Introduccin a los Bioprocesos Teora 1 (24/08/2016)

Procesos Fermentativos
Qu entienden por bioprocesos? En el caso de los procesos biolgicos hay una
transformacin de la materia, que particularmente recibe el nombre de sustrato
biolgico y como tal va a comprender el uso de clulas u organismos o de sus partes
como son las enzimas. Entonces, incluye un poco a los procesos bioqumicos que sera
el tratamiento de las enzimas particularmente.
La transformacin del sustrato se da por distintos microorganismos, para el caso
particular de bioprocesos microbianos. Como es con microorganismos, en ese entorno
va a ocurrir lo que se denomina fermentacin. Por lo tanto, es comn encontrar una
sinonimia entre lo que es un bioproceso y un proceso fermentativo. Mayormente los
trabajamos como sinnimos.
Fermentacin tiene tambin dos concepciones, en microbiologa ustedes habrn visto
un concepto ms bioqumico de la fermentacin y que tiene que ver con una manera
de transformar ese sustrato para obtener energa ms ineficiente que la respiracin
aerbica, pero hay tambin un concepto microbiolgico que tiene que ver con el
cultivo. Entonces, se llama fermentacin a cualquier tipo de cultivo sea aerbico o
anaerbico (fermentacin propiamente dicha). Por eso es que se habla de biorreactor
o de biofermentador de manera prcticamente indistinta, o van a encontrar por ej en
la bibliografa de que se habla de una fermentacin ctrica, cuando en realidad es un
proceso estrictamente aerbico y que prcticamente no existe fermentacin o no se
busca que haya un proceso fermentativo concomitante con la respiracin aerbica
para evitar prdidas en el rendimiento de lo que es la produccin de cido ctrico.
Cuando uno se introduce en los bioprocesos surge una infinidad de cuestiones. En
OPB 1 vieron que un determinado producto poda llegar a definir un tamao de
reactor, sobre bases cinticas, de productividad, el crecimiento microbiano. Por
dnde se comienza a trabajar cuando uno se encuentra de cero enfrente de un
desarrollo de un bioproceso? Se debe saber que:
-microorganismos o que lneas celulares son capaces de sintetizar el producto de
inters, como conseguirlas y luego como se las mantiene.
-cules son las materias primas que son necesarias para formular los medios de
cultivo o los buffer utilizados en el proceso extractivo del producto de inters.
-El tamao de los equipos. Si se parte de una estructura de cero o existe un
condicionamiento de una estructura preexistente, que por ejemplo en un cierto
periodo de tiempo en el ao producen bioinoculantes para el agro y el resto del
tiempo el fermentador esta inutilizado. Entonces se le podra dar a la planta un valor
agregado para que durante los tiempos muertos la planta produzca otra cosa, para
eso se debe ver que adaptacin se le hacen a los equipos con una mnima inversin.
-Modo de operacin de los reactores: de manera continua, semicontinua, discontinua.
-Ver si hay aprobaciones regulatorias que necesita el producto a desarrollar. Es decir,
los estados nacionales deberan controlar y corroborar que los productos cumplan con
los requisitos de por ej un cdigo alimentario o de una farmacopea que exigen que
tenga.
-Ver si hay algn impacto ambiental en el proceso que se va a producir.

-Ver si hay subproductos que pueden mejorar la economa del proceso productivo.
-Ver qu tipo de profesionales se requieren.
-Tiempo que va a demandar recuperar la inversin hecha.
Para empezar a entender un poco todo esto e ir respondiendo aunque sea
parcialmente alguna de esas cuestiones vamos a ver como se compone un proceso
fermentativo.
El proceso fermentativo tiene esencialmente tres etapas. La primera que engloba el
desarrollo del inculo y a la preparacin del medio de cultivo. La segunda que est
dada por la produccin propiamente dicha en un cultivo en un biorreactor en un
tamao requerido para esa demanda de mercado. La tercera etapa es la que tiene
que ver con los aspectos aguas debajo de la produccin y que son: la separacin del
producto cultivado en el fermentador y el tratamiento de los efluentes, en donde el
tratamiento de efluentes puede ser abordado como un bioproceso particular. Esta
clasificacin y tomando un poco el ejemplo de la petroqumica, reparte lo que es la
primer etapa que es el desarrollo del inculo y la preparacin del medio de cultivo de
una tercera etapa que tiene que ver con el producto y los efluentes en dos grupos que
se denominan upstream y downstream. Tambin por homologa algunos autores,
refieren a la etapa 2 del cultivo de produccin como midstream (etapa intermedia). Si
uno representa eso que dijimos en una manera ms esquemtica.

Se puede ver una figura grande que representa al biorreactor de produccin en la

etapa de midstream.
Las figuras que estn seguidas con flechas azules son las que corresponden al
desarrollo del inculo. Se identifica lo que sera un primer conservado (en un criovial),
un Erlenmeyer en las primeras etapas de cultivo, un prefermentador que luego va a
pasar a un fermentador de produccin.
En rojo se puede ver lo que tiene que ver con el desarrollo del medio de cultivo. Desde
el acopio, la recepcin, la evaluacin de la materia prima para prepararlo. La
preparacin propiamente dicha, cuidando la mezcla, la disolucin de los componentes
y por supuesto la esterilizacin, la mayora de los bioprocesos requiere una
esterilizacin tanto del medio de cultivo, como de los equipos (fermentadores y lneas
de conexin). Hay procesos particulares que no se valen de esto como la elaboracin
de cerveza, donde el medio de cultivo no tiene una esterilizacin estricta, sino que
tiene un hervor y adems se trabaja en pH cido y con los componentes del lpulo
que le da el sabor amargo y aromtico a la cerveza y tiene propiedades

