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SNDROME REPRODUCTIVO Y
RESPIRATORIO PORCINO
RESUMEN
El sndrome reproductivo y respiratorio porcino (SRRP) se caracteriza por defectos en la
reproduccin de las cerdas y problemas respiratorios de los lechones y cerdos en etapas
posteriores de crecimiento. La enfermedad est causada por el virus SRRP, un virus clasificado
actualmente como miembro del nuevo orden establecido de los Nidovirales, familia Arteriviridae,
gnero Arterivirus. La diana celular primaria de los virus son los macrfagos alveolares de los
cerdos. Existen dos tipos antignicos principales, el tipo europeo y el tipo americano.
Actualmente el virus del SRRP se encuentra distribuido en la mayor parte del mundo donde existe
produccin intensiva de cerdos. El fallo reproductivo se caracteriza por infertilidad, momificacin
fetal, abortos, nacidos muertos, y el nacimiento de cras dbiles que a menudo mueren al nacer por
trastornos respiratorios e infecciones secundarias. Los cerdos adultos pueden mostrar signos
ligeros de enfermedad respiratoria, a veces complicada por infecciones secundarias. El SRRP no
parece afectar a otras especies animales, slo a cerdos.
Identificacin del agente: El diagnstico de la infeccin vrica del SRRP es difcil; el virus puede
aislarse de cerdos afectados a partir de tejidos tales como suero o lquido asctico, o de muestras
de rganos, como pulmones, amgdalas, ganglios linfticos y bazo. Para el aislamiento del virus se
recomiendan el uso de macrfagos alveolares porcinos porque constituyen el sistema de cultivo
ms susceptible para los virus de ambos tipos antignicos. Tambin son adecuadas las clulas
MARC145 (clon MA104). Existe variabilidad entre grupos de macrfagos en cuanto a su
susceptibilidad frente al virus del SRRP. Por tanto, es necesario identificar un grupo con elevada
susceptibilidad, y conservar esta cepa en nitrgeno lquido hasta su uso. El virus se identifica y
caracteriza por inmunotincin con antisueros especficos. Se han desarrollado tcnicas
adicionales, como la tcnica inmunohistoqumica e hibridacin in situ sobre tejidos fijados y la
transcripcin inversa mediante la reaccin en cadena de la polimerasa para la confirmacin en el
laboratorio de la infeccin por el virus del SRRP.
Pruebas serolgicas: Hoy en da se dispone de un amplio rango de pruebas serolgicas para la
deteccin en suero de anticuerpos frente al virus del SRRP. La tcnica de la inmunoperoxidasa en
monocapa emplea macrfagos alveolares y la tcnica de inmunofluorescencia indirecta utiliza
clulas MARC145 que se infectan normalmente con el tipo antignico viral europeo o el
americano, respectivamente. Sin embargo, ambas tcnicas pueden ser diseadas con ambos tipos
de virus del SRRP. En la actualidad se usan frecuentemente tcnicas inmunoenzimticas (ELISA)
unidas a enzimas comercializados o propias. Se dispone de un ELISA comercial especfico para
ambos tipos de virus, europeo y americano. Se han descrito ensayos de tipo ELISA indirecto,
ELISA de bloqueo y ELISA doble, que permiten distinguir entre los tipos europeo y americano.
Requisitos para las vacunas y los materiales de diagnstico: Las vacunas pueden ser de gran
ayuda en la prevencin de las formas reproductiva y respiratoria del SRRP. Las vacunas vivas
modificadas no son adecuadas para su uso en hembras gestantes, cerdas jvenes y verracos. La
vacunacin puede dar lugar a la eliminacin del virus vacunal en el semen. Las vacunas de virus
vivos modificados pueden persistir en animales vacunados y se ha descrito la transmisin potencial
a animales no vacunados y la consiguiente enfermedad inducida por el virus vacunal.
862
A. INTRODUCCIN
El sndrome reproductivo y respiratorio porcino (SRRP) se caracteriza por defectos en la reproduccin de las
cerdas y crisis respiratorias de los lechones y cerdos en crecimiento (3, 17, 37) y es causa significativa de
prdidas econmicas. La enfermedad fue detectada por primera vez en 1987 en los Estados Unidos de Amrica
(USA), donde fue conocida al principio como la enfermedad porcina misteriosa, debido a la naturaleza elusiva de
su agente causal, pero ms tarde fue denominada sndrome respiratorio y de infertilidad porcino. Durante el
invierno de 19901991 la enfermedad apareci en Europa Occidental, donde se extendi rpidamente y adquiri
muchos ms nombres, incluyendo Seuchenhafter Sptabort der Schweine, Abortus blauw, enfermedad azul
espigada porcina, sndrome dysgnsique et respiratoire du porc, y sndrome respiratorio y aborto epidmico
porcino (10, 13, 48). A lo largo de este captulo, se emplear el nombre de SRRP para denominar esta
enfermedad; este es el nombre ms ampliamente aceptado por la comunidad veterinaria internacional.
