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OBSERVACION DE BACTERIAS, TINCIONES SIMPLES Y COMPUESTAS

Programa de Biologa, Facultad de ciencias, Universidad del Tolima
SHARON PENAGOS JARAMILLO 070100442014
MARIA JOSE GARCIA MORALES 1110513338
KATHERIN LEAL GONZALEZ 070150222014
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RESUMEN
La microbiologa se encarga del estudio de los microorganismos los cuales no pueden ser
reconocidos a simple vista , para hacer este estudio ms eficiente se han desarrollado diferentes
tcnicas para su determinacin y reconocimiento ms exacto debido a la gran variedad de formas
y caractersticas propias de los mismos. Entre ellas se encuentran las tinciones mtodo por el cual
es ms fcil su visualizacin y caracterizacin; estas se pueden realizar de manera sencilla, como
es el caso de las tinciones frescas o de manera ms especfica, como lo son las tinciones fijas.
Debido a que estos mtodos son de gran utilidad es importante su estudio y conocimiento, por esta
razn demostraremos la importancia de diferentes tipos de tinciones para la determinacin de
organismos. Se observan diferentes gneros de microorganismos, donde se muestra la variedad
de tinciones, sus ventajas y utilidad en el campo de estudio.
Reconoceremos tinciones importantes como es el caso de las tinciones frescas, tinciones simples,
tincin de Gram, tincin de Zielh Nielsen y la tincin de scheaffer-fulton.

PALABRAS CLAVE: Microbiologa, Tinciones, Determinacin, Tincin de Gram.

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ABSTRACT
Microbiology deals with the study of microorganisms which can not be recognized at first glance, to
make this more efficient study have developed different techniques for determination and more
accurate recognition because of the wide variety of shapes and characteristics thereof . These
include the method by which stains easier viewing and characterization; these can be done easily,
as in the case of fresh stains or more specifically, as are the fixed stainings.
Because these methods are useful it is important study and knowledge, therefore demonstrate the
importance of different types of stains for determination of organisms. different kinds of
microorganisms, where the variety of stains shown, its advantages and usefulness in the field of
study are observed.
We recognize important stains such as fresh stains, simple staining, Gram stain, stain and Ziehl
Nielsen staining Schaeffer-Fulton.

KEY WORDS: Microbiology, Staining, Determination, Gram stain.

INTRODUCCION
El propsito de este estudio, es el
conocimiento de diferentes mtodos de
tincin para la observacin de bacterias que
nos
permita
su
determinacin
y
caracterizacin, para esto debemos conocer
su forma y caractersticas propias de unos de
los principales gneros de bacterias.
Conoceremos las ventajas y desventajas de
las diferentes tinciones incluyendo su
facilidad y su complejidad en el manejo.
Podremos observar diferentes organismos
con caractersticas relevantes, entre los
organismos
que
observaremos
se
encuentran:
Bacilos: Organismos caracterizados por su
forma de barra o vara, los cuales se dividen
entre

Gram
positivos
(+):
Bacterias
caracterizadas
por
poseer
una
membrana citoplasmtica, Capa gruesa
de
peptidoglicano
y
cidos
teicoicos y lipoteicoicos,
que
sirven
como agentes quelantes y en ciertos
tipos de adherencia, Polisacridos de
la cpsula.
Gram
negativos
(-):
La envoltura
celular de las bacterias gram negativas
est compuesta por una membrana
citoplasmtica (membrana interna), una
pared celular delgada de peptidoglicano,
que rodea a la anterior, y una membrana
externa que recubre la pared celular de
estas bacterias.

Staphilococcus:
Cocos
Gram
(+),
anaerbicos facultativos, importantes en la
medicina.

Clostridium:
Es
un
gnero
de bacterias anaerobias, bacilos Gram
(+),
parsitas y saprfitas algunas
de
ellas,
que esporulan.
Mycobacterium:
El
gnero Mycobacterium est
formado
por bacilos aerobios inmviles
y
no
esporulados con un tamao de 0,2 a 0,6 x 1
a 10 m.
Las micobacterias son bacterias aerobias y
no
mviles.
Tienen cido-alcohol
resistencia, no
producen endosporas ni
cpsulas y suelen considerarse Gram (+). En
algunos casos, estos bacilos pueden
formar filamentos ramificados; sin embargo,
estos pueden romperse con facilidad.
ENFERMEDADES OCACIONADAS
ESTAS BACTERIAS

BACTERIA

ENFERMEDAD
Infecciones en la
piel
Neumona

Staphilococcus

Intoxicacin por
alimentos
Sndrome del shock
txico
Intoxicacin
sangunea
Infecciones del
tracto urinario

Klebsiella

Klebsiella: Bacterias inmviles, Gram (-),

anaerobias
facultativas y
con
una
prominente cpsula de polisacridos.