antimicrobianas, que genera un medio selectivo, en donde solo van a desarrollarse

microorganismos (deben tolerar el pH cido y los antimicrobianos) como la levadura y
lactobacilos. El proceso anaerbico de la fermentacin alcohlica de la cerveza es
tambin refractario a ciertas contaminaciones. En la produccin de vinagre que se
hace a pH muy cidos tambin suelen no esterilizar los mostos que se usan. Pero en
un proceso muy especfico como puede ser la produccin de un biofarmaco
recombinante si va a exigir una esterilizacin muy cuidadosa del medio de cultivo,
que se lo controle y se demuestre todo a travs de planillas y controles de calidad.
En verde tenemos sealadas las etapas del downstream.
Desarrollo del inculo
El desarrollo del inoculo se entiende como una sumatoria de acciones necesarias para
obtener la cepa, conservarla y propagarla o amplificarla hasta el sistema de
produccin, en calidad y cantidad adecuadas.
Obtencin de la cepa
Aislamiento: Es el mtodo ms clsico, tradicional y con muchsima vigencia. El
relevamiento de la biosfera es an muy exiguo, entonces las compaas
farmacuticas invierten mucho dinero en aislar clulas vegetales con distintos
principios activos o microorganismos con ciertas propiedades tecnolgicas que
interesan como la produccin de ciertas enzimas, metabolitos, entre otros.
Hay distintas tcnicas de aislamiento. Por ej. Para el aislamiento de ciertas cepas
productoras de antibiticos, particularmente en el caso de bacterias filamentosas, las
Streptomyces se hacen mtodos de bsqueda. Entonces se toma tierra (nicho de
estas bacterias filamentosas), se hace una siembra de lo que se aisl y que a priori es
una bacteria filamentosa y se la enfrenta con distintas cepas contra las que se busca
que haya una actividad biolgica que sea capaz de producir un metabolito que inhiba
el desarrollo de levaduras, de hongos filamentosos o de otras bacterias para usarlo en
alimentos, teraputica, medioambiente. Entonces, se siembra la cepa de la bacteria
filamentosa y las cepas de bacterias u hongos que se sospecha que tiene la primera
una actividad biolgica. Se deja cierto tiempo de incubacin y luego se sacan las
placas y se hacen siembras perpendiculares a la anterior, de esas bacterias contra las
que se busca una determinada actividad biolgica (en la figura se identifican como 1,
2, 3, 4 y 5). En la figura se observan 2 cepas de Actinomycetes (cepa 5 y cepa 6). En
la cepa 5 se ve que todas las cepas contra las que se busca actividad biolgica
(excepto 1) crecen hasta el borde de la colonia del Actinomycete. Actinomycete se
espera que sea capaz de producir un metabolito capaz de inhibir el crecimiento de las
colonias de bacterias contra las que se busca actividad biolgica. En la colonia 1 se
sembr toda la estra, pero creci slo en la parte inferior, esto habla de que muy
probablemente la colonia de Actinomycete haya producido una sustancia que difundi
e inhibi el crecimiento de la colonia 1, pero que fue inefectiva para inhibir al resto de
las colonias. Esta actividad biolgica no la tiene la cepa de Actinomycete 6 (la cepa 1
creci bien hasta el borde). Esta prueba de tipo screening sirve para ir continuando
los estudios y anlisis del actinomycete cepa 5 para identificarlo adecuadamente, ver
el metabolito en otras condiciones, y repetir el ensayo sobre todo por la cepa 1 para
saber si se reproducen o fue una cuestin de la tcnica como ser: el ansa estaba
demasiado caliente, hubo poco inculo y slo se sembr en ese punto, o una cuestin
nutricional (una cepa al crecer primero se consumi una serie de nutrientes que la
cepa 1 necesitaba para desarrollarse y no haba suficiente cantidad).

Ac hay otro ejemplo donde se hace un primer csped y en el mismo momento que se
hace el csped se siembra por puncin la colonia de microorganismos que se
sospecha que tenga actividad biolgica. El csped va a contener el microorganismo
contra el que se busca una determinada actividad biolgica. Como se puede ver,
entorno a las colonias se forman unos halos blanquecinos debido a la ausencia de
desarrollo del Micrococcus luteus, cepa amarillenta constituyente del csped en la
placa de petri. Podra haber algo que se est produciendo descontando las hiptesis
planteadas en el primer ejemplo. Tambin hay otros microorganismos con colonias de
color blanco con la misma cepa de Bacillus turgensis cepa 2, donde esa actividad de
inhibicin no se manifiesta.

Algo parecido se puede hacer cuando se buscan enzimas o metabolitos, en esas

pruebas de screening. Las enzimas muchas veces se pueden poner de manifiesto por
la formulacin de medios de cultivo diferenciales, donde el medio va a contener
alguna molcula que puede ser sustrato de esa enzima o que puede ser un indicador
y que al consumirse el sustrato o producirse el producto que se espera cambie el pH
del entorno de la colonia en presencia de la enzima que actu, poniendo en
manifiesto indirectamente la presencia de la enzima. En la imagen se ve como se
produce un precipitado con una lecitinasa que producira la colonia 3 de
Actinomycete, y no la producen el resto de las colonias. En el caso de la ureasa (hay
un aislamiento negativo y uno positivo) hay un viraje de color desde el amarillo al rojo
debido a la alcalinizacin del medio provocada por la accin de esa enzima. Hay ms
ejemplos que pueden encontrarse en la bibliografa sobre el tema del aislamiento.

