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S PROXIMAL DE ALIMENTOS II: DETERMINAC

PADTEURIZADOR DE TUBOS PARA 100 ml

UNIVERSIDAD NACIONAL DEL SANTA

FACULTAD DE INGENIERIA
E.A.P. INGENIERIA AGROINDUSTRIAL
ASIGNATURA

: Anlisis Instrumental de Prod.

Agroind.

TEMA

: Determinacin de anlisis proximal

de alimentos II: determinacin de
protenas mtodo Kjeldahl

DOCENTE

: Ing. Gilbert Rodrguez Paucar

GRUPO

:A

INTEGRANTES
o Farfn Zapata Javier
o Orbegozo Mattos Antony
Nuevo Chimbote, 2016

PRCTICA 02

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PADTEURIZADOR DE TUBOS PARA 100 ml

DETERMINACIN DE ANLISIS PROXIMAL

DE ALIMENTOS II: DETERMINACIN DE
PROTENAS MTODO KJELDAHL
I.

INTRODUCCIN:

El anlisis quimico juega un papel importante, tanto en el establecimiento y

mantenimiento de la calidad de los alimentos, como en la industria. En un
inicio, los analistas de alimentos se preocupaban principalmente por la
adulteracin, mientras que en la actualidad, el trabajo de rutina se refiere a
mtodos de analisis y al estudio de aditivos y contaminantes. Los mtodos o
tcnicas utilizadas pueden variar de acuerdo al alimento que se analiza. Es
importante sealar que el analisis nos lleva a determinar la calidad de un
producto alimenticio, por lo cual es necesario conocer las tnicas y mtodos;
adems, para obtener buenos resultados analiticos es necesario llevar a cabo
una buena preparacin de la muestra, por lo que hay que considerar que los
trabajadores del laboratorio deben tener una buena apreciacion de muestreo,
analisis estadistico y de criterios de calidad, asi como una buena comprensin
de los resultado obtenidos.
Los principales componentes de mayor importancia a analizar en un alimento
son: humedad, grasa, protenas, cenizas y carbohidratos. Aunque existen otros
tipos de anlisis, como es la determinacin de protenas por el mtodo de
KJELDAHL. (SKOOG, Douglas. WEST, Donald)
El contenido protenico de los alimentos puede determinarse por medio de
diversos mtodos. La forma ms habitual es su cuantificacin de forma
indirecta y aproximada, bien a partir del contenido en nitrgeno de la muestra, o
bien deduciendo su cantidad a partir del contenido de uno o dos aminocidos
particulares que conforman la protena, fciles de identificar y de cuantificar por
su reactividad qumica especfica. Este segundo procedimiento conlleva una
mayor inexactitud. Desde hace ms de 100 aos se est utilizando el mtodo
Kjeldahl para la determinacin del nitrgeno en una amplia gama de muestras
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(alimentos y bebidas, piensos, forrajes, fertilizantes) para el clculo del

contenido en protena.
Tambin se utiliza el mtodo Kjeldahl para la determinacin de nitrgeno en
aguas residuales y suelos. Es un mtodo oficial descrito en mltiples
normativas: AOAC, USEPA, ISO, Farmacopeas y distintas Directivas
Comunitarias. La convencin general, sobreentendida, es que la totalidad del
nitrgeno de la muestra est en forma proteica, aun cuando la realidad es que,
segn la naturaleza del producto, una fraccin considerable del nitrgeno
procede de otros compuestos nitrogenados (bases pricas y pirimdicas,
creatina y creatinina, urea, amoniaco, etc.), por ello se denomina protena
bruta o protena total a la obtenida por este mtodo.
Con este anlisis, sin embargo, no se determina el nitrgeno ntrico, el
cianhdrico, el de la hidracina, el de grupos azo y el nitrgeno de un ncleo
cclico. ( www.alfinal.com/nutricion/alimentaciongrasosa.php)

II.

OBJETIVOS:
Determinar el porcentaje de nitrgeno presente en la muestra para luego
ser transformado en porcentaje de protena a travs de un factor de
conversin.

III.

