Manual de Praìcticas Microbiologiìa General

Universidad Autnoma de Tlaxcala
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MANUAL DE PRCTICAS
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Revisin:
MICROBIOLOGA
GENERAL
7 SEMESTRE.
LICENCIATURA:
QUIMICA INDUSTRIAL
CATEDRATICO:
DRA. LIDIA PATRICIA JARAMILLO LIDIA
PERIODO:
OTOO 2016
OBJETIVO GENERAL
Aprendizaje declarativo:
Comprender los fundamentos de la microbiologa respecto a la naturaleza, distribucin,
morfologa y metabolismo de los microorganismos presentes en el ambiente y los
alimentos, que le permitirn aislar, identificar y establecer mtodos de control y
manipulacin de los mismos en un proceso industrial. Participar activamente en las
sesiones de laboratorio directamente relacionadas con la informacin terica y elaborar
sus reportes correspondientes efectuando los ejercicios y actividades propuestos para
cada sesin.
Aprendizaje procedimental:
1. Reconocer la estructura, funciones y rutas bioqumicas caractersticas de los
microorganismos involucrados en procesos industriales.
2. Desarrollar la capacidad de razonamiento y resolucin de problemas planteados de
forma analtica y grfica, lo que implica manejo, interpretacin y procesamiento de
datos con base en conceptos tericos del rea de la microbiologa.
3. Desarrollar la capacidad de anlisis e interpretacin en la investigacin y la lectura
crtica de bibliografa recomendada.
4. Aplicar pruebas adecuadas para resolver situaciones experimentales relativas al
rea de la microbiologa aplicada.
Aprendizaje actitudinal y valoral:
1. Desarrollar habilidades de comunicin oral y escrita, el pensamiento crtico y la
formacin
integral
que
le
permita
relacionarse
trabajar
en
equipos
multidisciplinarios durante el desarrollo de las prcticas y reportes de laboratorio.

Por la Cultura a la Justicia Social
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2. Desarrollar habilidades de anlisis, sntesis, organizacin y planificacin de

procesos microbiolgicos, realizando proyectos extracurriculares de carcter
investigativo o productivo en el rea de qumica industrial, con sentido sustentable,
responsabilidad social y cuidado del medio ambiente.
3. Ejercer plenamente su ciudadana, respetando el medio ambiente, el derecho a la
vida y el bienestar social, aplicando principios, conceptos y procedimientos de
gestin y administracin en su ejercicio profesional con un sentido crtico y
actualizado.
4. Fortalecer una actitud tica para el uso y transformacin de la materia viva.
Normas generales de uso del laboratorio.

Para el desarrollo de las prcticas es conveniente tener en cuenta algunas normas
elementales que deben ser observadas con toda escrupulosidad.
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1. Antes de realizar una prctica, debe leerse detenidamente para adquirir una idea
clara de su objetivo, fundamento y tcnica. Los resultados deben ser siempre
anotados cuidadosamente apenas se conozcan.
2. El orden y la limpieza deben presidir todas las experiencias de laboratorio. En
consecuencia, al terminar cada prctica se proceder a limpiar cuidadosamente el
material que se ha utilizado.
3. Cada grupo de prcticas se responsabilizar de su zona de trabajo y de su
material.
4. Antes de utilizar un compuesto hay que fijarse en la etiqueta para asegurarse de
que es el que se necesita y de los posibles riesgos de su manipulacin.
5. No devolver nunca a los frascos de origen los sobrantes de los productos utilizados
sin consultar con el profesor.
6. Todo el material, especialmente los aparatos delicados, como lupas y
microscopios, deben manejarse con cuidado evitando los golpes o el forzar sus
mecanismos.
7. Los productos inflamables (gases, alcohol, ter, etc.) deben mantenerse alejados
de las llamas de los mecheros. Si hay que calentar tubos de ensayo con estos
productos, se har al bao Mara, nunca directamente a la llama. Si se manejan
mecheros de gas se debe tener mucho cuidado de cerrar las llaves de paso al
apagar la llama.
8. Cuando se manejan productos corrosivos (cidos, lcalis, etc.) deber hacerse con
cuidado para evitar que salpiquen el cuerpo o los vestidos. Nunca se vertern
bruscamente en los tubos de ensayo, sino que se dejarn resbalar suavemente por
su pared.
9. Cuando se quiera diluir un cido, nunca se debe echar agua sobre ellos; siempre al
contrario: cido sobre agua.
10. Cuando se vierta un producto lquido, el frasco que lo contiene se inclinar de
forma que la etiqueta quede en la parte superior para evitar que si escurre lquido
se deteriore dicha etiqueta y no se pueda identificar el contenido del frasco.
11. No pipetear nunca con la boca. Se debe utilizar la perilla o propipeta.
12. Las pipetas se cogern de forma que sea el dedo ndice el que tape su extremo
superior para regular la cada de lquido.
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13. Al enrasar un lquido con una determinada divisin de escala graduada debe
evitarse el error de paralaje levantando el recipiente graduado a la altura de los
ojos para que la visual al enrase sea horizontal.
14. Cuando se calientan a la llama tubos de ensayo que contienen lquidos debe
evitarse la ebullicin violenta por el peligro que existe de producir salpicaduras. El
tubo de ensayo se acercar a la llama inclinado y procurando que sta acte sobre
la mitad superior del contenido y, cuando se observe que se inicia la ebullicin
rpida, se retirar, acercndolo nuevamente a los pocos segundos y retirndolo
otra vez al producirse una nueva ebullicin, realizando as un calentamiento
intermitente. En cualquier caso, se evitar dirigir la boca del tubo hacia la cara o
hacia otra persona.
15. Cualquier material de vidrio no debe enfriarse bruscamente justo despus de
haberlos calentado con el fin de evitar roturas.
16. Los cubreobjetos y portaobjetos deben cogerse por los bordes para evitar que se
engrasen.

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PRCTICA 1.
MANEJO DEL MICROSCOPIO PTICO
OBJETIVO
Conocer las partes principales del microscopio y sus funciones mediante el manejo
adecuado del mismo durante la observacin de diversas estructuras microscpicas.
INTRODUCCIN
Una de las herramientas ms tiles para el microbilogo es el microscopio ptico. Todas
las forma vivientes con las que se experimenta en el laboratorio de microbiologa son
invisibles a simple vista y es esencial estar familiarizado con el uso del microscopio.
PARTES DE UN MICROSCOPIO PTICO
Sistema ptico

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OCULAR: Lente situada cerca del ojo del observador. Ampla la imagen del
objetivo.
OBJETIVO: Lente situada cerca de la preparacin. Ampla la imagen de

sta.
CONDENSADOR: Lente que concentra los rayos luminosos sobre la

preparacin.
DIAFRAGMA: Regula la cantidad de luz que entra en el condensador.
FOCO: Dirige los rayos luminosos hacia el condensador.
Sistema mecnico
o
SOPORTE: Mantiene la parte ptica. Tiene dos partes: el pie o base y el

brazo.
PLATINA: Lugar donde se deposita la preparacin.
CABEZAL: Contiene los sistemas de lentes oculares. Puede ser monocular,

binocular, ..
REVLVER: Contiene los sistemas de lentes objetivos. Permite, al girar,

cambiar los objetivos.
TORNILLOS DE ENFOQUE: Macromtrico que aproxima el enfoque y

micromtrico que consigue el enfoque correcto.
MANEJO Y USO DEL MICROSCOPIO PTICO
1. Colocar el objetivo de menor aumento en posicin de empleo y bajar la platina

completamente. Si el microscopio se recogi correctamente en el uso anterior, ya
debera estar en esas condiciones.
2. Colocar la preparacin sobre la platina sujetndola con las pinzas metlicas.
3. Comenzar la observacin con el objetivo de 4x (ya est en posicin) o colocar el de
10 aumentos (10x) si la preparacin es de bacterias.
4. Para realizar el enfoque:

