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Preparacin, aislamiento y caracterizacin de la etapa

especfica de las clulas espermatognicas por anlisis


celular y molecular (aislamiento y microdiseccin de segmentos
escalonados de los tbulos seminferos).

La espermatognesis constituye un notable programa de diferenciacin de las


clulas, que implica cambios drsticos en la morfologa celular, la bioqumica y la
expresin gnica. Sin embargo, el estudio de las clulas germinales masculinas se
complica por la organizacin excepcional del epitelio seminfero y por la falta de
lneas celulares establecidas que son capaces de recapitular cualquiera de las
mltiples etapas de diferenciacin del programa de la espermatognesis in vitro.
Tipos de clulas con diferencias en sus propiedades de sedimentacin o
marcadores de superficie celular pueden aislarse de todo el tejido por diversos
mtodos, pero estos mtodos no permiten una identificacin precisa de todas las
etapas de diferenciacin. Como consecuencia de la regulacin paracrina estricta
por las clulas de Sertoli, el producto espermatognesis en ondas sincronizados a
lo largo de los tbulos seminferos, y cada seccin transversal dada del tbulo
contiene slo ciertos tipos de clulas en una combinacin especfica. El patrn de
absorcin de la luz de un tbulo seminfero, como se ve bajo un microscopio de
diseccin, se correlaciona con etapas definidas de la ola espermatognica, lo que
hace posible aislar etapas especficas sobre la base de sus propiedades de
transiluminacin. La precisin de la aislamiento de etapas especficas se puede
mejorar mediante la combinacin con microscopa de contraste de fase de
preparations7-10 de clulas vivas. La puesta en escena del ciclo de la
espermatognesis se caracteriza mejor en la rata y el ratn. A continuacin,
describimos un mtodo destinado a identificar, aislar y caracterizar las clulas
germinales masculinas ratn en pasos especficos de diferenciacin por
microdiseccin asistida por transiluminacin. Las caractersticas morfolgicas
distintivas de las clulas germinales, tal como se detecta mediante microscopa de
contraste de fase, son detallada. Aunque el mtodo descrito aqu genera
pequeas cantidades de clulas y por lo tanto no permite un mayor aislamiento de
los diferentes tipos de clulas que comprenden cada etapa de diferenciacin, las
aplicaciones de este mtodo son de gran alcance y diversa. Esto permite el
seguimiento de eventos de diferenciacin de espermatognesis, y en combinacin
con los anlisis bioqumicos, que permite la caracterizacin de los mecanismos
moleculares que regulan estos procesos. Este mtodo se puede utilizar para la
identificacin de los efectos de la citotxico y los factores ambientales en la
funcin reproductiva masculina, as como para el diagnstico rpido y completo y
la caracterizacin de los defectos de clulas de esperma atribuibles a la
infertilidad. En combinacin con los modelos de la orientacin de genes, permite la
caracterizacin de los factores crticos que participan en el ciclo celular, la

dinmica de la cromatina, la diferenciacin spermatid, biologa de clulas madre y


la fertilidad.

MATERIALES
REACTIVOS
de solucin salina tamponada con fosfato, pH 7,2-7,4 (PBS; Sigma Chemicals)
aceite de inmersin (Leica)
tampn fosfato salino, un tampn qumico ampliamente usado en biologa
(PBS por sus siglas en ingls. phosphate buffered saline)
EQUIPO
(2 pares) (World Precision Instruments) 0,05 mm x 0,01 mm pinzas de punta fina
0.015 mm x 0.015 mm tijeras de punta de microdiseccin y tijeras de diseccin
(Herramientas de Bellas Ciencia FST)
microscopio de contraste de fase y microscopio de diseccin (Leica)

PROTOCOLO
PROCEDIMIENTO
1 | sacrificar un ratn sexualmente maduros, extirpar los testculos y colocarlos en
una
placa
de
Petri
que
contiene
PBS.
Des encapsular el testculo y la transferencia de los tbulos seminferos a una
nueva
placa
de
Petri
que
contiene
PBS.
Pasos crticos
2 | Ver los tbulos sobre un microscopio de diseccin de transiluminacin. Con
unas pinzas finas, suavemente separe los tbulos, teniendo cuidado de no causar
daos
al
apretar
o
agitando
los
tbulos.
SOLUCIN DE PROBLEMAS
Figura 1 | asociaciones
celulares especficos que
definen las etapas del ciclo
del epitelio seminfero estn
presentes dentro de regiones
distintas que exhiben patrones
de absorcin de luz
diferenciales. En los ratones
hay 12 etapas designadas y
cada uno