El virus del SRRP (PRRSV), el agente etiolgico del SRRP, se clasifica en la actualidad como miembro del orden
Nidovirales, familia Arteriviridae, gnero Arterivirus (7). Para su multiplicacin, tanto in vivo como in vitro, se
emplean preferiblemente macrfagos alveolares porcinos. El virus presenta envuelta, contiene ARN con
polaridad de mensajero y un dimetro de 5070 nm. Se ha determinado la secuencia genmica del virus (14, 34),
y el ARN vrico es de aproximadamente 15 kb de longitud y codifica ocho marcos de lectura abierta (ORF). Se
han identificado tres protenas estructurales principales: una protena de la nucleocpsida (N; ORF 7) de 1415
kDa, una protena de membrana (M; ORF 6) de 1819 kDa, y una glicoprotena de envuelta (E; ORF 5) de 2425
kDa. Otras tres glicoprotenas estructurales menos abundantes estn codificadas por las ORFs 4, 3, y 2 (38). Se
han preparado anticuerpos monoclonales tanto contra las protenas estructurales mayoritarias como minoritarias
(15, 19, 32, 35, 43, 46, 50). Las cepas virales europeas estn antignicamente muy relacionadas entre s, y ms
alejadas de las correspondientes cepas americanas (4, 47). A su vez, la relacin antignica de stas ltimas
entre s tambin es muy estrecha. Se ha detectado la presencia del SRRP en varios pases de Asia y unos pocos
pases de Sudamrica. Australia, Nueva Zelanda, Suecia y Suiza se encuentran libres de SRRP.
Se han publicado revisiones acerca de las manifestaciones clnicas detalladas y de las lesiones provocadas por
la infeccin por el PRRSV en cerdos de diferentes grupos de edad (3, 17, 37). En resumen, los cerdos
neonatales infectados por el PRRSV muestran disnea (dificultad respiratoria), pero tambin una variedad de
otros sntomas tales como conjuntivitis, fiebre, aspereza de pelo, anorexia, diarrea, temblores, eritema cutneo,
edema de prpados y mortalidad, que puede llegar a ser elevada. En cerdos destetados y en crecimiento, se ha
observado fiebre, neumona, defectos en el desarrollo y un incremento en la mortalidad por infecciones
bacterianas simultneas. Las infecciones subclnicas son ms comunes en cerdos en fase de acabado, verracos
y cerdas de reposicin. La fiebre transitoria y la inapetencia pueden llegar a ser habituales. Se ha descrito que en
verracos infectados con el PRRSV y en los vacunados con la vacuna viva atenuada, el PRRSV puede aparecer
en el semen, lo que puede provocar cambios en la morfologa y funcin del esperma. Existen datos de mortalidad
asociada con la infeccin por el PRRSV en cerdos adultos. Recientemente se ha descrito una forma virulenta de
SRRP: sndrome de mortalidad y aborto de cerdas (SAMS). La enfermedad reproductiva se conoce bastante
bien. Varios grupos de investigacin han demostrado repetidamente que existe una relacin causal entre la
infeccin por el PRRSV y los defectos de reproduccin en las piaras de crianza, y la enfermedad ha podido ser
reproducida experimentalmente. Las infecciones en el ltimo tercio del periodo de gestacin parecen causar los
problemas principales, consistentes en abortos al final de la gestacin con fetos momificados y en nacimientos
de lechones muertos o tan dbiles que mueren tras su alumbramiento (13, 48). No est claro si las infecciones
en las primeras etapas de gestacin pueden causar fallos reproductivos o problemas en la recra. Existen
algunas evidencias, aunque escasas, de varios aislados con diferente grado de virulencia reproductiva; en
algunos pases se ha detectado la existencia de cepas que causan infeccin transplacental, sin efectos
destructivos en los fetos.
La importancia de la infeccin respiratoria es menos conocida. Ha sido difcil reproducir constantemente la
enfermedad respiratoria con el virus solo y tambin ha sido difcil demostrar experimentalmente en cerdos el
incremento en la susceptibilidad a infecciones bacterianas atribuida a la infeccin por el PRRSV. Algunos
estudios han descrito diferencias en la gravedad de los sntomas clnicos y en lesiones microscpicas y
macroscpicas tras la inoculacin experimental de cerdos con diferentes aislados PRRSV (22, 23). Tal
predisposicin del PRRSV a exacerbar otras enfermedades es actualmente un tema tpico de estudio de varios
grupos de investigacin, y aunque parece que el virus podra agravar algunas infecciones secundarias, no son
del todo conocidos sus posibles mecanismos.
