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ENZIMAS EM MEDICAMENTOS E
DIAGNSTICOS
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Maria Eugnia M Cruz

Manuela Gaspar

University of Lisbon

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13

ENZIMAS EM MEDICAMENTOS
E DIAGNSTICOS
Maria Eugnia M. Cruz, Maria Brbara Martins,
Maria Lusa Corvo, Maria Manuela Gaspar,
Edna Maria Morais Oliveira e Maria Antonieta Ferrara

SUMRIO
O uso teraputico de enzimas remonta ao final do sculo 19, quando preparaes brutas de enzimas pancreticas de origem suna j eram empregadas no tratamento de desordens gastrointestinais. Atualmente, existe no mercado uma ampla variedade de medicamentos base de enzimas para aplicao como auxiliares digestivos, antiinflamatrios, tratamento de cogulos sangneos, cncer, fibrose cstica, gota e deficincias metablicas, dentre outras. Como exemplos podem ser citados o uso de estreptoquinase
como agente antitrombtico, de asparaginase no tratamento de leucemia e de glicocerebrosidase no controle da doena de Gaucher. Outro importante uso teraputico das
enzimas na ativao seletiva de pr-frmacos, uma alternativa de superao da
toxicidade de determinados quimioterpicos.
O desenvolvimento de novas estratgias de formulao envolvendo o confinamento
em sistemas de transporte e direcionamento, como os lipossomas, ou conjugao qumica com molculas de baixo peso molecular ou polimricas, como o polietilenoglicol, permite contornar limitaes relacionadas instabilidade dos biocatalisadores, suscetibilidade ao ataque de proteases, dificuldade de acesso ao rgo alvo e antigenicidade.
O grande desenvolvimento experimentado pela terapia enzimtica nos ltimos
anos deve-se identificao, purificao e caracterizao de enzimas e metablitos relevantes e ainda ao advento das tcnicas de DNA recombinante e de processos de produo em larga escala que possibilitam a produo de enzimas em grandes quantidades e
com custos mais convenientes.
305

1 prova

306

ENZIMAS EM BIOTECNOLOGIA: PRODUO, APLICAES E MERCADO

Da mesma forma, o uso de enzimas em diagnsticos foi facilitado pelos avanos

recentes e, atualmente, muitos enzimas com elevada especificidade ao substrato foram desenvolvidas e so empregadas como catalisadores em diagnsticos em trs categorias: mtodos enzimticos de ensaio para anlises clnicas, enzimas marcadoras em
imunodiagnstico e enzimas cujos nveis so avaliados para diagnsticos clnicos de
doenas.
Novos usos teraputicos e em diagnsticos, ainda em fase de pesquisa, representam um potencial que pode repercutir de maneira ainda mais significativa no mercado
mundial destas enzimas, estimado em mais de um bilho de dlares por ano.

INTRODUO
A alta especificidade e eficincia cataltica das enzimas so caractersticas importantes
que aliceram sua aplicao como agentes teraputicos. Assim sendo, a relevncia do
uso de enzimas como medicamento relaciona-se ao fato de que pequenas quantidades
do catalisador biolgico podem produzir efeitos bastante especficos em condies
fisiolgicas.
O grande desenvolvimento experimentado pela terapia enzimtica nos ltimos
anos deve-se principalmente identificao, purificao e caracterizao de enzimas e
metablitos relevantes e ainda ao advento das tcnicas de DNA recombinante e de processos de produo em larga escala, que possibilitam a obteno de elevados
rendimentos, em larga escala e com custos relativamente baixos.
Da mesma forma, o uso de enzimas em diagnsticos foi facilitado pelos avanos recentes e, atualmente, muitas enzimas com elevada especificidade ao substrato foram desenvolvidas e so empregadas como catalisadores em diagnsticos.

USO DE ENZIMAS COMO MEDICAMENTOS

As primeiras preparaes enzimticas industrialmente produzidas e comercializadas tiveram a finalidade de atuar como auxiliares digestivos. Assim que, j antes da Primeira
Guerra Mundial, Takamine comercializou uma preparao enzimtica denominada
Takadiastase, que era produzida por fermentao semi-slida pelo fungo Aspergillus
oryzae. Este produto, que ainda hoje comercializado, contm hidrolases como
amilases e proteases, sendo utilizado como auxiliar digestivo (BURKE, 2003).
Atualmente, existe no mercado uma ampla variedade de medicamentos base de
enzimas (HAMMER, 2001) para aplicao como auxiliares digestivos, antiinflamatrios, anti-spticos, na reposio de enzimas hemostticas, na inibio da coagulao, na
preveno de leses de reperfuso, no tratamento da ictercia neonatal, no tratamento
de fibrose cstica, na reposio de enzimas metablicas e na terapia do cncer. A tabela
13.1 relaciona algumas enzimas com importantes atividades teraputicas.

1 prova

CAPTULO 13 ENZIMAS EM MEDICAMENTOS E DIAGNSTICOS

307

Tabela 13.1 Exemplos de enzimas teraputicas (TRAMPER e POULSEN, 2000; CHAPLIN, 2002,
MARSHALL et alii, 2003;WALSH, 2003)
Enzima

Nmero EC

Uso/indicao
teraputica

Reao

Asparaginase*

3.5.1.1

L-asparagina + H2O
L-aspartato + NH3

Leucemia

Colagenase

3.4.24.3

Hidrlise de colgeno

lceras de pele

Fator VII

3.4.21.21

Plasminognio plasmina

Cogulo sangneo

Hialuronidase

3.2.1.35

Hidrlise do hialuronato

Ataque cardaco

Lisozima

3.2.1.17

Hidrlise da parede celular

bacteriana

Antibitico

Rodanase

2.8.1.1

S2O32- + CN- SO32- +

SCN-

Envenenamento com
cianeto

Ribonuclease

3.1.26.4

Hidrlise de RNA

Antiviral

b-lactamase

3.5.2.6

Penicilina peniciloato

Alergia a penicilina

Estreptoquinase

3.4.22.10

Plasminognio plasmina

Cogulo sangneo

Tripsina

3.4.21.4

Hidrlise de protena

Inflamao

Uricase*

1.7.3.3

Urato + O2 alantona

Gota

Uroquinase

3.4.21.31

Plasminognio plasmina

Cogulo sangneo

Superxido dismutase

1.15.1.1

Radical superxido
Inflamao
perxido de hidrognio + O2

b-glucocerebrosidade*

3.2.1.45

Terapia de reposio
enzimtica

Doena de gaucher

Galactosidase*

3.2.1.23

Terapia de reposio
enzimtica

Doena de Fabry

Catalase

1.11.1.6

perxido de hidrognio
H2O + O2

Inflamao / stress
oxidativo

* aprovadas para uso clnico

A terapia enzimtica apresenta, entretanto, algumas limitaes relacionadas com a

instabilidade dos biocatalisadores, suscetibilidade ao ataque de proteases, dificuldade
de acesso ao rgo alvo e antigenicidade. Esta ltima est associada presena de uma
protena estranha ao organismo, o que pode causar resposta imune, provocando reaes alrgicas severas, particularmente com o uso contnuo.
Diversas estratgias de formulao tm sido desenvolvidas no sentido de contornar
essas limitaes. Dentre elas podem ser citadas a incorporao da enzima em sistemas
de transporte/direcionamento, como os lipossomas e a conjugao qumica com molculas de baixo peso molecular ou polimricas, como o polietilenoglicol.

1 prova

308

ENZIMAS EM BIOTECNOLOGIA: PRODUO, APLICAES E MERCADO

Ao contrrio das enzimas de uso industrial, as enzimas teraputicas so requeridas

em quantidades relativamente pequenas, devendo apresentar, entretanto, elevado
grau de pureza, alta especificidade, baixa antigenicidade e estabilidade em condies fisiolgicas. Com relao s propriedades cinticas, a constante de Michaelis (Km) deve
ser baixa e a velocidade mxima (vmax) elevada, de forma a se obter mxima eficincia
mesmo em condies de concentraes muito baixas de enzima e substrato.
As fontes de obteno das enzimas teraputicas devem ser selecionadas de forma a
se evitar qualquer possibilidade de contaminao indesejada. De acordo com a finalidade, as formulaes que contm enzimas podem ser administradas por via tpica, oral ou
parenteral. As enzimas administradas por via parenteral devem apresentar grau de pureza especialmente elevado, o que se reflete no custo. As preparaes enzimticas de
uso teraputico so em geral liofilizadas e contm sais tamponantes biocompatveis e
manitol como excipiente.

Aplicaes
Enzimas digestivas
Desde o final do sculo 19, preparaes brutas de enzimas pancreticas de origem suna
vm sendo empregadas no tratamento de desordens gastrointestinais (TRAMPER e
POULSEN, 2000). Atualmente, existe no mercado uma ampla variedade de medicamentos base de enzimas para problemas digestivos. Estes medicamentos podem conter em sua formulao, alm de proteases, amilases, lipases, celulases, sais biliares e
outros.

