Preparao do Material (amostra) para Estudo ao

Microscpio ptico (Texto do Prof.Walcir J. Fieri)

Preparaes fresco

Estas preparaes so simples, rpidas, porm no de boa

qualidade e a anlise da lmina imediata. o que se faz quando se
observa clulas da mucosa oral atravs de uma dissociao e coradas
com azul de metileno ou outro corante. Tambm so preparaes
fresco quando examinamos uma cultura de protozorios ou tecidos
cultivados em meios especiais. Geralmente, aps o exame das clulas
ou tecidos, estas preparaes so descartadas e as lminas so
lavadas e reaproveitadas. Estas preparaes no se preservam por
longos perodos de tempo para estudos posteriores.

Preparaes permanentes
Normalmente estas preparaes so complexas e
demoradas pois so fixadas para a preservao dos constituintes das
clulas e tecidos. So duradouras, isto , as lminas preparadas
podem ser guardadas por longos perodos de tempo e examinadas
por ocasio das aulas prticas. A maioria das lminas usadas para
estudo na Citologia, Histologia, Patologia, Gentica e outras
disciplinas, so preparadas com esse fim.
Para o estudo da micromorfologia das clulas e tecidos, so
utilizadas tcnicas histolgicas. Estas tcnicas so relativamente demoradas
e so realizadas atravs de etapas.A seguir, etapas deste mtodo ou protocolo:

01. Coleta do material ou amostra

A coleta da amostra (tecido ou rgo) para estudo pode ser

realizada atravs de:

a)

Bipsia: tcnica muito usada pela Patologia. Normalmente

retira-se um fragmento do tecido ou do organismo vivo, para tanto
se anestesia o local

b)

Necropsia ou autpsia: tambm uma tcnica muito usada

pela Patologia. Consiste na retirada de um fragmento de tecido ou
do rgo, porm do organismo j morto.

c)

Vivisseco: esta uma tcnica muito usada na Citologia e

Histologia. Refere-se retirada de fragmentos de tecidos ou
rgos de cobaias atravs de sua disseco. Neste caso, o termo
bipsia tambm usado por muitos pesquisadores.

As disciplinas Citologia e Histologia nem sempre se utilizam

de material humano para estudo, alis somente em raras ocasies. As
razes para tal procedimento so vrias, como a difcil obteno, nem
sempre didtico para estudo e s vezes o rgo demasiado
grande quando se quer estud-lo por inteiro. Assim, os animais mais
utilizados so o rato, o co, o gato, o coelho, o porco, a cabra, o boi,
etc. A amostra uma vez coletada, imediatamente lavada e
introduzida em uma soluo fixadora.

02. Fixao da Amostra

A fixao visa a preservao da morfologia e dos constituintes
qumicos das clulas e tecidos. Uma vez no fixador, as clulas morrem
imediatamente evitando processos autolticos. Falhas em fixar um tecido
adequadamente permite que as enzimas intracelulares continuem a funcionar e
a degradar a estrutura celular, condio conhecida como autlise postmortem.

So agentes fixadores o calor, o frio e os fixadores qumicos.

Pelo calor podem ser fixados, por exemplo, esfregaos de sangue

ou lminas contendo bactrias ou fungos. um processo muito usado pela
Microbiologia e Hematologia.

Pelo congelamento, o metabolismo das clulas fica nulo, porm no

fixa os tecidos, pois uma vez passado o efeito do congelamento o rgo pode
sofrer os processos autolticos, caso a amostra no seja tratada quimicamente.
O congelamento um processo muito utilizado pela Histoqumica.

Os fixadores qumicos so os mais utilizados, porm nem todos os

fixadores so compatveis com os mtodos de colorao. Os fixadores
qumicos mais usados so: a soluo de 10% de formalina em salina, as
misturas de Bouin, Helly, Zenker, etc.

Os fixadores devem possuir vrias propriedades como fixar a

amostra, evitar sua autlise, conservar a amostra, penetrar na mesma,
endurecer relativamente a amostra, no interferir nos corantes, insolubilizar os
componentes celulares e tissulares, no provocar alteraes qumicas e
morfolgicas nas clulas e tecidos.

