CAPTULO 8.

PREPARACIN A LA
FECUNDACIN
MADURACIN OVOCITARIA
Corresponde al conjunto de fenmenos que intervienen en el oocito primario del folculo maduro, como
consecuencia del alza ovulatoria de LH, que llevan a este oocito al estado de oocito secundario momento
en que ser ovulado apto para ser fecundado. Es la ltima etapa de la gametognesis femenina
(oognesis), y ocurre en las ltimas horas del crecimiento oocitario, y requiere de los elementos constituidos
previamente en las fases de crecimiento oocitario y folicular. Ejemplo de esto es la accin de los microtbulos
que comienzan su accin al producir la migracin perifrica de la VG y luego del alza de gonadotrofinas son
responsables de la migracin de los grnulos corticales hacia la periferia y de la formacin del huso meitico.
El rol de los microtbulos va incluso ms all, ya que la migracin de los proncleos tambin ser de su
responsabilidad.

Maduracin Nuclear
La maduracin nuclear tiene como objetivo el reinicio de la meiosis. Se ha planteado que los mecanismos
que reinician la meiosis in vitro se basan en el cese de seales inhibitorias, mientras que in vivo sera la
propia accin de la LH la que genere una seal activadora. Se debe destacar que en distintas especies
observamos diferentes mecanismos, as en roedores el nivel de AMPc es muy importante para mantener
inhibida la meiosis, mientras que en bovinos la inhibicin es transitoria.

Reinicio de la Meiosis
El alza ovulatoria de las gonadotrofinas (particularmente de LH), desencadena dos fenmenos descritos
(captulo 7):

Se modifican las uniones comunicantes entre las clulas de la granulosa (primero entre oocito y
corona radiada, y luego entre el resto de las clulas del cmulo)
Se expande el cmulo por aumento de la matriz, produciendo una disrupcin en las uniones
comunicantes.

Mecanismos tericos en el levantamiento de la inhibicin de la meiosis.

1.

Se detiene el OMI hacia el oocito.

2.

Se detiene el flujo de AMPc hacia el oocito, lo que se traduce en activacin de la PKA. Esto se explica la
accin de las gonadotrofinas sobre el cmulo y no directamente sobre el oocito, por lo dems no hay
receptores de gonadotrofinas en el occito. Se han descrito dos tipos de PKA (I y II), donde:
PKA I: Se encuentra en el oocito y su estimulacin inhibe la meiosis.
PKA II: Se encuentra en clulas del cmulo y su estimulacin produce la expansin de este y
la disrupcin de la vescula germinativa ("germinal vesicle breakdown" = GVBD) que
corresponde a la desaparicin de la membrana nuclear previo a la metafase I.

3. Uno de los primeros signos de que la competencia meitica (mucho antes de la maduracin) ha
comenzado es el comienzo de breves descargas de calcio - oscilaciones clcicas- desde depsitos

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intracelulares. Series de descargas comienzan infrecuentes en las etapas finales de crecimiento, y se

hacen regulares despus de la maduracin. A las tres horas de iniciada la maduracin las descargas se
hacen dbiles e irregulares y a las 6 horas desaparecen. La cantidad de calcio que el oocito pone en
juego aumenta durante la maduracin. El receptor de LH que actua via AMPc acta tambin por la va
de la fosfolipasa C, se produce DAG y liberacin de calcio por la via IP3 desde compartimentos
intracelulares en clulas de la granulosa que tienen ReLH. El calcio llegara por las uniones
comunicantes al oocito y por esta va intervendran protena kinasas dependientes de Calcio, PKC.
Quizs calcio e IP3 pasan a travs de las uniones comunicantes
ayudando al mecanismo de
CICR ("Calcium Induced Calcium Release", mecanismo por el cual el mismo calcio induce su propia
liberacin desde los depsitos intracelulares). Los agentes que bloquean la va de los IP, bloquean el
reinicio de la meiosis in vitro. La importancia relativa de estas dos vas PKA y PKC as como su
interaccin estn por definirse.
4. El MPF o Maturation Promoting Factor descrito en cap. Ciclo celular, y fue estudiado en Xenopus,
donde se vio que el trasplante de citoplasma de un oocito a finales de su divisin meitica a un oocito
en reposo (pequeo, sin competencia meitica), desencadena en este ltimo una divisin meitica. En
este contexto podemos inferir que la adquisicin de la competencia meitica sera un fenmeno tiempo
dependiente, e independiente de las clulas foliculares.
Examinando de cerca lo que ocurre con el MPF durante el perodo de reinicio de la meiosis en la rata, el
complejo inactivo o pre MPF es el que -adems de conferir la competencia meitica a medida de que la
clula sintetiza ciclina B y cdc2 y por lo tanto se alcanzan niveles adecuados de pre-MPF- se activa por
defosforilacin y produce la disrupcin de la vescula germinativa y el reinicio de la meiosis cuando se activa
a cabalidad. (El vanadato, que es un inhibidor de tirosina fosfatasas (remueven grupos fosfato de residuos
tirosina), inhibe el reinicio de la meiosis). La transicin metafase I-anafase I y la cada de la actividad H1
kinasa (actividad kinasa sobre histona) se produce por degradacin de la ciclina B y se comienza a formar
lenta y nuevamente pre-MPF. Si experimentalmente se mide la cantidad de cdc2 fosforilado (inactivo)
cuando se reinicia la meiosis, se observa que permanece bajo hasta la fertilizacin. Esto quiere decir que la
actividad del MPF no cae porque se lo fosforile para inactivarlo acumulndose como cdc2 fosforilado- sino
porque se degrada la ciclina y desaparece el complejo ciclina kinasa.

