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Montepuez
2013
ii
ndice.
Viso geral
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Introduo. ...................................................................................................................... 47
Normas de Preparao dos Meios de Cultura ....................................................... 47
Identificao de Bactrias em Meios de Cultura Preparados com Gelatina ................... 49
Observao de bactrias do ar e do ambiente de trabalho. ............................................. 51
Introduo .............................................................................................................. 51
Observao e Isolamento de bactrias halofitas no peixe seco salgado. ........................ 54
Estudo dos Fungos
59
Introduo .............................................................................................................. 59
Observao de gemulao em leveduras ........................................................................ 61
Crescimento de leveduras no sumo de uva. .................................................................... 64
Multiplicao de leveduras em condies aerbias e anaerbias ................................... 65
Introduo .............................................................................................................. 65
iii
Viso geral
Bem-vindo ao Manual de Praticas Laboratoriais de
Microbiologia
Caro estudante do curso de biologia! Pensando em si, elaborou-se este manual
intitulado Manual de Prticas Laboratoriais de Microbiologia, que contm
diversos protocolos de prticas laboratoriais, na qual servir de base para a fixao
dos contedos tericos, preparando lhe assim para a construo do saber, do
conhecer e do seu desenvolver, principalmente nos aspectos seguintes:
Controlo dos microrganismos no cultivo dos microrganismos;
A importncia dos microrganismos no mbito alimentar e ecolgico;
Metabolismo dos fungos e bactrias;
Necessidades de crescimento dos fungos e bactrias;
Cultivo e observao microscpica dos fungos e bactrias.
Espera-se que este manual lhe seja util para o desenvolvimento das sua habilidades
pratico-laboratoriais.
Objectivos do Manual.
O estudante que participar as aulas prticas
pr
laboratoriais que constam neste manual
deve ser capaz de :
Identificar macro e microscopicamente as caractersticas de
diferentes grupos de microrganismos;
Fazer o cultivo de microrganismos em laboratrio;
Desenvolver aulas prticas de microbiologia, mesmo em
locais sem acesso ao equipamento de laboratrio.
Compreender a importncia dos microrganismos e sua fcil
Objectivos
manipulao laboratorial;
Conhecer as condies de cultura dos microrganismos
Discutir a importncia do cultivo de microrganismos em
laboratrio.
Organizao do Manual.
Tendo em conta que este manual foi produzido com base em um Tamplate
usado para a produo de mdulos na Universidade Pedaggica, este
encontra-se estruturado da seguinte maneira:
Pginas introdutrias
Um ndice completo.
Uma viso geral detalhada do manual, resumindo os aspectos-chave que voc precisa
conhecer para completar e realizar as prticas aqui sugeridas. Recomenda-se vivamente que
leia esta seco com ateno antes de comear a realizar as suas actividades praticoexperimental.
Contedo do manual.
O manual contm um total de 18 protocolos correspondentes ao mesmo nmero de aulas.
Cada uma das aulas inclui uma pequena nota introdutria, objectivos da aula, material a ser
usado, os procedimentos a serem seguidos e em alguns casos tarefas de auto-avaliao. Esta
ltima visa consolidar as prticas que acabou de desenvolver. Recomenda-se que resolva-os
para melhor medir os seus conhecimentos sobre a aula.
Comentrios e sugestes.
Esta a sua oportunidade para dar sugestes e fazer comentrios sobre os diferentes
protocolos que so sugeridos neste manual. Os seus comentrios sero teis para ajudar a
avaliar e melhorar este material didtico de extrema importncia para quem quer desenvolver
habilidades pratico-laboratoriais em microbiologia
cones de actividade
Ao longo deste manual encontram-se uma srie de cones nas margens das
folhas. Estes icones servem para identificar diferentes partes do processo de
aprendizagem. Podem indicar uma parcela especfica de texto, uma nova
actividade ou tarefa, uma mudana de actividade, etc.
Acerca dos cones
Os cones usados neste manual so smbolos africanos, conhecidos por
adrinka. Estes smbolos tm origem do povo Ashante de Africa Ocidental,
datam do seculo 17 e ainda se usam hoje em dia.
Habilidades de estudo
Ao realizar uma aula prtica laboratorial necessrio ter muita ateno no
que observas, sendo necessrio fazer os respectivos desenhos. Para isso, tenha
consigo um bloco de anotaes e uma esferogrfica e tenha a certeza que o
que est a desenhar corresponde a aquilo que pretendes observar.