Las lesiones microscpicas y macroscpicas consecuencia de la infeccin por el PRRSV se observan
principalmente en cerdos recin nacidos y lactantes. En cerdos adultos, las lesiones pueden ser similares pero
menos marcadas. Las lesiones macroscpicas asociadas con el PRRSV varan. Las lesiones de pulmn varan
desde ninguna a una apariencia difusa, y se complican habitualmente por infecciones bacterianas coincidentes.
Los ganglios linfticos afectados, ms comnmente en cerdos jvenes, pueden aumentar significativamente de
tamao. Las lesiones microscpicas, bastante inespecficas, habitualmente afectan al pulmn y al tejido linfoide.
Las lesiones de pulmn se caracterizan por neumona intersticial multifocal que muestra infiltracin de clulas
mononucleares en los septos alveolares, hipertrofia e hiperplasia neumoctica de tipo 2, y una marcada
863
acumulacin de exudado alveolar necrtico e inflamatorio. Los ganglios linfticos muestran hiperplasia folicular,
focos de necrosis folicular y residuos en los folculos. Adems, se han descrito lesiones vasculares, cardiacas y
cerebrales. Las lesiones fetales observadas sin consecuencia, se caracterizan por vasculitis, miocarditis y
encefalitis. Es importante sealar que la infeccin por PRRSV es solamente un agente infeccioso que se ha
asociado con neumona intersticial en cerdos. El sndrome del adelgazamiento postdestete asociado con la
infeccin por circovirus porcino de tipo 2 est actualmente relacionado con neumona intersticial y linfoadenitis en
cerdos.
En general, los anticuerpos parecen poseer un valor protector limitado. Los cerdos infectados pueden
permanecer virmicos durante 46 semanas despus de la infeccin, y pueden transmitir el virus a otros cerdos.
No se sabe si los anticuerpos maternales pueden proteger contra infecciones tempranas, pero se puede detectar
viremia de la semana 4 en adelante en cerdos nacidos a partir de hembras seropositivas. Sin embargo, se ha
observado un cierto nivel de proteccin en lechones con anticuerpos maternos, y la elevacin en los ttulos de
anticuerpos neutralizantes se corresponde a menudo con un descenso en los ttulos virales de la sangre.
Adems, las hembras infectadas por segunda vez no muestran defectos reproductivos recurrentes. En pocas
palabras, la relacin entre ttulos de anticuerpos y proteccin no se entiende muy bien. La inmunidad mediada
por clulas no se ha estudiado ampliamente pero se piensa que ejerce un papel protector. La infeccin por
PRRSV, sin embargo, parece provocar una dbil respuesta inmune celular adaptativa. Un aspecto intrigante de
la infeccin por PRRSV es la duracin prolongada de viremia y la consiguiente transmisin de los virus por
contacto a animales, en comparacin con otras infecciones virales. Los virus desaparecen de la circulacin con
el tiempo, pero se mantiene una infeccin persistente en los tejidos linfoides. Sin embargo, en general se est de
acuerdo en que la infeccin no parece perdurar toda la vida.
B. TCNICAS DE DIAGNSTICO
1.
El diagnstico virolgico del SRRP es difcil. Ello es debido, principalmente, a que las clulas elegidas para aislar
el virus son los macrfagos alveolares porcinos, que debe extraerse de cerdos (preferentemente libres de
patgenos especficos [SPF]) de menos de 68 semanas de vida (48, 51). No todos los laboratorios disponen de
un suministro adecuado de este tipo de cerdos y las lneas celulares continuas no pueden reemplazar
correctamente a los macrfagos alveolares porque aquellas son generalmente menos susceptibles al virus.
Adems, no todos los cultivos de macrfagos son igualmente susceptibles al virus; se desconoce la razn de
esto, pero es necesario probar cada cultivo antes de su uso.