Enzimas em doenas inflamatrias

As enzimas proteolticas tambm so amplamente empregadas como agentes antiinflamatrios. A reduo de inflamao e edema atribuda dissoluo de fibrina e eliminao de fragmentos proticos presentes em exudatos inflamatrios. Como exemplos,
a papana produz reduo significativa de inflamao e inchamento obsttricos e de
edema ps-cirrgico dental; colagenase, enzima que hidrolisa seletivamente colgeno,
utilizada para tratamento de lceras drmicas e queimaduras; tripsina e quimiotripsina vm sendo empregadas no tratamento de trauma ps-operatrio, ferimentos esportivos, e citica (BICKERSTAFF, 2003); enzimas proteolticas (bromelina, papana, tripsina e quimotripsina) administradas por via oral apresentam efeito analgsico e
antiinflamatrio em pacientes com problemas reumticos (LEIPNER, 2001).
Em adio, as doenas inflamatrias das articulaes tm sido intensamente estudadas no que diz respeito ao possvel envolvimento de situaes de stress oxidativo (desequilbrio entre a produo de formas reativas de oxignio e os respectivos sistemas de
defesa) (HALLIWELL, 1995, HENROTIN et alii, 1992; MERRY et alii, 1989, MAPP et
alii, 1995). O envolvimento destas situaes de stress est na base da chamada terapia
antioxidativa, que utiliza agentes antioxidantes, entre os quais enzimas antioxidantes,
como agentes teraputicos (MATES et alii, 1999).

1 prova

CAPTULO 13 ENZIMAS EM MEDICAMENTOS E DIAGNSTICOS

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Uma das enzimas propostas como agente teraputico para inmeras doenas nas
quais as formas reativas de oxignio tm um papel importante a superxido dismutase
(SOD). Diversos estudos tm sido conduzidos para tentar esclarecer o possvel papel benfico desta enzima na reduo de danos de tecidos em doenas inflamatrias crnicas,
nas quais se inclui a artrite reumatide (REGNAULT et alii, 1996). A proposta do uso de
SOD baseia-se na hiptese de que um aumento da concentrao extracelular da enzima
diminuiria a quantidade de superxido produzido por neutrfilos ativados, impedindo
deste modo quer possveis danos provocados por este radical, quer a sua possvel atividade quimiottica (BARET et alii, 1984). As limitaes potenciais para o uso de SOD
como agente teraputico so a sua rpida eliminao do sangue por filtrao glomerular (GREENWALD, 1991; Dowling et alii, 1993; TAKAKURA et alii, 1994) e o seu tempo
de meia-vida muito reduzido (SOD de origem bovina - 6 min no rato (HUBER et alii,
1977) e 30 min em humanos (HUBER et alii, 1980)).

Enzimas em oncologia
Uma importante estratgia para o combate ao cncer consiste em explorar as diferenas bioqumicas entre as clulas normais e as clulas neoplsicas. Estas ltimas apresentam alteraes substanciais em seus perfis metablicos que esto relacionadas ao aumento da sntese de protenas e dos cidos nuclicos e eliminao ou limitao da sntese de molculas conhecidas como blocos construtores, como os aminocidos, por
exemplo, levando dependncia do suprimento externo destas substncias. As enzimas podem ser empregadas para esgotar o organismo de um determinado nutriente,
privando, seletivamente, as clulas neoplsicas do nutriente, sem afetar clulas e tecidos
normais.
A L-asparaginase, por exemplo, uma enzima muito eficaz no combate a leucemias linfocticas (linfomas) porque esgota os estoques de asparagina circulante, metablito essencial para as clulas tumorais em contraposio s clulas normais, que so capazes de sintetizar este aminocido. Um grande impulso na terapia enzimtica do cncer
surgiu da observao de Broome (1961), que identificou como sendo a asparaginase o
fator antilinfoma presente no soro de porquinhos da ndia. Subseqentemente, foram
identificadas fontes bacterianas e vegetais da enzima (MLLER e BOOS, 1998;
WRISTON e YELLIN, 1973).
A asparaginase foi introduzida no mercado em 1978. As formulaes Elspar, da
Merck, e Erwinase da Speywood, preparadas a partir de enzimas bacterianas produzida
por Escherichia coli e Erwinia carotovora, respectivamente, so utilizadas por via intravenosa, geralmente associadas a agentes alquilantes e outros antagonistas metablicos
(MULLER e BOOS, 1998; NARTA, et alii, 2007). No Brasil, tem-se conhecimento de
que somente o Elspar est em uso.
Apesar de efetiva, a asparaginase apresenta limitaes como o baixo tempo de
meia-vida e o risco de provocar reaes imunolgicas. Adicionalmente, o paciente pode
desenvolver resistncia ao medicamento. Assim, a utilizao da asparaginase est restrita ao ambiente hospitalar com acompanhamento mdico rigoroso. Em 1994, a FDA

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ENZIMAS EM BIOTECNOLOGIA: PRODUO, APLICAES E MERCADO

aprovou o uso da L-asparaginase modificada com polietilenoglicol (PEG). Esta modificao da enzima foi positiva porque aumentou a meia-vida do antineoplsico e reduziu
consideravelmente os efeitos imunognicos, ampliando ainda mais o espectro de atividade contra linfomas previamente resistentes. No entanto, as reaes imunognicas
no foram completamente eliminadas e quando ocorrem so de longa durao e,
portanto, mais difceis de controlar.
Outras enzimas capazes de decompor aminocidos vm sendo testadas para o tratamento de diversos tipos de tumores: L-glutaminase-L-asparaginase, L-metionina-g-liase, L-fenilalanina amonialiase, L-arginase, L-tirosinase, L-serina dehidratase, L-treonina
desaminase e indolil-3-alcano hidroxilase (BICKERSTAFF, 2003). Esta relao vem
crescendo de forma notvel tendo em vista as novas tcnicas de clonagem e expresso
de enzimas e identificao de metablitos relevantes.
Outro tipo de enzima oncoltica, ainda em fase experimental, a toxina da difteria, cuja ao interrompe a sntese protica. A sensibilidade das clulas tumorais a esta
toxina de 100 a 10.000 vezes maior em relao s clulas normais (AYESH et alii, 2003;
BICKERSTAFF, 2003).
As enzimas que degradam macromolculas (polissacardeos de membrana, protenas estruturais e funcionais ou cidos nuclicos), como neuramidase, ribonuclease e
carboxipeptidase, so tambm promissoras para o tratamento de neoplasias (AYESH et
alii, 2003; BICKERSTAFF, 2003).

Enzimas como anticoagulantes

O uso de enzimas no tratamento de doenas tromboemblicas iniciou-se com o conhecimento de que a lise da fibrina pode ser efetuada in vivo atravs de um processo que envolve a converso de plasminognio a plasmina e de que ativadores do plasminognio
podem produzir fibrinlise enzimtica controlada. A primeira gerao de agentes antitrombticos inclui a estreptoquinase bacteriana e a uroquinase de urina humana. A
crescente incidncia de doenas troboemblicas tem estimulado a busca, utilizando a
tecnologia do DNA recombinante, de novos agentes capazes de estimular, com maior
especificidade, os sistemas fibrinolticos naturais (PIDRARD e BOLLEN, 1990;
BICKERSTAFF, 2003).

Terapia de reposio enzimtica

O tratamento de deficincias enzimticas, particularmente as decorrentes de erros inatos do metabolismo, um campo de aplicao dos mais relevantes para as enzimas teraputicas. Como exemplos, podem ser citados o uso da glicocerebrosidase para o controle da doena de Gaucher, da alfagalactosidase para doena de Fabry, do fator VIIa para
hemofilia, da pegademase para imunodeficincia intensa (doena do menino bolha) e
da sacarosidase para deficincia congnita de sacarase e isomaltase (NOTHENBERG,
1999; BRADY, 2003; BRADY e SCHIFFMA, 2004).

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CAPTULO 13 ENZIMAS EM MEDICAMENTOS E DIAGNSTICOS

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Enzimas ativadoras de pr-frmacos

Um dos principais obstculos ao emprego de quimioterpicos no cncer a limitao
de dose devida toxicidade dos frmacos. Esta toxicidade causada pela baixa seletividade dos agentes, que se tornam lesivos para as clulas neoplsicas e tambm para as
clulas normais.
Uma alternativa para superar essas limitaes a estratgia denominada ADEPT
(antibody-directed enzyme prodrug therapy). A metodologia ADEPT compreende a
administrao de profrmacos, formas quimicamente inativas de molculas antineoplsicas, e sua posterior converso na forma ativa in vivo, exclusivamente nas proximidades do local de ao. Para isso, administra-se previamente ao paciente uma enzima capaz de promover a ativao da droga. Esta enzima direcionada para as clulas tumorais atravs da associao com um anticorpo especfico para os componentes superficiais
das clulas antineoplsicas. A enzima conversora do antineoplsico se fixa ao tumor e s
ento promove a ativao do frmaco, minimizando assim os efeitos colaterais.
Alguns artigos relatam ensaios ADEPT empregando as enzimas carboxipeptidase
G2, carboxipeptidase A, beta-glicuronidase, fosfatase alcalina, nitroredutase, citosina
desaminase, beta-lactamase e penicilina V amidase, dentre outras. Para o sucesso da
aplicao da metodologia ADEPT, fundamental que os pr-frmacos sejam projetados para resistir ao ataque das enzimas do organismo do paciente.
Outros sistemas anlogos em estudo so: PDEPT (polymer-directed enzyme-prodrug therapy), GDEPT (gene-directed enzyme-prodrug therapy), VDEPT (virus-directed enzyme-prodrug therapy), GPAT (genetic prodrug activation therapy) e TEPT,
(Targeted Enzyme Prodrug Therapy).
Na ativao seletiva de profrmacos, tm sido utilizadas enzimas microbianas, o
que pode acarretar reaes alrgicas. Assim, tambm est em estudo o uso de enzimas
humanizadas. Esses novos usos teraputicos, que ainda se encontram em fase de pesquisa, apresentam potencial que pode repercutir de maneira muito significativa no
mercado mundial de enzimas de uso farmacutico (BLAU et alii, 2006;
NICULESCU-DUVAZ e SPRINGER, 1997; NOTHENBERG, 1997; NAYLOR e
THOMSON, 2003).