Precisa de apoio?
Caso tenha alguma dvida durante a realizao das suas experiencias,
consulte ao seu professor antes que cometa erros que posteriormente sero
fatais para si.
Introduo
A realizao das prticas laboratoriais depende em grande parte de equipamentos
e materiais existentes no laboratrio. Mas isso no pode constituir um grande
problema que impea a realizao das prticas laboratorial em microbiologia,
podendo-se
se para isso produzir materiais alternativos que visem implementa-las.
implementa
No final desta aula voc deve ser capaz de:
Pipeta: serve para diluir preparaes diversas e inocular culturas lquidas. Estas
podem ser plsticas ou de vidro.
Pipeta Pasteur (fig.8) um tubo de vidro espichado em capilar, utilizada para
transportar pequenos volumes de lquido.
Inculo (ou semente): concentrao de clulas suficientes para cultivar uma de
meio com bom rendimento
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10. Identificar as amostras, bem como o material a ser utilizado antes de iniciar a
anlise. No use amostra ou substncia que no esteja rotulado.
11. Antes de usar qualquer produto deve ler com ateno o conjunto de informaes
impressas no rtulo dos reagentes, prestando ateno para os riscos que eles
comportam.
12. Devem retirar-se pequenas quantidades de reagentes de cada vez para evitar
desperdcios. Os excessos no devem ser devolvidos nos frascos a fim de evitar
contaminaes.
13. No se deve deixar os frascos dos reagentes abertos
14. Utilizar exclusivamente material estril para a anlise.
15. No comer, beber ou fumar no laboratrio.
16. Manter canetas, dedos e outros longe da boca.
17. No utilizar material de uso pessoal para limpar os objetos de trabalho.
18. Depositar todo o material utilizado em recipiente adequado, e no sobre o local de
trabalho.
NUNCA TENTE SER HERI!
Para alm das normas acima citadas, existem outras que podem ser consideradas para a
manuteno do laboratrio por parte do responsvel tcnico, a destacar:
1.
O laboratrio deve ter duas portas de sada, sendo que nenhuma delas deve estar
catalogados;
3.
separados dos vidros e plsticos. Sempre que possvel os reagentes devem ser
arrumados em locais com ventilao.
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O laboratrio, sendo um local onde se est exposto a diversos riscos, e como tantos
outros ambientes de trabalho deve se ter noes de primeiros socorros em casos de
acidente.
No caso de ocorrer um acidente no laboratrio, deve comunicar de imediato ao
professor ou ao responsvel do laboratrio.
Torna-se necessrio durante o trabalho em um laboratrio de microbiologia, ter
conhecimento de alguns procedimentos de primeiros socorros, no s, mas tambm,
saber identificar o tipo de acidente para facilitar o trabalho dos tcnicos de sade. Na
tabela 1, so indicadas alguns procedimentos de primeiros socorros, que no podem ser
entendidos como um tratamento completo, aconselhando-se ao estudante depois de o
acidente dirigir-se a um posto mdico mais prximo, caso o acidente seja grave.
Tabela 1: Alguns procedimentos de primeiros socorros.
Acidente
Salpicos e/ou queimaduras com
substncias qumicas superficiais
Salpicos de substncias qumicas
nos olhos
Pequenos golpes
Queimaduras ligeiras
Procedimentos
Lavar com gua abundante e corrente a rea afetada, uso de sabo
facilita a remoo. Recomenda-se depois ir a um posto mdico
Lavar os olhos com soro fisiolgico ou com gua. Com ajuda de dois
dedos deve-se manter as plpebras afastadas, de modo que o lquido
utilizado na lavagem seja tangencialmente ao globo ocular. Depois deve
consultar a um mdico
Se o corte for pequeno deve deixar sangrar por alguns segundos e lavar a
ferida com gua corrente. De seguida deve desinfeta-la e proteg-la com
um penso.
A vtima deve ser afastada do local, aliviando-lhe o vestirio no pescoo
e no peito. No caso da vtima estiver inconsciente, deve deita-lo com a
cabea na posio lateral e inclinada para trs, mantendo-o aquecido.
Levar de imediato a um posto de sade.