Modificacin de una cepa: Dado una cepa que se sabe que tiene una propiedad
biolgica, a lo mejor los ttulos que producen del metabolito o las actividades

enzimticas que producen no son suficientes como para que sea una cepa
competitiva en un bioproceso, es decir produce tan poco que los rendimientos van a
ser tan bajos que la economa del proceso no cierra. Entonces esa cepa se puede
mejorar. Hay ejemplos clsicos que tienen que ver con los antibiticos, a travs de
mtodos como mutaciones usando mutagenos qumicos y fsicos se fue haciendo que
ciertas cepas vayan ganando ciertas propiedades de la produccin de la enzima. En el
caso de la penicilina, entre 1940 a 1950 se aument el ttulo de la penicilina 400
veces mediante el mejoramiento por mutaciones.
Hoy las modificaciones que se hacen, son ms bien de lo que se llaman
modificaciones racionales, ya que se someten a mutaciones a las poblaciones. Hay
que ver como es, si se irradia la cepa o se la enfrenta a un mutageno qumico muy
agresivo y se genera una gran mortandad de las clulas viables iniciales que se
pusieron en contacto con el mutageno. Se seleccionan aquellas que sobreviven, se
buscan condiciones donde no sobrevivan ms del 10-20%, para de esta manera
aumentar las chances de encontrar alguna cepa que tenga la propiedad tecnolgica
buscada ms exacerbada, esto se da de forma aleatoria o al azar e implica mucho
trabajo ya que se debe aislar y probar cada uno de los aislamientos que sobrevivieron
al aislamiento y ver si posee la actividad biolgica buscada. En la medida que fue
avanzando la biologa molecular y que se pudieron conocer los genomas, se pudo
aplicar mtodos ms racionales. Se conocen qu pasos enzimticos son los pasos
claves, los pasos limitantes de las reacciones de sntesis. Esto se conoce como
ingeniera metablica. Aumentando el nmero de enzimas que pueden estar en
defecto, bloqueando ciertas enzimas que por ah distraen al intermediario hacia otra
ruta de sntesis distinta al metabolito de inters.
Construccin de las cepas: Esto significa partir desde cero. El caso tpico es de E. coli,
la cual no tiene en su genoma la posibilidad de producir la hormona de crecimiento
humano ni insulina. Entonces por mtodos moleculares se transforman algunas cepas
con los genes de inters para que puedan expresar la protena codificada en el gen y
recuperarla.
Compra: Es un mtodo en paralelo con el aislamiento. Rara vez se puede encontrar la
cepa altamente eficiente tecnolgicamente en un cepario que las venda con fines
lucrativos. A veces, las universidades las venden, pero restringen su uso comercial y
son slo para estudios acadmicos. Y no se puede sacar redito de esas cepas. Para la
venta de cepas existen ceparios: ATCC, ARS (agricultura de los estados unidos),
DSMZ, ABAC (argentina), etc.
Otro aspecto importante en el desarrollo del inculo es la conservacin de las clulas.
Los ceparios tienen un rol fundamental en conservar las cepas que se aisalaron y que
se depositaron ah. Cada institucin, cada laboratorio que trabaja en microbiologa o
en bioprocesos es comn que tenga su propio cepario a una escala mucho ms
pequea. En la facultad hay un cepario que tiene levaduras de inters microbiolgico,
clnico y ambiental que est a cargo de la catedra de microbiologa general. Cuando
se trabaja con clulas animales se habla de banco de clulas y no de cepario que est
relacionado con microorganismos bacterias, hongos filamentosos, levaduras,
protistas.
Para conservar la cepa de inters tecnolgico los mtodos ms comunes y eficientes
son dos: la criopreservacin y la liofilizacin. La criopreservacin implica el uso de frio
y por lo tanto se debe tener una cierta infraestructura, ya sea un freezer (-80C a
-120C) o termos de nitrgeno lquido que pueden trabajar a temperaturas mucho