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a. Acercar al mximo la lente del objetivo a la preparacin, empleando el

tornillo macromtrico. Esto debe hacerse mirando directamente y no a
travs del ocular, ya que se corre el riesgo de incrustar el objetivo en la
preparacin pudindose daar alguno de ellos o ambos.
b. Mirando, ahora s, a travs de los oculares, ir separando lentamente el
objetivo de la preparacin con el macromtrico y, cuando se observe algo
ntida la muestra, girar el micromtrico hasta obtener un enfoque fino.
2 Pasar al siguiente objetivo. La imagen debera estar ya casi enfocada y suele ser
suficiente con mover un poco el micromtrico para lograr el enfoque fino. Si al
cambiar de objetivo se perdi por completo la imagen, es preferible volver a
enfocar con el objetivo anterior y repetir la operacin desde el paso 3. El objetivo
de 40x enfoca a muy poca distancia de la preparacin y por ello es fcil que
ocurran dos tipos de percances: incrustarlo en la preparacin si se descuidan las
precauciones anteriores y mancharlo con aceite de inmersin si se observa una
preparacin que ya se enfoc con el objetivo de inmersin.
3 Empleo del objetivo de inmersin:
a. Bajar totalmente la platina.
b. Subir totalmente el condensador para ver claramente el crculo de luz que
nos indica la zona que se va a visualizar y donde habr que echar el aceite.
c. Girar el revlver hacia el objetivo de inmersin dejndolo a medio camino
entre ste y el de x40.
d. Colocar una gota mnima de aceite de inmersin sobre el crculo de luz.
e. Terminar de girar suavemente el revlver hasta la posicin del objetivo de
inmersin.
f. Mirando directamente al objetivo, subir la platina lentamente hasta que la
lente toca la gota de aceite. En ese momento se nota como si la gota
ascendiera y se adosara a la lente.
g. Enfocar cuidadosamente con el micromtrico. La distancia de trabajo entre
el objetivo de inmersin y la preparacin es mnima, aun menor que con el
de 40x por lo que el riesgo de accidente es muy grande.
a. Una vez se haya puesto aceite de inmersin sobre la preparacin, ya no se
puede volver a usar el objetivo 40x sobre esa zona, pues se manchara de
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aceite. Por tanto, si desea enfocar otro campo, hay que bajar la platina y
repetir la operacin desde el paso 3.
b. Una vez finalizada la observacin de la preparacin se baja la platina y se
coloca el objetivo de menor aumento girando el revlver. En este momento
ya se puede retirar la preparacin de la platina. Nunca se debe retirar con el
objetivo de inmersin en posicin de observacin.
c. Limpiar el objetivo de inmersin con cuidado empleando un papel especial
para ptica. Comprobar tambin que el objetivo 40x est perfectamente
limpio.
MANTENIMIENTO Y PRECAUCIONES
1. Al finalizar el trabajo, hay que dejar puesto el objetivo de menor aumento en
posicin de observacin, asegurarse de que la parte mecnica de la platina no
sobresale del borde de la misma y dejarlo cubierto con su funda.
2. Cuando no se est utilizando el microscopio, hay que mantenerlo cubierto con su
funda para evitar que se ensucien y daen las lentes. Si no se va a usar de forma
prolongada, se debe guardar en su caja dentro de un armario para protegerlo del
polvo.
3. Nunca hay que tocar las lentes con las manos. Si se ensucian, limpiarlas muy
suavemente con un papel de filtro o, mejor, con un papel de ptica.
4. No dejar el portaobjetos puesto sobre la platina si no se est utilizando el
microscopio.
5. Despus de utilizar el objetivo de inmersin, hay que limpiar el aceite que queda en
el objetivo con pauelos especiales para ptica o con papel de filtro (menos
recomendable). En cualquier caso se pasar el papel por la lente en un solo
sentido y con suavidad. Si el aceite ha llegado a secarse y pegarse en el objetivo,
hay que limpiarlo con una mezcla de alcohol-acetona (7:3) o xilol. No hay que
abusar de este tipo de limpieza, porque si se aplican estos disolventes en exceso
se pueden daar las lentes y su sujecin.
6. No forzar nunca los tornillos giratorios del
micromtrico, platina, revlver y condensador).
microscopio
(macromtrico,
7. El cambio de objetivo se hace girando el revlver y dirigiendo siempre la mirada a

la preparacin para prevenir el roce de la lente con la muestra. No cambiar nunca
de objetivo agarrndolo por el tubo del mismo ni hacerlo mientras se est
observando a travs del ocular.
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8. Mantener seca y limpia la platina del microscopio. Si se derrama sobre ella algn
lquido, secarlo con un pao. Si se mancha de aceite, limpiarla con un pao
humedecido en xilol.
Es conveniente limpiar y revisar siempre los microscopios al finalizar la sesin prctica y,
al acabar el curso, encargar a un tcnico un ajuste y revisin general de los mismos.
Material
Microscopio ptico
Portaobjetos
Cubreobjetos
Equipo diseccin
Mechero alcohol
Goteros
Cubeta Tincin
Reactivos
Verde de metilo
Hematoxilina
Eosina
Formol
Etanol
Cebolla, jitomate, tocino, yogurt, vinagre
casero
METODOLOGA
Experimento 1. Observacin de epidermis de cebolla
1. Separar una de las hojas interna de la cebolla y desprender la tenue membrana
que est adherida por su cara inferior cncava.
2. Depositar el fragmento de membrana en un porta con unas gotas de agua. Pon el
porta sobre la cubeta de tincin para que caiga en ella el agua y los colorantes. Si
es preciso, estirar el trozo de epidermis con ayuda de dos agujas enmangadas.
3. Escurrir el agua, aadir una gotas de verde de metilo actico (o azul de metileno)
sobre la membrana y dejar actuar durante 5 minutos aproximadamente. No debe
secarse la epidermis por falta de colorante o por evaporacin del mismo!
4. Con el cuentagotas baar la epidermis con agua abundante hasta que no suelte
colorante.
5. Colocar sobre la preparacin un cubreobjetos evitando que se formen burbujas y
llevarla al microscopio.
6. Observa la preparacin a distintos aumentos, empezando por el ms bajo.
Identifica las distintas clulas del tejido epidrmico y las de las hojas del bulbo de
cebolla.
Experimento 2. Observacin de pulpa de tomate
1. Utilizando un escalpelo, corta en dos mitades el tomate.
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2. Obtn, ayudndote de unas pinzas, un trozo de pulpa de tomate de unos 2mm de

grosor.
3. Depostalo en el centro de un portaobjetos sin poner agua.
4. Coloca encima un cubreobjetos y comprime suavemente con los dedos hasta
obtener un completo aplastamiento del fragmento de pulpa de tomate.
5. Lleva la preparacin a la platina del microscopio y realiza una observacin con
pequeos aumentos. Selecciona el mejor grupo de clulas y pasa a mayores
aumentos.
6. Identifica los distintos orgnulos celulares visibles y dibuja lo que observes en el
apartado observaciones.
Experimento 3. Observacin de clulas sanguneas.
1. Con la lanceta estril realizar una puncin en un pulgar.
2. Depositar una gota de sangre en la parte central de un portaobjetos.
3. Colocar un portaobjetos como indica el dibujo y deslizarlo sobre toda la superficie
del porta de manera que se pueda obtener una fina pelcula de sangre.
4. Colocar el frotis de sangre sobre la cubeta de tincin y aadir unas gotas de