FUNDAMENTO TERICO:

III.1. HISTORIA:
En 1883 el investigador dans Johan Kjeldahl desarroll el mtodo ms usado
en la actualidad para el anlisis de protenas (mtodo Kjeldahl) mediante la
determinacin del nitrgeno orgnico. En esta tcnica se digieren las protenas
y otros componentes orgnicos de los alimentos en una mezcla con cido
sulfrico en presencia de catalizadores. El nitrgeno orgnico total se convierte
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mediante esta digestin en sulfato de amonio. La mezcla digerida se neutraliza

con una base y se destila posteriormente. El destilado se recoge en una
solucin de cido brico. Los aniones del borato as formado se titulan con HCl
(o H2SO4) estandarizado para determinar

el nitrgeno contenido en la

muestra.
El resultado del anlisis es una buena aproximacin del contenido de protena
cruda del alimento ya que el nitrgeno tambin proviene de componentes no
proteicos. (www.alimentacionsana.com. /actualizaciones)
El mtodo Kjeldahl ha sufrido varias modificaciones. Originalmente se utiliz
permanganato de potasio para llevar a cabo el proceso de oxidacin
(digestin), sin embargo, los resultados no fueron satisfactorios, de manera que
este reactivo se descart. En 1885 Wilforth encontr que se poda acelerar la
digestin utilizando cido sulfrico y aadiendo un catalizador. Gunning en
1889 propuso aadir sulfato de potasio que eleva el punto de ebullicin del
cido sulfrico utilizado en la digestin para disminuir el tiempo de la reaccin.
En la actualidad se utiliza principalmente sulfato de cobre pentahidratado
CuSO4.5H2O como catalizador. (Nielsen, S.S. 1994)
III.2. MTODO DE KJELDAHL:
III.2.1. Definicin:
El mtodo Kjeldahl mide el contenido en nitrgeno de una muestra. El
contenido en protena se puede calcular seguidamente, presuponiendo una
proporcin entre la protena y el nitrgeno para el alimento especfico que est
siendo analizando
En el trabajo de rutina se determina mucho ms frecuentemente la protena
total que las protenas o aminocidos individuales. En general, el procedimiento
de referencia Kjeldahl determina la materia nitrogenada total, que incluye tanto
las no protenas como las protenas verdaderas. El mtodo se basa en la
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determinacin de la cantidad de nitrgeno orgnico contenido en productos

alimentarios, compromete dos pasos consecutivos:
a) La descomposicin de la materia orgnica bajo calentamiento en
presencia de cido sulfrico concentrado.
b) El registro de la cantidad de amoniaco obtenida de la muestra
Durante

el

proceso

de

descomposicin

ocurre

la

deshidratacin

carbonizacin de la materia orgnica combinada con la oxidacin de carbono a

dixido de carbono. El nitrgeno orgnico es transformado a amoniaco que se
retiene en la disolucin como sulfato de amonio. La recuperacin del nitrgeno
y velocidad del proceso pueden ser incrementados adicionando sales que
abaten la temperatura de descomposicin (sulfato de potasio) o por la adicin
de oxidantes (perxido de hidrgeno, tetracloruro, persulfatos o cido crmico)
y por la adicin de un catalizador. (Nollet, 1996).

III.2.2.

Etapas del mtodo de kjeldahl:

El mtodo consta de tres etapas: DIGESTIN-DESTILACIN-TITULACIN.

a) Etapa de digestin: un tratamiento con cido sulfrico concentrado, en
presencia de un catalizador y ebullicin convierte el nitrgeno orgnico en
in amonio, segn la ecuacin 1.

