos.
11)Diferenciar em almen de ferro a 2%, durante o tempo suficiente para que a
produo adquirida colorao cinza-azulada clara.
12)Lavar em gua corrente por 10 a 15 minutos.
13)Passar sucessivamente pela srie de lcoois a 50%, a 70%, a 90% e absoluto,
sendo 2 minutos em cada um.
14)Clarificar no creosoto (mistura destilada do alcatro, contendo hidrocarbonetos,
fenol e outros compostos aromticos) ou em xilol.
15)Montar com uma gota de blsamo do Canad ou resina sinttica sobre uma
lmina.
Depois de seca a preparao, observar com objetiva de imerso!

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Tcnicas de Colorao

COLORAES UTILIZADAS PARA PARASITOS EMERGENTES


COLORAO ACID-FAST
* Objetivo: identificao de coccdeos Cryptosporidium sp., Isospora belli,
Cyclospora cavetanensis; esporos de Microspordios tambm podem se corar.
* Princpio: fundamenta-se na caracterstica lcool-cido resistente dos parasitas.
* Amostra: fezes, escarro, lavado brnquico, bipsia pulmonar, suco duodenal, bile e
demais lquidos cavitrios ou secrees, preservadas em formalina 10% (1:3), ou in
natura.
Reagentes:
Fucsina Carblica de Kinyoun
Fucsina bsica ---------------------- 4 g
Etanol 95% -------------------------- 20 mL
Fenol --------------------------------- 8 mL
gua deionizada (qsp) ------------ 100 mL
Dissolver a fucsina em lcool etlico com freqente agitao (soluo A). Dissolver o fenol
em gua deionizada (Soluo B). Misturar as duas solues, deixar over-night e filtrar.
Estabilidade de 01 ano, a temperatura ambiente, em frasco mbar!
lcool-cido 10%
cido sulfrico ---------------------- 10 mL
Etanol absoluto ---------------------- 90 mL
Misturar em balo volumtrico de 100 mL.
Estvel a temperatura ambiente por 01 ano.
Verde malaquita 3%
Verde malaquita -------------------3g
gua deionizada -------------------- 100 mL
Dissolver o verde malaquita em gua deionizada, utilizando balo volumtrico de 100
mL.
Estabilidade de 01 ano, a temperatura ambiente, em frasco mbar!
Formalina
Formaldedo ---------------------- 10 mL
gua deionizada ----------------- 90 mL
Homogeneizar em balo volumtrico de 100 mL.
Realizao da colorao:
Preparar esfregao fino em lmina com o MB.
Secar a temperatura ambiente.
Fixar o esfregao com metanol por 30 segundos.
Corar com fucsina carblica de Kinyoun por 1 minuto.
Lavar rpido com gua deionizada.
Contracorar com verde malaquita 3% por 2 minutos.
Secar e levar ao microscpio utilizando objetiva de imerso (100X).

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Tcnicas de Colorao

COLORAO DE KINYOUN
* Objetivo: identificao de Cryptosporidium sp., Isospora belli, Cyclospora
cavetanensis.
* Princpio: fundamenta-se na caracterstica lcool-cido resistente dos parasitas.
* Amostra: fezes, escarro, lquidos cavitrios ou material de secreo.
Reagentes:
Fucsina Carblica de Kinyoun
Fucsina bsica ---------------------- 4 g
Etanol 95% -------------------------- 20 mL
Fenol ---------------------------------

8 mL

gua deionizada (qsp) ------------ 100 mL

Dissolver a fucsina em lcool etlico com freqente agitao (soluo A).


Dissolver o fenol em gua deionizada (Soluo B). Misturar as duas solues,
deixar over-night e filtrar.

Estabilidade de 01 ano, a temperatura ambiente, em frasco mbar!


1. lcool-cido 10%
cido sulfrico ---------------------- 10 mL
Etanol absoluto ---------------------- 90 mL

Misturar em balo volumtrico de 100 mL.

Estvel a temperatura ambiente por 01 ano.


2. Verde malaquita 3%
Verde malaquita --------------------

3g

gua deionizada -------------------- 100 mL

Dissolver o verde malaquita em gua deionizada, utilizando balo volumtrico


de 100 mL.

Estabilidade de 01 ano, a temperatura ambiente, em frasco mbar!