Aps a fixao da amostra, o procedimento seguinte consiste em

prepar-la para o exame ao microscpio. Com a finalidade de permitir que a luz
o atravesse, corte delgados da mesma devem ser realizados. Embora o
processo de fixao endurea o tecido, o material no se torna suficientemente
firme ou coeso para permitir cortes delgados perfeitos. Para que essa rigidez
seja atingida, o tecido deve ser completamente impregnado com algum meio
de sustentao que manter juntas as clulas nos tecidos. O componente de
sustentao mais utilizado a parafina histolgica. Como a parafina no
solvel na gua, h necessidade de se desidratar a amostra. Atualmente
utilizam-se tambm resinas histolgicas.

03. Desidratao da Amostra

A desidratao levada a efeito emergindo a amostra de
tecido em concentraes crescentes de lcool etlico.
Geralmente passa-se a amostra para lcool 70% e em seguida lcool
90% at lcool absoluto com vrias passagens. O uso de
concentraes de lcool, remove a gua da amostra sem causar dano
celular e substitui a gua pelo lcool.

04. Clarificao ou Diafanizao da Amostra

A impregnao da amostra com parafina impossvel

porque a mesma no miscvel no lcool. A amostra deve, portanto,
ser imersa em um produto qumico em que o lcool e a parafina sejam
solveis. O xilol o mais usado. Tal produto chamado agente
diafanizador porque torna a amostra translcida como resultado de
seu alto ndice de refrao, como tambm, dissolve os lpides.
O fragmento da amostra removido do lcool absoluto e
passado por sucessivas trocas de xilol at que o lcool seja
substitudo pelo xilol.

05. Impregnao e Incluso da Amostra

Do xilol a amostra colocada em parafina aquecida e

fundida. Esta etapa ocorre na estufa a uma temperatura aproximada
de 70c. A amostra passa por vrias trocas de parafina histolgica
para assegurar a substituio do agente clarificador pela mesma. A
parafina ento derramada em um molde, geralmente de papel, e
com o auxlio de uma pina, o fragmento da amostra includo na
parafina ainda lquida e deixados para endurecer. O excesso de
parafina posteriormente recortado.

06. Microtomia

O bloco de parafina contendo a amostra em seu interior

colocado no micrtomo. Este um aparelho que contm uma
navalha bem afiada que retira cortes delgados (entre 4 e 20 m de
espessura) do bloco. Os cortes obtidos so distendidos em gua
quente onde flutuam. So depois transferidos para as lminas de vidro
previamente revestidas com um adesivo, a albumina.

07. Colorao das Lminas

Geralmente os tecidos no corados so quase
transparentes e o reconhecimento de suas estruturas ao microscpio
ptico praticamente impossvel. Os mtodos de colorao dos
tecidos para observao microscpio ptico foram introduzidos por

volta de 1850 e com isso ocorreram, imediatamente, grandes avanos

no campo da histologia.
A qumica concernente maioria das tcnicas no bem
compreendida, e muitas coloraes so descobertas por acaso.
Colorao pela tcnica H/E:
A hematoxilina e a eosina (H/E), consiste na combinao mais
comum de corantes usados na Histologia e Patologia. A hematoxilina
um corante bsico e cora estruturas cidas em azul arroxeado. Cora,
por exemplo o ncleo da clula que rico em DNA
(cido desoxirribonuclico). Diz-se que os componentes cidos
so basfilos, isto tem afinidade por corante bsico. A eosina um
corante cido e cora componentes bsicos da clula em vermelho.
Cora o citoplasma que rico em protenas. Assim os componentes
bsicos so ditos acidfilos ou eosinfilos.
Certos corantes reagem com os componentes das clulas e
tecidos e os coram com uma cor diferente da cor do corante. A
mudana da cor do corante ao corar clulas e tecidos denominase metacromasia. So exemplos desses corantes o azul de
toluidina, o azul de metileno ou a tionina. Com os corantes azuis, a
cor muda para vermelho. A colorao dos mastcitos com o azul de
toluidina um bom exemplo de metacromasia. Os grnulos do
citoplasma coram-se em vermelho, enquanto o resto do tecido fica em
azul. A causa da metacromasia ainda no totalmente compreendida,
porm tem sido sugerido que devida a polimerizao das molculas
do corante.
Mtodo de colorao pela tcnica H/E: Em razo de
muitos corantes serem dissolvidos em gua, torna-se necessrio
remover a parafina do tecido e substitu-la pela gua. Para isso, as
lminas que contm os cortes, so mergulhadas repetidas vezes em
cubas contendo xilol, assim, a parafina dos cortes substituda pelo
xilol. Este, agora, retirado, passando as lminas atravs de
concentraes decrescentes de lcool etlico, desde o lcool absoluto
at a gua. Aps a colorao dos cortes, as lminas so montadas.
Clique no link abaixo e observe um esquema das estapas da tcnica
histolgica:
http://ufpel.tche.br/~mgrheing/tec_histo.jpg