Estratgias de formulao para fins teraputicos

Lipossomas como veculos de transporte in vivo
Diversas estratgias podem ser utilizadas com o objetivo de melhorar o ndice teraputico de enzimas. Uma delas a associao a sistemas que possam transport-las em organismos vivos, de tal modo que haja aumento da dose eficaz mdia e /ou reduo da
dose txica mdia. Um dos sistemas de transporte mais utilizado so os lipossomas, entendidos como microesferas constitudas por lipdios organizados em bicamadas
concntricas e separadas por compartimentos aquosos (figura 13.1).
Os lipossomas podem incorporar praticamente qualquer tipo de substncia, independentemente do peso molecular (desde molculas de baixo peso molecular a macromolculas); da carga eltrica (molculas carregadas ou neutras); e da solubilidade (par-

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ENZIMAS EM BIOTECNOLOGIA: PRODUO, APLICAES E MERCADO

Hidrfila
Figura 1 - A

Enzima

Hidrfoba
Figura 1 - B

Figura 13.1 Representao esquemtica de um lipossoma e localizao de enzimas no espao

lipossomal de acordo com as suas propriedades. Enzimas hidrossolveis no espao interno aquoso
(A); enzimas lipopossolveis na bicamada lipdica (B).

tculas hidroflicas, que se incorporam nos espaos internos aquosos - figura 13.1-A; partculas hidrofbicas, que se incorporam na bicamada lipdica - figura 13.1-B; e partculas
anfiflicas, que se distribuem entre os dois meios). Os lipossomas foram preparados
pela primeira vez em 1965 por Bangham para uso como modelos de membranas
(BANGHAM et alii, 1965) e, posteriormente, como transportadores de agentes bioativos in vivo (GREGORIADIS e RYMAN, 1972). Atualmente, possvel preparar
lipossomas com caractersticas bem definidas e adaptadas para cada objetivo em vista,
como por exemplo, o rgo alvo.
De acordo com suas caractersticas e comportamento in vivo aps a administrao
intravenosa, os lipossomas, podem ser classificados em quatro grupos (CRUZ, 1997;
LASIC e PAPAHADJOPOULOS, 1998; WOODLE e STORM, 1998; TORCHILIN e
WEISSIG, 2003):
Lipossomas convencionais, caracterizados por uma captura rpida pelas clulas
do sistema mononuclear fagocitrio (SMF) apresentando, por isso, reduzidos
tempos de circulao na corrente sangunea.
Lipossomas de longo tempo de circulao, que contendo determinadas molculas (como gangliosdeos) ou polmeros (como polietilenoglicol - PEG), apresentam tempos de circulao na corrente sangunea prolongados;
Lipossomas catinicos, contendo fosfolipdios carregados positivamente e adequados para o transporte de material gentico.
Lipossomas direcionadas, contendo ligantes superfcie capazes de reconhecer
especificamente determinadas clulas e, portanto, apropriados para um
direcionamento especfico.

1 prova

CAPTULO 13 ENZIMAS EM MEDICAMENTOS E DIAGNSTICOS

313

Atualmente, existem diversas formulaes lipossomais no mercado. A primeira delas foi comercializada em 1990 nos EUA, contendo anfotericina B e utilizada no tratamento de infeces sistmicas fngicas e infeces parasitrias, como a leishmaniose.
Conforme j mencionado, a administrao teraputica de enzimas na forma livre
pode apresentar graves limitaes, como reaes imunognicas severas; dificuldade de
acesso ao rgo alvo, vida mdia curta e rpida inativao aps administrao. Na forma
lipossomal este panorama alterado porque ocorrem modificaes nas propriedades
farmacocinticas e de biodistribuio das enzimas, ocorrendo reduo da sua toxicidade e aumento da eficcia (CRUZ et alii, 1993; JORGE et alii, 1994; GASPAR et alii, 1996,
CORVO et alii,1999).
Aps incorporao em lipossomas, a localizao da enzima no interior da vescula
depende da sua solubilidade: as enzimas hidrossolveis localizam-se no espao interno
aquoso e as lipossolveis, na matriz lipdica. O mecanismo de ao das enzimas incorporadas depende de sua localizao no lipossoma. Assim, as enzimas hidrossolveis s podem degradar os substratos aps a ruptura dos lipossomas (figura 13.1-A); enquanto
que as lipossolveis, capazes de expor o centro ativo para o exterior do lipossoma, podem exercer a sua atividade enzimtica (efeito teraputico) independentemente da
ruptura do lipossoma (figura 13.1-B).

Modificao qumica de enzimas teraputicas

A modificao qumica de enzimas tem sido uma das estratgias utilizadas para contornar algumas limitaes apresentadas pela terapia enzimtica, tais como reduzidos tempos em circulao, degradao proteoltica, toxicidade e reaes adversas do sistema
imune. A modificao qumica permite alterar as propriedades fsico-qumicas de enzimas teraputicas, especialmente por interferncia ao nvel da biodistribuio ou do
reconhecimento da macromolcula no organismo.
Diversos tipos de molculas podem ser utilizadas com este objetivo (FUJITA et alii,
1992; IGARASHI et alii, 1992; VERONESE, 1994), destacando-se a conjugao com polmeros de diferentes comprimentos de cadeia e cuja presena permite camuflar a macromolcula na circulao sangunea (ABUCKOSKI e DAVIS, 1981; VERONESE,
1994). A modificao de enzimas por conjugao com molculas hidrofbicas, para aumentar a afinidade pelas bicamadas lipdicas de lipossomas ou de membranas celulares,
tem sido tambm utilizada (MARTINS et alii, 1990, 1996; TORCHILIN, 1991).
A modificao por reaes qumicas possibilita a introduo de alteraes nas propriedades de uma enzima por atuao direta na estrutura da molcula nativa. So mtodos particularmente teis quando se pretende introduzir substituintes que no podem
ser inseridos por via gentica, por exemplo, aminocidos dextrgiros, anlogos ou derivados de aminocidos inexistentes na natureza, oligosdeos, sondas radioativas, sondas
de fluorescncia, polmeros, resduos de cidos graxos ou outras molculas.
A modificao qumica de uma enzima resulta da reao entre determinados reagentes qumicos e alguns grupos laterais de resduos de aminocidos, com formao, na
maior parte dos casos, de ligaes covalentes. Essas reaes foram, durante muitos anos,

1 prova

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ENZIMAS EM BIOTECNOLOGIA: PRODUO, APLICAES E MERCADO

utilizadas para a identificao e localizao de aminocidos em estruturas de enzimas

(MEANS e FEENEY, 1971) e no esclarecimento da relao entre a atividade cataltica e
os aminocidos existentes no centro ativo (EYZAGUIRRE, 1987). S no final do sculo
passado que se assistiu a um crescente interesse pela modificao de enzimas com o
objetivo de alterar suas propriedades (GEISOW, 1993).
Dada a grande complexidade estrutural das enzima e a dificuldade de predizer as
conseqncias funcionais das modificaes introduzidas, as tcnicas de alterao de
propriedades de enzimas atravs de reaes qumicas so freqentemente utilizadas de
um modo iterativo. A extenso da modificao qumica uma funo da reatividade
quer do reagente quer do grupo lateral do resduo de aminocido, bem como das
alteraes que a reao de modificao induziu na conformao da molcula.
Ao envolver a ligao aleatria com grupos reativos da enzima, a modificao qumica pode dar origem a alteraes no centro ativo ou na conformao da macromolcula, com a conseqente alterao de suas caractersticas. As enzimas podem conter vrias centenas de resduos de aminocidos, mas apenas alguns destes esto diretamente
envolvidos na sua ao cataltica (PAGE, 1984a). O principal papel do grande conjunto
de resduos de aminocidos de uma enzima o da formao de uma estrutura tridimensional com rigidez suficiente para maximizar a energia de ligao entre o substrato e a
enzima (PAGE, 1984b). O meio envolvente tambm pode induzir alteraes na estrutura tridimensional da molcula. A interveno em qualquer destes nveis pode afetar as
caractersticas de uma protena e tem conseqncias particularmente crticas quando
afeta a atividade cataltica. dada preferncia s reaes de conjugao em que so
unicamente modificados grupos distantes do centro ativo, o que pode afetar
consideravelmente as propriedades da enzima, sem, contudo, alterar a atividade
especfica.
A preservao das propriedades catalticas de uma enzima modificada pode ser alcanada atravs da utilizao de um adequado estabilizante da estrutura da enzima.
Alguns solventes (TIMASHEFF e ARAKAWA, 1993) e sistemas micelares naturais ou
sintticos, capazes de afetar a velocidade de muitas reaes qumicas quer in vivo quer
in vitro, so usados como estabilizadores.
O polietilenoglicol (PEG) um polmero bastante investigado para a modificao
covalente de macromolculas biolgicas visando aplicaes farmacuticas. Seu uso
uma prtica aceita na formulao teraputica aprovada pelo FDA (Food and Drug
Administration). As primeiras enzimas modificadas com PEG colocadas no mercado foram a pegademase bovina, utilizada no tratamento de imunodeficincia intensa e a
L-asparaginase, para o tratamento de leucemia (ROBERTS et alii, 2002).
O efeito da modificao qumica dos grupos - NH2 da lisina na atividade e na estabilidade da molcula de L-asparaginase foi investigado por alguns autores (SADANA e
Henley, 1988). Estudos sobre a ligao covalente de cadeias acila a grupos reativos da
enzima mostraram retenes de atividade entre 10% e 75% (CLASSEN e ROOIJEN,
1983; KITO, 1986; SADANA e HENLEY, 1988).

