MIKROBIOLOGI ANALISIS

Development and validation of a microbiological

assay for
determination of chlorhexidine digluconate in
aqueous solution

 ELSA YEKI MANOSA/10714048

MARSHA ASMARADITA D/10714050
NARISSA ANDRINA/10714054

KELOMPOK 11

ANTISEPTIK adalah produk yang digunakan untuk membersihkan dan

disinfeksi luka trauma, luka bakar, membran mukosa, tangan, dan situs
bedah
CHLORHEXIDINE
yaitu larutan desinfektan khemis yang bersifat
bakteriostatik dan bakterisidal terhadap
mikroba gram positif maupun gram negatif.
Klorheksidin merupakan derivat bis-biquanite
dan merupakan basa yang kuat. Selain
memiliki aktivitas antibakterial yang tinggi,
klorheksidin juga menghambat virus dan aktif
melawan jamur

INTRODUCTION

Chemical structure of chlorhexidine digluconate

(CAS: 18472-51-0).

Metode Fisikokimia Standar Untuk Penentuan Chlorhexidine

Kromato grafi cair kinerja tinggi (HPLC)

Menurut USP, 2008; BP, 2010; EP, 2011

Titrasi dengan asam perklorat 0,1 M

Menurut BP, 2010; EP, 2011

Spektros kopi UV langsung dan fluorometry

Dilakukan oleh Jensen, Christensen(1971), , Vries, Ruben, Arends, (1991)

Pada penelitian ini dilakukan metode difusi agar

karena
Metode ini ramah lingkungan dan tidak memerlukan
pelarut atau menghasilkan racun oleh-produk. Selain
itu,metode ini tidak memerlukan peralatan khusus,
rendah biaya, dan dapat dilakukan dengan prosedur
sederhana dan hanya memerlukan fasilitas
sederhana untuk mendapatkan hasil yang maksimal.

Bahan dan Metode

 Larutan Chlorhexidine digluconate

kemurnian20.0%
Air suling

Bahan

 Aliquot 250 l, 750 l, 2250 l larutan standar

dimasukkan ke labu volumetrik 10-mL kemudian
ditambahkan
aquadest
untuk
memberi
konsentrasi 0.5, 1.5, dan 4.5% (S1, S2, dan S3)

Persiapan larutan standar

 Aliquot 250 l, 750 l, 2250 l larutan sampel

dimasukkan ke labu volumetrik 10-mL kemudian
ditambahkan
aquadest
untuk
memberi
konsentrasi 0.5, 1.5, dan 4.5% (T1, T2, dan T3).
Larutan ini yang akan di uji dan dibandingkan
dengan larutan standar

Persiapan Larutan Sample

 Kultur Staphyllococcus aureus dikultivasi di casein-soy

agar pada suhu 2-8C
Untuk digunakan, mikroorganisme ditumbuhkan pada
Brain Heart Infusion (BHI) Broth dan diinkubasi pada suhu
35C2C
Dilakukan standardiasasi dengan menggunakan
sprektofotomerter
Dari suspensi terstandardisasi ini 1 mL aliquot
ditambahkan ke setiap 100 mL BHI agar pada 47C1C
sebagai lapisan inokulum pada lempeng

Standardisasi Mikroorganisme
dan Inokulum

 Design uji 3x3

6 lempeng untuk setiap uji
Agar terdiri dari dua lapisan, yaitu agar BHI sebagai dasar
dan agar BHI yang berisi inokulat sebagai lapisan atas
Dibuat 6 lubang, setiap lubang diisi 200L larutan acuan
(S1,S2, dan S3), 3 lubang diisi dengan larutan sampel (T1,
T2, dan T3)
Lempeng diinkubasi pada suhu 35C1C pada kondisi
aerob, selama 18 jam
Diameter hambat diukur menggunakan digital calliper

Metode Difusi Agar

Linearitas

3 dosis larutan standar dan 3 dosis larutan

sampel diuji
Linearitas dievaluasi dengan analisis regresi
yang dihitung dengan metode kuadrat terkecil

Presisi

RepeatabilitySample diuji dalam larutan

dengan konsentrasi yang sama dengan kondisi
eksperimen yang sama
Intermediare precission RSD
Membandingkan 3 hasil uji dari 3 hari
berbeda

Akurasi

Aliquot 500, 1000, dan 1500 l di encerkan

dengan air hingga konsentrasi akhirnya 1.5,
2.5, dan 3.5 %
Persen recovery larutan CHX dihitung dengan
persamaan yang diusulkan AOAC