ms bajas (-196C), en este ltimo la conservacin es mucho ms eficiente. Siempre

se suele usar crioprotectores y protocolos para conservar (se baja la temperatura
gradualmente y se utilizan crioprotectores como: sacarosa, glicerol y dimetilsulfxido).
La funcin de los crioprotectores es evitar que se formen cristales de agua, dentro de
la clula, muy grandes que terminan siendo dainos para la clula porque la rompen
durante el proceso de congelacin. Son molculas que contienen muchos oxgenos,
pueden formar puentes de hidrgeno con estas molculas de agua y forman cristales
ms pequeos que no son tan dainos. De todas formas, esto tiene que estudiarse
muy bien ya que algunos crioprotectores son muy txicos para la clula y quizs
durante la congelacin proteja la clula, pero en el momento de descongelarla si no
se la elimina inmediatamente la clula no crece y termina muriendo.
La liofilizacin tambin requiere un equipo denominado liofilizador. Es un proceso que
debe estudiarse y no todo puede liofilizarse (clulas animales, clulas de insecto,
clulas vegetales). Mediante este mtodo se obtiene un producto liofilizado que es
mucho ms robusto que el producto que se conserva a temperaturas bajas, se pueden
aislar y recuperar los fenotipos despus de 35 aos. El liofilizado se puede mantener a
temperatura ambiente o en heladera y no depende tanto de un equipo de frio.
Estudio de los crioprotectores: se hizo un estudio con la
cepa Bacillus licheriformis (este gnero se caracteriza
por ser gram (+) y por formar esporos luego de crecer y
llegar a una fase estacionaria), esta cepa CJ4648 no
esporula, ya que es una cepa que se la ha mutado para
lograr ese perfil tecnolgico. Si uno trabaja con Bacillus
o con algn microorganismo que esporule lo ms
comn es conservar el esporo, ya que es la estructura
de resistencia de la especie. Pero esta cepa en
particular, al no formar esporos se la debe conservar
con crioprotectores. Despus de conservarlo durante
determinado tiempo, se lo resuspende esos cultivos
conservados
con
distintas
concentraciones
o
porcentajes de glicerol (20-25%) con Tween, con Tween DMS al 15% y otras sin
crioprotectores. Es para ver la importancia de un estudio previo. En el caso del DMS al
15%, tambin debera verse que ocurre al 5% y al 10% y si es tan efectivo como
crioprotector ya que sera menos txico. Pero existe un enlentecimiento entre que el
microorganismo se inocula y comienza a desarrollarse; a diferencia de otros como es
el tween (marcado con un crculo) que el cultivo arranca de manera exponencial.
Muchas veces lo que se hace para medir la eficiencia de estos mtodos es evaluar la
fase lag. Si la fase lag es eterna significa que el microorganismo no crece y muri. O
la fase lag puede demorar ms. Hay que tener en cuenta que en la figura la duracin
de la fase lag no dura eso, sino que debe hacerse una transformacin a la grfica para
que la representacin sea logartmica, cosa que no es la figura presentada. Las fases
de crecimiento se miden en base a ese concepto de la cintica de crecimiento de
primer orden que tendra el microorganismo.

Otro de los aspectos para el desarrollo del inculo es el establecimiento de un

protocolo ptimo para la propagacin o amplificacin hasta el biorreactor de
produccin en calidad y cantidad adecuada.

Se tiene la cepa, sabemos conservarla, cmo la propagamos? Hay dos variables a

tener en cuenta en el protocolo para amplificar la cepa:
-Edad del inculo: Con el conservado se inocula un medio de cultivo, el cultivo
comienza a desarrollarse. cundo el desarrollo de ese cultivo es ptimo para
transferirlo al biorreactor de produccin? Cuando est en la fase exponencial
temprana, exponencial intermedia, exponencial tarda o estacionaria. Es decir, en que
fase de crecimiento esta.
-Tamao del inculo: es el volumen de inculo que se utiliza segn el tamao del
reactor, nmero de anzadas.
Incidencia de la edad del inculo sobre el rendimiento del aceite en el micelio de un
hongo.
Con el siguiente ejemplo se trata de ver la importancia de la edad y tamao del
inoculo sobre el rendimiento de un producto que es aceite que produce un hongo
filamentoso. Se inocula con conidios (que se pueden tomar de una estra del
conservado) (a los 7, 14, 21, 28 das de desarrollo del hongo), se respeta la cantidad
de conidios por ml de medio, para independizarse de la variable tamao del inculo y
simplemente estudiar la edad del inculo. Se vio que con los conidios que tienen una
semana, el porcentaje de aceite que es capaz de almacenar el micelio es mucho ms
alto que el resto y conforme envejece cae (excepto una ligera dispersin entre los 21
y 28 das). Entonces, se puede concluir que el ptimo son 7 das sobre las bases
experimentales? No, ya que no se ha estudiado por debajo y por encima de 7das, si
se sabe que, entre 7 das y 14 das, 7 das es mejor. Por lo tanto, el proceso de
optimizacin pasa por una puesta en valor de los estudios preliminares que se han
hecho. Esta experiencia ameritara seguir investigando en torno a los 7 das y tambin
porque las curvas se invierten abajo (curvas 4 y 5).

Lunin, V.V. et al. (2013) Biodiesel fuel

production from lipids of filamentous fungi.
Applied Biochemistry and Microbiology 49:
46-52

Incidencia de la edad del inculo sobre el rendimiento del metabolito secundario de

Actinomycete.
Se representa la curva de crecimiento de un microorganismo en el tiempo, pero este
microorganismo, a diferencia de los mtodos tradicionales de recuento como recuento
en placa y cmara de Neubauer, este utiliza mtodos indirectos: la tasa de produccin
de CO2. Un metabolismo ms activo implica ms produccin de CO 2 y la menor
produccin del metabolito implica menor produccin de CO 2, esto permite identificar
ms claramente en las tres fases de cultivo a clulas jvenes y viejas. En cada una de
estas fases se toman muestras. La 1 es temprana, la 2 es intermedia y la 3 tarda. Con
esas muestras de cultivos en los distintos estadios fisiolgicos se siembran 3