1 prova

CAPTULO 13 ENZIMAS EM MEDICAMENTOS E DIAGNSTICOS

protena nativa
(hidrfila)

Enzima nativa
(hidrfila)

protena
modificada

H2

H2

-NH

-NH

pH > pKa
-NH2

O
C
Cl
cloreto de acilo
insolvel em gua (C>10)
instvel em gua

afinidade para
bicamadas

bicamada
lipidica

Enzima
modificada

-NH 2

-N

-NH 2

-NH 2

-NH 2

-N

315

Estabilizavel em meio
aquoso
ultra-sons
micelas de tensioactivo
B

Figura 13.2 Representao esquemtica da ligao de cadeias hidrfobas superfcie da enzima,

com a conseqente alterao de afinidade por bicamadas lipdicas (A) Exemplo de conjugao por
intermdio da reao covalente entre o grupo carbonilo de um cloreto de acilo e os grupos laterais
e-NH2 dos resduos de lisina da enzima (B).

A figura 13.2 apresentada esquematicamente a modificao de uma enzima por ligao a cadeias hidrofbicas, a insero de uma enzima modificada numa bicamada lipdica e um exemplo de conjugao por intermdio da reao covalente entre o grupo carbonilo de um cloreto de acilo e os grupos laterais ee- NH2 dos resduos de lisina da enzima.
Com o objetivo de aumentar o carter hidrofbico da enzima, outros autores estudaram a reao de modificao da L-asparaginase por ligao a cadeias acila utilizando
o reagente de modificao convenientemente disperso em micelas. (MARTINS e
CRUZ, 1988; MARTINS et alii, 1990, 1996; MARTINS, 1998; CRUZ et alii, 2005).
O efeito da presena de substrato no meio reacional, adicionado para proteger o
centro ativo da enzima durante a reao de modificao, e da relao cloreto de acilo:enzima, para uma reao em meio heterogneo, apresentado na figura 13.3. Os resultados
do estudo demonstraram que possvel aumentar o grau de modificao at ser atingido
um percentual de grupos modificados mximo, sem alterar a atividade cataltica da enzima Acil-L-asparaginase. Foi ainda avaliado o efeito de meios heterogneos nos parmetros cinticos do bioconjugado e realizado um estudo comparativo de propriedades da
enzima modificada e da enzima nativa, tais como a mobilidade eletrofortica, potencial
zeta a determinados valores de pH, perfis de pH e de temperatura, estabilidade em soro
humano e estabilidade ao armazenamento (MARTINS et. alii, 1996).
Estudos semelhantes de otimizao da reao de modificao com cloreto de palmitolo e de caracterizao da enzima modificada foram realizados para as enzimas uricase, superxido dismutase e catalase (Martins, 1998; Aguiar et alii, 1998). No caso da
superxido dismutase e da catalase, estudou-se o efeito dos comprimentos de cadeia de
cloretos de acila no grau de modificao das enzimas. Os resultados obtidos para a
enzima superxido dismutase podem ser observados na figura 13.4.

1 prova

316

ENZIMAS EM BIOTECNOLOGIA: PRODUO, APLICAES E MERCADO

100

percentagem (%)

80

60

40

20

0
0

200

400

600

800

1000

1200

1400

1600

Razo molar (CIP:P)

modificao na ausncia de substrato:

% modificao

reteno de actividade

modificao em presena de substrato:

% modificao

reteno de actividade

Figura 13.3 Efeito da relao molar cloreto de acilo:enzima no grau de modificao e na reteno
de atividade da enzima, quer na ausncia de substrato quer na presena de substrato no meio
reacional.

35
C16

C18

C14

Grau de modificao (%)

30
C8

25
20
15
10
5
0
0

100

200

300

400

500

600

Razo molar cloreto de acilo/protena

reteno de actividade > 70%

Figura 13.4 Evoluo do grau de modificao da enzima superxido dismutase em funo da razo
molar cloreto de acila /protena e do comprimento da cadeia aclica.

1 prova

CAPTULO 13 ENZIMAS EM MEDICAMENTOS E DIAGNSTICOS

317

A figura 13.5 mostra esquematicamente a incorporao destas enzimas na estrutura de um lipossoma multilamelar e a destruio da estrutura lipossomal com liberao
gradual da enzima incorporada nas bicamadas.

Estabilidade em soro humano

lipossoma multilamelar
enzima
soro

soro

Figura 13.5 Representao esquemtica de enzima hidrofobizada e incorporada em lipossoma

multilamelar (A). Representao esquemtica da destruio gradual do lipossoma e da enzima
incorporada (B).

As enzimas L-asparaginase e superoxido dismutase modificadas com cadeias de

palmitolo foram incorporadas em lipossomas, tendo-se observado um aumento de afinidade destas enzimas para a bicamada dos lipossomas (CRUZ et alii, 1990; 1991;
MARTINS et alii, 1992, GASPAR et alii, 2003). Resultados de atividade biolgica dos sistemas constitudos por enzimas modificadas incorporadas em diferentes tipos de
lipossomas so apresentados no prximo item.

Terapia enzimtica via lipossomas

A seguir so apresentados exemplos de melhoria do desempenho de duas enzimas com
atividade teraputica, L-asparaginase e superxido dismutase, e respectivas formas aciladas aps incorporao em lipossomas.

L-asparaginase e acil L-asparaginase incorporadas em lipossomas e

testadas em modelos animais
Conforme j mencionado, a enzima L-asparaginase usada na terapia da leucemia, mas
existem inconvenientes como o reduzido tempo de residncia na corrente sangunea e
elevada toxicidade.
Com o objetivo de contornar essas limitaes, foram desenvolvidos estudos de formulaes lipossomais de L-asparaginase visando seleo das composies lipdicas capazes de manter a atividade enzimtica e simultaneamente maximizar a eficcia de encapsulao e as concentraes intralipossomais da enzima (CRUZ et alii, 1993; GASPAR
et alii, 1996). Foi tambm testada a incorporao em lipossomas de um derivado desta

1 prova

318

ENZIMAS EM BIOTECNOLOGIA: PRODUO, APLICAES E MERCADO

enzima obtido por ligao de cadeias de cido palmtico aos grupos amina da enzima
(Ac-L-asparaginase). A utilizao de derivados acilados teve como finalidade a obteno
de uma nova entidade enzimtica com carter hidrofbico e maior afinidade pelas bicamadas lipdicas dos lipossomas contrariamente L-asparaginase nativa, de carter hidroflico (JORGE et alii, 1994).
A composio lipdica dos lipossomas tem um efeito importante no s na eficcia
de encapsulao das enzimas, mas tambm na reteno da atividade enzimtica. Assim,
observou-se que alguns lipdios como o dicetilfosfato (DcP) reduziram a atividade cataltica da enzima, enquanto que outros lipdios, como o fosfatidilinositol (PI), a estearilamina (SA) e os gangliosdeos (GM1), conservaram quase 100% da atividade e permitiram a encapsulao da enzima com alta eficcia e elevadas concentraes intralipossomais. A tabela 13.2 apresenta, a ttulo de exemplo, a caracterizao fsico-qumica de
formulaes lipossomais de L-asparaginase e Acil L-asparaginase para o caso da composio lipdica contendo SA.
Tabela 13.2 Caracterizao fsico-qumica de formulaes lipossomais de L-asparaginase e
Acil-L-asparaginase
Enzima Incorporada

Protena final /
Protena inicial
(%)

Eficcia de
encapsulao
(%)

Atividade enzimtica
dos lipossomas
intactos (%)

L-Asparaginase

31 1

52 2

<5

Acil-L-Asparaginase

43 15

74 12

74 11

Composio lipdica fosfatidilcolina: colesterol: estearilamina. Cruz et alii, 1993; Jorge et alii, 1994.