Un
patrn
de
absorcin
de
la
luz
predecible se produce
cuando se observan
los
tbulos
seminferos bajo un
microscopio
de
diseccin
de

transiluminacin (Figura 1 lnea). Cuanto mayor es el nivel de condensacin de la


cromatina espermtica, mayor es la cantidad de luz absorbida, lo que resulta en la
aparicin diferencial de los segmentos tubulares segn la etapa de la
espermatognesis. Este patrn de absorcin de la luz se puede utilizar para aislar
las asociaciones celulares especficos durante la diferenciacin de clulas de
esperma.
3 | Determinar el patrn de absorcin de la luz e identificar el punto dbil (etapa
XII-I), el punto fuerte (etapa II-VI), la zona oscura (etapa VII-VIII) y la zona plida
(etapa IX-XI) (Fig. 1 , Tabla 1 y Figura complementario 1 lnea).
pasos crticos
Para piscinas etapa especfica de tbulos seminferos de ARN o protenas anlisis,
vase el recuadro 1.
4 | Cortar <0,5 mm pieza de la etapa de inters (complementario de vdeo 1 lnea).
Recoger el tbulo pieceof en un volumen de 15 l usando una pipeta. Transferir el
tbulo en un portaobjetos de vidrio. Con cuidado, colocar un cubreobjetos sobre el
tbulo.
Evitar
la
introduccin
de
burbujas
de
aire.
El cubreobjetos aplastar el tbulo y las clulas fluir (complementario Video 2 en
lnea). puede necesitar ser modificado para mejorar el acceso de los anticuerpos
frente al antgeno, en particular, en el estudio de las protenas nucleares (vase el
recuadro
2)
Este
procedimiento.
Para estudiar eventos moleculares y celulares durante una etapa especfica de la
diferenciacin de clulas germinales, se requiere un mtodo de estadificacin ms
precisa usando un microscopio de contraste de fase (Fig. 2).
CUADRO 1 PREPARACIN DE PISCINAS FASE ESPECFICA DE LA SEMINFEROS
TBULOS
para
el
anlisis
bioqumico
Los cortes de secciones secuenciales de 2 mm cada uno que comienza en el punto dbil.
Cuando una cantidad suficiente de tbulos se ha diseccionado, la transferencia de las piscinas
para crioviales y eliminar todo el exceso de PBS. Congelar los tbulos agrupados en nitrgeno
lquido y la transferencia a -80 C para el almacenamiento a largo plazo.
En nuestra experiencia, 5 cm en total de cada una de las etapas combinadas producirn
aproximadamente 5 mg de protena. La placa de Petri debe ser grabado al microscopio de
diseccin para evitar su movimiento y la mezcla de las piscinas etapas. Para mejorar la
precisin de corte de la longitud deseada de 2 mm de segmento, la cinta de una regla para la
placa de Petri para usar como una gua para el corte de los segmentos de 2 mm de tbulo.
Tambin es til para mantener un registro del nmero de segmentos de corte para cada etapa
agrupados para igualar las extracciones de protenas y RNA anlisis. Para confirmar que el
patrn de absorcin de la luz se ha identificado correctamente, los segmentos de tbulos
precedente y siguiente a la etapa deseada deberan ser examinados por el mtodo de la
calabaza (paso 4). Para facilitar la recogida de los tbulos agrupados en los crioviales es til
para ensanchar la boca de la punta de la pipeta mediante la reduccin de aproximadamente 1
cm desde el extremo. PBS pipeta hacia arriba y abajo un par de veces para mojar el interior de
5 | Toque uno de lalos
bordes
cubreobjetos
dedegradacin
filtro paradel
eliminar
el
punta
antes del
de recoger
el tbulo.con
Parapapel
evitar la
ARN o protena,
los tbulos
exceso de lquido
y
difundir
las
clulas
(complementario
Video
2
en
lnea).
agrupados deben recogerse dentro de no ms de 2 h despus de sacrificar el ratn.


pasos
crticos
6 | Se examinan las clulas con un microscopio de contraste de fases con el
objetivo de 40 aumentos. Identificar la etapa en la base de las asociaciones
celulares
y
caractersticas
morfolgicas.
Para un examen ms cuidadoso, utilice el objetivo 100x con aceite de inmersin.
pasos
crticos
SOLUCIN DE PROBLEMAS

Figura 2 | Ilustracin del procedimiento


experimental para el aislamiento de las
etapas de espermatognesis de ratn y las
mltiples aplicaciones de este mtodo.