Validasi Metode

 Aktivitas CHX diglukonat dihitung dengan persamaan

Hewitt
Perhitungan diasumsikan menunjukkan hubungan
langsung antara diameter hambat teramati dengan
logaritma dosis yang digunakan
Secara statisik, uji dianalasis dan diverifikasi dengan
ANOVA

Perhitungan potensi

 Uji ini dilakukan untuk menentukan metode yang

paling tepat untuk uji potensi CHX diglukonat
Kondisi percobaan di uji dan di atur untuk
menentukan kondissi terbaik untuk uji potensi CHX
diglukonat
Staphylococcus aureus yang digunakan merupakan
mikroorganisme yang tepat karena peka terhadap
CHX-D dan dapat membentuk area hambat yang
mudah teramati, sehingga memungkinkan
pengukuran yang presisi

Hasil

Parameter

Kondisi

Kurva Standar (g/mL)

1.5, 3.0, 6.0%

0.25, 1.0, 4.0%
0.5, 1.5, 4.5%

Pengenceran

Larutan buffer pH 6 dan 8

Air suling

Inokulum (%)

0.5 dan 1.0

Mikroorganisme

Bacillus subtilis
Staphylococcuus aureus

Media

BHI

Hasil

 Tabel Diameter Zona Hambat pada Larutan Chlorhexidine

Digluconate

Perhitungan diasumsikan menunjukkan hubungan langsung

antara diameter hambat teramati dengan logaritma dosis
yang digunakan

Dengan membuat grafik hubungan

antara diameter zona hambat (mm)
dan log konsentrasi (%), diperoleh
persamaan garis, yaitu:

Grafik Hubungan Diameter Zona Hambat (mm) dengan

Konsentrasi (%)
23
22.5

R = 0.9999

22
21.5

y= 1.3972 Ln(x) + 20,26

R2=0.9999

dengan

21
20.5
20

Ket: x = log dosis

Y= diameter zona

19.5
19
-0.4

-0.2

0.2

0.4

0.6

0.8

Presisi
Repeatability (intra-assay) : R.S.D 2,03%
Intermediate precision (inter-assay) : R.S.D 2,94%

Akurasi
R.S.D 1,32%

Metode yang digunakan dapat menentukan konsentrasi CHX

digluconate dalam larutan secara akurat dan menunjukkan hasil yang
diperoleh dari bioassay (uji biologi) dekat dengan konsentrasi sampel
sebenarnya

Potensi
Aktivitas CHX Digluconate berada pada rentang 92,52%92,61% dengan R.S.D. 0,1%
Diperbolehkan berdasarkan USP 2008 yang mengizinkan
variasi sampai dengan 10% untuk produk non-steril yang
digunakan untuk penggunaan luar

Uji mikrobiologi dapat dijadikan metode yang digunakan

pada quality control larutan CHX digluconate
dikarenakan:
1. Dari hasil uji mikrobiologi ditunjukkan linearitas,
keprisisian, dan keakuratan yang baik pada
konsentrasi 0,5-4,5 %
2. Reagen sederhana, preparasi sampel minim,
menghasilkan residu yang tidak toksik, tidak
menggunakan alat khusus, dan mendukung untuk
penggunaan analisis rutin

Kesimpulan

Fiorentino Flavia, Marcos Correa, Herida Sagado. 2013. Development and

Validation of a Microbiology Assay for Determination of Chlorhexidine
Digluconate in Aqueous Solution. Brazilian Journal of Pharmaceutical Science
Vol. 49 halaman 351-358

Pustaka

THANK YOU

 1. Ferica (076) : RSD dari uji presisi dan akurat dikatakan valid parameternya dari mana?
2. Imelda : Penyiapan bakteri saat kultivasi mengapa suhunya rendah?
3. Fitri : Larutan yang digunakan kemurnian 20% maksudnya? Bagaimana penentuan
konsentrasi nya? Apakah boleh konsentrasinya diganti?
3. 20% itu merupakan konsentrasi sediaan yang mengandung 20% Chlorhexidine Digluconate.
Konsentrasi ditentukan dari farmakope Brazil karena uji dilakukan oleh institusi di Brazil
2. Suhu rendah adalah suhu penyimpanan kultur bakteri dan media SCA untuk digunakan kultur
diambil dan ditumbuhkan dalam media BHI kemudian diinkubasi pada suhu 35oC
1. RSD yang dapat diterima adalah sampai dengan 10% berdasarkan USP 2008. Hasil uji yang
dilakukan memenuhi kriteria dengan uji presisi sekitar 2%, akurasi sekitar 1%, dan potensi
sekitar 0,1%

Sesi Tanya Jawab