Realizao da colorao:
Preparar esfregao fino em lmina e deixar secar a temperatura ambiente ou na
chama do bico de Bunsen.
Corar com fucsina por 15 minutos, no mnimo.
Lavar com gua deionizada.
Gotejar soluo lcool-cido sobre o esfregao, at que a soluo se torne incolor.
Lavar com gua deionizada.
Contracorar com verde malaquita 3% por 15 a 60 segundos.
Lavar com gua deionizada e secar a temperatura ambiente.
Examinar ao microscpio com objetiva de imerso (100X).

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Tcnicas de Colorao

COLORAO DE SAFRANINA
* Objetivo: identificao de Cryptosporidium sp., Isospora belli, Cyclospora
caetanensis.
* Princpio: fundamenta-se na caracterstica lcool-cido resistente dos parasitas.
* Amostra: fezes, escarro, lquidos cavitrios ou material de secreo.
Reagentes:
1. lcool-cido 3%
cido clordrico ---------------------- 3 mL
Etanol --------------------------------- 97 mL

Misturar em balo volumtrico de 100 mL.

2. Corante de Safranina
Safranina ----------------------------

1g

gua deionizada (qsp) ------------- 100 mL

Dissolver a safranina em gua deionizada, utilizando o balo volumtrico de


100 mL.

Estabilidade de 01 ano, a temperatura ambiente, em frasco mbar!


3. Verde malaquita 3%
Verde malaquita --------------------

3g

gua deionizada -------------------- 100 mL

Dissolver o verde malaquita em gua deionizada, utilizando balo volumtrico


de 100 mL.

Estabilidade de 01 ano, a temperatura ambiente, em frasco mbar!


Realizao da colorao:
Preparar esfregao fino em lmina com o MB e deixar secar.
Fixar o esfregao em lcool-cido por 5 minutos.
Lavar gentilmente com gua deionizada.
Corar com safranina 1%, ferver por 1 minuto.
Lavar com gua deionizada.
Contracorar com verde malaquita 3% por 2 minutos.
Lavar gentilmente com gua deionizada.
Examinar ao microscpio com objetiva de imerso (100X).

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Tcnicas laboratoriais
Tcnicas de Colorao

COLORAO DE TRICRMIO (MODIFICADO POR WEBER)


* Objetivo: deteco de esporos de microspordios, cistos de Giardia intestinalis,
Entamoeba coli, E. histolytica, Chilomastix mesnili, Endolimax nana,
protozorios intestinais excluindo os considerados emergentes; podem ser
detectados ovos de helmintos.
* Princpio: baseia-se na deteco de microorganismos atravs de contraste de cor
destes com a contra-colorao da lmina.
* Amostra: fezes, secrees, lquidos cavitrios ou derrames e bipsias.
Reagentes:
1. Formol 10%
Formoaldedo --------------- 100 mL
gua deionizada ----------- 1000 mL qsp
2. Corante tricrmio Weber
Chromotrope 2R ----------- 6 g
Verde malaquita ----------- 0,15 g
cido Fosfotngstico ----- 0,7 g
cido actico glacial ------ 3 mL
gua deionizada ----------- 100 mL qsp

Misturar o cido actico glacial com os componentes secos. Homogeneizar


bem. Deixar em repouso por 30 minutos temperatura ambiente. Adicionar
100 mL de gua deionizada. Homogeneizar.

Estabilidade de 01 ano, a temperatura ambiente, em frasco mbar.


3. lcool-cido tricrmio
cido actico ---------------

4,5 mL

lcool etlico 90% --------- 995,5 mL


4. Etanol 90%
Etanol ----------------------- 900 mL
gua deionizada ---------- 100 mL
5. Etanol 95%
lcool etlico -------------- 950 mL
gua deionizada ----------

50 mL

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Tcnicas de Colorao

Colorao:
Colocar em frasco coletor uma parte de MB para 3 partes de formol 10%.
Fazer esfregao fino, com 10l de amostra conservada, em lmina.
Deixar secar a temperatura ambiente.
Fixar com metanol 3 a 5 minutos.
Colocar a lmina no corante tricrmio por 90 minutos.
Lavar em lcool-cido por 1 a 3 segundos.
Lavar em etanol 95% mergulhando por 5 segundos.
Colocar em etanol por 1 minuto (2 trocas).
Colocar em xilol por 10 minutos e esperar secar.
Observar ao microscpio com objetiva de imerso (100X).