alcohol absoluto y dejar que el alcohol se evapore para fijar la preparacin.
5. Cubrir con unas gotas de hematoxilina y dejar actuar durante 15 minutos. Evitar la
desecacin del colorante agregando ms lquido.
6. Lavar la preparacin y aadir unas gotas de eosina dejndola actuar 1 minuto.
7. Volver a lavar hasta que no queden restos de colorante.
8. Dejar secar aireando el porta o bien al calor muy lento de la llama del mechero.
9. Observar al microscopio.
Experimento 4. Observacin de clulas de tejido adiposo.
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1. Con ayuda de un bistur, cortar una finsima capa de grasa, colocarla en un porta y
cubrirla con unas gotas de formol. Dejar actuar 4 minutos.
2. Lavar la muestra con agua y cubrirla con unas gotas de Sudn III. Dejar actuar
unos 5 minutos.
3. Volver a lavar la preparacin con agua, cubrirla con un cubreobjetos y observar al
microscopio.
Experimento 5. Observacin de bacterias.
a. Bacterias del yogurt
1. Realizar el frotis disolviendo una mnima porcin de yogur en una pequea gota de
agua.
2. Fijar con metanol para eliminar parte de la grasa.
3. Teir con un colorante cualquiera de los arriba indicados durante 1-2 minutos.
4. Observar al mximo aumento del microscopio.
b. Bacterias del vinagre.
1. Tomar con una aguja enmangada una pequea porcin de madre de vinagre
natural o de la telilla que se forma sobre la superficie de los vinos agriados.
2. Extender la muestra en el portaobjetos con una gota de agua y hacer el frotis.
3. Dejar secar y fijar con calor.
4. Teir 2-3 minutos, lavar el exceso de colorante y secar.
RESULTADOS
Reportar las observaciones efectuadas con el mayor detalle posible.
Diferenciar entre clulas animales y vegetales.
CUESTIONARIO

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PRCTICA 2.
INTRODUCCIN A LAS TCNICAS MICROBIOLGICAS
OBJETIVO
Conocer el tipo de material y los medios de cultivo usados en microbiologa, as como
aplicar las tcnicas de preparacin y esterilizacin de los mismos.
INTRODUCCIN
Siempre es necesario que el medio de cultivo empleado para cultivar microorganismos
este completamente libre de toda forma de vida antes de usarse. Los mtodos ms
empleados para lograr este fin son el empleo de calor hmedo, calor seco, radiaciones y
ultrafiltracin.
El estudio de los microorganismos requiere que estos se puedan cultivar en el laboratorio
bajo condiciones controladas, para ello es necesario conocer los requerimientos
nutricionales de cada cepa en particular y controlar factores fsicos que alteren su
crecimiento.

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Los medios de cultivo se han clasificado de acuerdo con su composicin qumica y el uso
al que estn destinados, en: enriquecidos, selectivos, diferenciales, de prueba, de conteo,
de mantenimiento.
Material
Incubadora
Tubos de ensaye
Autoclave
Mechero Bunsen
Cajas petri
Matraz EM 250 mL
Pipetas graduadas 1, 2 mL
Varilla angular de vidrio
Portapipeteros
Portacajas
Gasa
Algodn
Papel estraza
Mechero Fisher
Cinta testigo
Agua potable
Balanza granataria
Cucharilla
Reactivos
Agar nutritivo
Caldo nutritivo
Agua peptonada
METODOLOGA
Experimento 1. Limpieza y esterilizacin del material.
1. Lave el material con agua y jabn, enjuague con agua de la llave. Enjuague
con agua destilada y escurra.
2. Si el material as lo requiere lave con mezcla crmica y enjuague
perfectamente. Precaucin!! la mezcla crmica es corrosiva.
3. Si el material se va a esterilizar con calor hmedo envulvalo con papel de
estraza, coloque cinta testigo y acomdelo en el interior del autoclave, se
somete a calentamiento por 15 minutos a 15 lb/pulg 2.
4. El material que se esteriliza con calor seco, pipetas y cajas Petri, se colocan
en sus contenedores y se someten a calentamiento por 1 hora a 160-180C.
5. Terminado el tiempo se deja enfriar el material y se guarda envuelto hasta
que se vaya a utilizar.
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Experimento 2. Preparacin de medios de cultivo.

1. Pesar la cantidad de medio de cultivo necesaria de acuerdo al volumen que
se desea preparar. Si el medio de cultivo es comercial, verificar la cantidad
requerida; si el medio se va a preparar, pese cada uno de los ingredientes
necesarios.
2. Disolver en agua y ajustar el pH, si as se indica, empleando cido actico
diluido o hidrxido de amonio diluido.
3. Calentar hasta completa disolucin, repartir entre tubos si es necesario y
esterilizar en autoclave por 15 minutos a 15 lb./pulg 2. Nota: Algunos medios
de cultivo no requieren esterilizacin o las condiciones son diferentes a las
especificadas anteriormente, observe siempre las indicaciones.
RESULTADOS
Indicar el material sometido a esterilizacin, as como las condiciones a las que se

llevo a cabo esta.
Indicar el nombre de los medios de cultivo empleados, el volumen preparado, la

cantidad requerida y las condiciones especficas de preparacin.
CUESTIONARIO
PRCTICA 3.
TCNICAS DE TINCIN MICROBIANA
OBJETIVO
Realizar diferentes tipos de tincin en clulas microbianas.
INTRODUCCIN
La palabra citologa significa el estudio de las clulas. A travs del desarrollo de la
citologa los cientficos han tenido que recurrir a varias tcnicas que permiten la
diferenciacin de las estructuras celulares, una de estas tcnicas es la tincin. Al tratar
ciertas sustancias qumicas con otras sustancias se producen reacciones coloreadas
especficas para las sustancias as tratadas.
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Material
Frasco lavador
Mechero Fisher
Papel filtro
Microscopio
Porta y cubreobjetos
Asa de siembra
Cubeta de tincin
Equipo de diseccin
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Reactivos
Etanol 10% y 40%
KOH 0.1M
Toluidina 0.1% en EtOH 10%
Cristal violeta
Lugol
Lactofenol
Alcohol-acetona
Safranina
Azul de metileno
Fucsina-fenol
Pan y tortilla enmohecido
Levadura
METODOLOGA
Experimento 1. Tincin Gram
1. Preparar los frotis bacterianos.
2. Teir con cristal violeta 1min
3. Lavar con abundante agua el exceso de colorante.
4. Cubrir con Lugol 1min
5. Lavar con agua el exceso de Lugol
6. Decolorar con alcohol-acetona o simplemente con alcohol hasta que la preparacin
deje de perder color (30seg)
7. Lavar con abundante agua para eliminar el resto de disolvente
8. Teir con safranina 1min
9. Lavar con agua para eliminar el colorante de contraste
10. Secar la preparacin.
11. Examinar al microscopio fijndose sobre todo en el color de cada preparacin
Los tiempos de exposicin a los colorantes son orientativos. Cada vez que se prepara la
batera de colorantes para realizar la tincin Gram presentan algunas diferencias respecto
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a los preparados en otro momento, por lo que puede ser necesario ajustar los tiempos.
En un laboratorio de Microbiologa, cada vez que se preparan los colorantes, se suelen
hacer pruebas con cultivos patrn de los dos tipos (Gram+ y Gram-) para ajustar as los
tiempos y tener la certeza de que el resultado de todas las tinciones que se hagan
mientras duren esos colorantes son fiables.
Experimento 2. Tincin cido resistente
1. Prepara un frotis bacteriano
2. Cubrir la preparacin con carbofucsina
3. Calentar la preparacin en un mechero Bunsen durante 5 min. No debe hervir. Si
se evapora, se aade ms carbofuxina para que no se seque en ningn momento
4. Lavar con agua el resto de colorante
5. Decolorar con la mezcla cido-alcohol
6. Lavar con agua para que no prosiga la decoloracin
7. Teir con azul de metileno 1 min
9. Secar la preparacin
10. Examinar al microscopio
Experimento 3. Tincin negativa de los microorganismos
1. Con tcnica asptica coloca 2 o tres asas llenas de suspensin bacteriana sobre el
portaobjetos limpio
2. Aade una gota llena de nigrosina, mezcla
3. Extiende el material hasta formar una pelcula delgada (gris, no negra)
4. Seca al aire, no fijes con flama
5. Examina al microscopio
Experimento 4. Tincin de esporas
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1. Preparar los frotis bacterianos indicados