No caso de queimadura trmica deve ser aplicada uma pomada
especfica e posteriormente aplicar uma gaze esterilizada
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Substncia
Smbolo
Precaues
Evitar choques, variao de presso,
frico, calor e fogo
Explosiva
Comburente
Inflamvel
fontes de calor
Caractersticas da Substncia
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Toxico
Corrosivo
Perigosa para o
ambiente
recipientes prprios
Mutagnica
Irritante
Sensibilizante
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Nocivo
(Fonte: Adaptado de Bandeira e Nota, 2008)
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Elementos pr textuais
1.1.
O titulo completo da experiencia, que deve ser curto e dar uma indicao
clara da inteno do trabalho;
Nome (s) do (s) autor (es);
O nome da Escola/Faculdade/Delegao onde o trabalho foi realizado;
Data em que o relatrio foi concludo;
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Elementos textuais
2.1. Introduo: aqui deve ser apresentado de uma forma clara o problema em
estudo (se existir um problema), indicando o objetivo do trabalho, dizendo de
que trata o relatrio e os motivos que conduziram a sua elaborao, bem como o
objetivo que se pretende alcanar.
2.2.
relao ao problema ou objetivo inicial. Deve ser o mais sucinto possvel, sem
omitir, no entanto, as principais concluses, que devem ser mencionadas de
acordo com a ordem pelo qual aparecem no trabalho.
3.
Elementos ps - textuais
3.1.
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CONSTITUIO DO
MICROSCPIO PTICO
Parte ptica
Parte Mecnica
Base ou p: Suporte do
microscpio
Coluna ou Brao: Pea fixa a
base, na qual esto aplicadas
todas as outras partes
constituintes do microscpio
Parafuso Macromtrico
Possibilita movimentos
verticais de grande amplitude,
permite uma focagem rpida.
Parafuso Micromtrico:
Possibilita movimentos verticais
de pequena amplitude, permite
otimizar a focagem.
Tubo ou canho:
Suporta a ocular
Revolver: Suporta e
permite a seleo da
objetiva
Sistema de
iluminao
Condensador: tem
como finalidade
concentrar os raios
emitidos pela fonte
luminosa, fazendoos incidir na
preparao
Sistema de
ampliao
Diafragma: encontra-se
associado ao
condensador. Regula a
intensidade da luz
Objetivas: sistema
de lentes que
ampliam a imagem
do objeto.
Oculares: sistema
de lentes que
ampliam a imagem
fornecida pela
objetiva
Figura 15. Representao esquemtica da constituio do microscpio ptico composto (Fonte: Adaptado de Marques et al, s/d
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condensador, a uns dois teros da sua abertura, depois olhando pela ocular, regule o
cone luminoso, fechando aos poucos o diafragma.
Focalize o objeto. Esta operao consiste em trazer o objeto para o foco da
objetiva, formando a imagem que, ampliada pela ocular, ser vista pelo observador.
Para efetivar a focalizao proceda o seguinte:
Gire o revlver colocando a objetiva de menor ampliao no eixo ptico;
Ajuste a iluminao de campo;
Centralize a preparao;
Aproxime ao mximo a preparao, da objetiva de menor ampliao, por meio
do mecanismo de movimento. Durante este trabalho dever ser observado a
aproximao diretamente com a vista, no devendo ser utilizado a ocular;
Imprima (observando pela ocular) movimento moderado de afastamento entre a
preparao e a objetiva, at que seja distinguida a imagem do objeto;
Movimente o parafuso micromtrico para focalizao final;
Regular o diafragma e o condensador para visualizar com mais nitidez;
Para trocar de objetiva basta girar o revlver e em seguida ajustar o foco
imprimindo movimentos lentos no parafuso micromtrico;
Quando terminar a observao, gire o revlver at a menor objetiva e apagar a
luz.
Tape com a capa e coloque-o na caixa.
N.B2: Quando o microscpio binocular deve-se ajustar a distncia interocular de tal
forma que o observador visualize um s campo de luz. Para o caso de microscpio
monocular, procurar manter ambos os olhos abertos, a fim de evitar fadiga.
Regras bsicas na conservao do microscpio.
