24

BAB III
METODE PENELITIAN

3.1. Tempat dan Waktu Penelitian

3.1.1. Waktu Penelitian
Penelitian dilaksanakan selama 3 minggu, dimulai dari tanggal 4 sampai 23
maret 2014
3.1.2. Tempat Penelitian
Pembuatan Ekstrak kulit buah manggis (Garcinia mangostana L.)
dilakukan di Laboratorium Program Studi S2 Bioteknologi Universitas Udayana,
Bali, dan untuk penelitian dilakukan di Laboratorium Kesehatan Masyarakat
Rumah Sakit Tingkat III Udayana, Denpasar Bali.
3.2. Alat dan Bahan Penelitian
3.2.1. Alat
Alat-alat yang dipergunakan dalam penelitian ini adalah : Autoclave,
Inkubator, Gelas ukur, Rotary evaporator, Kain kasa, Pisau, Tabung Reaksi, Tissu,
Cottom swab, Micropipet, Kaki tiga, Petridisk, Jangka sorong, Blender,
Aluminium foil, Labu ukur, Alat tulis, Pembakar Bunsen, Pembakar Spritus,
Batang pengaduk, Bulp filler, Ose, Erlenmeyer, Laminar air flow.
3.2.2. Bahan
Bahan yang dipergunakan dalam penelitian ini adalah: Kulit buah manggis
(Garcinia mangostana L.), Biakan Escherichia coli, Media MH (Muller Hinton),
Media TSA (Trypticase Soy Agar), H2SO4, BaCl2, Aquadest, Alkohol 96%, Blank
disk

25
3.3. Rancangan Penelitian
Penelitian ini menggunakan rancangan penelitian acak lengkap, perlakuan
berupa konsentrasi ekstrak kulit manggis (Garcinia mangostana L.) yang terdiri
atas 5 konsentrasi yaitu 0%, 25%, 50%, 75% dan 100%, kemudian dilakukan
pengulangan sebanyak 5 kali sehingga terdapat 25 unit penelitian.
3.4. Populasi dan Sampel
3.4.1. Populasi
Populasi penelitian ini adalah buah manggis (Garcinia mangostana L.)
yang diperoleh dari pasar Kumbasari yang berada di wilayah Kota Denpasar, Bali.
3.4.2. Sampel
Sampel yang dipergunakan dalam penelitian ini adalah ekstrak kulit buah
manggis (Garcinia mangostana L.) kering. Ektrak tersebut kemudian dibuat
variasi konsentrasi yaitu 25%, 50%, 75%, dan 100%. Jumlah pengulangan yang
dilakukan pada penelitian ini menggunakan rumus umum : (t-1)(r-1) 15 dimana
t adalah jumlah perlakuan dalam penelitian dan r adalah Jumlah perlakuan ulang
sampel. Pada penelitian ini t = 5 sehingga dari persamaan tersebut didapatkan
r = 5 artinya pengulangan dilakukan sebanyak 5 kali