2. Teir con verde malaquita. Con unas pinzas de madera colocar la muestra encima
de la llama del mechero para que el colorante humee, pero sin que hierva, durante
5 min. Aadir ms colorante si la muestra se seca.
4. Teir con safranina 1 min
6. Secar la preparacin
7. Observar la preparacin al microscopio
Experimento 5. Morfologa de levaduras
1. Preparar un frotis con suspensin de levaduras. Fijar a la flama
2. Baar el portaobjetos durante un minuto con solucin de etanol al 40%
3. Lavar en la llave de agua
4. Baar el frotis con solucin de KOH y deja reaccionar por una hora, si se empieza
a deshidratar agregar mas KOH
5. Lavar en la llave y aplicar azul de toluidina por dos minutos
6. Lavar con etanol al 10%, sacudir el exceso, secar al aire
7. Observar al microscopio
Experimento 6. Preparacin en fresco de mohos
1. Colocar sobre un portaobjetos una gota de solucin de lactofenol no demasiado
grande para evitar que el cubreobjetos flote y la preparacin quede demasiado
gruesa. Realizar la misma operacin en otro portaobjetos que se usar para lavar
la muestra.
2. Tomar el material a observar en una mnima cantidad con agujas finas o lancetas
procurando arrancarlo desde la base y disponerlo con cuidado sobre la gota de uno
de los portaobjetos. Con esta especie de lavado se consigue desprender el exceso
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de conidios que casi siempre llenan estas preparaciones y que impiden ver lo que
realmente interesa, los conidiforos.
3. Transportar el material con la lanceta a la gota del segundo portaobjetos que ser
ya el definitivo. Si se trata de hongos con picnidios (estructuras globosas tapizadas
en su interior por los conidiforos), se aplastarn stos ligeramente sobre la gota o
se seccionarn con un bistur.
4. Con agujas muy finas se distribuye el material en la gota de manera que no quede
amontonado.
5. Colocar el portaobjetos poco a poco y empezando por un lado para evitar que se
formen burbujas entre los dos vidrios.
Experimento 7. Preparacin en cinta adhesiva.
1. Colocar sobre un portaobjetos una gota de solucin de lactofenol no demasiado
grande para evitar que el cubreobjetos flote y la preparacin quede demasiado
gruesa.
2. Cortar un trozo de cinta adhesiva transparente de aproximadamente 2cm.
3. Tocar con el lado adhesivo de la cinta la superficie de la fruta o el pan enmohecidos
o el borde de una colonia de hongo de un cultivo. En la zona central de una colonia
puede haber una excesiva concentracin de esporas.
4. Pegar la cinta adhesiva sobre la gota del portaobjetos
5. Eliminar el colorante sobrante con un papel de filtro
6. Observar al microscopio
RESULTADOS
Reportar cada una de las observaciones efectuadas con las distintas tcnicas.
CUESTIONARIO

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PRCTICA 4.
AISLAMIENTO DE MICROORGANISMOS
OBJETIVO
Aplicar las diferentes tcnicas microbiolgicas para sembrar microorganismos y obtener
cultivos puros.
INTRODUCCIN
Los microorganismos en su estado y hbitat natural no existen en forma pura sino, en
comunidades o poblaciones microbianas mezcladas. El estudio organizado de cualquier
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organismo requiere que se examine una especie pura, a pesar de que es muy difcil
aislar una sola clula existen tcnicas capaces de aproximar este ideal.
Material
Autoclave
Cajas petri
Pipetas 1 y 2 mL
Asa de siembra
Gradilla
Campanas de Durham
Reactivos
Agar nutritivo
Caldo nutritivo
Caldo lactosado
Cultivo mixto
Agua peptonada
METODOLOGA
Experimento 1. Preparacin de diluciones en serie
1. Colocar en una gradilla los tubos con agua peptonada y esterilizar.
Rotularlos como 1/10, 1/100, 1/ 1000, etc.
2. Con una pipeta estril se transfiere 1 mL de la muestra problema al tubo
rotulado como 1/10. Tapar el tubo y agitar. Cada vez que se quita el tapn, el
labio del tubo se debe flamear.
3. Para hacer la dilucin 1/100 se transfiere 1 mL del tubo 1/10 al tubo 1/100.
Tapar el tubo y agitar.
4. Se continua de la misma forma para cada una de las diluciones siguientes.
En cada transferencia debe emplearse una pipeta estril.
Experimento 2. Siembra en placa
a. Por estras
1. Se derrite el agar nutritivo, se mantiene a una temperatura de 45C
aproximadamente.
2. Destape la botella del agar, flamee la boca y vierta unos 15-20 mL de agar
derretido sobre la caja Petri. tape la botella del agar.
3. Cubra la caja inmediatamente y djela sobre la mesa por unos 15 20 min, para
que el agar solidifique adecuadamente.
4. Introduzca el asa de cultivo estril en el caldo de cultivo mixto para extraer una
pequea cantidad de microorganismos y dibuje sobre la superficie del agar una
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serie de lneas estriadas. Tenga cuidado de no perforar la superficie del agar

durante el sembrado.
5. Etiquete la caja Petri con su nombre, el nmero de experimento. Incube en
posicin invertida por un periodo de 24 a 48 h a 35C
b. Con varilla angular de vidrio
1. Repita los pasos 1-3 del experimento anterior
2. Esterilice el asa de cultivo, introduzca en el cultivo mixto y deposite la gota cerca
del borde de la superficie del agar.
3. Vierta 2 gotas de alcohol sobre el brazo ms corto de la varilla de vidrio, flamee y
permita que arda hasta que se queme todo el alcohol, repita la operacin y
despus permita que la varilla se enfre al aire por un minuto.
4. Utilice el brazo de la varilla para distribuir uniformemente la gota de cultivo sobre la
superficie de agar.
c. Por vaciado
1. Se derrite el agar nutritivo, se mantiene a una temperatura de 45C
aproximadamente.
2. Se coloca sobre una caja de Petri estril 1 mL de dilucin
3. Destape la botella del agar, flamee la boca y vierta unos 15-20 mL de agar
derretido sobre la caja Petri. tape la botella del agar.
4. Cubra la caja de Petri y homogenice la mezcla empleando movimiento circulares y
en forma de 8.
Experimento 3. Siembra en tubo. Para la siembra en tubo, el medio de cultivo se coloca

dentro de este (aproximadamente la mitad en volumen del tubo) antes de proceder a la
esterilizacin.
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a. Por estras
1. El tubo con el medio estril se coloca sobre una superficie, de tal forma que el
medio quede inclinado. Se deja enfriar y solidificar.
2. Se toma una muestra de colonia con el asa de siembra estril y se desliza sobre la
superficie del agar en forma de estras.
3. Incubar a 35C por 24 horas.
b. Por picadura
1. El tubo con el medio estril se coloca sobre una superficie, de tal forma que el
medio quede inclinado. Se deja enfriar y solidificar.
2. Sobre el medio de cultivo se introduce longitudinalmente el asa con la muestra.
c. En medio lquido
1. El caldo lactosado se coloca en el tubo de ensaye antes de esterilizar, se coloca
una campana Durham en posicin invertida, el medio de cultivo debe cubrir la
campana pero tambin debe permitir espacio para la muestra.
2. Se mide 1 mL de muestra (agua residual) con una pipeta estril y se transfiere
aspticamente al tubo con caldo lactosado estril.
3. Incube durante 24-48 h a 35C.
RESULTADOS
1. Examinar y observar el tipo de crecimiento en cada uno de los diferentes modos de
siembra en placa y tubo.
2. Hacer una descripcin minuciosa de las caractersticas de crecimiento de las
colonias presentes.
CUESTIONARIO