Ciertas lneas celulares de rin de mono (p. ej. MA104) pueden reemplazar correctamente a los macrfagos
pero estas lneas celulares no permiten la multiplicacin de todos los aislados, particularmente de las cepas
europeas. Este captulo, por tanto, slo describe el aislamiento de virus con macrfagos alveolares. Se han
desarrollado tcnicas de inmunohistoqumica e inmunofluorescencia para detectar el antgeno del PRRSV en
tejidos. Estas pruebas son ms rpidas que el aislamiento de los virus y no necesitan la infraestructura de los
cultivos celulares. Adems, la tcnica inmunohistoqumica (21, 28) empleando tejidos fijados con formalina hace
posible la visualizacin del antgeno junto con las lesiones histolgicas y permite el anlisis comparativo
retrospectivo con especmenes de archivo. Tambin se ha descrito la hibridacin in situ, capaz de detectar y
diferenciar los genotipos PRRSV norteamericano y europeo en tejidos fijados con formalina (29, 41). La
transcripcin inversa mediante la reaccin en cadena de la polimerasa (RTPCR) y la PCR combinada son
pruebas muy sensibles para detectar el ARN vrico (12, 27, 30, 33, 45) y ahora son empleadas ms
habitualmente sobre otros tejidos diferentes, incluyendo el suero. Estas pruebas son tambin tiles cuando es
problemtico el aislamiento del virus, como por ejemplo cuando se examina semen (12) y cuando se emplean
tejidos parcialmente degradados por autolisis o por calor durante el transporte de las muestras para el
aislamiento de los virus. Se ha diseado una tcnica de PCR multiplex para diferenciar los aislados PRRSV
norteamericano y europeo (20). El anlisis de los polimorfismos de longitud de los fragmentos de restriccin de
los productos amplificados por PCR, ha permitido diferenciar cepas naturales y vacunales del PRRSV (49) y
recientemente se han llevado a cabo estudios epidemiolgicos moleculares mediante el anlisis filogentico de
secuencias especficas de genes estructurales.
a)
864
b)
c)
ii)
Preparacin de las diluciones de la muestra (suero, lquido asctico, suspensin de tejidos al 10%) en
placas base
Se dispensan 90 l de medio de crecimiento en cada pocillo de una placa de microtitulacin. Se
aaden muestras de 10 l a los pocillos de las filas A y E (dilucin 1/10 por duplicado). Se agitan las
placas y se transfieren 10 l de las filas A y E a las filas B y F (dilucin 1/100). Se agitan las placas y
se transfieren 10 l de las filas B y F a las filas C y G (dilucin 1/1.000). Se agitan las placas y se
transfieren 10 l de las filas C y G a las filas D y H (dilucin 1/10.000). Se agitan las placas.
iii)
iv)
v)
865
2.
Pruebas serolgicas
Existe una variedad de tcnicas para la deteccin de anticuerpos sricos contra el PRRSV. El diagnstico
serolgico es, en general, fcil de realizar, y presenta una adecuada especificidad y sensibilidad, especialmente
en una piara base. En ocasiones el suero de cerdos individuales causa problemas por reacciones inespecficas,
pero esta dificultad se puede resolver tomando de nuevo muestras al cabo de 23 semanas. La serologa se
lleva generalmente a cabo generalmente mediante tcnicas de unin, tales como el IPMA, la tcnica de
inmunofluorescencia, o la tcnica del enzimoinmunoensayo (ELISA) de todas ellas se han descrito muchas
variedades (1, 8, 9, 16, 24, 36, 39, 40, 48, 52). Estas pruebas se llevan a cabo habitualmente con antgeno vrico
de un determinado tipo antignico, de modo que los anticuerpos dirigidos contra el otro tipo antignico,
heterlogo, pueden ser detectados con menor sensibilidad. En Dinamarca se ha utilizado extensamente un
ELISA de bloqueo (39) y se ha descrito como un sistema ELISA doble que emplea como antgeno tanto el virus
europeo como el americano (40). La primera vacuna atenuada viva para el SRRP basada en el virus del tipo
americano se ha observado que se transmite a animales no vacunados (6, 42), y se ha descrito en Dinamarca el
desarrollo subsiguiente en las piaras de defectos en la reproduccin del SRRP inducidos por el virus de la
vacuna (6, 31). La reaccin al PRRSV vacunal del tipo americano puede que se produzca en pases que usan o
han estado usando esta vacuna; los pases europeos pueden, por tanto, observar reacciones y aislar ambos
tipos antignicos (6, 31). Recientemente se ha descrito la identificacin de las cepas de PRRSV de tipo europeo
en EE.UU. y Canad, pero su prevalencia no est bien documentada.
Los anticuerpos contra el virus pueden detectarse mediante tcnicas de unin a anticuerpo tan slo 714 das
despus de la infeccin, y alcanzan sus ttulos mximos en 3050 das. Algunos cerdos pueden convertirse en
seronegativos en 36 meses, pero otros permanecen seropositivos durante mucho ms tiempo. Los anticuerpos
neutralizantes se desarrollan lentamente y no alcanzan ttulos elevados. Se pueden detectar a partir de 3
4 semanas tras la infeccin y pueden persistir durante 1 ao o ms. Se ha descrito el uso del complemento para
aumentar la sensibilidad de la prueba de neutralizacin srica del virus (25). Todava no se ha investigado en
profundidad la duracin de los ttulos de anticuerpos tras la infeccin, y probablemente los resultados
dependern de las pruebas realizadas. Los anticuerpos maternos tienen una vida media de 1214 das, y su
ttulo puede, en general, detectarse hasta 48 semanas despus del nacimiento, dependiendo del ttulo de
anticuerpos de la vaca en el parto y la prueba realizada. En un medio infectado, los cerdos nacidos de madres
seropositivas pueden seroconvertirse activamente a partir de las 3 6 semanas de vida.