04. Montagem das lminas

Para a proteo dos cortes e para torn-los permanentes,

h necessidade de serem protegidos por uma lamnula. Para tanto, as
lminas so desidratadas, passadas para o xilol e com uma gota de
resina chamada resina histolgica, uma lamnula colocada sobre o
corte. A temperatura ambiente se encarrega de secar a preparao.
Artefatos de Tcnica

Os artefatos de tcnica podem ou no ocorrer nas

preparaes como a que acabamos de descrever. So pequenas
anormalidades encontradas nas lminas, oriundas da tcnica de
preparo das mesmas. Podem ser pequenas dobras, rugas, rupturas,
sinais de dentes de navalha, bolhas de ar, precipitados de corantes,
etc. Estes artefatos necessitam ser reconhecidos para evitar que
sejam confundidos com as estruturas celulares.
Mtodos Especiais:

Histoqumica e Citoqumica

A histoqumica e a citoqumica compreendem o estudo dos

compostos e elementos qumicos presentes nas clulas e tecidos, sua
identificao e locais onde as reaes qumicas se realizam. Enquanto
os mtodos histolgicos tm sido usados tradicionalmente pelos
histologistas para demonstrar estruturas tais como ncleos, complexo
de Golgi, fibras nervosas, etc., as tcnicas histoqumicas baseiam-se
na compreenso total das reaes qumicas inorgnicas e orgnicas,
ao passo que o uso de corantes comuns para a colorao envolve
reaes que no so sempre compreendidas e pode comprometer um
grande nmero de fenmenos fsico-qumicos. Existem alguns
princpios fundamentais utilizados pela histoqumica que devem ser
observados risca:
a) a substncia qumica e o tecido devem ser preservados.
b) deve ser evitada a difuso das substncias qumicas e de
seus locais nas clulas e tecidos.
c) a tcnica histoqumica deve produzir um produto final
insolvel.

d) o produto final da reao deve apresentar cor ou

tonalidade que possa ser visvel.
e) a reao histoqumica deve ser especfica para a
substncia qumica que est sendo usada.
rantes biolgicos. O primeiro consiste nos corantes de tecidos em
geral, usando um ou mais corantes para diferenciar o ncleo do
citoplasma das clulas. O segundo grupo envolve processos especiais
de colorao. Por exemplo, aqueles usados para demonstrar colgeno
e elastina do tecido conjuntivo. O terceiro grupo inclui os metais
pesados nos mtodos de impregnao, nos quais os sais metlicos
so depositados nos tecidos, e estes sais depois so convertidos em
metal, que aparecem em negro quando observados ao microscpio.
Criofratura

A criofratura um mtodo de preparao de tecidos para a

microscopia eletrnica sem o uso de fixadores qumicos ou agentes de
desidratao e incluso. Consistem em congelar rapidamente
temperaturas baixas (-160 C) e depois fraturar a amostra com uma
navalha de metal. A superfcie exposta do tecido introduzido no
vcuo em baixa temperatura, o que permite a gua congelada do
tecido sublimar-se. Os componentes celulares ficam expostos em
relevo na superfcie. O carbono e a platina so ento depositados em
camada fina sobre a superfcie, de tal forma que produza um
sombreamento. cidos fortes digerem a parte orgnica e o molde de
carbono-platina examinado ao microscpio eletrnico de varredura.
Este mtodo permite o estudo, principalmente de superfcies
membranosas.
Imunofluorescncia e Imunocitoqumica

Certas protenas especficas ou polissacardeos podem ser

localizados pelas tcnicas de imunocitoqumica ou
imunofluorescncia. Estes mtodos levam em conta que o organismo
produz protenas especficas chamadas anticorpos, em resposta a
protenas estranhas introduzidas denominadas antgenos. Os
anticorpos reagem com os antgenos inativando-os. Corantes
fluorescentes podem ser ligados quimicamente aos anticorpos, de
modo que os locais onde os antgenos reagem com os anticorpos
podem ser localizados com o microscpio de fluorescncia.
Cultura de Clulas e Tecidos

Hoje, existem tcnicas atravs do uso de enzimas especficas, que

permitem o isolamento de fraes puras de um tipo celular nico, como clulas
pancreticas, clulas hepticas, certas clulas sangneas, conjuntivas,
cancergenas, etc.

