Universidade Estadual de Campinas

Departamento de Bioqumica - IB
Laboratrio de Aula Prtica
Hemoglobina
Objetivo: purificar e caracterizar hemoglobina.
Etapas
I Purificao de hemoglobina humana
II - Dosagens de protenas totais, eletroforese das fraes purificadas e caracterizao
eletrofortica das hemoglobinas.
III - Curvas de equilbrio ao oxignio e caracterizao ptica da hemoglobina.

Ateno!!

Cuidados para manuseio do sangue:

- Todo material biolgico deve ser mantido resfriado (4oC), para preservao das atividades
enzimticas e diminuio do metabolismo celular.
- Usar luvas cirrgicas para manipulao.
- Evitar manuseio por vrias pessoas.
1. Preparao de hemolisado total
1. Coletar 5mL de sangue, adicionar soluo salina fisiolgica (0,9% NaCl) na proporo 1:3.
2. Centrifugar a 3.000 rpm por 10 minutos.
3. Descartar cuidadosamente com um conta-gotas o sobrenadante (que corresponde ao plasma) e
ressuspender o precipitado (que corresponde as hemcias) com soluo salina fisiolgica na
proporo 1:3 (sangue/salina, v/v) em gelo, homogeneizando cuidadosamente.
4. Centrifugar a 3000 rpm por 10 minutos. Descartar o sobrenadante. Repetir este procedimento
de lavagem por mais duas vezes.
5. As hemcias sedimentadas sero hemolisadas com gua destilada na proporo 1:1 (v/v).
6. Levar ao freezer por 20 minutos.
7. Centrifugar a 4500 rpm por 10 minutos para retirada das membranas rompidas das hemcias
(ghost cells). O sobrenadante (hemlise total) corresponde predominantemente hemoglobina.
2. Preparao da hemoglobina
1. Usar o hemolisado total obtido na etapa anterior.
2. Preparar 0,5 L de tampo Tris HCl 0,05 M pH 8,0 e 0,5 L de tampo fosfato 0,05 M pH 7,4.

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3. Promover o inchamento da resina Sephadex deixando-a em gua destilada por 30

minutos (realizado).
4. Montar uma coluna cromatogrfica com a resina previamente preparada: Sephadex G25
(Ateno: o volume da amostra no dever ultrapassar 10% do volume total da coluna.
5. Equilibrar a coluna com tampo Tris HCl pH 8,0 perfundindo o tampo pela coluna at que
o pH de sada seja igual ao pH da entrada.
6. Passar a soluo de Hb (hemolisado total) na coluna de excluso molecular com tampo
Tris HCl pH 8,0 (nessa cromatografia separa-se a Hb de outras protenas citosslicas e de
nions de baixo peso molecular, especialmente dos fosfatos orgnicos intraeritrocitrios
como 2,3 BPG, ATP e ADP).
7. Coletar a amostra da coluna evitando diluio (desprezar o incio e final da amostra).
8. Transferir a soluo acima para um saquinho de dilise (com poro menor que 64000,
devidamente amarrado) e mergulha-lo em um Becker contendo 400 mL de tampo fosfato
pH 7,4.
9. Dialisar overnight a soluo de Hb (trocando 3 vezes o tampo), obtendo assim a Hb
purificada.
1. CURVAS DE EQUILBRIOS DE OXIGENAO DA HEMOGLOBINA
(medidas de P50 e n em solues purificadas de Hb)
1. Dilua a soluo purificada de Hb em tampo Fosfato 0,05M, pH 7,4 at que a absorbncia da
soluo em 541 nm estar entre 0,4 e 0,8.
2. Coloque 3mL da soluo de Hb dentro do tonmetro. Feche-o, vedando bem suas vias de sada
e leia a absorbncia da soluo em 541, 560 e 576nm (se possvel faa uma varredura entre 500
e 600 nm).
3. Permeie a soluo com nitrognio puro, por 10 min, at que a Hb esteja totalmente
desoxigenada (colorao prpria) e leia a absorbncia nos trs comprimentos de onda citados.
4. Adicione 1mL de ar (com uma seringa e agulha), agite brandamente o tonmetro a temperatura
ambiente, por 10min, e leia novamente a absorbncia em 541, 560 e 576nm.
5. Repita por trs vezes o procedimento 4, variando, se necessrio, a quantidade de ar
adicionado.
6. Calcule a concentrao de Oxi-Hb em cada uma das 4 adies de ar, com as correspondentes
concentraes de oxignio adicionadas, pO2 (prencher Tabelas abaixo).
7. Construa o grfico de Hill (log Y/1 - Y vs. log pO2) e determine log P50 e n.

