Laboratorio N2 de enzimologa: Actividad enzimtica

en fluidos biolgicos: actividad de fosfatasa acida en

suero

INTRODUCCIN
Este trabajo se realiz sobre suero en sangre para calcular la actividad
enzimtica de fosfatasa acida a partir de su velocidad de reaccin.
La fosfatasa acida es una lisozima celular, isoenzima del grupo de las fosfatasas
acidas. Su peso molecular es de 100.000 D. Se encuentra presente en el lquido
seminal1. Est ubicada principalmente en la glndula prosttica y en menor
proporcin en el hgado, estomago, rin, musculo, plaquetas, eritrocitos,
medula sea y bazo. Debido a esto es importante para diagnsticos clnicos de
cncer en prstata.
Cmo se puede determinar la actividad enzimtica de la fosfatasa acida
prosttica? Primero se midi la fosfatasa acida total y se resto la fosfatasa acida
inhibida por al L-tartrato (inhibidor especifico de la fosfatasa acida prosttica).
La actividad se expresa en unidades de enzima. Considerando una unidad de
enzima a la cantidad necesaria para transformar una micro moles de sustrato
por minuto. Los valores de actividad total en suero para adultos normales se
encuentran entre 2-11 U/L. La actividad enzimtica de fosfatasa acida prosttica
para adultos normales se encuentra entre 2-3 U/L. Valores mayores a estos
ltimos (en adultos) se asocian a cncer a la prstata.

MATERIALES Y METODOS
Equipos:

Espectrofotmetro
Vortex
Bao Maria (37)
Pipetas
Tubos de ensayo
Gradillas

Reactivos:

Sustrato: p-nitrofenol fosfato0.036M

NaOH 0.1M
Buffer citrato con tartrato 0.09 M Ph 4.85
Buffer citrato sin tartrato 0.081M pH4.85
Suero

Procedimiento:

Blanco 1

blanco 2

PNFF

0,5

0,5

Buffer con
T

0,5

Muestra 2

R Muestra
1

R Muestra
2

0,5

0,5

0,5

Buffer sin
T

0,5

Bao
Maria

0,5

37 C

Suero

0,2

Bao
Maria

Muestra 1

0,2

37 C

NaOH 0,1
M

Suero

0,2

0,2

Llevar al Vortex.
Calibrar el equipo en agua destilada. Leer la absorbancia a 402nm.

FUNDAMENTOS
2

Las fosfatasas cidas son enzimas que en pH cido (aproximadamente 5,0)

tienen la propiedad de catalizar la hidrlisis de fosfomonosteres, liberando
como productos de la reaccin fosfato inorgnico y un alcohol, cuya
naturaleza depende del sustrato utilizado1.
En esta experiencia se utiliz paranitrofenolfosfato como sustrato originando
como producto de la reaccin p-nitrofenol y un fosfato inorgnico 1, 2. Al aadir
NaOH cambia el pH del medio, deteniendo la actividad de la enzima y
convirtiendo p-nitrofenol en p-nitrofenolato, un compuesto amarillo que presenta
una mayor absorbancia a 402nm.
La adicin de L-tartrato inhibe la fosfatasa acida prosttica, pero no inhibe a
otras isoenzimas. La diferencia entre los dos ensayos (fosfatasa acida total y
fosfatasa acida no prosttica) representa el nivel de fosfatasa acida prosttica en
suero2.