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Tcnicas de Colorao

COLORAO DE GRAM CHROMOTROPE (MODIFICADO POR WHEATLY)


* Objetivo: deteco de esporos de microspordios atravs do contraste de cor
destes com o fundo da lmina.
* Princpio: baseia-se na deteco de microorganismos atravs de contraste de cor
destes com a contra-colorao da lmina.
* Amostra: fezes, secrees, lquidos cavitrios ou derrames e bipsias.
Reagentes:
1. Formol 10%
Formoaldedo --------------- 100 mL
gua deionizada ----------- 1000 mL qsp
Ou
Formol 37% ---------------- 270 mL
gua deionizada ---------- 1000 mL qsp
2. Soluo de violeta 1%
Soluo 1
Cristal violeta ---------------- 25 mL qsp
Etanol ------------------------- 250 mL qsp
Soluo 2
Oxalato de amnio --------- 10 g
gua deionizada ----------- 1000 mL qsp

Misturar em balo volumtrico de 1000 mL, juntar soluo 1 e 2 e


homogeneizar.

3. Lugol de Gram
Soluo 1
Hidrxido de sdio ----------- 4 g
gua deionizada -------------- 25 mL
Soluo 2
Iodo metlico ----------------- 2 g
Iodeto de potssio ------------ 1 g

Misturar as duas solues, adicionar 97 mL de gua deionizada e


homogeneizar.

4. lcool Acetona
Acetona ------------------ 75 mL
ter etlico --------------- 25 mL
5. Corante tricrmio Weber

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Tcnicas laboratoriais
Tcnicas de Colorao

Chromotrope 2R ----------- 6 g
Verde malaquita ----------- 0,15 g
cido Fosfotngstico ----- 0,7 g
cido actico glacial ------ 3 mL
gua deionizada ----------- 100 mL qsp

Misturar o cido actico glacial com os componentes secos. Homogeneizar


bem. Deixar em repouso por 30 minutos temperatura ambiente. Adicionar
100 mL de gua deionizada. Homogeneizar.

Estabilidade de 01 ano, a temperatura ambiente, em frasco mbar.


6. lcool-cido tricrmio
cido actico ---------------

4,5 mL

Etanol 90% ----------------- 1000 mL qsp


7. Etanol 90%
lcool etlico -------------- 900 mL
gua deionizada ---------- 100 mL
8. Etanol 95%
lcool etlico -------------- 950 mL
gua deionizada ----------

50 mL

Colorao:
Colocar em frasco coletor uma parte da amostra para 3 partes de formol 10%.
Fazer esfregao fino, com 10l de amostra conservada, em lmina.
Deixar secar a temperatura ambiente.
Fixar com metanol ou sob a chama do bico de Bunsen (3 vezes, 1 segundo sob a
chama, ou 5 minutos a 60C em estufa).
Cobrir a lmina com soluo cristal violeta 1%, adicinar 3 gotas de carbonato de
sdio 5% e deixar por 2 minutos.
Lavar o excesso com gua deionizada.
Cobrir a lmina com lugol de gram por 2 minutos.
Lavar com gua deionizada.
Descorar com mistura acetona-ter.
Colocar no corante tricrmio por 10 minutos.
Colocar em lcool-cido por 1 a 3 segundos.
Lavar em etanol 95% mergulhando.
Colocar em etanol PA por 1 minuto e 2 trocas.
Deixar secar e observar ao microscpio com objetiva de imerso (100X).

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Tcnicas laboratoriais
Tcnicas de Colorao

COLORAO DE LEISHMAN
* Objetivo: visualizao e identificao de Blastocystis hominis.
* Princpio: baseia-se na deteco de microrganismos atravs da colorao destes
parasitas.
* Amostra: fezes, secrees, lquidos cavitrios ou de derrames e bipsias.
Reagentes:
1. Laboazul
Soluo aquosa concentrada de 1-2-3 Propanetricarboxylic acid, 2 Hydroxy
Cooper Sodium Salt (1.2.1) Tetrahydrate

Estvel por 02 anos em temperatura ambiente.

2. Leishman
Leishman ----------------------

2,5 g

lcool metlico --------------- 1000 mL

Adicionar o Leishman no frasco do lcool metlico. Agitar. Deixar descansar por


aproximadamente 24 horas. Filtrar e armazenar em frasco mbar por 02 anos.

3. gua deionizada
4. leo de imerso
Colorao:
Verificar a presena de vermes, ao abrir o frasco.
Homogeneizar o material acrescentando 3 gotas de laboazul.
Fazer um esfregao fino deixando secar a temperatura ambiente ou na chama do
bico de Bunsen.
Cobrir a lmina com Leishman por 3 a 5 minutos.
Gotejar sobre a lmina gua deionizada de maneira a se obter uma diluio do
corante para mais ou menos a metade, homegeneizar a mistura e deixar mais 15
minutos.
Lavar em gua deionizada e deixar secar temperatura ambiente.
Fazer a leitura em microscpio ptico em objetiva de imerso (100X), aps adio
de leo de imerso.