Conforme mencionado acima, as enzimas hidrossolveis, localizadas no espao interno aquoso dos lipossomas, s podem degradar os substratos aps ruptura dos lipossomas; enquanto que as lipossolveis, localizadas na matriz lipdica, podem exercer sua atividade enzimtica independentemente da ruptura do lipossoma. Assim, quando a forma
hidrofbica da enzima, L-asparaginase acilada, foi incorporada em lipossomas, a principal caracterstica foi possibilidade da expresso da atividade enzimtica na forma intacta
dos lipossomas, ao contrrio das formulaes lipossomais da enzima nativa.
Estudos in vitro de citotoxicidade em clulas de ovrio de hamster chins demonstraram que a L-asparaginase encapsulada em lipossomas foi menos txica para as clulas normais em cultura do que a enzima na forma livre (CRUZ et alii, 1993). Uma vez
que a enzima encapsulada em lipossomas liberada lentamente das vesculas, a degradao de asparagina tambm mais lenta, o que d s clulas mais tempo para se recuperar dos danos resultantes do contato da enzima com seu substrato.
De acordo com a composio lipdica e o tipo de lipossomas, os parmetros farmacocinticos da enzima variam: em lipossomas com dimetro inferior a 0,2 m, observou-se um aumento do tempo de meia-vida da enzima nativa de 2h (enzima livre) para
9h (lipossomas convencionais) ou 29 h (lipossomas de longo tempo de circulao)
(GASPAR et alii, 1996). A enzima acilada apresentou um tempo de meia-vida de 3h, que
aps incorporao em lipossomas foi aumentado para 24 h (JORGE et alii, 1994).

1 prova

CAPTULO 13 ENZIMAS EM MEDICAMENTOS E DIAGNSTICOS

319

Foi estudada a toxicidade com vistas avaliao da segurana imunolgica das formulaes lipossomais de L-asparaginase e acil-L-asparaginase aps sensibilizao dos
animais por via intra muscular e desafio (challenge) por via intra venosa. Verificou-se
que a encapsulao da enzima nativa em lipossomas impediu a induo de anticorpos
anti-asparaginase uma vez que no ocorreu morte nos grupos de animais pr-sensibilizados que receberam a enzima na forma de lipossoma. Por outro lado, todos os animais
sensibilizados com L-asparaginase na forma livre e tratados com enzima livre sofreram
choque anafiltico e 17% dos animais morreram. No caso da acil-L-asparaginase, embora esta enzima se encontre parcialmente exposta para o exterior, os lipossomas
conseguiram mascarar as reaes imunognicas. (tabela 13.3).
Tabela 13.3 Toxicidade aguda in vivo: influncia da formulao utilizada de L-asparaginase e
Acil-L-asparaginase
Challenge (i.v.)

Animais c/ choque
anafiltico (%)

Animais mortos (%)

Livre

Livre

100

17

Livre

Lipossomas

Lipossomas

Livre

100

Lipossomas

Lipossomas

Livre

Livre

66

17

Livre

Lipossomas

Lipossomas

Livre

Lipossomas

Lipossomas

Sensibilizao (i.m.)
L-Asparaginase

Acil-L-Asparaginase

i.m. via intramuscular; i.v. via intravenosa

Dose administrada para as formulaes de L-asparaginase e acil-L-asparaginase: 2000 U/kg. (Gaspar et alii,
1996; Jorge et alii, 1994)

A atividade teraputica das formulaes de L-asparaginase nativa e modificada foi

avaliada em um modelo animal de linfoma aps administrao subcutnea de clulas
P1534. Observou-se que a enzima acilada livre e as formas lipossomais da enzima nativa
e modificada tm efeito teraputico superior forma comercial. A atividade teraputica
foi estimada atravs do nmero de animais curados e do ndice de sobrevivncia (razo
entre o tempo de sobrevivncia dos animais tratados e os animais controle). Verificou-se que tanto as formas lipossomais quanto a enzima modificada tm um ndice de
sobrevivncia superior a 700 e um nmero de animais curados de 7 em 10. Para a forma
comercial, o ndice de sobrevivncia 400 e o nmero de animais curados, de apenas 2
em 10 (figura 13.6).

1 prova

320

ENZIMAS EM BIOTECNOLOGIA: PRODUO, APLICAES E MERCADO

800

10

6
400
4

Animais curados

Tratados / Controle (%)

600

200
2

0
Comercial
L - ASNase

Lipossomas
L - ASNase

- Tratados / Controle (%)

Semi - sinttica
Ac -L - ASNase

Lipossomas
Ac -L - ASNase

- Animais curados

Figura 13.6 Atividade teraputica de formulaes de L-asparaginase e Ac-L-asparaginase nas

formas livre e lipossomal em um modelo animal de linfoma. Dose administrada 800 U/kg. (JORGE et
alii, 1994; GASPAR et alii, 1996).

Concluindo, tanto a modificao qumica quanto a incorporao em lipossomas ou

a associao de ambas as estratgias promoveram a reduo da toxicidade, o aumento do
tempo de circulao na corrente sangunea e conseqente aumento da atividade teraputica, resultando num aumento substancial do ndice teraputico da enzima L-asparaginase. Estas formas podero constituir uma alternativa forma comercial da enzima.

Superoxido-dismutase e acil superoxido-dismutase incorporadas em

lipossomas e testadas em modelos animais
A enzima superxido dismutase, com atividade antioxidante, apresenta, como j mencionado, limitaes teraputicas devido essencialmente sua rpida eliminao da corrente sangunea. Uma estratgia para contornar este inconveniente e melhorar o potencial teraputico a sua incorporao em sistemas de transporte/direcionamento
(STONE e SMITH, 2004). possvel prever trs vantagens do uso de lipossomas como
transportadores de superxido dismutase:
O aumento da disponibilizao da enzima nos locais de artrite provoca uma aumento correspondente da atividade teraputica.
A cintica de liberao controlada da enzima dos lipossomas pode reduzir a dose
a ser administrada, bem como o nmero de administraes necessrias eficcia
teraputica.

1 prova

CAPTULO 13 ENZIMAS EM MEDICAMENTOS E DIAGNSTICOS

321

No caso da forma modificada da enzima (superxido dismutase acilada), as formulaes lipossomais podem exercer atividade teraputica antes de sua destruio, resultando em efeito teraputico mais rpido.
A enzima superxido dismutase nativa e um derivado obtido por ligao de cadeias de cido palmtico a grupos amina da enzima foram incorporados em lipossomas. A
seguir, foram efetuados estudos de caracterizao das formulaes, de farmacocintica
e biodistribuio e de atividade in vivo usando como modelo a artrite adjuvante de rato.
A utilizao de derivados acilados de superxido dismutase teve como finalidade a obteno de uma nova entidade enzimtica com carter hidrofbico e por isso com maior
afinidade para as bicamadas lipdicas dos lipossomas contrariamente enzima nativa,
de caractersticas hidroflicas. As formulaes lipossomais com superxido dismutase
nativa e acilada foram de dois tipos: lipossomas convencionais contendo estearilamida
(SA) (CORVO, 1997) e de longo tempo de circulao revestidos com polietilenoglicol
(LCL) (CORVO, 1999, 2002). Em todos os estudos comparativos realizados in vivo, as
formulaes lipossomais foram preparadas com razes protena/lipdeo iniciais entre
12 a 15 mg de enzima nativa ou acilada (concentraes intralipossomais de protena)
por mol de lipdeo. Os resultados obtidos so relatados a seguir.
A eficcia de encapsulao da superxido dismutase em lipossomas variou com a
composio lipdica, o tipo de lipossomas e o tamanho, podendo ir at 80% em lipossomas SA (0,2 mm). No entanto, todas as formulaes apresentaram valores de reteno
de atividade enzimtica superiores a 90%.
Os valores mais elevados de eficcias de incorporao observados para superxido
dismutase acilada resultam da maior afinidade desta pela bicamada lipdica dos lipossomas contrariamente superxido dismutase nativa (localizada no espao interno aquoso). Estes resultados esto de acordo com o valor de coeficiente de partio em octanol/gua da enzima modificada, 20 vezes superior ao obtido para a nativa (3,13 contra
0,15, respectivamente) (MARTINS et alii, 1994).
Os lipossomas de superxido dismutase nativa e modificada apresentaram atividades enzimticas na forma intacta bastante diferentes evidenciando a diferente localizao destas duas entidades enzimticas no espao lipossomal. Para os lipossomas da enzima acilada, 40 a 47% da enzima encontrava-se parcialmente exposta superfcie do lipossoma, enquanto que para os lipossomas da forma nativa, este valor era inferior a 5%,
confirmando a sua localizao no espao interno aquoso.
Para os estudos de farmacocintica e biodistribuio, os lipossomas com superxido dismutase nativa e acilada foram marcados radioativamente atravs da co-encapsulao do complexo 111In-DTPA e administrados intravenosamente. A monitorao do
seu comportamento in vivo foi realizada numa cmara g. A anlise das imagens obtidas
(figura 13.7) mostra que no caso das formulaes lipossomais LCL e SA no tempo zero,
o contorno do fgado, bao e regio cardaca eram visveis. No entanto, aps 24 h, no
caso da formulao SA, a regio do corao j no era visvel, evidenciando o desaparecimento da formulao do sangue, enquanto que para a formulao LCL, esta regio
ainda era visvel, mostrando que uma alta percentagem da dose injetada ainda se en-