CLCULOS
Para hacer los clculos se utiliz la frmula utilizada por Navarro-Carrillo 2

: coeficiente de extincin molar, para el pnitrofenolato es 18400/cm.mol

Vt: Volumen total de la muestra (6,2mL)
Vs: Volumen de suero (0.2ML)
l: longitud de la celda (1CM)

RESULTADOS
3

Absorbancias:

Suero X congelado(A)
Suero - Yuri (B)
Suero Gabriela(C)

BM1
0.047
0.065
-

BM2
0.048
0.107
-

M1
0.05
0.321
0.118

MR1
0.05
0.09

M2
0.048
0.326
0.065

MR2
0.061
0.315
0.082

CV - M1
0%
19.03%

CV - M2
16.87%
2.43%
16.35%

Promedios de absorbancias:
No prosttico
X1
0.05
0.321
0.104

Total
X2
0.0545
0.321
0.0735

Concentraciones y coeficientes de variancia:

Suero X congelado(A)
Suero - Yuri (B)
Suero Gabriela(C)

U/L no
prosttico
0.1684
11.99
6.627

U/L
U/L total prosttico
0.5335
0.3651
-2.38
-9.61
4.12
-2.507

DISCUSION DE RESULTADOS

En el estudio de Navarro-Carrillo2 se encontraron los siguientes valores de

concentracin de fosfatasa cida (AcP): en hombres: 4.5-12.9 U/L, mujeres: 311.4, pero se cita que la casa Comercial Merk refiere valores entre 4.5 y 13.8
U/L sin distinguir el sexo. Para la fosfatasa cida prosttica (PAP) se obtuvo
valores de hasta 4.1U/L mientras que la casa comercial a la que se hace
referencia obtuvo hasta 3.7U/L.
En la muestra A (suero X congelado) la actividad de la AcP tiene valores muy
pequeos, se puede pensar que esto se debe a que estuvo congelada
(aproximadamente 3 meses). Adems, no se sabe las condiciones en las que fue
almacenada; la AcP es sensible a la temperatura y al pH, si se deja el suero a
temperatura de ambiente, la AcP puede perder gran parte de su actividad en
menos de una hora3.
En el caso de la muestra B (suero Yuri) la AcP concuerda con los valores
esperados para un hombre, pero la actividad de la PAP es menor a cero,
atribuimos esto a un error en el desarrollo del procedimiento pero no podemos
especificarlo. Sin embargo, se puede presumir un error en determinacin de la
absorbancia del blanco de la muestra 2, para las dems muestras los blancos
tienen valores de absorbancia entre 0.047 y 0.065 mientras que en el blanco de
la M2 el valor es de 0.107.
La muestra C (Suero Gabriela) tiene un valor de actividad de AcP que
corresponde al rango esperado, pero, luego del anlisis la fosfatasa no prosttica
resulta mayor a la total. Es necesario remarcar que para esta muestra no se
hicieron blancos, por lo que no se sabe si los valores que se estn considerando
se acercan de manera satisfactoria a los valores que se hubieran obtenido
trabajando con los blancos. Los coeficientes de variacin de la muestra C son
muy grandes (mayores a 5%) por lo que suponemos que hubo errores
sistemticos en el desarrollo del procedimiento.
Se debe considerar que en la prctica realizada hubo una escases de sangre,
como se puede observar en la tabla para la muestra B no se preparo el blanco
para la muestra 1 y 2, y para la muestra C no se pudo preparar la repeticin
correspondiente para la muestra 1, por tal razn no se puede tener la seguridad
de que los datos obtenidos sean precisos, es probable que la falta de datos sea
la razn por la cual la concentracin de AcP no prosttica sea mayor que la AcP
total, lo cual es una incoherencia.

BIBLIOGRAFIA
5

(1) GUIJA ,E; SOBERN, M; HAAK-MARES, H. Mecanismo de accin de las

fosfatasas cidas de bajo peso molecular. Anales de la Facultad de Medicina
Universidad Nacional Mayor de San Marcos Lima 2007 68(4): 356 - 362
(2) NAVARRO CARRILLO, F; SALAZAR LPEZ, M;
ZAMORANO OCHOA, S.
Obtencin de valores de referencia de fosfatasa alcalina y fosfatasa cida en
personas de la Ciudad de Hermosillo, Sonora. Boletn Clnico Hospital Infantil del
Estado de Sonora 1999; 16(1) : 29-38.
(3)RAVEL.R. Clinical Laboratory Medicine: Clinical Aplications of Laboratory Data.
6th edition. 1995