fermentadores y se estudia la evolucin en cada uno de los fermentadores. Se mide

de nuevo que pasa con la produccin celular (biomasa) en los distintos estadios
fisiolgicos. Se vio que, independientemente de la edad del inoculo, la primera fase
tiene un crecimiento muy acelerado y hay una ligera discrepancia en cuanto a los
rendimientos que se pueden obtener hacia las 40 hs de cultivo. Donde el inculo
intermedio estara por encima del inoculo temprano y tardo. Pero esto es biomasa y
ac interesa producir metabolitos secundarios. Por esto no podemos quedarnos con la
informacin de la biomasa y decir que el intermedio es el que ms rinde y utilizar ese
inculo, sino que realmente hay que ver y cuantificar el metabolito secundario que es
lo que realmente interesa, esto se representa en la grfica 2. El del inculo
intermedio, que es el de mayor ttulo o concentracin del metabolito secundario
(sobrenadante) ha permitido obtener, con un mximo que est en las 150 h y que ese
ttulo se podra alcanzar con el inculo tardo a unas 48-50 h despus. Y aquel cultivo
realizado con el inoculo tardo que aunque dio en biomasa prcticamente lo mismo
que los otros cultivos, no produjo el metabolito de inters. Despus se debe comenzar
a sumar las curvas: tomar un inculo temprano implica tener menos tiempo
produciendo ese inculo y habr que esperarlo ese determinado tiempo para obtener
el ttulo mximo que se sabe que es capaz de obtener ese proceso. Entonces el
tiempo que se debe esperar, en las condiciones de produccin, cun caro es respecto
de obtenerlo anteriormente en las condiciones de produccin del inculo? Pensar en
trminos de la economa del proceso: Horas de uso de equipo, costo de medio de
cultivo. Observar que cuando se inocularon los 3 fermentadores, no hicieron la curva a
partir de las 30 h de cultivo, a las 40 h est en su mxima expresin y en lugar de
desaparecer la produccin de CO2, se mantiene y esto se puede deber a que el inculo
utilizado en un prefermentador y en un fermentador de produccin es distinto.
STANDBURY 1995 Lo que dice el libro al respecto: las condiciones fisiolgicas con que
se transfiere hacia una nueva fase de cultivo pueden tener un impacto fundamental
en el perfil de produccin.

Ahora estudiamos la otra variable que interesa: el tamao del inoculo. En un

experimento muy simple. Entre otras variables, como la cantidad de medio de cultivo,
el nmero de ansadas que le pone. Entonces, se trabaja con Bacillus turgensis y se
hacen cultivos de 20, 25 y 30 ml de a pares y a uno de esos cultivos de un
determinado volumen se los inocula con una ansada y al otro con dos ansadas, para

dar de alguna manera una unidad de inoculacin. Lo que se ve en la grfica, que

representa la concentracin del producto que es la metionina (metabolito primario).
Una vez que se independiza del volumen de cultivo, para el proceso cuanto ms
inoculo hay es peor ya que se tiene menor rendimiento del producto. Entonces el
mayor tamao no siempre es sinnimo de mayor calidad.

Anakwenze. et al. (2014) Optimization of fermentation conditions of Bacillus Thuringensis EC1 for enhanced methionine
production.Advances in Microbiology 4: 344-352

Se ve otro ejemplo, donde hay una E.coli, que muchas veces es una plataforma que
sirve para la produccin de productos recombinantes, en este caso se produce un
polihidroxialcanoato (bioplstico). Hay microorganismos como el Bacillus que
producen y acumulan mucho polihidroxialcanoato, pero tambin se puede hacer de
manera recombinante para que otros microorganismos que normalmente no lo
producen como la E. coli, lo hagan. Para lo cual se introduce una enzima que es capaz
de sintetizar a partir de ciertos materiales de carbono el bioplstico. En el
experimento se trat de aplicar el mtodo de 5 estras, que claramente permite hacer
una dilucin. Se toma un concentrado y se estra con el ansa ojal y se hace la
descarga de forma muy abundante de un microorganismo donde crece y otro donde
se diluyen y aparecen colonias aisladas. Se identifican dos regiones: una de alta y una
de baja carga microbiana. Qu pasa con el bioplstico en las colonias? Si se toman
las muestras y se observan en el microscopio que, en la regin de alta la cepa es de
E. coli transformada que es un poco ms larga que la wildtype, mientras que en la
regin de baja (donde estn las colonias aisladas) se observa que se ha podido
expresar el polihidroxialcanoato y es el fenotipo de la clula que almacen el
bioplstico que luego se lo extrae y se lo procesa.

Entonces, a qu se debe este fenmeno que encuentran los autores? En la

publicacin se plantea:
Hiptesis (H1): puede deberse a que en la regin de alta hay tanta carga microbiana
que se perdi el plsmido que codifica una o algunas de las enzimas que realizan la
sntesis del polihidroxialcanoato. Entonces se plantea un nuevo experimento para
saber si la H1 es cierta o no. Para ello, se vuelve a repetir la experiencia sin tanta
carga microbiana (con la regin alta se vuelven a hacer dos estras, y all aparecer
una regin alta y una baja. Cuando se toman muestras de la regin alta y aparece el
fenotipo que se vio antes y en la regin baja se debera ver que se expres la protena
y esto significa que el plsmido se haba conservado en la regin alta inicial), tambin
se puede aplicar tcnicas de biologa molecular como la purificacin del plsmido
mediante una PCR.
Hiptesis 2(H2):
-la incidencia de la falta de nutrientes, se puede pensar que la regin donde hubo
ms desarrollo, hubo mayor demanda de nutrientes y pudo haber quedado en
defecto, dentro de eso los autores se inclinan a pensar que el O 2 es el nutriente ms
problemtico porque no se disuelve demasiado en el medio de cultivo (por eso el
batch aunque sea cerrado se sigue entendiendo que el O 2 se puede seguir aportando
en los procesos aerbicos). Ellos piensan que el O 2 puede ser un nutriente deficitario
ya que si se mira la imagen y se piensa que no hay difusin de O 2 en la placa de Petri,
la atmosfera es la misma y no hay prcticamente limitaciones en la difusin de O 2 en
el medio areo. Entonces el aire que baa la superficie de la regin alta y la regin
baja es esencialmente lo mismo, pero el O 2 disuelto en el medio de cultivo es
deficiente para la regin con mayor densidad celular. Para comprobarla se hace un
cultivo que emula un cultivo microaerofilico en un tubo de ensayo (con un volumen
mas alto, donde el O2 ser deficitario) donde la relacin superficie/volumen en la
regin de alta va a ser ms que el de la regin de baja que va a ser aerbico. Y al
cabo de un tiempo se midi cual era la produccin de bioplastico y encontraron que
era mayor en el ambiente anaerbico, contrariamente a la sospecha. Entonces se
descarta esta hiptesis.
Se plantea otra hiptesis que es el tamao del inoculo, donde en la regin de alta se
acumula y en la regin de baja se va diluyendo. Tambin la experiencia se puede
hacer en un tubo de ensayo para facilitar el resultado experimental y se siembra con
20.000, 40.000, 60.000, 80.000 UFC/ml, y se ve que en lo que sera equivalente a la
regin de alta se inhibe la produccin de bioplstico a diferencia de lo que pasa en los
cultivos que se inocularon con un inoculo menor. Este experimento si bien no explica
cul es el mecanismo molecular que hace que cambie el comportamiento segn la
cantidad de inoculo, pone en evidencia la importancia del tamao del inoculo y la
necesidad de su estudio para el desarrollo de los bioprocesos.