7 | Despus de un
examen
con
un
microscopio, congelar la diapositiva
en nitrgeno lquido durante 20 s, y
quitar el cubreobjetos dndole
vuelta, con un escalpelo. Fijar las
clulas en 90% de etanol durante 2-5
minutos y luego secar al aire
(complementario Video 3 en lnea). Almacenar las diapositivas a 15-25 C si se
van a utilizar dentro de unas pocas semanas o lugar a -80 C para el
DElargo
LOS PREPARATIVOS
almacenamiento CUADRO 2 MODIFICACIN
a
plazo.DE SQUASH
mejorar el acceso de los anticuerpos frente a los antgenos su objetivo el
SOLUCIN DEPara
PROBLEMAS
paso 4 puede ser modificado de la siguiente manera: Cortar <0.5- mm pieza de
la etapa de inters y transferirlo a una nueva placa de Petri. Aadir 15 l de
sacarosa 100 mM a la tbulo. Liberar las clulas de los tbulos, ya sea por la
depilacin con pinzas aparte del tbulo o empujando las clulas desde el
tbulo como si el vaciado de una salchicha. Pipetear arriba y hacia abajo para
volver a suspender las clulas en la solucin de sacarosa. Transferir las clulas
a un portaobjetos de predipped en 1% de paraformaldehdo y 0,15% de TritonX. Secar los portaobjetos en una cmara hmeda y luego proceder
directamente a la inmunocitoqumica o congelar las diapositivas para su uso
posterior.
Si se desea la propagacin cromosoma, preincubar el tbulo en una solucin
hipotnica durante 30 min antes de aislar el segmento deseado.

TABLA 1 Caractersticas morfolgicas de las fases celulares especificas en la


espermatognesis.
Caractersticas
espermaticas del paso
1-12
Etapa I
Ninguna estructura
visible acrosmica
Cromatoide cuerpo
todava no se condensa
Etapa II
Complejo de Golgi
aparente, el cuerpo
cromatoide en el entorno
de Golgi.
Pequeas vesculas
acrosmicas redondas
bajo el complejo de
Golgi.
Etapa III
Muy similar a la Etapa 2,
pero grnulo acrosmica
aparente por primera
vez.
cromatoide
cuerpo
menudo presentes en las
muescas de la envoltura
nuclear.
Etapa IV
El sistema acrosmico
sigue en blanco y

flagelos delgada de paso


13
espermtidas
alargndose

Conjunto
de
fibras
densas
externas
resultantes de espesor
en los flagelos de la
etapa
14-15
espermtidas
alargndose Intermedio
espermatogonias.

Espermatogonia
intermedia.

ligeramente
aplanada
contra el ncleo.
Acrosoma
extendido
sobre el ncleo que
continua siendo blanco.
Cuerpo
cromatoide
aparente, se aleja del
complejo de Golgi.
Etapa
VI
Acrosoma ahora oscuro
y se extiende sobre el
ncleo en un ngulo de
95-120 .

etapa VII
Acrosoma cubre 120-150
de la circunferencia
nuclear.
etapa
VIII
Acrosoma abarca> 150
de
la
circunferencia
nuclear.
Ncleo hace contacto
con la superficie celular.

Etapa IX iniciacin de la
elongacin nuclear.

Etapa X forma de
gancho de la cabeza
ms
espermtica
prominente que en el
paso 9.
Etapa XI alargamiento
adicional de la cabeza
espermtica.
Inicio de la condensacin

Paso
15
paquetes
spermatid en proximidad
a los ncleos de clulas
de
Sertoli
tipo
B
espermatogonias.
Paquete
espermtico
inaparente.
Movimiento
de
las
espermatidas
alargdas
por la luz del epitelio de
tipo B.
Espermatogonias.
Paso 16 espermtidas ya
no est en manojos.
paquinemas
grandes.
espermatocitos
preleptoteno pequeos.
Step
16
spermatids
released
into
lumen
during.
stage
VIII
Large
pachytene
spermatocytes with fuzzy
chromatin
indicating
period of RNA synthesis.
Preleptotene/leptotene
spermatocytes.
pachytene
grandes.
espermatocitos leptotene
pequeo
pachytene
grandes.
espermatocitos
Leptoteno / zygotene.

las clulas ms grandes,


MI
espermatocitos
diplotene
espermatocitos

de la cromatina.
etapa
XII
Alargado ncleo con
condensacin
o
totalmente la cromatina
condensada.

zygotene.
clulas meiticas, tanto
la meiosis I y II,
diferenciables en base al
tamao.
espermatocitos
secundarios
muy
similares a la etapa 1
espermtidas pero ms
grandes.