Cmo se acopla la seal de reinicio de la meiosis con la activacin del MPF?

Un nivel alto de AMPc y por lo tanto una actividad PKA importante, mantiene inhibida la desfosforilacin
de la cdc2 del complejo pre-MPF

Una cada transitoria de AMPc permite la activacin del MPF y el reinicio de la meiosis y una vez activado
el MPF se hace independiente de la regulacin por el AMPc. La defosforilacin bajo el control de AMPc
se puede inhibir con IBMX que es un inhibidor de la fosfodiesterasa

El AMPc acta a travs de la PKA puesto que inhibidores de sta inducen el reinicio meitico en oocitos
bloqueados con IBMX. El nexo entre PKA y MPF no ha sido determinado.

Otras substancias como la insulina, el producto de un oncogn (RAS 21) y la progesterona (inhibe la
adenilciclasa), estimularan la meiosis en el oocito.
Normalmente la cada de MPF produce la descondensacin de los cromosomas, permite que se forme la
membrana nuclear y se desorganiza el huso mittico, esto normalmente permite la salida de la clula de la
mitosis. Estos fenmenos no ocurren luego de la cada de la actividad del MPF al final de la metafase I y esto
se debera probablemente a la activacin de otras kinasas que mantienen el estado de fosforilacin de estos
substratos, como las MAP kinasas.
En todo caso, recordemos que la accin de kinasas como el MPF o las MAP lo que hacen es inducir una
secuencia o cadena de fosforilaciones que llevan a:

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la condensacin de los cromosoma (fosforilacin de histonas)

la ruptura de la VG

la formacin del huso mittico

las modificaciones transcripcionales y traduccionales observadas en estas etapas.

Segunda detencin ovocitaria en Metafase II

Luego de reiniciada la meiosis, se elimina el primer cuerpo polar y el oocito vuelve a detenerse en metafase
II, condiciones en las cuales el oocito ser ovulado. En los vertebrados, vemos que este ovocito detenido en
metafase II, se caracteriza porque hasta el momento de la fertilizacin contiene altas cantidades de MPF,
pero sin embargo no hay degradacin de ciclina. Esto se debe a que tambin hay niveles altos de factor
citosttico o CSF dentro del oocito no fertilizado. No ha sido posible aislar este factor.
El producto del proto oncogen c-mos, la protena p39mos, podra representar una parte de la actividad CSF.
Se trata de una protena kinasa sensible al calcio (debido a que es degradada selectivamente por una
cisteina proteasa dependiente de calcio, como la llamada calpana) capaz de bloquear la degradacin de las
ciclinas.
El rol de c-mos ha sido bien estudiado en los anfibios:

participa en la activacin del MPF

su reactivacin despus de la metafase I

mantenimiento de la actividad MPF en metafase II.