JUNG 2005

Otro ejemplo tiene que ver con la produccin de penicilina. Se hacen distintos inculos
de biomasa 25 mg de micelio seco/100ml. 12,5 ml, 75 ml, 115 ml y trabajan con dos
cepas diferentes. Se ve que con bajos inculos, el ttulo de la penicilina (el producto)
es bajo y que para al menos una de las cepas un inoculo muy alto tambin es
contraproducente. La otra cepa tambin, llega un punto donde por ms que se
duplique la cantidad de biomasa con la que se inocula no se aumenta el ttulo
significativamente de la penicilina. Mayores tamaos de inculos implica tamaos de
prefermentadores ms grandes y mayores volmenes de medio de cultivo, entre
otros. Se debe encontrar la proporcin justa en la economa de procesos es necesario.
TORNQVIST 1956

Una vez que se tienen evaluadas todas estas etapas. Una vez determinado el tamao
de inculo, muchas veces la reactivacin del conservado de la cepa que est
congelada o seca, implica la reactivacin en un primer volumen pequeo y a partir de
all se prosigue implementando a pequea escala en un Erlenmeyer y luego a
biorreactores con mayores cantidades de medio de cultivo, hasta llegar a inocular al
biorreactor de produccin. En esas etapas, y sobre todo si los procesos son aerbicos,

se suele usar para los erlenmeyers agitadores orbitales (son planchas que permiten
alojar los Erlenmeyer sin que se escape su volumen, esas plataformas son capaces de
orbitar y generan un movimiento que va a agitar y mezclar los cultivos, algunos
pueden ser termostatizados. Hay intercambio de O 2 en la superficie que est en
contacto con el aire, el hecho de que exista mayor rea y agitacin favorece la
oxigenacin del cultivo y evita que se formen entornos microaerofilos. Adems la
agitacin ayuda a disipar cualquier gradiente qumico producido por el metabolismo
del microorganismo, maximizando el desarrollo.
Parmetros involucrados en la capacidad de transferencia de O2
-Tamao y forma del recipiente (para los frascos agitados) (base, geometra del cuello,
presencia de baffles) Hay Erlenmeyers que tienen una base ms ancha y maximizan
la aireacin que se denominan. . Los erlenmeyers difieren en su volumen, para
cada volumen las diferentes marcas varan en su geometra. Cuando se hace un
experimento (desarrollo de un medio de cultivo, las pruebas de las cepas para saber
cmo se comportan) se debe hacer una comparacin rigurosa, de lo contrario el
resultado ser errneo. Es importante estandarizar y que sean siempre la misma
calidad de Erlenmeyer, con un mismo tamao de cuello (lugar por donde ingresa el
aire, si hay diferencias en la seccin del cuello puede haber una gran diferencia en los
rendimientos de biomasa o productos). Tambin se debe tener en cuenta el material
de los mismos, comnmente se utilizan los de vidrio y de plstico, estos ltimos son
ms livianos, fciles de esterilizar (transparentes de policarbonato). En los Erlenmeyer
tanto de plstico como de vidrio se pueden agregar bafles en la base, y cuando se
mueva el Erlenmeyer el bafle acta como un rompe olas y da lugar a un mezclado
mucho ms eficiente y una oxigenacin mucho mayor.

-Material del tapn, filtro: es importante con qu se realiza el tapn o el cierre del
erlenmeyer: tapn de algodn (no siempre sale igual y se generaran gradientes
difciles de disipar), tapar con papel de aluminio (no acta un filtro en este caso, y el
aire entra sin ser filtrado en el medio esterilizado, en algunos casos no fracasa el
experimento), tapones de goma y silicona (suelen cerrar mejor y son ms

hermticos), tapas de aluminio, son ms difciles de estandarizar. Una manera de

resolver estas diferencias, para los erlenmeyers de plstico vienen tapas ciegas que
poseen un filtro y todos los erlenmeyers tienen la misma capacidad de transferencia
de humedad, CO2, etc. Y es ms comparable la experiencia.
-Dimetro de agitacin-orbital-: Se debe tener en cuenta las rpm. Mayor cantidad de
vueltas por minuto mejor ser la difusin del O 2. Existen agitadores que hacen
movimiento orbital, otros lo hacen de un extremo al otro de manera lineal, estos
ltimos se usan ms en reacciones qumicas ya que suelen ser ms agresivos y por
ello se los trata de evitar en microbiologa, adems que los golpes generan ms
espuma. En microbiologa se prefiere el agitador orbital. Es importante el dimetro de
la agitacin orbital.
-Volumen de cultivo: Es muy importante ya que puede generar una menor rea de
transferencia de O2.