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PRCTICA 5.
CONTROL DEL CRECIMIENTO DE MICROORGANISMOS
OBJETIVO
Evaluar el efecto de diferentes parmetros fsicos (temperaturas, potencial
oxidorreduccin y presin osmtica) y qumicos (antibiticos y substancias qumicas) en el
crecimiento microbiano.
INTRODUCCIN.
El crecimiento de una poblacin de microorganismos puede ser controlado por agentes
fsicos y/o agentes qumicos. El efecto de estos agentes sobre los microorganismos varia
dependiendo de diversos factores, tales como: el grado en el que son aplicados, por la
especie microbiana que se desea controlar, por la composicin del medio donde se
encuentran los microorganismos, etc.
1. Agentes fsicos
Efecto de la temperatura
El rango de temperatura en el cual pueden vivir los microorganismos es de 5C a 80C.

Debido a que los organismos consisten principalmente de agua, el lmite inferior para su
desarrollo es aquel en el cual el agua se congela. El lmite superior se encuentra fijado
por la habilidad trmica de los constituyentes qumicos de la materia viva, que son
principalmente las protenas y los cidos nucleicos.

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Sin embargo, el rango de temperatura para el desarrollo de una especie microbiana en

particular, es muy especfico. Por ejemplo, para E. coli., la temperatura mnima de
crecimiento es de 10 a 12C, la mxima aproximadamente de 46C y la ptima entre 37 y
45C.
A temperaturas cercanas a la mnima, disminuye la velocidad de todas las reacciones
qumicas de la clula. En esta regin, un ligero incremento en la temperatura produce un
enorme incremento en la velocidad de crecimiento. A medida que se alcanza la
temperatura ptima, va disminuyendo el aumento en la velocidad de crecimiento.
Finalmente, un ligero incremento en la temperatura por arriba de la ptima, causa una
rpida disminucin de la velocidad de crecimiento hasta alcanzar cero.
La bacteria E. coli es un ejemplo de una bacteria mesoflica. Los mesfilos son
organismos con una temperatura ptima entre 20 y 45C. Los organismos que tienen una
temperatura ptima de crecimiento por arriba de 45C, se conocen como termfilos; los
organismos que tiene una temperatura de crecimiento ptima debajo de 20C se conocen
como psicrfilos. Como todas las clasificaciones, esta es arbitraria y existen muchas otras
que se salen de los rangos anteriormente dados.
Efecto de pH
El medio interno de todas las clulas vivientes es aproximadamente neutro. Sin embargo,
la mayora de los microorganismos son relativamente insensibles a la concentracin
externa de iones hidrgeno e hidroxilo. Muchas especies pueden crecer bien a cualquier
valor de pH entre 6 y 9.
La explicacin por la que algunos microorganismos pueden crecer en un medio tan
variante de pH, es debido a que sus clulas son ligeramente permeables a los iones
hidrgeno e hidroxilo. Por lo tanto es difcil mantener la neutralidad interna en un medio
que contiene grandes cantidades de cualquier tipo de iones.
En contraste, algunas especies muestran una marcada preferencia por condiciones
extremadamente cidas o extremadamente alcalinas. Un ejemplo tpico de bacterias que
se desarrollan perfectamente en medios cidos es el Thiobacilli que crece a un pH de 0.
Otro caso extremo son los bacilos que descomponen la urea, muchos de los cuales no
puede crecer a un pH menor a 8.
Efecto de la concentracin de Sales y Azcar (Presin osmtica)
La osmosis es la difusin de molculas de solventes por una membrana semipermeable,
de mayor a menor concentracin. La presin osmtica de una solucin depende de la
concentracin de substancias disueltas en la misma. Si se comparan dos soluciones de
presin osmtica diferente, la mayor presin se llama hipertnica y la otra hipotnica.
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Cuando se colocan clulas normales en soluciones hipertnicas (alta presin osmtica)

ocurre una plasmlisis. El agua sale del protoplasma, se concentra y la clula adquiere la
forma de una pequea masa. Cesa la actividad metablica y la clula se inactiva e incluso
puede morir. Las bacterias Gram(+) son mas difciles de plasmolizar que las Gram(-).
Los microorganismos adaptados a medios que tienen altas concentraciones de azcar se
llaman sacarfilos, mientras que aquellos que se desarrollan en medios con altas
concentraciones de sal se llaman halfilos.
Por lo general, concentraciones de 10 a 15% de sal y del 40 al 50% de azcar, inhiben el
crecimiento de microorganismos.
2. Agentes qumicos
Antibiticos
La palabra antibitico significa destructor de la vida. Los antibiticos son substancias
que son producto de un tipo de microorganismo y que de alguna manera interfieren el
metabolismo celular de otros, causando su inhibicin o muerte.
Los antibiticos son tiles para combatir enfermedades causadas por microorganismos,
ya que adems de ser especficos la cantidad de antibiticos tolerada por el husped es
suficiente para atacar a los microorganismos.
Algunos microorganismos desarrollan resistencia a los antibiticos. Se sabe que por cada
milln o por cada diez millones de divisiones celulares aparece un mutante resistente a
un antibitico dado. Si esta mutacin ocurre, el mutante tendr mayor valor de
supervivencia que los microorganismos normales y el tratamiento anterior con el mismo
antibitico no tendr ningn resultado.
Los antibiticos ms comnmente usados son la penicilina y la estreptomicina, ambos
bactericidas, y el cloramfenicol y la tetraciclina que son bacteriostticos.
Substancias Qumicas.
De acuerdo al efecto que este tipo de agente puede ejercer sobre los microorganismos,
las sustancias pueden clasificarse en tres grupos:
A) Substancias qumicas que lesionan la membrana celular: jabones, detergentes,
cidos, lcalis, etc.
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B) Substancias qumicas que inhiben la actividad enzimtica, desnaturalizan las

protenas o ambas acciones. A este grupo pertenecen: alcoholes, fenoles, agentes
de oxidacin, metales pesados, etc.
C) Substancias que lesiona ncleos y genes. Por ejemplo, los colorantes bsicos
como el verde brillante y el cristal violeta.
Algunos de estos agentes qumicos son bactericidas, pero la gran mayora de ellos son
bacteriostticos. Sin embargo, no hay un desinfectante que sea til para todos los fines.
La eleccin de un determinado tipo de desinfectante depende del carcter del material a
desinfectar, la capacidad de corrosin o toxicidad, los factores econmicos, etc.
NOTA: Esta prctica se llevara a cabo en TRES sesiones, en la primera se realizarn los
incisos 1.A, 1.B y 1.C, en la segunda los incisos 2.A y 2.B, y en la tercera el inciso 2.C y
2.D.
Material
1, 2 y 3 SESIN
Cajas petri
Tubos ensaye (rosca)
Pipetas 1, 2 y 5 mL
Probeta 100 mL
Vaso pp 500 mL
Mechero Fisher
Pipeteros/cajeros
3 SESIN
Crculos de papel filtro 2 cm
Extensor de vidrio
Pinzas diseccin
Asa de siembra
TODAS LAS SESIONES
Estufa de cultivo
Refrigerador
Cuentacolonias
Licuadora
Potencimetro
Autoclave
Reactivos
50 g alimento contaminado por sesin
1. SESIN
Agar nutritivo
Agua peptonada
Caldo tioglicolato
Caldo nutritivo
2 SESIN
Agar soya tripticasa
NaCl
Caldo extracto de malta
Sacarosa
3 SESIN
Etanol 70%
Penicilina (500 Un/mL)
Estreptomicina (2500 g/mL)
Tetraciclina (1500 g/mL)
Agar nutritivo
Fenol 5%
H2O2 3%
Agua peptonada
Caldo nutritivo
METODOLOGA
PRIMERA SESIN
Agentes Fsicos
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1.A Efecto de la temperatura