O microscpio constitui um aparelho bastante caro, aps cada uso necessrio tomar
diversos cuidados para manter a funcionamento do aparelho. De entre os vrios
cuidados que se devem tomar para a conservao do microscpio, a seguir so
mencionados alguns:
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O microscpio deve estar sempre protegido com uma capa plstica ou com caixa
prpria e guardado em ambiente provido de luz artificial para evitar o crescimento de
fungos. A cada utilizao o p do microscpio dever ser removido com um pano
limpo.
As oculares devem ser limpas externamente com papel de seda e internamente,
por um tcnico, s quando necessrio.
A objetiva de imerso limpa com papel de filtro ou papel vegetal humedecido
com uma mistura de xilol e ter na proporo de 1:1 ou ainda por lcool.
As objetivas a seco so limpas com um linho macio e ocasionalmente, com
papel humedecido com gua destilada.
A parte interior das objetivas no deve ser limpa usualmente e quando feito
dever ser praticada por pessoa habilitada. Deve-se remover a objetiva e passar
suavemente um pincel macio. No se deve assoprar para evitar a humidade. Esta
operao dever ser feita com muito cuidado para no descentralizar as objetivas.
Para uma boa conservao do microscpio o operador dever seguir uma rotina
diria que vai desde uma simples remoo do p at uma lubrificao mensal de todas
as partes mveis com um leo fluido.
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Controlo de microrganismos.
Introduo.
A preveno e o controlo dos microrganismos podem ser eficientemente
realizados mediante aplicao de agentes qumicos ou fsicos sobre eles antes que
estes entrem em contacto com os hospedeiros, ou antes que atravessem a barreira
cutnea. Tais procedimentos podem ser utilizados sobre os alimentos, gua,
objectos em geral ou sobre a pele/mucosa. A natureza do agente a ser utilizado
(fsico ou qumico), seu tipo especfico (grupo a que pertence) e sua intensidade
de aplicao tm de ser apropriados para a natureza do material que se vai
submeter ao tratamento, bem como devem ser condizentes com o grau de
eliminao dos microrganismos que se pretende alcanar. Portanto, pode-se
planear desde uma inactivao selectiva, at uma destruio completa de todos os
micrbios presentes no local. Sendo assim faz-se necessrio definir alguns
conceitos essenciais e fazer consideraes bsicas sobre os mesmos.
Conceitos de Definies.
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Aco de Anti-spticos
spticos.
Ao terminar esta aula, voc deve ser capaz de:
Objectivo
Erro! No existe
te nenhum texto com o estilo especificado no documento.
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Procedimentos
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Crescimento Bacteriano
Controlo
Placa
Auto-avaliao
Mo suja
Detergente
lcool 70%
iogurte
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Microscpico ptico
Laminas e lamelas
Agua destilada
Conta gota
Papel vegetal
Azul metileno
lcool
Materiais
Lamparina de lcool
leo de imerso
Iogurte natural
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Gram negativas
Clulas coradas em
violeta
Formao do complexo
VG-I no interior das
clulas,
que
permanecem em violeta
O complexo no removido pelo O etanol remove o
etanol. As clulas permanecem violetas complexo VG-I. As
clulas
ficam
descoradas
As clulas no so afetadas, As clulas tomam o
permanecem violetas
corante,
tornando-se
vermelhas
Etanol
Safranina
Iogurte comercial
Lminas
Lamelas
Pipeta
gua destilada
Luvas
Materiais
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8. Repete a lavagem.
9. Pingue uma gota de lcool a 95% durante 1 minuto.
10. Repete a lavagem.
11. Pingue uma gota de safranina deixe por 30 segundos.
12. Repete a lavagem.
13. Seca suavemente sobre papel absorvente.
14. Observa ao microscpico, sem usar lamela, com as objetivas de menor
ampliao. Regista as tuas observaes.
15. Coloca uma gota de leo de imerso sobre a preparao e observa com a
objectiva de 60x. Faz um esquema da tua observao e legenda
legenda-o.
Interpretao dos Resultados
As bactrias do esfregao aparecero coradas de violeta quando forem
Gram-posetivas,
posetivas, ou coradas de rosa (safranina) no caso de serem Gram
Gramnegativas.
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Lmina
Lamela,
Microscpio ptico
Palito de dente
Papel filtro,
Materiais
Pipetas Pasteur
Azul metileno
lcool
Com o palito de dente retire entre os dentes o trtaro e
espalhe numa lmina;
Pingue uma gota de gua.