Procedimiento: Se introducen de 1 a 5 g de muestra un tubo de mineralizacin

y se ponen 3 g de catalizador que suele estar constituido por una mezcla de
sales de cobre, xido de titanio y/o xido de selenio. De forma habitual se
utiliza como catalizador una mezcla de K2SO4: CuSO4: Se (10:1:0,1 en peso).
Despus se adicionan 10 ml de H2SO4 concentrado y 5 ml de H2O2.
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Posteriormente se digiere a 420 C durante un tiempo que depende de la

cantidad y tipo de muestra. Se sabe que la digestin ha terminado porque la
disolucin adquiere un color verde esmeralda caracterstico. En esta etapa, el
nitrgeno proteico es transformado en sulfato de amonio por accin del cido
sulfrico en caliente. En la actualidad, para llevar a cabo este proceso se
utilizan digestores automticos que son capaces de digerir un nmero
determinado de muestras al mismo tiempo (imagen 1).

b) Etapa de destilacin (imagen 2): se alcaliniza la muestra digerida y el

nitrgeno se desprende en forma de amoniaco (ecuacin 2). El amoniaco
destilado se recoge sobre un exceso desconocido de cido brico
(ecuacin 3).

Procedimiento: Despus de enfriar se adicionan al tubo de digestin 50 ml de

agua destilada, se pone en el soporte del destilador y se adiciona una cantidad
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suficiente de hidrxido sdico 10 N, en cantidad suficiente (50 ml aprox.) para

alcalinizar fuertemente el medio y as desplazar el amoniaco de las sales
amnicas. El amoniaco liberado es arrastrado por el vapor de agua inyectado
en el contenido del tubo durante la destilacin, y se recoge sobre una
disolucin de cido brico (al 4 % p/v).

El procedimiento a seguir es diferente en funcin de si en la etapa de

destilacin el nitrgeno liberado es recogido sobre una disolucin de
cido brico o sobre un exceso conocido de cido clorhdrico o sulfrico
patrn. Ello condicionar la forma de realizar la siguiente etapa de
valoracin, as como los reactivos empleados.
c) Etapa de valoracin: La cuantificacin del nitrgeno amoniacal se realiza
por medio de una volumetra cido-base del in borato formato,
empleando cido clorhdrico o sulfrico y como indicador una disolucin
alcohlica de una mezcla de rojo de metilo y azul de metileno (ecuacin 4).
Los equivalentes de cido consumidos corresponden a los equivalentes de
amoniaco destilados. (Nielsen, S.S. 1994)

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III.2.3.

APLICACIONES:

Se aplica en una amplia variedad de trabajos para los anlisis de alimentos,

bebidas, piensos, grano, carnes, aguas residuales, suelos para cultivos y otros.
Hoy por hoy es el mtodo ms usado para el anlisis de protenas y se efecta
mediante la determinacin de nitrgeno orgnico. Esto es as porque los
diferentes tipos de protenas coinciden todas ellas en una proporcin similar de
dicho nitrgeno orgnico.
III.2.4.

CLCULOS:

De la valoracin se puede calcular el nmero de equivalentes de nitrgeno

recogidos, y con ste dato se obtiene el porcentaje de nitrgeno en la muestra.
Para calcular el porcentaje de protena basta con multiplicar por un factor de
conversin el % de nitrgeno calculado. Este factor de conversin est
tabulado para cada grupo de alimentos.
Tabla 1: se recogen los factores para algunos alimentos.

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III.2.5. VENTAJAS Y DESVENTAJAS DEL MTODO:

A. VENTAJAS:
Apropiado para varios tipos de productos.
Alta fiabilidad.
Usado como mtodo de referencia.
B. DESVENTAJAS:
Interfieren compuestos nitrogenados no proteicos.
Uso de catalizadores txicos o caros.
Eleccin del factor de conversin.
III.3. OTROS MTODOS UTILIZADOS:
III.3.1. Mtodo de Dumas
Se caracteriza por pirlisis completa de la muestra y medicin del contenido de
nitrgeno de los gases de combustin. El nitrgeno puede ser medido con
manmetro despus de absorber el dixido de carbono en una solucin
alcalina o por conductividad trmica en mtodos automatizados.
A. VENTAJAS:
Muestra equivalencias satisfactorias al compararlo con el mtodo de
Kjeldahl en anlisis de forrajes y alimentos infantiles, aunque con
valores levemente mayores.
B. DESVENTAJAS:
Incluye nitrgeno inorgnico.
Requiere pequeas cantidades de muestra 5-50 mg, finamente
dividida y homognea para minimizar el error de muestreo. Este
mtodo no puede aplicarse a material hmedo por lo que debe
efectuarse un secado previo. (Ranganna, S. 1977)

III.3.2.