La p39mos actuara en Xenopus activando por fosforilacin la MAP kinasa-kinasa, que activa la MAP kinasa.
La funcin de la p39mos es menos conocida en los mamferos pero la obtencin de ratas en que el gen cmos ha sido suprimido, ha permitido demostrar que ste interviene no solamente en el bloqueo de la
metafase II sino que tambin antes, en la secuencia de las MAPkinasas, la organizacin del huso y la
reactivacin del MPF despus de la primera meiosis.
La detencin en metafase II estara relacionada con la fosforilacin de la tubulina. El CSF es una protena
kinasa que se asocia a los microtbulos fosforilando la tubulina y de esta manera estabilizando el huso e
impidiendo la anafase. La estabilizacin de la ciclina podra deberse a la fosforilacin de la tubulina o de la
ciclina misma. Hay una estrecha relacin -cuyo mecanismo es desconocido- entre los sucesos que ocurren
en el citoplasma como la formacin del huso y el funcionamiento molecular del ciclo de divisin, siendo esto
ltimo un ejemplo de ello. Modificaciones postraduccionales de la tubulina podran tambin participar en la
estabilizacin del huso en metafase II as como la ausencia de centrolos en los centros de organizacin de
microtbulos situados en los polos del huso.
La reiniciacin de la meiosis ocurre si hay fecundacin o al menos un estmulo partenogentico. El
espermatozoide es el encargado de realizar la activacin ovocitaria. Tanto el espermatozoide como los
estmulos activadores experimentales, producen:

Influjo de calcio

Degradacin de la ciclina con inactivacin del MPF

Ver captulo de Activacin Ovocitaria

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Maduracin Citoplasmtica
Un oocito que ha presentado su maduracin nuclear puede ser fecundable, sin embargo si ha presentado
anomalas en su etapa de maduracin citoplasmtica, presentar anormalidades durante la fertilizacin y las
divisiones subsiguientes.
Durante la foliculognesis, el oocito aumenta drsticamente la cantidad de ribosomas y mitocondrias, lo que
le da una gran capacidad de sntesis proteica. En la ltima etapa de maduracin el oocito, por medio de la
sntesis del Male Pronucleus Growth Factor o MPGF, es responsable del buen desarrollo del
espermatozoide cuando este penetra su citoplasma.
Esta protena est presente en el citoplasma ovocitario desde el momento en que ocurre la disgregacin
membranaria de la vescula germinativa y sera responsable de:

la descondensacin de la cromatina nuclear del espermatozoide

romper los puentes di- sulfuros que existen en el ADN condensado -de fin de meiosis- de la cabeza
espermtica.

El MPGF es esteroide dependiente: el oocito humano cultivado con su cmulo en presencia de estradiol y
luego de 17 beta estradiol deviene capaz de descondensar el material gentico de la cabeza espermtica.
La naturaleza del MPGF es desconocida. Si eventualmente hubiera ms de un espermatozoide que se
introdujera en el citoplasma ovocitario, el MPGF no alcanza para descondensar la totalidad de material
gentico.
Como ya mencionamos existen descargas de calcio hacia el final del crecimiento ovocitario, la maduracin
citoplasmtica pudiera regularse por ondas de calcio dependientes de IP3 cerca del momento de la ruptura o
disgregacin de la VG

Maduracin membranaria. Zona pelcida

La membrana o zona pelcida (ZP) est constituida por tres tipos de glicoprotenas llamadas ZP1, ZP2 y
ZP3. Si bien se plante que las clulas foliculares la producan desde los primeras etapas de la
foliculognesis, hoy en da se reconoce al oocito como el principal responsable de su secrecin.
Experimentalmente, el oocito de Hamster no es reconocido por el espermatozoide de su misma especie si no
ha madurado. Esto ocurre en las horas previas a la ovulacin mediante la adquisicin de ciertas protenas.

protenas en la superficie de la ZP que son reconocidas por el espermatozoide de la misma especie. La

ZP, de 15-20 micrones de espesor, constituida por glicoprotenas, constituye as una barrera contra la
fecundacin heterloga (distinta especie).

protenas en la superficie de la ZP y en la matriz intercelular de las clulas de la corona radiata que

inducen la reaccin acrosmica de los espermatozoides en general y del que se una a la ZP en
particular.

La ZP, de 15-20 micrones de espesor, constituida por glicoprotenas, constituye as una barrera contra la
fecundacin heterloga (distinta especie).