Este captulo describe con detalle el IPMA y cmo llevar a cabo esta prueba en laboratorios donde se hayan
establecido los procedimientos de aislamiento de virus empleando macrfagos, y pueda ser utilizado con virus de
ambos tipos antignicos. Esta tcnica puede ser adaptada tambin a la lnea celular MARC145, para los tipos
europeo y americano (39, 40). Igualmente se ha diseado una tcnica de inmunofluorescencia indirecta (IFI)
empleando clulas MARC145 para la serologa del PRRSV y se incluye en el presente captulo. Se dispone de
ELISAs comerciales con buena sensibilidad y especificidad y se han comparado (18).
a)
i)
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ii)
Se lavan las clulas una vez con 50 ml de PBS y la suspensin celular es centrifugada 10 minutos a
300 g (a temperatura ambiente).
iii)
Las clulas se introducen en 40 ml de medio RPMI 1640 suplementado con FBS al 5%, 100 IU
(Unidades Internacionales) de penicilina y 100 g de estreptomicina (medio de crecimiento).
iv)
Se distribuyen 100 l de la suspensin celular en cada pocillo de una placa de microtitulacin (con un
vial de clulas, se pueden inocular cuatro placas a una concentracin de 105 clulas por cada pocillo
de las placas). Alternativamente se utiliza tampn HEPES (cido N2 hidroxietilpiperazina, N2
etanosulfnico)
v)
i)
A cada pocillo se le aaden 50 l de una suspensin vrica conteniendo 105 DICC50/ml, reservando
dos pocillos sin infectar como controles.
ii)
Se incuban las placas 1824 horas a 37C en un incubador con CO2 al 5%.
i)
Se decanta el medio de crecimiento y las placas se enjuagan una vez en solucin salina.
ii)
Las placas se golpean suavemente sobre una toalla para eliminar el exceso de lquido y se secan (sin
tapadera) 45 minutos a 37C.
iii)
Se congelan las placas (sin tapadera) 45 minutos a 20C. (Las placas que no se utilicen
inmediatamente en las pruebas deben ser selladas y conservadas a 20C).
iv)
Se incuban las clulas 10 minutos a temperatura ambiente con paraformaldehdo al 4% (en PBS).
Alternativamente las clulas pueden fijarse en etanol absoluto enfriado en hielo durante 45 minutos a
5C o en acetona al 80% en hielo durante 45 minutos (5).
v)
Se elimina el paraformaldehdo y las placas se lavan una vez con solucin salina.
i)
Se distribuyen 180 l de 0,5 M NaCl con suero de caballo al 4% y Tween 80 al 0,5%, a pH 7,2 (tampn
de dilucin), en los pocillos de las filas A y E de la placa/s base.
ii)
Se adicionan 120 l del suero problema y control a los pocillos de las filas A y E (=dilucin 1/10), y se
agitan.
iii)
i)
Se transfieren 50 l de cada uno de los pocillos de la placa/s base a los correspondientes pocillos de
una placa con macrfagos fijados. Se sella la placa/s y se incuba durante 1 hora a 37C.
ii)
Se eliminan las diluciones de suero y se lava la placa/s tres veces con 0,15 M NaCl + Tween 80 al
0,5%.
i)
Se diluye el conjugado de conejo antiporcino HRPO a una dilucin predeterminada en 0,15 M NaCl
+ Tween 80 al 0,5%. Se aaden 50 l de la dilucin del conjugado a todos los pocillos de la placa/s.
Se sella la placa/s y se incuba 1 hora a 37C. Se lavan las placas tres veces.
Procedimiento de tincin
i)
ii)
iii)
Se sustituye el AEC por 50 l de 0,05 M acetato sdico, pH 5,0 (ver nota al pie de pgina 1).