Mtodo de Biuret

La reaccin se caracteriza por una coloracin prpura cuando los iones

cpricos son complejados por los enlaces peptdicos a pH alcalino. El matiz del
color depende del tipo de protena y su intensidad depende del contenido de
protena presente.
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A. REACTIVO UTILIZADO
Solucin alcalina conteniendo iones cpricos complejados con tartrato de sodio
y potasio.
B. LECTURA
550 nm, a 263 nm se aumenta la sensibilidad en 10 veces.
C. DESVENTAJA
Se ha encontrado poca aplicacin en anlisis de alimentos debido a la
presencia de interferentes como azcares reductores que reducen el ion
cprico en medio alcalino produciendo resultados insatisfactorios.
Ejemplo: leche.
III.3.3.

(Ranganna, S. 1977)

Mtodo "dye-binding"

Se caracteriza por la formacin de un cogulo de protena coloreado e

insoluble producto de la reaccin de la protena con una solucin coloreada de
cido sulfnico a pH 2. El anin coloreado se une por asociaciones
electrostticas a los sitios bsicos de la protena, por ejemplo a los grupos
Mamino de lisina, guanidina de arginina, imidazol de histidina y aminos
terminales.

Adems

se

producen

atracciones

intermoleculares

por

interacciones hidrofbicas entre la protena y la mitad no inica del anin y

entre el anin unido a protena y la mitad no inica del anin en solucin. El
cogulo se separa por filtracin y se mide colorimtricamente el exceso de
tintura en el sobrenadante. Esta medida se relaciona con el contenido de
protena.
A. LECTURA A
595 nm
B. CONSIDERACIONES
El mtodo es emprico por lo que se debe buscar la concentracin de tintura
ideal que sature la protena y forme el cogulo pero que no pierda sensibilidad.
C. VENTAJAS
til en anlisis de rutina de muestras similares.
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Econmico y rpido.
Preciso como el mtodo de Kjeldhal.
Usado como mtodo de referencia.
D. DESVENTAJAS
Dificultad en encontrar tinturas puras.
Desuniformidad en la calidad de las tinturas de un lote de fabricacin
a otro, por lo que se require la calibracin del mtodo con cada lote.
No es aplicable a alimentos que varen su contenido en grupos
aminos (protelisis, pardeamiento). (PEARSON. D)
III.3.4.

Mtodo de destilacin alcalina

La hidrlisis de las amidas en medio alcalino fuerte da origen a amonaco el

cual es destilado y su valor es relacionado con el contenido de protena. Se ha
encontrado que el rendimiento de amonio es altamente reproducible para una
protena dada.
III.3.5.

Mtodo de Lowry

Cuando se agrega reactivo de Folin a una protena, sta se reduce a un

complejo azul de molibdeno por la oxidacin de los aminocidos tirosina,
triptfano, cistina, cisterna e histidina.

A. REACTIVO
cido fosfomolbdico-fosfotngstico
B. Lectura A
750 nm
C. Ventajas
Alta sensibilidad y simple de operar.
D. Desventajas
La respuesta del color vara de acuerdo al tipo de protena.
La intensidad del color no es estrictamente proporcional a la
concentracin de protena.
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Los iones potasio, magnesio, EDTA e hidratos de carbono interfieren

en la reaccin.
III.3.6.

Mtodo de titulacin con formol

A la muestra neutralizada con lcali se le agrega formaldehido en exceso el

cual reacciona con cada grupo bsico de lisina y arginina. El exceso de
formaldehido se neutraliza con un exceso de lcali estndar el cual se titula, y
se relaciona con el contenido de protena.
A. Desventaja
Su reproducibilidad es menor a la de otros mtodos alternativos.
(ROBERTSON, J.A., Monredon, F.D)

IV.

MATERIALES:

FIG.01: Equipo Kjendhal

FIG.02: Balanza Analtica

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FIG.03: Vaso Precipitado

FIG.04: Ac. Sulfrico

FIG.05: Catalizadores

V.