Neumona
Sepsis
Neumona

Pseudomonas:
Es
un
gnero
de bacilos rectos o ligeramente curvados,
Gram
(-)
oxidasa positivos, aerbicos estrictos.

POR

Pseudomonas

Otitis
Endocarditis
bacteriana


Mycobacterium
tuberculosis

Tuberculosis

Botulismo

Clostridium

Gangrena
Ttano

Para lograr la adecuada observacin y

reconocer las caractersticas entre los
organismos
se
realizarn
diferentes
preparaciones en diferentes organismos
nombrados anteriormente. Con el objetivo de
diferenciar y manejar diferentes tipos de
tincin. Nos enfocaremos en tinciones
frescas y fijas.
Las tinciones frescas las realizaremos desde
medio slido y lquido y en las tinciones fijas
realizaremos tinciones simples (Frotis),
tinciones diferenciales Tincin de Gram y
Zielh Nielsen)
y tinciones especiales
Schaeffer-fulton y cloracin negativa. Siendo
las tinciones fijas las de mayor complejidad
entre las que manejaremos en esta
oportunidad, conoceremos su procedimiento
y la accin que tiene sobre los organismos.
Manejaremos cuatro tipos de tinciones fijas.
TIPOS DE TINCIONES
Tincin simple
Se aplica para incrementar el contraste de
las clulas a observar bajo el microscopio por
medio de un nico colorante que, tie con la
misma tonalidad toda la clula; de esta
forma, se hace visible la morfologa y el
arreglo del crecimiento de las mismas.

Presenta un colorante principal o

primario (Bsico que tie las clulas
cargadas negativamente)
Un
agente
mordiente
(Sales
metlicas, solucin yodada o Lugol)
Un agente decolorante (Disolvente
orgnicos)
Un contractor o colorante secundario
(Distinto color utilizado en el
colorante primario)

Tincin de Gram
Se utiliza tanto para poder referirse a la
morfologa celular bacteriana, como para
poder realizar una primera aproximacin a la
diferenciacin
bacteriana,
considerndose bacterias Gram (+) a las que
se visualizan de color morado, y bacterias
Gram (-) a las que se visualizan de color
rosa.
El cristal violeta (colorante catinico) penetra
en todas las clulas bacterianas (tanto Gram
positivas como Gram negativas) a travs de
la pared bacteriana. El lugol es un compuesto
formado por I2 (yodo) de mordiente, haciendo
que el cristal violeta se fije con mayor
intensidad a la pared de la clula bacteriana.
El I2 entra en las clulas y forma un complejo
insoluble en solucin acuosa con el cristal
violeta.
La mezcla de alcohol-acetona que se agrega,
sirve para realizar la decoloracin, ya que en
la misma es soluble el complejo I2/cristal
violeta. Los organismos Gram positivos no se
decoloran, mientras que los Gram negativos
s lo hacen.

Son aquellas en las cuales se utiliza ms de

un colorante
y tienen por objetivo, la
observacin de estructuras especficas de las
bacterias.

Para poner de manifiesto las clulas Gram

negativas se utiliza una coloracin de
contraste. Habitualmente es un colorante de
color rojo, como la safranina o la fucsina.
Despus de la coloracin de contraste las
clulas Gram (-) son rojas, mientras que las
Gram (+) permanecen violetas.

Sus principales caractersticas son:

Tincin de Ziehl-Neelsen

TINICIONES COMPUESTAS

Es una tcnica de tincin diferencial rpida y

econmica, usada para la identificacin de

bacterias cido-alcohol resistentes (BAAR),

Las paredes celulares de ciertas bacterias
contienen cidos grasos (cidos miclicos)
de cadena larga
que les confieren la
propiedad de resistir la decoloracin con
alcohol-cido, despus de la tincin con
colorantes bsicos. Por esto se denominan
cido-alcohol resistente. Las micobacterias
como Mycobacterium tuberculosis y M.
marinum se caracterizan por sus propiedades
de cido-alcohol resistencia. La coloracin
clsica
de
Ziehl-Neelsen
requiere
calentamiento para que el colorante atraviese
la pared bacteriana que contiene ceras. Al
suspender el calentamiento y enfriar con
agua, provoca una nueva solidificacin de los
cidos grasos de modo que el colorante ya
no puede salir de las bacterias. Por otro lado,
el calentamiento aumenta la energa cintica
de las molculas del colorante lo cual
tambin facilita su entrada a las bacterias.
Las bacterias que resisten la decoloracin
son de color rojo y las que no, se ven de
color azul ya que se utiliza azul de metileno
como tincin de contraste.
Tincin Schaeffer-Fulton
Existen
diversos
tipos
de
esporas
microbianas, pero la espora bacteriana tiene
especial importancia ya que son organelos
de gran resistencia que se producen en el
interior de la clula, por lo que reciben el
nombre de endosporas. Pocos gneros de
bacterias son capaces de formar endosporas,
siendo los principales: Bacillus y Clostridium.
La tincin de Schaeffer-Fulton es una tcnica
diseada
para
aislar
estas
endosporas tindolas de color verde y
cualquier otro organismo bacteriano de rojo.
El tinte principal es el verde de malaquita, y
el colorante de contraste es safranina , que
tie cualquier otro organismo bacteriano de
rojo.
Cloracin Negativa Tincin negativa
para capsula
Es aplicada para poner en evidencia la
capsula microbiana una estructura externa a
la pared celular, sintetiza entre la membrana
celular y la pared de peptidoglicano. Para
esto es utilizado la tinta china para teir el
fondo y azul de metileno para teir el soma

bacteriano. La tcnica de tincin negativa

incorpora la tinta china, que tiene
elementos de gran tamao que no
pueden entrar a la clula, por lo cual la
capsula aparecer como una zona
transparente, sobre un fondo negro.
Teniendo conocimiento de estas bacterias y
estas preparaciones, esperamos determinar
e identificar las caractersticas de estos
organismos mediante las tinciones. Al igual
identificar que preparacin es la ms
eficiente y en cual lograremos clasificar los
organismos y reconocer estructuras de los
mismos.
MATERIALES Y METODOS

1 asa bacteriolgica.
Bandeja para tincin
Mechero de alcohol
Microscopio
Portaobjetos
Cubreobjetos
Pipeta Pasteur
Azul de Metileno
Cristal Violeta
Lugol de Gram
Alcohol-cetona
Safranina
Verde Malaquita
Fucsina
Tinta china

PREPARACIONES FRESCAS
Solidos
Se tom una muestra del medio de cultivo
indicado (Pseudomona) con un asa estril,
anterior a esto con un gotero fue puesta una
gota de agua sobre un porta objeto para
mantener hmeda la muestra, luego se
coloc la bacteria tomada por el asa en la
gota de agua cubrindola con el cubre
objetos y se dispuso a observarse al
microscopio a 40x.
PREPARACIONES FIJAS
Tincin Simple

Se realiz un frotis de Pseudomona el cual

se dej secar y luego se fij, despus fue
agregado azul de metileno (nico colorante)
dejando secar la muestra, finalmente se llev
a observar al microscopio al 40x y 100x.
Tinciones Diferenciales
Tincin de Gram
Se realiz un frotis de dos muestras
(Staphilococcus y Pseudomona) las cuales
se dejaron secar y luego fueron fijadas,
despus se les adiciono cristal violeta
(colorante catinico que penetra en todas las
clulas bacterianas Gram (+) y Gram (-) a
travs de la pared bacteriana) dejndolo por
1 minuto, seguidamente fue lavado el exceso
y fue adicionado el lugol el cual entra en las
clulas y forma un complejo insoluble en
solucin acuosa con el cristal violeta, este fue
dejado por 1 minuto sobre la muestra siendo
luego
lavado el exceso, despus fue
agregado el alcohol-cetona dejndolo
durante 30 segundos, finalmente se agreg
safranina (ayuda al contraste de las clulas
bacterianas) y fue lavado el exceso dejando
secar para luego ser observado al
microscopio a 40x y 100x.
Tincin BAAR Ziehl-Neelsen
Se hizo un frotis de Mycobacterium
tuberculosis dejndolo secar, seguidamente
fue adicionada fucsina fenicada durante 5
minutos, despus se calent la lmina con
mechero hasta lograr la emisin de vapores
lo que ayuda a que el colorante atraviese la
pared
bacteriana,
luego
fue
lavada
suavemente (solidificacin de los cidos
grasos para evitar la salida del colorante)
siendo despus adicionado alcohol acido
durante 30 segundos posteriormente fue
lavada y luego se dej secar la muestra
donde finalmente adicionamos azul de
metileno (colorante de contraste) esperando
unos momentos fue lavada y puesta a secar
la muestra siendo llevada a observar al
microscopio a 40x y 100x.