867
Si los anticuerpos estn presentes en el suero problema, aproximadamente el citoplasma del 3050% de
las clulas del pocillo estar teido de rojo intenso por el cromgeno. Un suero problema negativo se
reconocer por falta de tincin del citoplasma. Un suero que reacciona de forma inespecfica puede teir
todas las clulas del pocillo (si se compara con un suero control positivo). El ttulo de un suero se expresa
como el inverso de la mayor dilucin que tie el 50% o ms de los pocillos. Un suero con un ttulo < 10 se
considera negativo. Un suero con un ttulo de 10 a 40 se considera como dbil positivo. A menudo se
observa tincin inespecfica en algunas diluciones. Un suero con un ttulo de 160 se considera positivo.
b)
868
i)
Se aaden 50 l de medio de cultivo celular (p ej. Medio Mnimo Esencial [MEM] conteniendo L
glutamina 2 mM, piruvato sdico 1 mM, 100 IU de penicilina y 100 g de estreptomicina) sin FBS a
cada pocillo de las columnas 2, 4, 6, 8, 10 y 12 de la placa de 96 pocillos utilizando una pipeta
multicanal.
ii)
iii)
Empleando una pipeta multicanal se adicionan 150 l de la suspensin celular a cada pocillo de la
placa de 96 pocillos.
iv)
Se diluye la preparacin del PRRSV en MEM sin FBS hasta una concentracin de 102,2 DICC50/50l y
se distribuyen 50 l en cada pocillo de las columnas 1, 3, 5, 7, 9 y 11.
v)
Se incuban las placas aproximadamente 4872 horas a 37C en un incubador con atmsfera
humidificada y un 5% de CO2 hasta obtener una monocapa con el 4050% aproximadamente de las
clulas infectadas, lo que se determinar mediante inmunofluorescencia indirecta. Alternativamente,
las placas de microtitulacin pueden ser primero inoculadas con suspensiones celulares MARC145
(p. ej. a una concentracin de 100.000 clulas/ml en un medio suplementado con FBS al 510%) e
incubadas, como mximo 72 horas, hasta que las clulas confluyan. Entonces se aaden volmenes
de 50 l de preparaciones del PRRSV (p. ej. 105 DICT50/ml) en cada pocillo y las placas se incuban un
tiempo adicional de 4872 horas antes de la fijacin. Se ha sugerido el uso de tampones orgnicos
tales como HEPES en los medios para estabilizar el pH cuando no se dispone de incubadores con
CO2.
i)
Se aaden 500 l de una suspensin de clulas MARC145 (p. ej. en MEM suplementado con FBS al
10%) a una concentracin de 100.000 clulas/ml, a cada compartimento de un porta de ocho cmaras.
ii)
Se incuban las clulas aproximadamente 4872 horas a 37C en un incubador con atmsfera
humidificada y un 5% de CO2 hasta que confluyan.
iii)
Se aaden a cada cmara 50 l de una suspensin del PRRSV conteniendo 105 DICC50/ml y despus
se incuban las clulas aproximadamente 18 horas en un incubador con atmsfera humidificada y un
5% de CO2. En ese momento podrn observarse mediante inmunofluorescencia indirecta 1520
clulas infectadas por campo de visin.
i)
Se elimina el medio, se lava una vez con PBS y se elimina el PBS. En el caso de portas de ocho
cmaras, se sacan las paredes de plstico de los compartimentos y se dejan intactas las gomas.
ii)
Se aaden volmenes de 150 l de acetona (al 80% en agua) fra (4C) a cada pocillo de una placa de
96 pocillos. Las placas se incuban 30 minutos a 4C. En el caso de portas de ocho cmaras, se
emplea acetona (80100%) a temperatura ambiente para fijar las clulas durante 1015 minutos a
temperatura ambiente. Algunas marcas comerciales de acetona pueden degradar las gomas de las
cmaras dejando una pelcula sobre los portas. Es recomendable comprobar la acetona antes de
usarla para la fijacin rutinaria.
iii)
iv)
Las placas pueden introducirse entonces en bolsas de plstico, se sellan y conservan a 70C hasta
su uso. Los portas pueden mantenerse de forma similar en cajas de portas.
i)
Se diluyen las muestras de suero hasta la dilucin 1/20 en PBS (0,01 M; pH 7,2) en placas de
96 pocillos (p. ej. se aaden 190 l de PBS empleando una pipeta multicanal y seguidamente 10 l del
suero problema).
ii)
Se incluyen como controles de referencia sueros de ttulo conocido, positivos con anticuerpos contra el
PRRSV y negativos, sin ellos.
i)
ii)
iii)
iv)
Se incuban las placas tapadas a 37C durante 30 minutos en una atmsfera hmeda. Los portas
deben ser incubados de forma similar en cajas o bandejas de portas con tapadera.
v)
Se eliminan las muestras de suero y las placas se secan sobre toallas de papel. Se deben realizar un
total de seis lavados empleando 200 l de PBS. El PBS se aade a cada pocillo y a continuacin se
invierten las placas para eliminar el PBS. En el caso de portas, despus de extraer las muestras de
suero, se lavan 10 minutos con PBS.