1 prova

322

ENZIMAS EM BIOTECNOLOGIA: PRODUO, APLICAES E MERCADO

contrava em circulao. De fato, aps 48 h, ainda se detectou em circulao 23% da

dose administrada, enquanto que para as outras duas formulaes aps 24 h s se observou cerca de 10% da dose administrada (CORVO et alii, 1999).
Os perfis sanguneos obtidos para as diferentes formulaes lipossomais de superxido dismutase em ratos com artrite adjuvante, aps administrao intravenosa das
formulaes enzimticas, mostraram que o revestimento dos lipossomas com polietilenoglicol associado a seu pequeno tamanho so fatores favorveis para a obteno de
longos tempos de circulao da enzima.
Em termos de acumulao nos locais de inflamao em ratos com artrite adjuvante, o resultado mais importante observado foi a acumulao muito superior (10 vezes)
observada na pata inflamada comparativamente pata normal obtida com lipossomas
LCL (figura 13.7).
Os estudos de farmacocintica e biodistribuio das formulaes lipossomais com
a enzima modificada demonstraram que a presena da enzima na superfcie dos lipossomas no se traduziu em alteraes no comportamento in vivo dos lipossomas, isto ,
na acumulao nos locais de inflamao, que seguiram o perfil observado para as
formulaes da enzima nativa.
Para a avaliao do efeito teraputico das diferentes formulaes de superxido
dismutase nativa, foi calculada a regresso do edema provocado no final do esquema de
tratamento. Realizaram-se estudos do efeito da dose (dose nica de 33, 198 e 363 mg) e
da freqncia de tratamento (1 a 11 administraes de 33 mg de enzima por animal).
Ambas as formulaes lipossomais mostraram um efeito teraputico significativamente
superior quando comparados com a enzima no encapsulada para as doses estudadas.
No entanto, s a formulao LCL apresentou efeito teraputico significativamente dife-

t = 0h

t = 24h

SA 200nm

LCL 110 nm

Figura 13.7 Imagens obtidas com uma cmara g, s 0 h e 24 h, para os lipossomas SA e lipossomas
LCL (Corvo et alii, 1999).

1 prova

CAPTULO 13 ENZIMAS EM MEDICAMENTOS E DIAGNSTICOS

323

rente para a dose mais baixa. Comparando os dois sistemas lipossomais, o efeito teraputico da formulao LCL foi superior em todas as doses relativamente aos lipossomas
SA. Observou-se ainda que com 6 administraes, apenas, a formulao LCL j apresentava o seu efeito mximo (CORVO et alii, 2002).
Deste estudo pode-se concluir que o tipo de lipossomas, seu tamanho, dose e nmero de administraes so fatores importantes. O revestimento de lipossomas com polietilenoglicol confere superioridade a estes sistemas no transporte de superxido dismutase para os locais de inflamao, sendo o seu tamanho (aproximadamente de 0,10
m) um fator crtico.
O efeito teraputico comparativo das formulaes lipossomais, quer LCL quer SA,
de superxido dismutase nativa e acilada, foi avaliado atravs do dimetro da pata inflamada, que mede o inchao da articulao, e do volume da pata, que relaciona a intensidade do edema na articulao e nos tecidos moles. O esquema de tratamento utilizado
foi constitudo por uma injeo nica das diversas formulaes lipossomais com uma
dose de 363 g de SOD por rato. Observou-se reduo mais rpida do volume da pata
inflamada para os lipossomas de superxido dismutase acilada 4 dias aps a injeo das
formulaes comparativamente aos lipossomas da forma nativa (GASPAR et alii, 2007)
A presena de superxido dismutase acilada nas superfcies dos lipossomas permite que
estes exeram o seu efeito teraputico mesmo antes do rompimento das vesculas. Esta
uma vantagem em relao aos lipossomas da enzima nativa, nomeadamente em
situaes de isquemia seguida de reperfuso.
Os exemplos de terapia enzimtica envolvendo a modificao qumica e posteriormente associao a lipossomas podem ser utilizados para a incorporao de outras enzimas de caractersticas hidrofbicas.

USO DE ENZIMAS EM DIAGNSTICOS

Durante muito tempo, o diagnstico clnico utilizou principalmente mtodos qumicos. Recentemente, diversas enzimas com excelente especificidade pelo substrato foram desenvolvidas e so empregadas como catalisadores em diagnsticos. Da mesma
forma que as enzimas de uso teraputico, o uso de mtodos de ensaio enzimticos para
diagnsticos foi facilitado pelos avanos das reas bioqumica e biomdica que permitiram a identificao e caracterizao de enzimas/metablitos relevantes e pelo desenvolvimento da biologia molecular, que tornou possvel a produo de enzimas em grandes quantidades com custos mais convenientes. O mercado de diagnsticos pode ser dividido em trs categorias principais (GOLDBERG, 2005; KOPETZKI et alii, 1994;
MUROOKA e YAMASHITA, 2001):

Mtodos enzimticos em anlises clnicas

Atravs do uso de enzimas, possvel analisar uma substncia especfica a partir de
amostras biolgicas sem necessidade de isolamento, o que simplifica o processo e diminui o tempo de ensaio. As enzimas utilizadas em anlises clnicas so usadas como insumos em kits de reagentes. Estes kits reagentes so empregados em instrumentos alta-

1 prova

324

ENZIMAS EM BIOTECNOLOGIA: PRODUO, APLICAES E MERCADO

mente automatizados que analisam amostras biolgicas e servem de auxiliares para o diagnstico e tratamento de doenas. Exemplos de enzimas empregadas para este fim so
apresentados na tabela 13.4.
Tabela 13.4 Exemplos de enzimas empregadas em anlises clnicas
Enzima

Substrato avaliado

lcool desidrogenase

lcool

lcool oxidase

lcool

aldedo desidrogenase

indicador p/ reaes que produzem acetaldedo

catalase/aldedo desidrogenase

cido rico

colesterol oxidase/peroxidase

colesterol

colesterol oxidase

colesterol total

creatinase

creatinina e creatina

creatininase

creatinina

Glicose-6-P desidrogenase/hexoquinase

glicose e ATP

glicose oxidase (/peroxidase)

glicose

a-glicosidase

a-amilase

b-glicosidase

a -amilase

b-glucuronidase

esterides

glutamato desidrogenase/urease

uria

glicerol-3-P desidrogenase

triglicrides e glicerol, indicador em ensaios de

aldolase, triose-P isomerase e glicerol quinase

lactato desidrogenase

indicador em ensaios de GPT

lactato desidrogenase/piruvato quinase

indicador em reaes em que ADP, ATP ou

piruvato so produtos

lipase/glicerolquinase/glicerol-3-P
oxidase/peroxidase

triglicrides e glicerol

malato desidrogenase

oxaloacetato e malato

malato desidrogenase/fosfoenolpiruvato
carboxilase

CO2/carbonato

maltose fosforilase

a- amilase

mutarotase/glicose oxidase/peroxidase

glicose

sarcosina oxidase

creatinina e creatina

sacarose fosforilase

fosfato inorgnico

urease

uria

uricase/peroxidase/aldedo desidrogenase

cido rico

1 prova

CAPTULO 13 ENZIMAS EM MEDICAMENTOS E DIAGNSTICOS

325

Enzimas marcadoras em imunodiagnsticos

Enzimas para imunodiagnsticos so usadas como marcadores em sistemas ELISA, por
exemplo, e so ligadas a um anticorpo para testar de forma bastante especfica a presena da substncia alvo. Exemplos: fosfatase alcalina, peroxidase e urase.

Enzimas avaliadas em diagnsticos clnicos de doenas

Alteraes em sistemas enzimticos esto envolvidas em muitas doenas. Assim, a avaliao dos nveis enzimticos em amostras biolgicas vem sendo cada vez mais empregada
em diagnsticos clnicos de doenas. A tabela 13.5 apresenta exemplos de enzimas
utilizadas com este fim.
Tabela 13.5 Exemplos de enzimas empregadas em diagnsticos clnicos de doenas
Enzima avaliada

Doena alvo

Fosfatase cida

Cncer de prstata, doena de Gaucher

Alanina aminotransferase

Problemas hepticos

Fosfatase alcalina

Problemas hepatobiliares e sseos

Amilase

Pancreatite aguda

Enzima conversora angiotensina

Doena de Gaucher, leprose, cirrose biliar

Aspartato aminotransferase

Tecidos danificados (corao, fgado, rim)

Colinesterase

Exposio a organofosfatos

Creatinina quinase

Problemas cardacos/musculares

Gama glutamiltransferase

Problemas hepticos

Lactato desidrogenase

Infarto do miocrdio, cncer de testculo

Renina

Hiperaldoteronismo

PERSPECTIVAS
O desenvolvimento de aplicaes de enzimas como medicamentos e em diagnsticos
tem sido considervel nos ltimos anos, refletindo a magnitude da potencialidade destes catalisadores biolgicos. Este um setor com perspectiva de crescimento acentuado
impulsionado pelos avanos em biologia molecular, genmica, protemica e engenharia de protenas. O crescente conhecimento das doenas em nvel molecular permite o
desenvolvimento de terapias mais especficas, portanto mais eficientes e menos sujeitas
a efeitos colaterais, e diagnsticos mais precisos. Adicionalmente, com os conhecimentos adquiridos, teoricamente possvel expressar qualquer protena ouenzima de interesse, proveniente de qualquer fonte, em clulas microbianas, vegetais ou animais, possibilitando a produo de enzimas com rendimentos e custos mais convenientes. esperada tambm uma grande contribuio das novas estratgias de formulao, como

1 prova

326

ENZIMAS EM BIOTECNOLOGIA: PRODUO, APLICAES E MERCADO

por exemplo, a conjugao com molculas como polietilenoglicol e o uso de sistemas

de transporte/direcionamento, como os lipossomas, para aprimorar o uso teraputico
das enzimas. Grandes avanos tambm so esperados no campo de protenas artificiais
com atividade cataltica.
Novos usos teraputicos e em diagnsticos, ainda em fase de pesquisa, representam um potencial que pode repercutir de maneira ainda mais significativa no mercado
mundial destas enzimas, estimado em mais de um bilho de dlares por ano.