Kelompok I

Kelompok II : ekstrak dengan konsentrasi 75 % = 5 sampel

Kelompok III : ekstrak dengan konsentrasi 50 % = 5 sampel

Kelompok IV : ekstrak dengan konsentrasi 25 % = 5 sampel

Kelompok V : Kontrol negatif menggunakan aquadest steril = 5 sampel

: ekstrak dengan konsentrasi 100 % = 5 sampel

26

3.5. Prosedur Penelitian

Penelitian uji sensitifitas bakteri Escherichia coli terhadap ekstrak kulit
buah manggis (Garcinia mangostana L.) secara in-vitro dilakukan dengan
langkah- langkah sebagai berikut :
3.5.1. Pembuatan Ekstrak Kulit Buah Manggis
Ektraksi kulit buah manggis (Garcinia mangostana L.) dilakukan di
Laboratorium Program Studi S2 Bioteknologi Universitas Udayana, Bali. Kulit
buah manggis (Garcinia mangostana L.) dipotong kecil-kecil, dibersihkan
kemudian dikeringkan dan di angin-anginkan pada tempat yang tidak terkena
sinar matahari secara langsung. Potongan kulit buah manggis yang telah kering
sebanyak 1000 gram di blender sampai halus. Kulit buah manggis yang telah
halus dimaserasi atau direndam dengan 1 liter etanol 96% selama 24 jam, meserat
yang dihasilkan kemudian disaring. Ampas yang didapatkan dimaserasi kembali
dengan 3 kali pengulangan masing-masing menggunakan 2 liter etanol 96%
selama masing-masing 24 jam. Maserat yang diperoleh melalui penyaringan
ditampung, diendapkan semalam, kemudian diuapkan dengan rotary evaporator
untuk mendapatkan ekstrak kental (Maliana et al, 2013).
3.5.2. Sterilisasi Alat
Semua alat yang akan digunakan disterilisasi dengan cara di cuci terlebih
dahulu sampai bersih. Kemudian dibungkus dengan aluminium foil, selanjutnya
disterilisasi di dalam autoclave pada suhu 121C selama 15 menit. Setelah
disterilisasi, alat-alat ini dikeringkan dalam oven 100C untuk menghilangkan uap
yang mungkin tertinggal akibat sterilisasi basah dengan autoclave.

27

3.5.3. Pembuatan Media

a) Media Muller Hinton (MH)
Disiapkan alat dan bahan yang akan digunakan. Ditimbang media
Muller hilton sebanyak 1,53 gram lalu dimasukkan ke dalam erlenmeyer
dan ditambahkan aquadest sebanyak 45 ml. Dipanaskan media di atas
pembakar bunsen sambil di aduk kemudian disesuaikan pH antara 7,30,1.
Ditutup mulut erlenmeyer dengan kapas steril untuk menghindari
kontaminasi kemudian media disterilisasi dalam autoclave pada suhu 121C
selama 15 menit. Media Muller hilton yang telah disterilisasi didinginkan
dengan waterbath hingga suhu 50C kemudian dituang pada petridish
masing-masing 15 ml secara aseptis di dalam laminar air flow. Media
dibiarkan mengeras kemudian diletakkan terbalik untuk mencegah uap air
membasahi permukaan media. Diinkubasi satu plate media dalam inkubator
pada suhu 37C selama 24 jam sebagai control untuk melihat kualitas
media terhadap adanya kontaminasi.
b) Media Trypticase SoyAgar (TSA)
Disiapkan alat dan bahan yang akan digunakan. Ditimbang media
TSA sebanyak 1,2 gram lalu dimasukkan ke dalam erlenmeyer dan
ditambahkan aquadest sebanyak 30 ml. Dipanaskan media di atas
pembakar bunsen sambil diaduk kemudian disesuaikan pH antara 7,30,1.
Ditutup mulut erlenmeyer dengan kapas steril untuk menghindari
kontaminasi kemudian media disterilisasi dalam autoclave pada suhu
121C selama 15 menit. Media TSA yang telah disterilisasi didinginkan
dengan waterbath hingga suhu 50C kemudian dituang pada petridish

28
masing-masing 15 ml secara aseptis di dalam laminar air flow. Media
dibiarkan mengeras kemudian diletakkan terbalik untuk mencegah uap air
membasahi permukaan media. Diinkubasi satu plate media dalam
inkubator pada suhu 37C selama 24 jam sebagai control untuk melihat
kualitas media terhadap adanya kontaminasi.
3.5.4. Pembuatan Larutan Ekstrak Kulit Buah Manggis
Ekstrak kulit buah manggis yang telah didapatkan dibuat beberapa
konsentrasi mulai dari 25%, 50%, 75%, dan 100% dengan cara dilarutkan dengan
aquadest steril sebagai pelarut, pengambilan larutan dilakukan dengan
menggunakan pipet ukur, Berikut pembuatannya :

3.5.5

a) 100 %

: 1 ml ekstrak kulit buah manggis.

b) 75%

: 0,75 ml ekstrak kulit buah manggis + 0,25 ml Aquadest.

c) 50%

: 0,5 ml ekstrak kulit buah manggis + 0,5 ml Aquadest.

d) 25%

: 0,25 ml ekstrak kulit buah manggis + 0,75 ml Aquadest.

e) 0%

: 1 ml Aquadest.