PROCEDIMIENTO:

PRUEBA DE KJELDALH
El mtodo consta de 3 etapas:
Hervir
Hervir muestra en una
concentracin de

METODO DE ARRASTE
DE VAPOR DE AGUA.

DIGESTIN

DESTILACIN

TITULACIN
DESTILACIN.
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Descomposicin del
nitrgeno de la

Liberacin de

Valorar la cantidad de
nitrgeno.

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Imagen N02:Solucin de
sulfato de amonio.

Imagen N01:Maquina de
Digestin de Kjendalh

catalizadores
(1) n - C -NH2 + mH2SO4 CO2 + (NH4)2 SO4 + SO2
protena
calor
DESTILACIN.

La destilacin con vapor de agua acelera la

obtencin de destilado.

(2) (NH4)2SO4 + 2 NaOH 2NH3 +

Na2SO4+ 2H2O
(3) NH3 + H3BO3 (cido brico)
NH4 + H2BO3- (in borato)

Imagen N03:Maquina
de destilacin de
Kjendalh.
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TITULACIN.

Imagen N04:Maquina
de titulacin.
DIGESTIN

1gr de pescado trozo

(enlatado)
Juntos con los
catalizadores de
kjendalh

PESAR
En 1 de los 6 tubos para
el proceso de la
COLOCAR

COLOCAR
Tiempo: 1 2 horas
aproximadamente.
REALIZACION

RESULTADO 1

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Los tubos en el Bloc

Digest.
Digestin (Combustin)
a una T de 350 400

Muestra: Color verde

Brocella.

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TITULACIN

Hasta que vire

COLOR GRIS CLARO

VALORAR

RESULTADOS.

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0.1N de
AcidoClorhidrico.

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INSTRUMENTO DE
TITULACIN

GASTO DE LA SOLUCION
DE ACIDO CLORHIDRICO
0.1N

RESULTADOS:

Porcentaje de Protenas en Harina de Pescado

La Tabla 1 muestra los datos obtenidos por 8 personas para determinar el
porcentaje de protenas en la harina de pescado especialmente escogidas, y
tambin el promedio de todas ellas.

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En la figura 1 se mostrara la grfica representada por las coordenadas

obtenidas por las 8 personas donde podremos apreciar la variacin que existe
entre los datos de estas personas, tambin una recta de linealizacin.
alumno
Dania
Bryan
Judith
Greka
Jaime
Neyser
Guiliana
Seleny
promedi
o

ml
cdigo
muestra
15100288
70.53
15100382
1.72
15100273
76.00
15100257
75.73
011------44.40
15100348
54.46
015100264.90
15100291
83.47

%N
9.820
0.233
10.580
10.510
6.160
7.650

%pro
61.360
1.426
66.125
65.680
38.500
47.860

9.080
11.613

56.730
72.579

8.206

51.283

58.90

80.000
70.000
60.000
50.000
40.000

Linear ()

30.000
20.000
10.000
0.000
1

Figura 1. Grafica del porcentaje de protenas en la harina de pescado.

VI.

DISCUSIONES:

Segn R.S. KIRK, R.SAWYER. H.EGAN (1996). El mtodo Kjeldahl an

sigue siendo las tcnicas ms confiables para la determinacin de
nitrgeno orgnico. Este mtodo se basa en la combustin en hmedo
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de la muestra por calentamiento con cido sulfrico concentrado en

presencia de catalizadores metlicos y de otro tipo para reducir el
nitrgeno orgnico de la muestra hasta amoniaco, el cual queda en
solucin en forma de sulfato de amonio. El digerido, una vez
alcalinizado, se destila directamente o por arrastre con vapor para
desprender el amoniaco, el cual es atrapado y luego se titula.

Las protenas son necesarias para la formacin y renovacin de los

tejidos. Los organismos que estn en perodo de crecimiento necesitan
un adecuado suministro de protenas para su aumento de peso. Los
organismos adultos que tienen su peso estabilizado estn en equilibrio
dinmico, en el que sus protenas se degradan y se regeneran
continuamente, aunque su composicin permanece constante. Para ello
debe existir en la dieta un suministro regular y continuo de protenas.
Las carnes rojas tienen ms contenido de protenas aproximadamente
21,3 gr. de protena por cada 100gr. de carnea diferencia de la carne de
pollo que solo contiene 18,2gr por cada 100gr. de su carne (tablas de
composicin de alimentos, 1996).