Se realiz un frotis de Bacilos, dejndolo

secar y luego fijar, se le agreg luego verde
de malaquita al 5%(colorante primario),
despus fue colocado de 5 a 8 minutos al
calor sin dejar que llegara a punto de
ebullicin o se secara el colorante. (Ayuda a
que el colorante atraviese la pared celular de
la endospora) posteriormente se dej enfriar
por 5 minutos y seguidamente fue lavada la
muestra donde finalmente se agreg
safranina por 2 minutos (colorante de
contraste), despus de un momento fue
lavado y se dej secar para ser llevado a
observar al microscopio a 40x y 100x.
Al final de la observacin nos dirigimos a
observar otra muestra de Clostridium
anteriormente fijada en el laboratorio.
Tincin Negativa para Capsula
Fue realizada una emulsin microbiana de
Klebsiella, luego fue adicionada una gota de
tinta china (colorante primario) sobre la
emulsin donde seguidamente se hizo un
extendido del cultivo con el cubre objetos
dejando as una pelcula fina por todo el
portaobjetos, despus se adiciono fucsina
dejndola secar y finalmente fue llevada la
muestra a observar al microscopio a 40x y
100x.
RESULTADOS Y DISCUSIN.

PREPARACIONES FRESCAS

Solido Pseudomona, Bacilos 40x

Tinciones Especiales
Tincin Schaeffer-Fulton

Fue difcil la observacin de organismos ya

que haba ausencia del colorante pero se

llegaron a divisar pequeos bastones.

PREPARACIONES FIJAS

colorante utilizado en esta tincin) lo que

nos
mostr
que
estas
bacterias
pertenecan al grupo de las Gram
positivas.

Tincin Simple Speudomona, Bacilos

40x
Tincin de Gram-Pseudomona, Gram (-)
40x

Se lograron divisar algunas estructuras en

forma de bastn ms no eran claras ya
que era necesario otro tipo de tincin.

Tinciones Diferenciales

Accedimos a la observacin de bacterias

en forma de bastn en algunos lugares
agrupados y en ciertas regiones es posible
divisar movimientos de ellos gracias a los
flagelos que poseen dichas bacterias
estn teidas de rosado lo que nos
demuestra que estas estn dentro del
grupo de las Gram (-)

Tincin de Gram-Staphilococcus
Gram (+) 40x

Tincin de Ziehl-Neelsen-

Mycobacterium tuberculosis,
Micobacterias (BAAR). 40x

Fueron divisados organismos con forma

redondeada muy parecidos a cocos, de
color morado (ya que retuvieron el primer

Tincin Schaeffer-Fulton- Bacilos 40x

Observando la muestra encontramos

como las bacterias acido-resistentes
fueron teidas de rosado gracias a la
tincin
permitindonos
identificar
estructuras en forma de bastones (bacilos)
las cuales pertenecen a la bacteria y las
dems teidas de azul las cuales no son
acido resistentes.

La tincin nos permiti observar una

muestra llena de endosporas las cuales
tienen forma circular y son todas las que
se puede distinguir por una coloracin
verdosa gracias al colorante utilizado.

Tincin Schaeffer-Fulton -Clostridium

40x

Tincin Negativa para CapsulaKlebsiella 40x

Fueron encontradas dentro de la muestra

pequeas estructuras teidas de verde las
cuales hacen referencia a las endoesporas
las cuales se tien de esta manera al
reaccionar al colorante verde de malaquita
,lo dems observado con otros colores son
otras estructuras o tan solo contaminacin
del medio por pequeas partculas.

Fueron divisadas gracias a esta tincin

capsulas de polisacridos las cuales se
ven incoloras ya que la tinta negra no logra
entrar a ellas y solo deja observar la
estructura exterior.

2. J. M. Ghuysen et al. (1994) Bacterial

Cell Wall, Elsevier,
3. Ryan KJ; Ray CG (editors) (2004).
Sherris Medical Microbiology (4th ed.
edicin). McGraw Hill. p. 370.
4.

CONCLUSION

En el mundo hay diversidad de

bacterias con composiciones y
estructuras muy variadas por lo que
es necesario realizar tinciones para
poder reconocer cada una de ellas.
No todas las bacterias pueden ser
reconocidas con un mismo mtodo
de tincin.
Existen bacterias ms complicadas
de teir que otras.

BIBLIOGRAFIA
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5. Patrick R. Murray; Ken S. Rosenthal;

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6. Aulton Michael E. (2004): Ciencia y
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