-Naturaleza del material del recipiente: Hay una comparacin interesante, que cuando
se hace el experimento se debe cuidar que las bocas de los erlenmeyers tengan la
misma seccin uno de plstico y otro de vidrio y cuando
se calcula la capacidad de transferencia de O 2 en los de
vidrio con respecto de los de plstico se ve que, se
transfiere mucho ms O2 en el de vidrio y el plstico al
ser hidrofbico el lquido no se va a desplegar tan bien
como lo hace en el vidrio que es un material hidroflico
cargado. Y esto hace que la transferencia de O 2 sea peor
en el de plstico que en el de vidrio.
Maier, U & Bchs, J (2001)
Characterization of the gas-liquid
mass transfer in shaking
bioreactors. Biochem Eng J 7: 99 106

-Propiedades fisicoqumicas del cultivo (viscosidad,

composicin qumica): Se debe tener en cuenta la viscosidad, pH, composicin
qumica y la presencia de ciertas sustancias como aceites y sustancias
antiespumantes que muchas veces dificultan la solubilidad del O2.

Hay una expresin matemtica de tipo emprica donde se ve que la velocidad de

transferencia de O2 mxima es directamente proporcional a:
Na: velocidad de agitacin (rpm)
dob: dimetro de orbita. b es un exponente + y semiemprico
inversamente proporcional:
VL-c: volumen del lquido

OTRmax=Na.dob.VL
-c
.dr-e

dr-e: dimetro del recipiente

Para que vean la incidencia de los coeficientes experimentales est el siguiente
ejemplo. Cuando uno duplica las variables que tienen una incidencia positiva sobre la
transferencia de O2. Na cuando se duplico, la transferencia de O 2 aumenta en un 80%.
Cuando se duplica dob, la transferencia de O2 solo aumenta un 20%. Entonces el
shaker tiene como variable operativa la posibilidad para manejar la velocidad y no el
dimetro de la rbita, que sera ms caro. Cuando uno disminuye a la mitad las
variables que tienen una incidencia negativa sobre la transferencia de O 2. Si se reduce
VL-c a la mitad, aumenta en un 44% la transferencia del O2 y en caso de dr-e un 58%.
Entre todas las variables la que ms incidencia tiene es la velocidad de agitacin. Y
solo para tener una idea de lo que estamos hablando, la velocidad que se reporta
para frascos Erlenmeyer esta entre
2 45 mmol/l.h. Todo esto depende del medio
y de las condiciones del experimento. La experiencia vale para los frascos
erlenmeyers en los que se hizo el experimento,los lquidos que se usaron, el sistema
de aireacin, etc. Lo que se mide es el OTR, tasa o velocidad de transferencia del
oxgeno por, su expresin diferencial sera, la variacin de oxgeno en el tiempo,
relacin con el Kl*a: se relaciona con el gradiente, por lo que el Kl*a est metido ah.
Es importante saber variables de las que depende y cmo se hace para estudiarlas.
Se representa la poltica clsica de la amplificacin, partiendo de un conservado hasta
llegar a un reactor de produccin. Esto es extremadamente variable y depende de
cada proceso e inclusive para cada proceso depende de cada empresa productora. Ya
que es probable que cada empresa productora tenga su cepa distinta a la de los otros
y su medio y condiciones de cultivo ligeramente diferentes a otros productores.
Cuando no se conocen estas cosas se trabaja con escalas decimales, desde criotubo
se suele activar segn corresponda en medio o agua destilada en pequeo volumen,
esos pocos ml tal vez se pueden pasar a 100 ml o a 1 l. Ese 1l sirve para inocular 10 l,
en un biorreactor. Y luego pasar a un biorreactor de 100 litros y estos ya son
prefermentadores o tambin llamados fermentadores semilla en donde se desarrolla
el inoculo en manera controlada. Todo esto debe estudiarse, ya que talvez no es
necesario seguir toda esta rutina y se pueden utilizar menos pasos para inocular el
biorreactor y no es necesario mantener el 10% del inoculo, esto ahorrara espacio,
tiempo e infraestructura.
Chisti 2010 fig 3.2
Otro de los aspectos importantes del upstream es el desarrollo del medio de cultivo.
Desarrollo del medio de cultivo
El medio de cultivo es una mezcla de sustancias, las cuales se corresponden con una
fuente de carbono y muchas veces es una fuente de energa. Como fuente de
macronutrientes necesarios como nitrgeno, carbono. Para un organismo fotosinttico
la fuente de carbono ser CO2 y la fuente de energa ser la luz. Para los
microorganismos que fijan nitrgeno, puede tomar el nitrgeno disuelto en el aire y no
un NH4 o NO3- disueltos en medio de cultivo. Tambin otros macronutrientes como
Ca2+, PO43-, Na+, Cl-.
Otros requerimientos, micronutrientes que sern los cofactores de algunas enzimas
que algunos se incorporaran en trazas debido a su toxicidad (Zn, Co, Mo, Se),
vitaminas, factores mitogenicos (no del todo conocidos de origen peptdico,
necesarios para que las clulas comiencen a replicarse). Estos ingredientes
normalmente se van a disolver en un entorno acuoso y la calidad del agua ser muy