Cubra com uma lamela.
Procedimentos
Observe ao microscpio
Anote a observao
Adicione uma gota de azul metileno.
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Caneta
Microscpio ptico
Lmina,
Lamela,
Esptula
Luvas.
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Pina
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Erro! No existe
te nenhum texto com o estilo especificado no documento.
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1. Presena de microrganismos no ar
a) Retire a tampa das placas contendo gelatina e deixe abertas no
ambiente durante 15 minutos. Incube as placas por 3 a 5 dias a
30C.
2. Presena de microrganismos no laboratrio
a) Inocule as placas contendo gelatina, para isso proceda da
seguinte maneira:
b) Enumere as trs placas, sendo que na:
Procedimentos
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contaminantes do laboratrio?
3. Neste experimento, houve influncia do meio de cultura
cu
no
aparecimento de bactrias? Justifique sua resposta. Pesquise sobre
fontes nutricionais requeridas por bactrias.
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Bisturi
Pipetas Pasteur plstica
Sal
Tubo de ensaio
Ansa de repicagem
Placas com meio de cultura slido
Parafilme ou pelcula aderente
Estufa a 40C
Microscpio ptico
Laminas e lamelas
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Agite bem.
coloque numa lmina e
Com uma pipeta retire uma gota e coloque-a
tape com lamela;
Observe ao microscpio ptico;
Por irrigao, adicione azul metileno, retire o excesso de gua
com papel de filtro
Observe ao microscpio, usando primeiro a objectiva de 4x e
depois com a objectiva de imersoo de 60x.
Explique o que observou antes e depois de adicionar o azul
metileno.
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Microscpio ptico;
Lminas;
Lamelas
Actividade
Pina de madeira;
Lamparina de lcool;
Papel de filtro;
Soluo de azul metileno;
leo de Imerso;
gua destilada;
Vinho fermentado
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gua destilada;
de chvena de acar;
1 Tigela;
1 Tubo de ensaio;
Material
1 Funil;
1 Rolha para fechar o tubo de ensaio;
Algodo;
Azul metileno;
Fermento biolgico.
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lamela
5. Observar ao microscpio, comeando pela objetiva de menor
ampliao, percorra a preparao de modo a localizar uma
clula de levedura em diviso
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Auto-avaliao
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Medidor de pH
Estufa;
Frigorifico
Microscpio ptico
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Procedimentos
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Garrafas termos de 1L
Termmetro
Gobels
Varetas de vidro
Tubos de vidro dobrados ou tubos plsticos
Pipetas
Material
Microscpio ptico
Laminas e lamelas
Soluo de glicose a 30%
gua de cal
Suspenso de leveduras
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Cerveja 2M;
Agar ou Gelatina
cido actico laboratorial ou vinagre de cozinha
Hidrxido de potssio (ou potassa custica - KOH)
Acar comum ou sacarose
gua destilada
Medidor de pH
Placas de Petri esterilizadas
Material
Etanol
Esptula ou ansa de repicagem
Balana analitica
Bquer de 100 e 250ml
Pipetas de 0,5ml
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de esporulao
a) Retire com a pipeta uma porco
orco de 0,2ml da suspenso de
clulas contida na cerveja para
ra o meio contido numa placa.
b) Espalhe com a vareta de vidro dobrada em L.
c) Deixe temperatura ambiente.
d) Aps pelo menos 1 dia, retire uma poro de clulas, com uma
esptula ou uma ansa de repicagem.
e) Suspenda essas clulas numa gota de gua, colocada sobre uma
lmina.
f) Cobra com lamela e observe ao microscpio ptico.
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Procedimentos
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Po
Bisturi
gua com detergente (2 ml de detergente
ergente-manoxol-para 100 ml
de gua)
Materiais
Lamelas
Laminas
Placa de petri
Microscpio ptico.
Estereoscpio binocular
75
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Referencias Bibliogrficas
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ptica e Biologia Celular. Universidade Pedaggica, Departamento de Biologia Maputo, 2008
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MARQUES, Eva et al: Tcnicas Laboratoriais de Biologia, Bloco I, Porto editora, s/d
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PINTO, Ana Maria et al: Tcnicas Laboratoriais de Biologia. Lisboa, Porto editora, 1 edio, 2001
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Gois, Departamento de Biologia, s/d