Preparar una dilucin 10-2 y verter 1 mililitro en cada una de 4 cajas petri, agregar de 12 a
15 mL de agar nutritivo fundido y templado, homogenizando mediante 6 movimientos de
derecha a izquierda, 6 en el sentido de las manecillas del reloj, 6 en sentido contrario y 6
de atrs a adelante, sobre una superficie lisa y horizontal hasta lograr una completa
incorporacin del inculo en el medio; cuidar que el medio no moje la cubierta de las
cajas. Dejar solidificar.
Las cajas se marcan y son colocadas a diferentes temperaturas de la siguiente manera:
1 caja a temperatura entre 4 y 6C (refrigerador)
1 caja a temperatura entre 20 y 25 C (medio ambiente)
1 caja a temperatura de 35C (estufa de cultivo)
1 caja a temperatura de 55C (estufa de cultivo)
Observar y llevar a cabo el conteo de microorganismos de cada una de las cajas a las 24
y 48 horas.
Reportar los resultados obtenidos en ufc/mL de muestra y graficar los datos, si es posible,
relacionando ufc/mL con los diferentes valores a temperatura y generacin por hora.
1.B Efecto del pH
Verter 1mL de la dilucin 10-2 preparada en 1.A, en cada una de 4 cajas petri, verter de 12
a 15mL de agar nutritivo fundido y templado con diferente pH, marcando las cajas como
se indica a continuacin y homogenizando mediante 6 movimientos de derecha a
izquierda, 6 en el sentido de las manecillas del reloj, 6 en sentido contrario y 6 de atrs a
adelante, sobre una superficie lisa y horizontal hasta lograr una completa incorporacin
del inculo en el medio; cuidar que el medio no moje la cubierta de las cajas. Dejar
solidificar.
1 caja con agar a un pH de 5
Las cajas se incuban a 28C. Observar y llevar a cabo el conteo de microorganismos de
cada una de las cajas a las 24 y 48 horas.
Reportar los resultados obtenidos en ufc/mL de muestra y graficar los datos relacionando
ufc/mL con los diferentes valores de pH.
1.C Efecto del potencial oxidorreduccin
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Revisin:
Inocular un tubo con 15 mL de caldo tioglicolato y uno con 15 mL de caldo nutritivo con
0.1 mL de la dilucin preparada en el inciso 1.A
Incubar los tubos a 37C durante 24 a 48 horas y observar si se produce crecimiento (en
el fondo, superficie o en el tubo)
SEGUNDA SESIN
2.A Efecto de la concentracin del NaCl
Verter 1mL de la dilucin 10 -2 preparada como en 1.A en cada una de 5 cajas petri. Verter
de 12 a 15mL de agar soya tripticasa fundido y templado, con diferente concentracin de
NaCl, como se indica a continuacin y homogenizando mediante 6 movimientos de
derecha a izquierda, 6 en el sentido de las manecillas del reloj, 6 en sentido contrario y 6
de atrs a adelante, sobre una superficie lisa y horizontal hasta lograr una completa
incorporacin del inculo en el medio; cuidar que el medio no moje la cubierta de las
cajas. Dejar solidificar.
1 caja con agar a una concentracin de NaCl del
0%
5%
10%
15%
20%
Las cajas se incuban a 35 C. Observar y llevar a cabo el conteo de microorganismos en

cada una de las cajas a las 24 y 48 horas.
Reportar los resultados obtenidos en ufc/mL de muestra y graficar los datos relacionando
ufc/mL de muestra con cada concentracin de NaCl empleada.
2.B Efecto de la concentracin de sacarosa.
Verter 1 mL de dilucin 10 -2 preparada en 1.A en cada uno de 5 tubos de ensaye. Agregar
10 mL de caldo extracto de malta (CEM), con diferentes concentraciones de sacarosa:
1 Tubo con C.E.M con 0% de sacarosa.
1 Tubo con C.E.M con 5% de sacarosa
Agitar cuidadosamente los tubos para lograr que la dilucin y el medio de cultivo se
distribuyan uniformemente.
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Observar el efecto de la variacin de la concentracin de sacarosa sobre el crecimiento

microbiano en los tubos inoculados, a las 24 y 48 horas.
Reportar los resultados obtenidos.
TERCERA SESIN
2.C Efecto de los antibiticos.
Verter de 12 a 15 mL de agar nutritivo en cada una de 4 cajas petri y homogenizar
cuidando que el medio no moje la cubierta de las cajas. Dejar solidificar.
Preparar una dilucin 10-2 de la muestra e inocular 0.1 mL en cada una de las cajas por el
mtodo de extensin en superficie.
Posteriormente sumergir los crculos de papel filtro estriles en las diferentes soluciones
de antibiticos utilizando pinzas estriles. Preparar un crculo con cada antibitico. Los
crculos se colocan en el centro de las cajas petri (un crculo de papel en cada caja petri),
conteniendo agar nutritivo solidificado como se indica a continuacin:
1 caja con crculo sumergido en penicilina.
1 caja con crculo sumergido en tetraciclina
1 caja con crculo sumergido en estreptomicina.
1 caja con crculo sumergido en agua peptonada (testigo).
Las cajas se incuban a 35 C y se observa el crecimiento microbiano en la periferia de los
crculos a las 24 y 48 horas, usando el testigo como referencia.
Reportar las observaciones hechas y establecer cual de los antibiticos es el mas
efectivo.
2.D Efecto de Sustancias Qumicas
El procedimiento descrito a continuacin se llevara acabo para cada uno de los 3 agentes
qumicos estudiados, que son las soluciones de fenol, alcohol etlico y peroxido de
hidrgeno.
Verter en cada uno de 4 tubos de ensaye 10 mL de caldo nutritivo. Tapar los tubos e
identificar cada tubo dependiendo del tiempo de tratamiento empleado (0, 5, 10 y 15
minutos).
En un tubo de ensaye limpio se vierte 1 mL de la muestra a analizar y se aaden 5 mL de
la solucin del desinfectante estudiado. Se registra el tiempo en el que se empez el
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tratamiento y despus de 0, 5, 10 y 15 minutos se transfieren dos asadas de la mezcla

muestra-desinfectante, a los tubos conteniendo caldo nutritivo.
Los tubos se tapan y se incuban a 35 C. Este procedimiento se repite para los otros dos
desinfectantes usados.
Por ltimo se inocula un tubo de ensaye conteniendo caldo nutritivo, con dos asadas de la
muestra (sin haber sido tratada con desinfectante). Se incuban a las mismas condiciones
que el resto de los tubos.
Llevar a cabo las observaciones a las 24 y 48 horas de incubacin, en cuanto al efecto de
los diversos desinfectantes y el distinto tiempo de tratamiento, sobre el crecimiento
microbiano en los tubos, llevando a cabo comparaciones con los tubos testigo.
RESULTADOS
CUESTIONARIO