Estas clulas, retiradas do organismo, podem ser mantidas vivas em

um meio de cultura adequado e, conseguem ainda, com que se multipliquem
formando um tecido. Normalmente utilizam-se lminas de vidro como suporte
para o desenvolvimento dessas culturas e como as clulas tendem a se
multiplicarem formando camada nica, facilita a observao ao microscpio.

Essas culturas tm sido usadas para o estudo do metabolismo de

clulas normais, cancerosas, embrionrias ou infectadas por vrus, bactrias ou
protozorios. Na citogentica, as culturas de clulas so de extrema
importncia para o estudo da mitose, da meiose, dos cromossomos e para a
confeco dos caritipos dos indivduos.

Colorao Vital e Supravital

Ao se injetar corantes vitais de baixa toxidade em animais vivos
(colorao vital) ou aplicados em clulas e tecidos sobreviventes, retirados do
organismo, e vivendo, muitas vezes em meios de cultura (colorao supravital),
estes corantes se incorporam seletivamente em algumas clulas, organelas ou
componentes extra-celulares. A localizao do corante, pode ajudar no s na
identificao do componente corado, como fornecer subsdios para sua funo.
Por exemplo, a alizarina, usada como corante vital, incorpora-se seletivamente
matriz calcificada do osso que est sendo formado durante o uso do corante,
corando-se em vermelho.

Os corantes azul tripam, carmim, nanquim e outros, tm sido

usados para o estudo da fagocitose e para a identificao de diferentes tipos
de macrfagos (clulas fagocitrias). Os corantes supravitais vermelho
neutro e verde Janus tm sido usados, respectivamente, para o estudo
de leuccitos e mitocndrias. Supravitalmente,
o azul
de
metileno cora clulas nervosas e seus prolongamentos, ficando fcil sua
identificao.

Interpretao de Cortes de Tecidos, Clulas ou rgos

s vezes o estudante, no incio, tem dificuldades em

interpretar uma lmina histolgica, pois o corte observado ao
microscpio apresenta apenas duas dimenses e as estruturas
celulares, as clulas, os tecidos ou os rgos possuem trs
dimenses.
Ao se pegar uma lmina histolgica, ela deve ser antes examinada a
olho nu contra a luz. Deve-se observar a forma do rgo ou da estrutura, seu
tamanho, a tcnica de colorao usada e em que posio o rgo ou tecido foi
seccionado.

Geralmente os cortes apresentam 7 m de espessura, portanto,

menos que a espessura da maioria das clulas. Deve-se imaginar o que
poderia ser visto em cortes feitos acima ou abaixo do corte existente em sua
lmina. Estruturas como vasos sangneos e nervos, muitas vezes tm um
curso sinuoso atravs dos tecidos, de modo que quando eles so identificados
em um plano particular do corte, podem ser cortados vrias vezes, muitas das
quais transversalmente, outras obliquamente e em algumas, longitudinalmente.

Entenda que se voc examina um corte feito atravs de uma clula,

o corte pode no ter passado pelo seu ncleo, de modo que ela pode aparecer
sem ncleo.

Cortes em vasos sangneos, ductos de glndulas ou vias

respiratrias requerem muita ateno na sua interpretao.

Unidades de Medida Usadas em Microscopia

Quando se examina estruturas ao nvel de microscpio, h
necessidade de se ter uma noo de tamanho e para isso foram criadas
algumas unidades de medida.

1 m (micrmetro) = 1/1000 mm

1 nm (nanmetro) = 1/1000 m

1 (angstron) = 1/10000 m

1 mm = 1000 m

1 m = 1000 nm

1 m = 10000

1 nm = 10 A