diferente as sea un proceso de un alga marina (agua de mar o de pozo), clula animal
que producir un frmaco recombinante (agua de calidad ultra pura, con baja
conductividad elctrica).
Al medio de cultivo luego se esteriliza. Siempre que se lo inocule con microorganismos
se va a formar la biomasa que uno espera que sea idntica a lo que se coloc. Se van
a producir productos metablicos que pueden ser el producto de inters (cido ctrico,
etanol, vitamina), algunas veces el producto de inters es la biomasa o est incluido
en ella (protenas recombinantes, aceites de microorganismos oleaginosos) y se va a
producir calor, que tiene poca incidencia a nivel de laboratorio, pero que a escalas
industriales se lo debe tener en cuenta para evacuar.
Se busca que con un medio de cultivo se maximice un rendimiento y se minimice la
formacin de subproductos. Esto se trabajara desde la cepa (modificando algn paso
metablico) o desde el medio de cultivo, ya que un sustrato se puede metabolizar de
manera distinta. Adems se busca minimizar inconvenientes en el proceso. Uno de los
mayores inconvenientes es la generacin de espuma.
Caractersticas de los medios de cultivo
-Materias primas de mnimo costo, calidad consistente y amplia disponibilidad.
-Permitir un mximo rendimiento de producto por unidad de masa de sustrato
empleado.
-Garantizar un mnimo rendimiento de productos indeseados.
-Minimizar ciertos inconvenientes en otros aspectos del proceso.
Las fuentes de carbono y de energa ms reconocidas en procesos industriales son:
-Melazas: es un subproducto de la industria de los ingenios azucareros. Es un jarabe
rico en sacarosa y contiene baja cantidad de fucosa y fructuosa. Tambin posee
oligoelementos y nitrgeno. Muchas veces es un medio de cultivo que tiene todos los
ingredientes para el desarrollo del microorganismo, aunque se debe modificar la
actividad acuosa.
-Extracto de malta
-Almidn/dextrinas
-Lquidos sulfticos de papeleras
-Alcoholes (etanol, metanol)
-Aceites Vegetales
-Celulosa
-Alcanos
-Otros efluentes
Fuentes de nitrgeno:
-Amonaco (gas, NH4OH) si es gaseoso se inyecta directamente por el burbujeador. El
NH4OH sirve para controlar el pH siempre que el metabolito sea acidificante.
-Sales de nitrgeno (nitratos, amonio)
-Lquido de maceracin del maz
-Extractos de levadura (no puede filtrarse el medio que lo contiene, ya que tapara el
filtro. Para la obtencin hay distintos mtodos: por autolisis de la clula)
-Peptonas (es un hidrolizado de protenas que no coagula a 60C, se obtienen por
mtodos cidos, bsicos o enzimticos, muy usadas)
-Harinas (soja, algodn)
-Efluentes

Hay dos conceptos claves cuando se quiere desarrollar un medio de cultivo para un
bioproceso:
Diseo: Aquellas variables que se manejan y tienen que ver con los efectos
cualitativos. Lo que define el ingrediente del medio de cultivo, fuentes de carbono y
nitrgeno que se utilizan.
Formulacin: Se refiere a aspectos cuantitativos. Cuanto se agrega de los ingredientes
del medio de cultivo.
Tanto para disear como para formular los medios de cultivo existen diferentes
estrategias:
Estrategias cerradas donde existen componentes preseleccionados de diferentes
estrategias. Hay un condicionamiento que puede ser econmico, reglamentario,
poltica (importaciones)
Estrategias abiertas: cuando no estn presentes las restricciones.
En funcin del ingenio para el diseo o la formulacin:
Intuitivo: Se ampara en bases empricas y/o ecolgicas.
Racionales: Estequiometricas (contenido de C, N, O, H que producirn tanta cantidad
de biomasa sobre la base de una ecuacin semiemprica para llegar a un coeficiente
estequiometrico o rendimiento de inters), estadsticas (relacionadas con la
optimizacin, muy usado actualmente ya que genera resultados llamativos y tiles. Se
basan en herramientas informticas, con una alta carga estadstica. Se pueden
obtener grficos de superficie, donde se obtiene la respuesta sobre las variables que
se estuvieron analizando-tiempo de cultivo, concentracin de producto, cantidad de C
o N, entre otros-).
A nivel industrial se utilizan muchas cosas que pueden llevar a que sean de
naturaleza compleja o indefinida en un medio de cultivo. Aunque muchas veces se
pueden encontrar recetas que usan medios definidos o simples, cuya composicin
qumicamente es muy precisa. Esto no ocurre cuando se utiliza una levadura,
peptona, suero animal o hidrolizado.
Como ejemplo se observa esta curva que tiene ver con la mejora del ttulo de
produccin de penicilina en unidades de U/ml (se medan de manera biolgica). En la
curva se ve como se fueron introduciendo distintas estrategias de mejora, entre ellas
muchas estn relacionadas con el desarrollo de la cepa. Tambin se ven mejoras en el
medio de cultivo (rebalanceos de los medios definitivos, mejora de los ingredientes,
alimentaciones programadas), cambio en la composicin del inoculo del medio y
mejoras en la oxigenacin del biorreactor.
AIBA 1973 pag 150