REFERNCIAS
ABUCHOWSKI, A.; DAVIS, F. F. Soluble polymer-enzyme adducts. In: HOLCENBERG, J.; ROBERTS, G.
(eds.). Enzymes as Drugs. Chap. 13, New York: John Wiley & Sons.
AGUIAR, C.; CORVO, M. L.; CRUZ, M. E. M.; MARTINS, M. B. F. Synthesis and characterization of chemically modified catalase. Livro de Actas do III Congresso de Libertao Controlada de Medicamentos,
190-1, 1998.
AYESH, B.; MATOUK, I.; OHANA, P.; SUGHAYER, M. A.; BIRMAN, T.; AYESH, S.; SCHNEIDER, T.; DE
GROOT.; N.; HOCHBERG. A. Inhibition of tumor growth by DT-A expressed under the control of
IGF2 P3 and P4 promoter sequences. Molecular Therapy, 7 (4):535-41, 2003.
BANGHAM, A. D.; STANDISH, M. M.; WATKINS, J. C. Diffusion of univalent ions across the lamellae of
swollen phospholipids. J. Mol. Biol., 1:238-52, 1965.
BARET, A.; JADOT, G.; MICHELSON, A. M. Pharmacokinetic and antiinflammatory properties in the rat
of superoxide dismutases (Cu SODs and Mn SOD) from various species. Biochem. Pharmacol.,
33:2755-60, 1984.
BICKERSTAFF, G. Therapeutic enzymes. http://www.biol.paisley.ac.uk/Courses/Enzymes/ glossary/
Therapy1.htm, 2003.
BLAU, L.; MENEGON, R. F.; CHUNG, M. C. Pr-frmaco ativado por enzima, uma estratgia promissora
na quimioterapia. Quim. Nova, 29(6):1-11, 2006.
BRADY, R. O. Enzyme replacement therapy: Conception, chaos and culmination. Philos Trans R. Soc.
Lond B. Biol. Sci., 358(1433):915-9, 2003.
BRADY, R. O.; SCHIFFMA, R. Enzyme-replacement therapy for metabolic storage disorders. The Lancet
Neurology, 3(12):752-6. 2004.
BROOME, J, D. Evidence that l-asparaginase activity of guinea pig serum is responsible for its antilymphoma effects. Nature, 191:1114-5, 1961.
BURKE, B. A. Jokichi Takamine. Journal of Chemical Education, Biographical Snapshots, American Chemical Society. http://jchemed.chem.wisc.edu/JCEWWW/Features/ eChemists/Bios/Takamine.html, 2003.
CHAPLIN, M. Medical applications of enzymes. www.sbu.ac.uk/biology/ enztech/medical.html, 2002.
CLASSEN, E.; ROOIJEN, N. A comparative study on the effectiveness of variuos procedures for attachment of two proteins (L-asparaginase and horse radish peroxidase) to the surface of liposomes. Prep.
Biochem., 13:167-74, 1983.
CORVO, M. L.; BOERMAN, O. C.; OYEN, W. J. G.; VAN BLOOIS, L.; CRUZ, M. E. M.; CROMMELIN, D. J.
A.; STORM, G. Intravenous administration of superoxide dismutase in long circulating liposomes.II.
In vivo fate in a rat model of adjuvant arthritis. Biochim. Biophys. Acta., 1419:325-34, 1999.
CORVO, M. L.; JORGE, J. C. S.; VANT HOF, R.; CRUZ, M. E. M.; CROMMELIN, D. J. A.; STORM, G. Superoxide dismutase entrapped in long-circulating liposomes: formulation design and therapeutic activity in rat adjuvant arthritis. Biochim. Biophys. Acta., 1564:227-36, 2002.

1 prova

CAPTULO 13 ENZIMAS EM MEDICAMENTOS E DIAGNSTICOS

327

CORVO, M. L.; MARTINS, M. B. F.; FRANCISCO, A. P.; MORAIS, J. G.; CRUZ, M. E. M. Liposomal formulations of Cu,Zn-superoxide dismutase: physico-chemical characterization and activity assessment in
an inflammation model. J. Control Release, 43:1-8, 1997.
CRUZ, M. E. M.; GASPAR, M. M.; LOPES, F.; JORGE, J. S.; PEREZ-SOLER, R. Liposomal L-asparaginase: in
vitro evaluation. Int. J. Pharm, 96: 67-77, 1993.
CRUZ, M. E. M. Lipossomas: vesculas mgicas ou simples utopia? Boletim de Biotecnologia, 58:3-16, 1997.
CRUZ, M. E. M.; GASPAR, M. M.; MARTINS, M. B.; CORVO, M. L. Liposomal superoxide dismutase and
their use in treatment of experimental arthritis. In: DZGNES, N. (ed.). Methods in Enzymology,
Liposomes. Part E, v. 391, p. 395-413, Elsevier Academic Press, Amsterdam, 2005.
CRUZ, M. E. M.; JORGE, J. C. S.; MARTINS, M. B. F. Processos para a preparao de lipossomas com protenas hidrofbicas. Patente Portuguesa n. 95812, 1990.
CRUZ, M. E. M.; JORGE, J. S.; MARTINS, M. B. F.; GASPAR, M. M. G.; SIMES, A. C. E.; PEREZ-SOLER, R.
Liposomal compositions and processes for their production. Patente Europeia: 913110180.4-2114,
1991.
DOWLING, E. J.; CHANDER, C. L, CLAXSON, A. W.; LILLIE, C.; BLAKE, D. R. Assessment of human recombinant manganese superoxide dismutase in models of inflammation. Free Radic. Res. Comms.
18:291-8, 1993.
EYZAGUIRRE, J. Chemical Modification of Enzymes: active site studies. EYZAGUIRRE, J. (eds.). Chichester: Ellis Horwood Ltd., 1987.
FUJITA, T.; FURITSU, H.; NISHIKAWA, M.; TAKAKURA, Y.; SEZAKI, H.; HASHIDA, M. Therapeutic effects of superoxide dismutase derivatives modified with mono- or polysacharides on hepatic injury induced by ischemia/reperfusion. Bioch. Bioph. Research Commun., 189:191-6, 1992.
GASPAR, M. M.; PEREZ-SOLER, R.; CRUZ, M. E. M. Biological characterization of L-asparaginase liposomal formulations. Canc. Chemother Pharmacol, 38:373-7, 1996.
GASPAR, M. M.; BOERMAN, O. C.; LAVERMAN, P.; CORVO, M. L.; STORM, G.; CRUZ, M. E. M. Enzymosomes with surface-exposed superoxide dismutase: in vivo behaviour and therapeutic activity in a model of adjuvant arthritis. J. Control Release, 117:186-95, 2007.
GASPAR, M. M.; MARTINS, M. B.; CORVO, M. L.; CRUZ, M. E. M. Design and characterization of enzymosomes with surface-exposed superoxide dismutase. Biochimica et Biophysica Acta, 1609:211-7, 2003.
GEISOW, M. The medium and the message: progress in protein engineering and bioinformatics research.
The Biochemistry, Feb/Mar: 34-37, 1993.
GOLDBERG, D. M. Clinical enzymology: An autobiographical history. Clinica Chimica Acta, 357: 93-112,
2005.
GREENWALD, R. A. Therapeutic usages of oxygen radical scavangers in human diseases: myths and realities. Free Radic Res. Comms., 12-13: 531-8, 1991.
GREGORIADIS, G.; RYMAN, B. E. Fate of protein-containing liposomes injected into rats. An approach to
the treatment of storage diseases. Eur. J. Biochem., 3:485-91, 1972.
HALLIWELL, B. Oxygen free radicals, nitric oxide and human inflammatory joint disease. Ann Rheum
Dis., 54:505-10, 1995.
HAMMER, J. Therapeutic use of enzymes. Infinity, 2:1-2, 2001.
HENROTIN, Y.; DEBY-DUPONT, G.; DEBY, C.; FRANCHIMONT, P.; EMERIT, I. Active oxygen species,
articular inflammation and cartilage damage. In: EMERIT, I.; CHANCE, B. (eds.). Free Radicals and
Aging. Birkhauser Verlag, Basel, p. 309-22, 1992.
HUBER, W.; MENANDER-HUBER, K. B.; SAIFER, M. G. P.; WILLIAMS, L. D. Bioavailability of superoxide
dismutase: implications for the anti-inflammatory action mechanism of orgotein. AAS, 7, 185-195,
1980.