Pembuatan Standar Mc. Farland 0,5

Disiapkan alat dan bahan yang akan digunakan. Dibuat larutan BaCl2

1,175% dengan cara ditimbang 1,175 gram BaCl 2.2H2O lalu dilarukan dengan
aquadest sampai volume 100 ml. Dibuat larutan H2SO4 1% dengan cara
mengencerkan H2SO4 pekat 97% sebanyak 1,03 ml dengan aquadest hingga
volume 100 ml. Standar Mc. Farland 0,5 dibuat dari 0,5 ml 1,175% BaCl2.2H2O
ditambah 99,5 ml H2SO4 1% (Mahon et al., 2011). Standar kekeruhan ini
dimasukkan ke dalam tabung reaksi dengan ukuran dan ketebalan yang sama

29
dengan yang dipakai untuk membuat suspensi bakteri. Tabung ini ditutup agar
tidak terjadi penguapan.
3.5.6. Pembuatan Suspensi Bakteri
Disiapkan 5 ml NaCl 0,85% steril dalam tabung reaksi. Kemudian diambil
beberapa koloni Escherichia coli dengan menggunakan ose secara aseptis dari
media TSA. Dimasukkan ke dalam tabung reaksi yang berisi NaCl 0,85% lalu
dihomogenkan untuk kemudian dibandingkan dengan standar Mc. Farlan 0,5.
Suspensi bakteri dengan kekeruhan standar Mc. Farlan 0,5 sebanding dengan
konsentrasi bakteri 1,5x108 CFU/ml (Mahon et al., 2011).
3.5.7. Penanaman Escherichia coli pada Media Muller Hilton.
Disiapkan alat dan bahan yang akan digunakan. Suspensi Escherichia coli
yang telah distandarisasi kekeruhannya dicelupkan cotton swab steril, ditunggu
bebeapa saat agar suspensi meresap ke dalam kapas. Kemudian cotton swab steril
diangkat dan diperas dengan ditekan-tekan pada dinding tabung bagian dalam
sambil diputar-putar. Digoreskan merata pada permukaan media Muller hilton
sebanyak 3 lapis. Dibiarkan media Muller hilton tersebut selama 5-15 menit agar
suspensi Escherichia coli meresap ke dalam agar Muller Hilton.
3.5.8. Uji Aktivitas Antibakteri Ekstrak Kulit Buah Manggis
Disiapkan alat dan bahan yang akan digunakan. Ekstrak kulit buah
manggis yang Telah dibuat dalam beberapa konsentrasi dihomogenkan terlebih
dahulu.Setelah homogen, dimasukkan blank disk kedalamnya kemudian ditunggu
selama 15-30 menit. Disk diletakkan pada media Muller hilton yang telah ditanam
bakteri uji, kemudian diinkubasi dalam inkubator pada suhu 37C selama 24 jam.

30
Dilakukan dua kali pengujian untuk setiap konsentrasi ekstrak kulit buah manggis.
Diameter zona hambat diukur dengan jangka sorong kemudian hasil dicatat pada
tabel pengamatan.
3.6. Analisis Data
Data dari hasil penelitian ini di analisis dengan mengunakan analisis
varian, dalam hal ini terlebih dahulu dilakukan uji normalitas shapiro wilk dan
homogenitas untuk mengetahui data berdistribusi normal dan homogen. Jika data
normal dan homogen maka dianalisis dengan analisis varian, tetapi jika data tidak
homogen maka dianalisis dengan menggunakan analisis non parametrik yaitu Uji
Kruskall-wallis dan dilanjutkan dengan Uji Mann-whittney. Analisis dilakukan
dengan menggunakan program SPSS (Stastistical Package for the Social Sciences
16.0).