i)
Mediante una pipeta multicanal se aaden a cada pocillo volmenes de 50 l de los conjugados
diluidos apropiadamente (en PBS preparado en el momento) de IgG (cadenas ligeras y pesadas) de
conejo o de cabra antiporcino conjugada con FITC (isotiocianato de fluorescena). Volmenes
similares se aaden a las cmaras individuales de los portas.
ii)
Se incuban las placas o los portas con sus tapaderas a 37C durante 30 minutos en una atmsfera
hmeda.
iii)
Se elimina el conjugado de las placas y stas se secan sobre toallas de papel. Se realiza un total de
cuatro lavados mediante PBS, como se ha descrito previamente. Tras eliminar el conjugado de los
portas, se aclaran con PBS, se lavan 10 minutos con PBS y se aclaran con agua destilada. Se deben
golpear suavemente los portas sobre un papel absorbente para eliminar el exceso de agua.
iv)
869
Se inoculan las placas con clulas MARC145 y se incuban a 37C en un incubador con atmsfera
humidificada y un 5% de CO2 hasta que confluyan.
ii)
Se inoculan todos los pocillos con la preparacin del PRRSV excepto los pocillos de las columnas
1, 6 y 11, y las placas se incuban a 37C en un incubador con atmsfera humidificada y un 5% de CO2
durante 4872 horas.
iii)
Se elimina el medio de cultivo y las monocapas se lavan una vez con PBS (0,01 M, pH 7,2). Las
monocapas se fijan con acetona fra (solucin acuosa al 80%) durante 10 minutos a temperatura
ambiente. Se elimina la acetona, se secan al aire las placas y se mantienen tapadas a 20C para
almacenamientos cortos o a 70C para almacenamientos a largo plazo, hasta su uso.
iv)
Se preparan diluciones seriadas del suero incluyendo un suero control positivo antiPRRSV realizando
diluciones al cuarto y empezando por la dilucin 1/16 1/20. Se diluye un suero control negativo a la
dilucin 1/16 1/20. Se administran 50 l de cada dilucin (1/16, 1/64, 1/256, 1/1024 1/20, 1/80,
1/320, 1/1280) en los pocillos conteniendo el antgeno vrico de las columnas 2, 3, 4, 5 7, 8, 9, 10.
Para cada suero, tambin se dispensan 50 l de la dilucin 1/16 1/20 en los pocillos control de las
columnas 1 y 6. De la misma forma se administran las diluciones de los sueros control positivo y
negativo en los pocillos de las columnas 11 y 12.
v)
Las placas se incuban a 37C durante 30 minutos en una cmara hmeda. Se desecha el suero y se
lavan las placas tres veces con PBS.
vi)
Se aaden 50 l de IgG antiporcino, diluida apropiadamente, conjugada con FITC y las placas se
incuban a 37C durante 30 minutos en una cmara hmeda. Se elimina el conjugado, y las placas se
lavan varias veces y se golpean ligeramente sobre material absorbente para eliminar el exceso de
lquido.
c)
870
el manejo rpido de gran nmero de muestras. Tambin se han desarrollado y estn disponibles
comercialmente ELISAs que utilizan protenas recombinantes de ambos tipos de PRRSV como antgenos.
1.
a)
b)
Mtodo de cultivo
El PRRSV se propaga en una lnea celular continua de rin de mono verde africano, tal como la MA104 o
Vero. La propagacin vrica no debe exceder de cinco pases desde el virus del inculo original (MSV) a
menos que pases posteriores demuestren proporcionar proteccin en el ganado porcino.
c)
871
la seguridad de la vacuna. Debe incluirse en cada lugar cerdos centinelas no vacunados a fin de vigilar la
posible fuga de virus atenuados.
2.
Mtodo de produccin
La lnea celular de rin de mono verde africano se siembra en recipientes adecuados. Para la produccin se
emplea medio MEM complementado con FBS; el FBS debe estar libre de pestivirus o anticuerpos frente a
pestivirus y tambin libre del riesgo de encefalopata espongiforme bovina. La incubacin se realiza a 37C.
Los cultivos celulares se inoculan directamente con un stock de virus productor del SRRP, que generalmente
procede del 1 al 4 pase a partir del MSV. Los cultivos inoculados se incuban de 18 das antes de recoger el
medio de cultivo. Durante la incubacin, los cultivos deben observarse diariamente para detectar ECP y
contaminacin bacteriana.
Las vacunas de virus muertos se inactivan qumicamente con formalina o etileneimina binaria y se mezclan con
un adyuvante adecuado. Las vacunas MLV se mezclan generalmente con un estabilizador antes de ser
embotelladas y liofilizadas. Si se emplea formalina como inactivador, debe comprobarse que en el producto final
la concentracin residual de formaldehdo no excede de 0,5 g/l.
3.
