CUANTIFICACION DE PROTEINAS

CUANTIFICACION DE PROTEINAS: METODO DE BRADFORD

INTRODUCCION
Determinar la concentracin de protenas en una muestra biolgica es una tcnica
de rutina bsica cuando se aborda un esquema de purificacin de una protena
concreta, cuando se quiere conocer la actividad especfica de una preparacin
enzimtica, para el diagnstico de enfermedades, as como para otros muchos
propsitos.
En la actualidad se emplean varios mtodos para la cuantificacin de las
protenas; entre ellos est el mtodo de Biuret, Mtodo de BCA, los cuales se
basan en las propiedades que tienen las protenas, las cuales a absorben la luz
UV y tiene la capacidad de unificar colores. Otro de estos mtodos es el e
Bradford el cual se apoya en la unin del colorante (Coomassie Blue G-250) en las
protenas. Las protenas evidencian un color azul al momento de unirse logrando
un complejo protena-colorante. El resultado proteico requiere la comparacin del
valor de absorbancia de la muestra con los obtenidos a partir de cantidades
conocidas de protenas, y con estos valores se construye una curva de calibracin
en la cual se analiza los valores obtenidos.

METODOLOGIA
MATERIALES:
Espectrofotmetro
Micropipeta 1000 l
Tubos de ensayo
REACTIVOS:
Solucin acuosa de buffer fosfatos 0,1M ( 4 ml )
Solucin de albumina
Suero fetal bovino 1/20
Reactivo de Bradford
Azul de Coomasie
En una serie de 7 tubos de ensayo se depositaron 2 ml de cada una de las
disoluciones que se prepararon (tabla 1) y se dej posteriormente en reposo por
10 min en la oscuridad y luego se ley la absorbancia a 595 nm contra el blanco

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(solucin de fosfatos + Coomasie) correctamente preparado.

DILUCIONES

1/1

1/2

1/8

1/16

1/32

1/64

(Tabla 1)

RESULTADOS

DILUCION

BLA 1
NCO

1/1

1/2

1/4

1/8

1/16

1/32

1/64

0.025
M

0.012
5M

6.25
x10-

3.125
x10-3M

1.56
25
x10-

SLN PATRON 0
(ML)
CANTIDAD
0
DE
SLN
ANTERIOR
SLN
4
FOSFATO
+
COOMASIE
CONCENTRA
CION
(MOL/L)

0.1 0,05
M
M

3M

MUESTRA
SUERO
FETAL
BOVINO

3M

ABSORBANC
IA OBTENIDA
(Tabla 2)

1,18
9

1,015

CALCULOS:
c1v1=c2v2

Solucin Buffer 0.1M

0.1M x 2/4 = 0.05M
0.05M x 2/4 =0.025M
0.025 x 2/4 =0.0125M
0.0125M x 2/4 =0.00625M

0,634

0,426

0,25
8

0,156

0,09
2

1,334
0,464

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0.00625M x 2/4 = 0.003125M

0.003125M x 2/4 = 0.0015625M

GRAFICA (CURVA DE CALIBRACION)

DETERMINACION DE LA CONCENTRACION SUERO FETAL BOVINO:

0.464 x 0 x = 0.0116
0.0116 x 0 =0.00029
Y= 11.831 x 0.00029 + 0.178= 0.18

ANALISIS DE RESULTADOS

Analizando los resultados obtenidos se observa que hay una relacin directa
entre la absorbancia y la concentracin, como se observa en la grfica y en los

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datos obtenidos; al momento de analizar la muestra #1 que tiene una

concentracin 0.1M y una absorbancia 1.189 , pasando a diluir esta muestra
logramos obtener una menor concentracin que era lo esperado y por ende una
absorbancia menor.

CONCLUSIONES
El cambio en la absorbancia a 595 nm es proporcional a la concentracin de la
protena en la muestra
Se logr determinar la concentracin de la muestra de suero fetal bovino a partir
de una curva de calibracin de albumina, utilizando el mtodo de Bradford
La intensidad de absorcin depende del contenido de aminocidos bsicos y
aromticos de la protena
Dado la dispersin de los datos de la curva de calibracin se puede notar
fcilmente que se presentaron errores en la toma de los anlisis.