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PRCTICA 6.
DETERMINACIN DEL PUNTO TRMICO MORTAL Y DEL TIEMPO TRMICO
MORTAL
OBJETIVO
El alumno aplicara un mtodo que le permitir conocer la temperatura y el tiempo mnimo
necesario para estilizar una suspensin bacteriana, as como el efecto que tiene
diferentes diluyentes sobre dichas determinaciones.
INTRODUCCIN
Diferentes
especies microbianas varan ampliamente en sus fluctuaciones de
temperatura ptima para su desarrollo: las llamadas psicrfilas crecen mejor a
temperaturas bajas (15 a 20C), las formas mesfilas lo hacen mejor de 30 a 37C, la
mayor parte de la termfilas entre 50C y 60C.
La mayor parte de los microorganismos son mesfilos, 30C es la temperatura ptima
para muchas de las formas de vida libre y la temperatura del husped es ptima para los
simbiontes de los animales de sangre caliente.
El lmite superior de temperatura tolerada por cualquier especie se correlaciona bien con
la estabilidad trmica general de las protenas de dicha especie.
Los microorganismos comparten con los vegetales y los animales la respuesta al choque
por calor, una sntesis de protenas por el calor cuando son expuestos a una elevacin
sbdita en la temperatura por arriba de la ptima para el crecimiento. Al parecer estas
protenas son resistentes al calor y estabilizan a las protenas de la clula sensible al
calor. Las bacterias tambin exhiben fenmeno denominado choque por fro, sea la
muerte de las clulas por un enfriamiento rpido, en oposicin a uno lento. Por ejemplo, el
enfriamiento rpido de Escherichia coli desde 37C a 5C puede matar al 90% de las
clulas.
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Revisin:
EFECTO LETAL DEL CALOR

La temperatura elevada, combinada o no con humedad, es uno de los mtodos ms
utilizados para eliminar microorganismos. La destruccin de las clulas de los
microorganismos por accin del calor depende de la temperatura y tiempo de aplicacin.
Cada microorganismo presenta caractersticas particulares de resistencia al calor, por lo
cual es importante conocer las condiciones en las cuales son eliminados en su totalidad,
ms si se trata de organismos patgenos. Para expresar esta resistencia se pueden usar
dos trminos: el punto trmico mortal y el tiempo trmico mortal.
Al subir la temperatura por encima de la temperatura mxima de crecimiento, se dejan
sentir los efectos sobre la viabilidad: la prdida de viabilidad significa que las bacterias
dejan de ser capaces de crecer y dividirse. La muerte se debe a la destruccin o
inactivacin irreversible de una molcula o estructura esencial (como el ADN
cromosmico o por creacin de un dao irreparable en la membrana). Algunos
parmetros utilizados para caracterizar o medir en la prctica la inactivacin por calor de
una suspensin bacteriana son:
tiempo trmico mortal: es el tiempo mnimo requerido para que mueran todas las
bacterias de una determinada suspensin a una determinada temperatura;
tiempo de reduccin decimal: es el tiempo requerido para reducir al 10% la densidad
de la suspensin, a una determinada temperatura (tambin llamado valor D);
Punto trmico mortal: es la temperatura mnima que mata a todas las bacterias en un
tiempo determinado (normalmente el tiempo de referencia empleado es de 10 min.).
Material
Vasos de pp 100 mL y 250 mL
Probeta 50 mL
Bao Mara
Agitador magntico
Tubos de ensaye (rosca)
Parrilla de agitacin
Varilla de vidrio
Embudos de vidrio
Papel filtro
Pipeta 1, 2 y 5 mL
Mechero
Reactivos
Agar nutritivo
Pur de tomate
Jugo de naranja
Leche descremada
Agua destilada estril
Cepa bacteriana

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Revisin:
Pinzas tubo de ensaye

METODOLOGA
PREPARACIN DE SUSPENSIONES BACTERIANAS.
- Preparar las suspensiones de la cepa apropiada en agua destilada estril (que quede
turbia).
- Colocar en tubos diferentes 10 mL de jugo de naranja, 10 mL de agua destilada, 10 mL
de leche descremada y 10 mL de pur de tomate. Ser necesario rotularlos.
- Transferir 1 mL de la suspensin bacteriana preparada a cada tubo.
DETERMINACIN DE PUNTO TRMICO MORTAL (PTM)
-Colocar en una gradilla una serie de 6 tubos
-Marcar cada tubo con el nombre de la cepa
-Anotar en cada tubo las temperaturas siguientes: testigo, 50, 60, 70, 80C y ebullicin
-Colocar en cada uno de los cinco tubos 0.5 mL de la suspensin bacteriana
-Calentar la suspensin a la temperatura indicada en un bao Mara durante 10 minutos
(El tubo testigo NO SER CALENTADO)
-Vaciar 0.1 mL de cada tubo en la superficie de una placa de agar simple y homogeneizar
por rotacin sobre la mesa o mediante extensin con varilla de vidrio doblada a 90
-Incubar las placas a 37C durante 24 horas
-Observar si hay o no crecimiento
DETERMINACIN DEL TIEMPO TRMICO MORTAL (TTL)
-Colocar en una gradilla una serie de 6 tubos de 13 x 100
-Marcar cada tubo con el nombre de la cepa que va a estudiar
-Anotar en cada tubo los tiempos que se indican a continuacin: testigo, 5, 10, 15, 20 y 30
minutos
-Colocar en cada tubo 0.5 mL de la suspensin bacteriana
-Calentar en un bao Mara a 70C, durante los tiempos indicados (El tubo testigo NO SE
CALIENTA)
-Vaciar 0.1 mL de cada tubo sobre la superficie de una placa de agar simple y
homogeneizar por rotacin sobre la mesa o mediante extensin con varilla de vidrio
doblada a 90
-Incubar las placas a 37C durante 24 horas
-Observar si se presenta o no crecimiento
RESULTADOS
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Revisin:
Anotar el PTM de cada cepa con los diferentes diluyentes, usando la tabla siguiente:
DILUYENTE
CRECIMIENTO DESPUS DEL CALENTAMIENTO (C)

TESTIGO 37
60
70
80
EBULLICIN
Agua
Jugo naranja
Leche
Pur tomate
Anotar el PMT de las capas usadas en esta practica con diferentes diluyentes, usando la
tabla siguiente:
DILUYENTE ( C/ 10 MINUTOS)
2
3
1 = Agua
2 = Jugo de naranja
3 = Leche
4 = Pur de tomate.
Anotar los resultados del TTL de cada cepa con diferentes diluyentes, usando la tabla que
viene a continuacin:
DILUYENTE
CRECIMIENTO DESPUS DEL CALENTAMIENTO

DURANTE (min)
TESTIGO
5
10
15
20
30
Agua
Jugo naranja
Leche
Pur tomate
Anotar el TTL en cada uno de los diluyentes, utilizando el cuadro que viene a
continuacin:
DILUYENTE/TTL ( MINUTOS/70C)
2
3

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1 = Agua
2 = Jugo de naranja
3 = Leche
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4 = Pur de tomate.
CUESTIONARIO
1.- Que caractersticas presentan las bacterias llamadas psicrfilas?
2.- A que temperatura crecen las bacterias mesfilas?
3.- Que sucede con las protenas en la clula bacteriana cuando se aplica un cambio
brusco en la temperatura?, esto representa alguna ventaja para el m.o.?
4.- Qu es el tiempo trmico letal y cmo se determina?
5.- Qu informacin da el punto trmico mortal?
6.-A que temperatura se reporta el punto trmico mortal?
7.-Que muestras despus de la incubacin reporta el tiempo ptimo para la destruccin
de las bacterias en los distintos diluyentes? Porqu?
PRCTICA 7.
ANLISIS DE MICROORGANISMOS INDICADORES Y PATGENOS EN ALIMENTOS
OBJETIVO
Que el alumno aplique las tcnicas microbiolgicas para evaluar la calidad de algunos
alimentos y compare los datos obtenidos con los de las normas correspondientes.
INTRODUCCIN
Material
Reactivos
ACORDE A LAS NOMs