Control interno
Los lotes de produccin del PRSV deben ser titulados en cultivos de tejidos mediante estandarizacin del
producto. Los lotes de titulacin baja deben concentrarse o bien mezclarse con lotes de titulacin ms alta para
alcanzar el ttulo correcto.
4.
Control de lotes
Las muestras en sus envases finales deben analizarse en cuanto a su pureza, seguridad o inocuidad y potencia.
Los viales de MLV deben ser probados en cuanto al contenido mximo de humedad permitido.
a)
Pureza
Las muestras se examinan para descartar una posible contaminacin con bacterias, hongos o pestivirus.
Para probar la presencia de bacterias se inoculan diez recipientes, cada uno de ellos conteniendo 120 ml
de medio hidrolizado de casena de semilla de soja, con 0,2 ml procedentes de 10 muestras de
contenedores finales. Los diez recipientes se incuban a 3035C durante 14 das y se realiza un
seguimiento del posible crecimiento bacteriano. Para probar la presencia de hongos se inoculan
10 recipientes, cada uno de ellos conteniendo 40 ml de medio hidrolizado de casena de semilla de soja,
con 0,2 ml procedentes de 10 muestras de contenedores finales. Los recipientes se incuban a 2025C
durante 14 das y se observa el posible crecimiento de hongos.
b)
Inocuidad
Las pruebas de inocuidad pueden llevarse a cabo con una combinacin de cobayas, ratones o cerdos.
c)
Potencia
Las muestras de los contenedores finales de una vacuna MLV se titularn (log10) en placas de
microtitulacin para la determinacin del ttulo.
872
Procedimiento de la prueba
i)
Se preparan diluciones decimales partiendo de 101 hasta 105 empleando la vacuna problema
rehidratada y 1,8 ml de MEM. Debe titularse un control positivo interno del PRRSV en el rango
apropiado.
ii)
Se inocula 0,1 ml/pocillo de cada dilucin en cinco pocillos de una placa con 96 pocillos conteniendo
monocapas de rin de mono verde africano.
iii)
iv)
Se observan las placas microscpicamente para detectar ECP. El control positivo interno del PRRSV
debera dar un ttulo dentro del rango de 0,3 log10 DICC50 de su media predeterminada.
v)
0,5 logs para estabilidad durante el periodo de validez del producto y 0,7 logs para la variabilidad de la
prueba de potencia.
Para determinar la potencia del producto final de vacunas con virus muertos se pueden emplear animales
hospedadores o pruebas de vacunacin/serologa con animales de laboratorio o pruebas de
vacunacin/desafo. Los ensayos en paralelo empleando tcnicas tipo ELISA que cuantifican antgeno para
comparar un estndar con el producto final son adecuados para determinar la potencia relativa de un
producto. El estndar debe proporcionar proteccin en el animal hospedador.
d)
Duracin de la inmunidad
Los estudios de la duracin de la inmunidad se realizan antes de que la vacuna reciba la acreditacin final.
Para la forma respiratoria del SRRP, la duracin debe ser elevada hasta la edad de puesta en mercado de
los cerdos. La duracin de la inmunidad para la forma reproductiva debe cubrir la etapa de destete de los
lechones.
e)
Estabilidad
Todas las vacunas tienen inicialmente un periodo de validez de 24 meses antes de expirar. Los estudios de
estabilidad en tiempo real se llevan a cabo para confirmar si es correcta la fecha de expiracin.
f)
Conservantes
Los antibiticos se aaden durante la produccin, generalmente gentamicina sulfato o neomicina, no
excediendo los 30 g/ml.
g)
Precauciones (riesgos)
La vacunacin slo se recomienda para cerdos de piaras PRRSVpositivas. Las vacunas MLV tratan de ser
una ayuda en la reduccin de la enfermedad asociada con la forma respiratoria y/o reproductiva del SRRP y
no est recomendada para ser usada en cerdas gestantes, ni en cerdas jvenes o machos en edad de
crianza. La vacunacin de machos en edad de crianza con la vacuna MLV no se recomienda debido al
posible vertido del virus de la vacuna en el semen (11, 12). La primera vacuna MLV para el SRRP basado
en el virus tipo americano, se ha observado que se transmite a animales no vacunados (6, 42) y por tanto
causa defectos en la reproduccin tpicos del SRRP inducidos por el virus de la vacuna en las
explotaciones afectadas (6, 31).
5.
a)
Inocuidad
Ver seccin C.4.b.
b)
Potencia
Ver seccin C.4.c.
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NB: Existen laboratorios de referencia de la OIE para el Sndrome reproductivo y respiratorio porcino (ver el
Cuadro en la Parte 3 de este Manual de animales terrestres o consultar el sitio Web de la OIE para encontrar un
listado ms actualizado: www.oie.int).
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