Procedimiento De Kjeldahl
El mtodo para determinar el contenido de protena en la carne se basa
en la destruccin de la materia orgnica con cido sulfrico concentrado,
formndose sulfato de amonio que en exceso de hidrxido de sodio
libera amonaco, el que se destila recibindolo en:
a) cido sulfrico donde se forma sulfato de amonio y el exceso de
cido es valorado con hidrxido de sodio en presencia de rojo de
metilo, o
b) cido brico formndose borato de amonio el que se valora con
cido clorhdrico.

Segn Nielsen (1994) recomend el uso de una mezcla de sulfato de

cobre (II) y bixido de titanio para este mtodo de reconocimiento de
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protenas. A pesar de ello, Wall y Gehrke (1975) consideraron que esta

mezcla es menos efectiva.

Segn CROWE, (2001) Tambin se ha conseguido reducir el tiempo de

digestin por adicin de sulfato de sodio o de potasio que elevan la
temperatura de digestin. Los catalizadores metlicos se pueden
obtener en forma de tableta muy convenientes, compuestas en una base
de sulfato de potasio. han informado que la adicin de perxido de
hidrgeno acelera significativamente la digestin y disminuye la
formacin de espuma.

Segn ROBERTSON, (1974) us esta tcnica empleando el aparato de

destilacin de Kjeldahl para la determinacin de protenas en trigo y
cebada. Se han empleado muchos catalizadores. Se ha considerado
que el ms efectivo es el mercurio en forma de xido mercrico; as
como el selenio, que es casi tan efectivo como aqul, pero ambos tienen
riesgos txicos y problemas para desecharlos. Adems, el mercurio
forma complejos con el amonaco

Como catalizador se utiliza CuSO4, puede usarse sales de Hg, Zr, Se,
pero stos dos ltimos son muy caros y el Hg es txico. El K2SO4 sirve
como elevador de la temperatura de ebullicin (no es catalizador), por
cada 10 C de elevacin de la temperatura, la velocidad de la reaccin
se duplica.

El ataque finaliza cuando la solucin se torna de un color verdeesmeralda lmpido. En este proceso de digestin o ataque de la muestra,
se libera en la digestin la grasa, fibra, carbohidratos presentes en la
muestra en forma de CO2; la parte oxigenada de la protena tambin se
libera, slo queda la parte nitrogenada de la protena. Al final del ataque,
se tiene en la solucin H2SO4 sobrante, sales sulfatadas de los
minerales

disueltas,

el

(www.alimentacionsana.com)
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sulfato

de

amonio.

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VII. CONCLUSIONES:

Los resultados por si mismos no resultan concluyentes para determinar

el porcentaje de protenas en las muestras debido al alto error obtenido
con los resultados.

Se concluy que este mtodo al medir el nitrgeno que queda del

compuesto no solo mide el nitrgeno orgnico de la muestra sino el
nitrgeno total, generando as un cierto margen de error en la obtencin
final del contenido de protenas total en la muestra.

Se determin que para una determinacin ms exacta de protenas en la

muestra, el nitrgeno debe formar parte de grupos amida o amina, que
se convierten en ion amonio y que son retenidos como tal en el cido
sulfrico; pero si el nitrgeno est presente en formas ms oxidadas
como en grupos nitro, azo o azoxi, esto llevara a prdidas del elemento
ya que este producto estara constituido parcialmente por nitrgeno
elemental(xidos de nitrgeno); por lo que se debe tomar una
precaucin agregando tiosulfato de sodio y cido saliclico que ayudan a
una pre reduccin en la digestin.

VIII. BIBLIOGRAFA:
SKOOG, Douglas. WEST, Donald. HOLLER, James. Qumica Analtica.
Sexta edicin. McGraw-Hill.
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PADTEURIZADOR DE TUBOS PARA 100 ml

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