METODOLOGA
1. Preparar la muestra para el anlisis pesando 10g de muestra y agregando 90 mL
de solucin diluyente. Homogenizar perfectamente la muestra en la dilucin
primaria. A partir de esta preparar las diluciones 10 -2 a 10-4 y sembrar 2 cajas de las
diluciones 10-2, 10-3 y 10-4.
2. Aplicar las tcnicas para llevar acabo los siguientes anlisis microbiolgicos:
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Revisin:
Cuenta estndar de bacterias mesofilas aerobias (NORMA OFICIAL MEXICANA

NOM-092-SSA1-1994, BIENES Y SERVICIOS. MTODO PARA LA CUENTA DE
BACTERIAS AEROBIAS EN PLACA).
Cuenta de hongos y levaduras (NORMA OFICIAL MEXICANA NOM-111-SSA11994, BIENES Y SERVICIOS. MTODO PARA LA CUENTA DE MOHOS Y
LEVADURAS EN ALIMENTOS).
Cuenta de coliformes totales en placa (NORMA OFICIAL MEXICANA NOM-113SSA1-1994, BIENES Y SERVICIOS. MTODO PARA LA CUENTA DE
MICROORGANISMOS COLIFORMES TOTALES EN PLACA).
Cuenta de coliformes NMP (NORMA OFICIAL MEXICANA NOM-112-SSA1-1994,
BIENES Y SERVICIOS. DETERMINACIN DE BACTERIAS COLIFORMES.
TCNICA DEL NMERO MS PROBABLE).
Salmonela (NORMA OFICIAL MEXICANA NOM-114-SSA1-1994, BIENES Y

SERVICIOS. MTODO PARA LA DETERMINACIN DE SALMONELLA EN
ALIMENTOS).
SISTEMAS DE EVALUACIN
Criterios de evaluacin parcial
Porcentaje de calificacin
Evaluaciones orales o escritas (3 exmenes)
50%
Trabajo de investigacin, participacin en clase, tareas

(Exposicin, participacin y/o redaccin de trabajos)
10%
Laboratorio (OBLIGATORIO)
40%
o Anteproyecto**
5%
o Reporte de prctica
25%
Portada
Introduccin (mximo 2 hojas; con base en libros)
Metodologa (en prosa)
Resultados (tablas-grficas-fotos; con ttulo y un.)
0.5 ptos
1.0 ptos
1.0 ptos
1.0 ptos

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Revisin:
Discusin de resultados (describir lo que se obtuvo-explicar

porque se obtuvo-que dice la bibliografa-que encontraron
otros inv.)
5.0 ptos
Conclusin
(mximo dos prrafos)
1.0 ptos
Bibliografa
0.5 ptos
o Trabajo en laboratorio
10%
** Incluye resumen las propiedades fsicas-qumicas-toxicolgicas de los reactivos

involucrados en la prctica.
Las evaluaciones parciales:
1- El Estudiante tendr derecho a exentar el examen ordinario si aprueba las tres
evaluaciones parciales (calificacin mnima 6.0).
2- Para las calificaciones parciales se tomarn en cuenta los Criterios de evaluacin
parcial si los exmenes (escritos u orales) son acreditados con una calificacin
mnima de 6.
3- La calificacin de examen ordinario se obtendr de la suma de dos porcentajes. La
calificacin obtenida en el examen ordinario tendr un valor de 90% de la
calificacin final y el 10% restante corresponder al proyecto de actividad
integradora realizada en el semestre.
4- El examen ordinario evaluar los conocimientos tericos y los generados en las
prcticas de laboratorio.
5- La calificacin final de la Unidad de Aprendizaje ser el promedio de las
calificaciones parciales o de la calificacin obtenida en la evaluacin ordinaria.
6- En caso de no aprobar el laboratorio, no tendr derecho a presentar examen
parcial.
7- Los equipos de laboratorio sern de mximo dos estudiantes.
8- El reporte de prcticas se entrega en forma escrita a mano y slo se permiten
imgenes de equipo o de resultados impresas.
9- En caso de no presentar reporte de prcticas de laboratorio no se tendr derecho a
examen.
10-Para cada prctica de laboratorio el alumno deber presentar el diagrama de flujo
de la metodoloa y el resumen de las propiedades fsicas-qumicas-toxicolgicas de
los reactivos involucrados en la misma.
REFERENCIAS BSICAS
Pgina:
1 de 38

Registro:
MANUAL DE PRCTICAS
Cdigo:
Revisin:
1. Pelckzar M. Microbiologa. McGraw Hill

2. Casida, Industrial (1989). Microbiology, John wiley and Sons.
3. Ward. Fermentation Biotechnolgy, principles . Prentice Hall.
4. Carpenter P. Microbiologa. Interamericana.
5. Norris J. R. Methods in microbiology. Vol 1 y 2. Academic Press.
6. Scriban R. Biotecnologa. Editorial El manual moderno.
7. Prescott Microbiologa
8. Normas Oficiales Mexicanas
REVISTAS ESPECIALIZADAS

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DRA. LIDIA PATRICIA JARAMILLO LIDIA

multidisciplinarios durante el desarrollo de las prcticas y reportes de laboratorio.

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2. Desarrollar habilidades de anlisis, sntesis, organizacin y planificacin de

Normas generales de uso del laboratorio.

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OBJETIVO: Lente situada cerca de la preparacin. Ampla la imagen de

CONDENSADOR: Lente que concentra los rayos luminosos sobre la

DIAFRAGMA: Regula la cantidad de luz que entra en el condensador.

FOCO: Dirige los rayos luminosos hacia el condensador.

SOPORTE: Mantiene la parte ptica. Tiene dos partes: el pie o base y el

PLATINA: Lugar donde se deposita la preparacin.

CABEZAL: Contiene los sistemas de lentes oculares. Puede ser monocular,

REVLVER: Contiene los sistemas de lentes objetivos. Permite, al girar,

TORNILLOS DE ENFOQUE: Macromtrico que aproxima el enfoque y

1. Colocar el objetivo de menor aumento en posicin de empleo y bajar la platina

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a. Acercar al mximo la lente del objetivo a la preparacin, empleando el

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7. El cambio de objetivo se hace girando el revlver y dirigiendo siempre la mirada a

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2. Obtn, ayudndote de unas pinzas, un trozo de pulpa de tomate de unos 2mm de

4. Colocar el frotis de sangre sobre la cubeta de tincin y aadir unas gotas de

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Reportar las observaciones efectuadas con el mayor detalle posible.

Diferenciar entre clulas animales y vegetales.

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Experimento 2. Preparacin de medios de cultivo.

Indicar el material sometido a esterilizacin, as como las condiciones a las que se

Indicar el nombre de los medios de cultivo empleados, el volumen preparado, la

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1. Preparar los frotis bacterianos indicados

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serie de lneas estriadas. Tenga cuidado de no perforar la superficie del agar

Experimento 3. Siembra en tubo. Para la siembra en tubo, el medio de cultivo se coloca

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El rango de temperatura en el cual pueden vivir los microorganismos es de 5C a 80C.

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Sin embargo, el rango de temperatura para el desarrollo de una especie microbiana en

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Cuando se colocan clulas normales en soluciones hipertnicas (alta presin osmtica)

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B) Substancias qumicas que inhiben la actividad enzimtica, desnaturalizan las