Maduracin cortical. Reaccin cortical

Durante las ltimas etapas de la foliculognesis, el aparato de Golgi da lugar a grnulos de 300-500
micrones que van migrando hacia la periferia del ovocito y aumentando en nmero. El robservar la pesencia
de estos grnulos corticales (semejantes a lisosomas) en la periferia del ovocito constituye un signo de
maduracin ovocitaria. Al momento de la unin de la membranas citoplasmticas de los gametos y al
comienzo de la introduccin de la cabeza espermtica en el citoplasma ovocitario, el contenido de los

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grnulos corticales es liberado al espacio perivitelino. Las reacciones que ocurren en la membrana ovocitaria
(en animales inferiores) y la ZP como consecuencia de la liberacin del contenido de los grnulos, impiden la
poliespermia, es decir le entrada de otros espermatozoides al ovocito. Como ya mencionamos la migracin y
ubicacin de los grnulos en la regin cortical del oocito se produce mediante microtbulos (tubulina) y
tambin por la accin de actina que se encuentra en relacin a la membrana oocitaria. Los microtbulos
tienen de esta manera ingerencia en un adecuado bloqueo de la poliespermia. El aparato de Golgi es
tambin responsable de la formacin de otros tipos de grnulos relacionados con la secrecin de
glicoprotenas de la ZP durante toda la foliculognesis.

Maduracin de clulas periovocitarias: secrecin de moco

En los ltimos das previos a la ovulacin- las clulas periovocitarias contribuyen significativamente a la
secrecin de la ZP. La capacidad de producir mucopolisacridos (moco) y de disociarse en respuesta al alza
de gonadotrofinas (LH y FSH preovulatorio) es exclusiva de estas clulas en relacin al resto de las clulas
de la granulosa o foliculares (clulas parietales). La capacidad de producir mucopolisacridos (moco) y de
disociarse en respuesta al alza de gonadotrofinas (LH y FSH preovulatorio) es exclusiva de estas clulas en
relacin al resto de las clulas de la granulosa o foliculares (clulas parietales).
La FSH induce las clulas del cmulo a producir gran cantidad de cido hialurnico, de manera que se
dispersan en esta matriz. Posteriormente segregan condroitin sulfato y otros glicosaminoglicanos, que hacen
que los oocitos humanos estn rodeados de una capa de 1cm de grosor al momento de ser ovulados, que
los protege de la ovulacin y del trayecto por la tuba.

MADURACIN ESPERMTICA
Una vez concluida la espermiognesis, los espermatozoides liberados al lumen del tbulo, transitan hacia la
porcin ms caudal del epiddimo, donde se almacenan hasta la eyaculacin. El proceso de maduracin se
lleva a cabo en las vas genitales masculinas y femeninas, y tiene dos objetivos:
-

Adquirir movilidad

Que se encuentren capacitados para desencadenar una reaccin acrosmica

Vas genitales masculinas

Tres eventos marcan al espermatozoides durante su estada en el epiddimo:

ocurre una consolidacin de las enzimas acrosmicas: stas adquieren una estructura paracristalina
para preservarlas hasta el momento de la fecundacin.

el espermatozoide adquiere movimientos de progresin rpida y rectilnea eficaces que son

dependientes de andrgeno y de un estricto equilibrio del nivel intracelular de calcio que se mantiene
gracias a un gradiente de concentracin de calcio que va disminuyendo en el epiddimo.

el espermatozoide adquiere factores decapacitantes, constituidos por protenas y glicoprotenas

presentes en el lquido seminal, que se unen a la membrana plasmtica de la cabeza del
espermatozoide y se intercala colesterol libre entre los fosfolpidos de la bicapa membranaria.

Algunas protenas poseen un sitio receptor de glicanos. La presencia de estas protenas y de colesterol libre
puede ser considerada como factores de proteccin necesarios para la permanencia de los gametos en el
epiddimo y en el deferente. Este proceso dura 10 a 12 das aproximadamente. Los espermatozoides en el
eyaculado estn contenidos en el lquido seminal que es una mezcla de las secreciones del epiddimo, del
deferente, de las vesculas seminales, de la prstata y de las glndulas bulbouretrales de Cooper. Contenido
normal de espermatozoides segn la OMS (Organizacin mundial de la salud) es > 20 millones / cc de

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semen. Los espermatozoides presentes en el eyaculado no pueden fecundar el oocito. Desde 1951 se sabe
que los espermios deben haber permanecido un tiempo en las vas genitales femeninas para adquirir el
poder fecundante o capacitacin espermtica que se ver a continuacin.