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Amostra

Abs
540

Abs
560

Abs
576

Abs540

Abs560 Abs576

mdio

%Oxi-Hb
(ou Y)

Deoxi-Hb
1a adio de ar
2a adio
3a adio
4a adio
Oxi-Hb
Amostra

mL de ar
adicionado

PO2
(torr)

log
pO2

Y / 1 -Y log Y / 1- Y

Deoxi-Hb
1a adio de ar
2a adio
3a adio
4a adio
Oxi-Hb
QUADRO 1 - EQUAO DE HILL, CLCULO DE P50 E n
Obs.: A ligao da Hb pelo oxignio foi descrita em 1913, por Archibald Hill, de acordo com o
equilbrio:
Hb(O2)n
Hb + nO2
(2)
Como o oxignio um gs, conveniente expressar sua concentrao em termos de pO 2 a
presso parcial de oxignio (em torr ou mmHg). Definindo-se Y como a frao de Hb ligada ao O2
(oxi-Hb ou HbO2), a expresso gera:
Y=

(pO 2 )n
(pO 2 )n + (P50 )n

(3)

que pode ser rearranjada, dando:

n

pO
Y
= ( 2 )
1 Y
P50

(4)
onde P50 a pO2 para 50% de saturao dos stios da Hb. Essa equao diz que a proporo de
oxi-Hb (Y) para desoxi-Hb (1 - Y) igual potncia n da relao entre pO2 e P50. Tirando-se o
logartmo de ambos os lados da equao 8, temos:
log

Y
= n log pO 2 n log P50
1 Y

(5)
Um grfico de log [Y/(1/Y)] contra log pO2, chamado grfico de Hill, aproxima-se de uma
linha reta. Sua inclinao n no ponto mdio de ligao (Y= 0,5) chamado coeficiente de Hill. O
valor de n reflete a cooperatividade entre os centros de ligao da Hb. Para a Hb humana n=2,8
aproximadamente.

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Questes:
1. Considerando as diferenas na absoro ptica da Hb quando na sua forma oxigenada,
desoxigenada, proponha uma forma de medir a saturao da Hb com O 2 (Y) usando suas
propriedades colorimtricas.

Figura 1 - Representao do espectro ptico da hemoglobina (formas oxi e desoxigenada) entre

500 e 600 nm.
2. O que seria necessrio para montar um grfico de Hill com sua amostra?
3. Como voc poderia controlar/variar a pO2?
2. Caracterizao ptica da hemoglobina nas amostras purificadas
1. Dilua a hemoglobina purificada em tampo Fosfato 0,05M, pH 7,4 at a absorbncia da
soluo, em 541 nm, estar entre 0,4 e 0,8. Dilua a soluo a fim de que a leitura esteja nessa
faixa.
2. Pipete fraes de 3 mL da soluo de Hb e transfira para tubos marcados 4, 5 e 6 conforme a
Tabela abaixo:
Tubo
1
2
3
4
5
6
Tampo pH 7,4
3,1 mL 3 mL 3 mL 0,1 mL
Soluo de Hb
3 ml
3 mL 3 mL
Ditionito de Sdio 100 mM
0,1 mL
0,1 mL
Ferricianeto de Potssio 50 mM
0,1 mL
0,1 mL
3. Complete as adies da Tabela, agite os tubos por inverso.
4. Ajuste o espectrofotmetro com a soluo do tubo 1.
5. Leia a absorbncia das solues (tubos 2 a 6) entre 500 e 600 nm (varredura). Anote os
valores de absorbncia nos comprimentos de onda de 541, 560 e 576nm.
Tubo
1
2
3
4
5
6
Abs 541 nm
Abs 560 nm
Abs 576 nm

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