1 prova

328

ENZIMAS EM BIOTECNOLOGIA: PRODUO, APLICAES E MERCADO

HUBER, W.; SAIFER, M. G. P. Orgotein, the drug version of bovine Cu, Zn SOD: I. A summary account of
safety and pharmacology in laboratory animals. In: MICHELSON, A. M.; MCCORD, J. M.;
FRIDOVICH, I. (eds.). Superoxide and Superoxide Dismutases. Academic Press, London, p. 517-536,
1977.
IGARASHI, R.; HOSHINO, J.; TAKENAGA, M.; KAWAI, S.; MORIZAWA, Y.; YASUDA, A.; OTANI, M.;
MIZUSHIMA, Y. Lecithinization of superoxide dismutase potentiates its protective effect against Forssman antiserum-induced elevation in guinea pig airway resistance. J. Pharmac. Exper. Therap.,
262:1214-9, 1992.
JORGE, J. C. S.; PEREZ-SOLER, R., MORAIS, J. G.; CRUZ, M. E. M. Liposomal palmitoyl-l-asparaginase:
characterization and biological activity. Canc. Chemother Pharmacol, 34:230-4, 1994.
KITO, M. Chemical and physical lipophilization of proteins. J. Amer. Oil. Chem. Soc., 64:1676-813.
KOPETZKI, E.; LEHNERT, K.; BUCKEL, P. Enzymes in diagnostics: achievements and possibilities of recombinant DNA technology. Clin. Chem., 40:688-704, 1994.
LASIC, D. D.; PAPAHADJOPOULOS, D. Medical Applications of Liposomes, Elsevier Science B.V.,
Amsterdam, 1998.
LEIPNER, J.; ITEN, F.; SALLER, R. Therapy with proteolytic enzymes in rheumatic disorders. BioDrugs,
15:779-89, 2001.
MAPP, P. I.; GROOTVELD, M. C.; BLAKE, D. R. Hypoxia, oxidative stress and rheumatoid arthritis. Br.
Med. Bull, 51:419-36, 1995.
MARSHALL, S. A.; LAZAR, G. A.; CHIRINO, A. J.; DESJARLAIS, J. R. Rational design and engineering of
therapeutic proteins. Drug. Discovery Today, 8:212-21, 2003.
MARTINS, M. B. F. Construo de Bioconjugados: caracterizao e avaliao de propriedades. Tese de
doutoramento. Instituto Superior Tcnico. Universidade Tcnica de Lisboa, 1998.
MARTINS, M. B. F.; CORVO, M. L.; CRUZ, M. E. M. Lipophilic Derivatives of Cu,Zn-Superoxide Dismutase: Characterization and immobilization in Liposomes. Proceed Intern. Symp. Control Rel. Bioact.
Mater, 19:524-5, 1992.
MARTINS, M. B. F.; CRUZ, M. E. M. Characterization of bioconjugates of L-asparaginase and Cu,Zn-superoxide dismutase. Proceedings Third European Symposium on Controlled Drug Delivery, 188-91,
1994.
MARTINS, M. B. F.; CRUZ, M. E. M. Processo para a preparao de protenas quimicamente modificadas,
Patente Portuguesa: 88198, 1988.
MARTINS, M. B. F.; GONALVES, A. P. V.; CRUZ, M. E. M. Biochemical characterization of a bioconjugate of L-asparaginase. Bioconjugate Chemistry, 7:430-5, 1996.
MARTINS, M. B. F.; JORGE, J. S.; CRUZ, M. E. M. Acylation of L-asparaginase with total retention of enzymatic activity. Biochimie, 72:671-6, 1990.
MATES, J. M.; PEREZ-GOMEZ, C.; DE CASTRO, I. N. Antioxidant enzymes and human diseases. Clinical
Biochemistry, 32:595-603, 1999.
MEANS, G. E.; FEENEY, R. E. Proteins and their properties. In: Chemical Modifications of Proteins. p.
3-20, San Francisco: Holden-Day Inc, 1971.
MERRY, P.; WINYARD, P. G.; MORRIS, C. J.; GROOTVELD, M.; BLAKE, D. R. Oxygen free radicals, inflammation, and synovitis: the current status. Ann. Rheum. Dis., 48:864-70, 1989.
MLLER, H. J.; BOOS, J. Use of L-asparaginase in childhood ALL. Critical Reviews in Oncology: Hematology, 28:97-113, 1998.
MUROOKA, Y.; YAMASHITA, M. Genetic and Protein Engineering of Diagnostic Enzymes, Cholesterol
Oxidase and Xylitol Oxidase. Journal of Bioscience and Bioengineering, 91:433-41, 2001.

1 prova

CAPTULO 13 ENZIMAS EM MEDICAMENTOS E DIAGNSTICOS

329

NARTA, U. K.; KANWAR, S. S.; AZMI, W. Pharmacological and clinical evaluation of l-asparaginase in the
treatment of leukemia . Critical Reviews in Oncology/Hematology, 61:208-11, 2007.
NAYLOR, M. A.; THOMSON, P. Recent advances in bioreductive drug targeting. Mini-Reviews in Medicinal Chemistry, 1:17-29, 2001.
NICULESCU-DUVAZ, I.; SPRINGER, C. J. Antibody-Directed Enzyme Prodrug Therapy (ADEPT): A Review. Advanced Drug Delivery Reviews. 6:151-72, 1997 .
NOTHENBERG, M. Usos teraputicos de enzimas: A estratgia ADEPT. 3o Seminrio Brasileiro de Tecnologia Enzimtica. Depto. de Bioqumica, Instituto de Qumica/UFRJ, Rio de Janeiro, 1997.
NOTHENBERG, M. Avanos na terapia enzimtica. 4o Seminrio Brasileiro de Tecnologia Enzimtica.
Depto. de Bioqumica, Instituto de Qumica/UFRJ, Rio de Janeiro, 1999.
PAGE, M. The mechanisms of chemical catalysis used by enzymes. In: PAGE, M. (ed.). The Chemistry of
Enzyme Action. p. 229-269, Amsterdam: Elsevier Science Publishers, 1984a.
PAGE, M. The energetics and specificity of enzyme-substrate interactions. In: PAGE, M. (ed.). The Chemistry of Enzyme Action. p. 1-54, Amsterdam: Elsevier Science Publishers, 1984b.
PIDRARD, L.; BOLLEN, A. Development of new thrombolytic agents using recombinant DNA technology. Journal of Biotechnology, 15:283-304, 1990.
REGNAULT, C.; SOURSAC, M.; ROCH-ARVEILLER, M.; POSTAIRE, E. HAZEBROUCQ, G. Pharmacokinetics of superoxide dismutase in rats after oral administration. Biopharmac Drug Disp., 17:165-74,
1996.
ROBERTS, M. J.; BENTLEY, M. D.; HARRIS, J. M. Chemistry for peptide and protein PEGylation. Advanced Drug Delivery Reviews, 54:45976, 2002.
SADANA, A.; HENLEY, J. P. Influence of pH on enzyme stabilization: an analysis using a series-type mechanism. J. Biotech., 7:95-112, 1988.
STONE, W. L.; SMITH, M. Therapeutic uses of antioxidant liposomes. Mol. Biotechnol, 27:217-30, 2004.
TAKAKURA, Y.; MASUDA, S.; TOKUDA, H.; NISHIKAWA, M.; HASHIDA, M. Targeted delivery of superoxide dismutase to macrophages via mannose receptor-mediated mechanism. Biochem. Pharmacol,
47:853-8, 1994.
TIMASHEFF, S. N.; ARAKAWA, T. Stabilization of protein structure by solvents. In: CREIGHTON, T. E.
(ed.). Protein Structure: a practical approach. p. 331-345, Oxford: IRL Press, Oxford University Press,
1993.
TORCHILIN, V. P. Immobilized enzymes in clinical analysis. In: TORCHILIN, V. P. (ed.). Immobilized
enzymes in medicine. v. 11, p. 146-170, Berlin: Springer-Verlag, 1991.
TORCHILIN, V. P.; WEISSIG, V. Liposomes a pratical approach. Oxford Univ. Press Inc., New York, 2003.
TRAMPER, J.; POULSEN, P. B. Enzymes as Processing Aids and Final Products. In: STRAATHOF, A. J. J. e
ADLERCREUTZ, P. (eds.). Applied Biocatalysis. 2nd ed. Harwood Academic Publishers, The Netherlands, p. 55-91, 2000.
VERONESE, F. M. Enzyme surface modification by polymers for improved delivery. J. Control Release,
29:171-6, 1994.
WALSH, G. Pharmaceutical biotechnology products approved within the European Union. European
Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics, 55:3-10, 2003.
WOODLE, M. C.; STORM, G. Long circulating liposomes: old drugs, new therapeutics. Springer-Verlag,
Berlin, Heidelberg, Germany, 1998.
WRISTON, J. C.; YELLIN, T. O. L-asparaginase: a review. Adv. Enzymol Relat. Areas Mol. Biol., 39:185-248,
1973.

1 prova

1 prova