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Tcnicas laboratoriais
Tcnicas de Colorao

Exame microscpico do exame coprolgico de fezes


Aps o exame macroscpico das fezes como aspecto, consistncia, reao e pH, Cor,
odor, muco e vicosidade; homogeneizar bem as fezes observando se h presena de
vermes adultos ou parte deles, diluir as fezes em gua, coar e preparar trs lminas:
a) 1 gota de soluo fisiolgica + 1 gota de suspenso das fezes com lamnula
( melhor para resduos vegetais)
b) 1 gota de lugo1 + 1 gota de suspenso de fezes ( melhor para resduo animal e
intestinal)
c) 1 gota de suspenso de fezes + 1 gota de Sudam III (para identificao de
gordura neutras)
Classificamos como material semilgico as estruturas abaixo porque para realizar o
Exame Coprolgico e feito uma dieta alimentar e estamos avaliando a digesto e/ou
absoro do indivduo que efetuou a dieta adequadamente. O que no classificamos
denominado de material no semiolgico ou estroma.
RESDUOS DE ORIGEM ANIMAL
1) Fibra muscular
a) mal digerida
b) em digesto
c) digesto avanada

(lugol)

(sudam III)

2) Gorduras

(lugol)

(sudam III)

3)Tecido conjuntivo
RESDUOS DE ORIGEM VEGETAL
4)Celulose Digestvel
A)Amido
a) amido amorfo
b) amido includo
c) amido cru
B) Vegetais
a) fibra vegetal
b) pelo vegetal
c) esporo vegetal
d) vaso vegetal
C) Cristais (40x)
a) Oxalato de clcio
b) Fosfato amonaco magnesiano (fosfato triplo)
c) cidos graxos
d) Caroteno
e) Charcot-Leyden
f) Colesterol
g) Outros (medicamentos, sulfas, etc...)
5)Celulose Indigestvel

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Tcnicas laboratoriais
Tcnicas de Colorao

RESDUOS DE ORIGEM INTESTINAL


6) Muco
7) Clulas intestinais de descamaes
8) hemcias, leuccitos
9) Microbiota bacteriana
a) Iodfila
b) no iodfila

cocos
cocos

bacilos
bacilos

leveduras
leveduras

Referncia Bibliogrfica:

Rey, L. 1991. Parasitologia. Ed. Guanabara Koogan, 2 edio. 731p.


Pesquisa de Sangue Oculto
Reao de Guiaco ( existe o Kit Hemoccult II que baseado na prova de guiaco)
alcool etlico a 95%
goma guico em p:
Pulverizar e agitar at a saturao, preparar no momento de uso
Metodologia:
Fazer um esfreago com fezes em um papel de filtro, gotejando 2 a 3 gotas de acido
actico
glacial e 2 a 3 gotas de uma soluo recem preparada de lcool etlico saturado com
goma de guico em p.
Juntar igual quantidade de perxido de hidrognio 10 vol
Misturar bem com um basto de vidro e observar o desenvolvimento de colorao azum
em 5 min
Cor esverdeada negativa

Reao de Meyer- Johannessen


fenolftaleina 2g
hidrxido de potssio anidro 20g
gua destilada qsp 100mL
aquecer at fervura (rosa) acrescentando 10 a 30g de zinco em p para obteno de
descolorao completa.
Filtrar e guardar em frasco ambar, com um pouco de zinco em p , no fundo do frasco.
Metodologia
fazer uma suspenso de fezes de 5%, passar 5 mL para um tudo de ensaio e juntar 1 mL
de reativo de
Meyer-Johnannessen. Acrescentar 3 a 4 gotas de perxido de hidrognio 10 vol
positiva quando desenvolve colorao rsea imediatamente.

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Tcnicas de Colorao

Pesquisa de Gordura nas fezes


corante: Sudam III
alcool 70
acetona
Sudam III at saturao ( ou Sudo III)
Triturar o corante em GRALL, previamente aquecido e depois acrescentar a soluo aos
poucos
Deixar na estufa a 37 por 24 horas
Filtrar em papel de filtro antes de usar
( na prtica usar 1g do corante para 100 mL da mistura de alcool-acetona)
Sudo III - o benzeno-azobenzeno-azobetanaftol

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