Vas genitales femeninas. Capacitacin espermtica

El estado de capacitacin espermtica se caracteriza por la aparicin de movimientos hiperactivos, laterales
de la cabeza (1984) y por la factibilidad de realizar la Reaccin Acrosmica.
Los cambios membranarios que se detallarn a continuacin hacen tambin que el espermatozoide se
hiperactive adquiriendo movimientos de propulsin circular en vez de lineal.
En las vas genitales femeninas (mucosa uterina y tubaria) el pH uterino es bajo y estn presentes
glicosaminoglicanos, albmina y lipoprotenas. En la capacitacin que se realiza normalmente en las vas
genitales femeninas (capacitacin in vivo) entran en juego tres mecanismos a nivel molecular:

Eliminacin de las protenas de revestimiento: los glicosaminoglicanos presentes en el tracto

femenino fijan las protenas (factores decapacitantes) que poseen receptores a glicanos. La albmina
liga protenas unidas a la membrana en forma no covalente y el ph bajo (ph=6,4) acta en este
mismo sentido.

La albmina y lipoprotenas (LDL y HDL estn presentes en tracto genital femenino) son aceptores de
colesterol libre, y extraen una parte del colesterol libre de la membrana.

Enzimas del tracto genital femenino reordenan las cadenas glucdicas de las protenas
membranarias.

Recordemos que los principales fosfolpidos de la bicapa membranaria son fosfatidil etanolamina,
fosfatidilserina, fosfatidilcolina, y fosfatidilinositol; el colesterol libre intercalado entre los fosfolpidos influye en
el nivel de rigidez de la membrana y la unin de Calcio a la fosfatidilserina hace que sta no estabilice ms a
la fosfatidil etanolamina, la que se agrega entonces en micelas.
La eliminacin de las protenas de revestimiento primero, y del colesterol libre despus, hace que los
fosfolpidos membranarios de la membrana plasmtica del espermio, puedan movilizarse; esto permite la
penetracin de iones, entre los cuales se encuentra el Calcio que se une a la fosfatidilserina. La
fosfatidilserina no estabiliza entonces la fosfatidil etanolamina que ya no forma la bicapa lipdica sino micelas,
lo que fluidifica an ms la membrana. Las protenas transmembranarias implicadas en el reconocimiento y
fijacin a la ZP3 devienen de esta manera identificables y mviles.
En realidad, la capacitacin se lleva a cabo en un espermatozoide que ha permanecido previamente en las
vas genitales masculinas. De hecho, en las especies en que la estada de los espermatozoides en las vas
genitales masculinas es muy corto (aves), casi no es necesaria la capacitacin posterior en las vas genitales
femeninas previamente a la fecundacin. Por otra parte, mientras ms largo es el perodo que permanecen
en las vas genitales masculinas, mayor el tiempo de duracin del estado de capacitacin en las vas
genitales femeninas

Capacitacin in vitro
Es posible obtener la capacitacin espermtica en un medio artificial, mediante lavados sucesivos de los
espermatozoides. Esta capacitacin in vitro se obtiene poniendo en suspensin los espermatozoides con un
glucosaminoglicano como la heparina y un aceptor de colesterol como la albmina srica. En estas
condiciones, a diferencia de condiciones in vivo, se necesita que haya una gran concentracin de
espermatozoides, ya que los espermios muertos o que han sufrido la reaccin acrosmica contribuyen a la
modificacin membranaria de los espermatozoides intactos.

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La Reaccin Acrosmica (RA)

Consiste en la fusin en varios puntos, de la membrana celular de la cabeza del espermatozoide con la
membrana externa del acrosoma. Ambas desaparecen, dejando una regin desprovista de ambas
membranas, es lo que se llama la FENESTRACION. Como consecuencia de lo anterior se liberan las
enzimas acrosomiales al exterior (acrosina y hialuronidasa). La presencia de enzimas que permanecen en la
membrana interna acrosomial, permiten la penetracin de la membrana pelcida. La R.A. se desencadena
por una entrada masiva de Ca al interior del espermatozoide y slo en los espermatozoides capacitados; el
% de espermatozoides capacitados aumenta por factores presentes en los envoltorios del oocito: corona
radiata y membrana pelcida. El porcentaje de espermatozoides capacitados in vitro es menor que el
obtenido en la capacitacin natural. Como veremos ms adelante, la RA del espermatozoide fecundante
ocurre una vez que ste se ha adherido a la membrana pelcida.

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