BIOQUMICA GIA 5

PRODUCCIN DE PIRUVATO ACETALDEHDO Y ETANOL POR

FERMENTACIN DE LA GLUCOSA CON LAS ENZIMAS DE LA LEVADURA
I. EL PROBLEMA
Demostrar experimentalmente algunos mtodos para la obtencin de
intermediarios metablicos, particularmente los de la fermentacin de la glucosa
con las enzimas de la levadura y reconocerlos por medio de reacciones
colorimtricas cualitativas.
II. INTRODUCCIN
La primera etapa de la fermentacin de glucosa por las enzimas de la levadura es
la produccin de piruvato, este procedimiento se efecta mediante una serie de
reacciones que implican un nmero considerable de intermediarios, al cual se le
denomina gliclisis anoxignica o anaerbica.
La reaccin global se podra considerar como la transferencia de dos pares de
tomos de hidrgeno (2e- 2H+) de la glucosa al NAD +. Debido a que la coenzima
slo se encuentra en cantidades catalticas, es necesario reoxidarla para que esta
transformacin no se suspenda, y as, el NADH + + H+ que se forma se reconvierte
en NAD+ por el oxgeno molecular a travs de la cadena respiratoria. Sin embargo,
este proceso no se realiza cuando las condiciones son anaerobias y en este caso
la reoxidacin se efecta cuando el piruvato se convierte en acetaldehdo y
posteriormente en etanol, segn las siguientes reacciones

El piruvato forma acetaldehdo y CO 2 por la accin de la piruvato descarboxilasa la

cual requiere del in magnesio y de la tiamina pirofosfato (TPP). La enzima que
cataliza la etapa final de la fermentacin es la alcohol deshidrogenasa, el
acetaldehdo entonces se reduce a etanol reaccin en la cual el NADH + + H aporta
el potencial de reduccin.
Los metabolitos piruvato y acetaldehdo, normalmente se encuentran presentes
en muy bajas concentraciones, por lo tanto, para demostrar su existencia como
intermediarios en las va metablicas, es necesario impedir que se transformen en
otros compuestos, situacin que se logra ya sea bloqueando la enzima que
cataliza la conversin del metabolito mediante el empleo de inhibidores, o
cambiando las condiciones fisiolgicas, por ejemplo, el valor de pH para que la
velocidad de catlisis disminuya, o mediante agentes que atrapen al intermediario
formando un compuesto que no se pueda metabolizar.
El pH ptimo para la fermentacin alcohlica inducida por levaduras es 4,5
situacin que se verifica a travs del ensayo en el laboratorio. Cuando el pH es
ligeramente alcalino se inactiva la piruvato descarboxilasa, generndose en el
medio una acumulacin de piruvato, su presencia se puede demostrar por la
reaccin con 2,4 dinitrofenilhidrazina.
El pH que favorece la accin de la etanol deshidrogenasa oscila entre 5 a 6; sin
embargo, en caso de modificarlo hacia un rango ligeramente alcalino (pH=8), la
reaccin se favorece hacia la oxidacin del etanol, es decir, se acumula
acetaldehdo.
Para atrapar acetaldehdo se le aade a la mezcla de incubacin sulfito de sodio
(adicin bisulftica) y este se reconoce con el reactivo de schiff.
Otro de los productos de la fermentacin de la glucosa es el etanol y para
reconocerlo se realiza el ensayo de vanadato oxina.
Fundamentos qumicos de pruebas de reconocimiento
Dinitrofenilhidrazina
Para el reconocimiento de aldehdos y cetonas, se realiza la prueba con 2,4dinitro-fenil-hidrazina, que conduce a la formacin de las 2,4-dinitro-fenilhidrazonas correspondientes, que son slidas. La formacin del precipitado
coloreado naranja, rojo o amarillo es prueba positiva para aldehdos y cetonas.
Cetonas:
R-CO-R + H2NNHC6H3(NO2)2

RR-C=NNHC6H3(NO2)2 + H2O
Cristales coloreados

Prueba de Schiff
El clorhidrato de pararosanilina decolorado o fusina (reactivo de Schiff) reacciona
con los aldehdos produciendo un complejo de color violeta. El formaldehido, cido
glioxlico, paraformaldehido, acetaldehdo y benzaldehdo se pueden detectar en
cantidades superiores a 1mg bajo las condiciones del ensayo; no dan prueba
positiva la acetona y la vainillina (es un aldehdo). Como interferentes de la prueba
se reporta que 10 mg de etanol al 96% y 10 mg de cido actico glacial generan
un color levemente violeta, parecido al observado para 1 mg de paraformadehdo
o cido glioxlico.

Adicin bisulftica
Todos los aldehdos, las metilcetonas y algunas cetonas cclicas reaccionan con
bisulfito de sodio produciendo compuestos de adicin bisulftica.

La adicin de un cido o una base disueltos en agua destruye el in bisulfito y

regenera el compuesto carbonlico.

Vanadato oxina
Los alcoholes, aunque estn mezclados con otros compuestos como
hidrocarburos, teres, cetonas y compuestos halogenados, se reconocen
mediante la formacin de un complejo de coloracin roja, rosa o naranja, en la
capa de benceno, con una mezcla de 8-hidroxiquinolina (oxina) y vanadato de
amonio.
III .MATERIALES Y REACTIVOS
Material de prueba:
Levadura en pasta
Material por grupo
10
2
3
4
2
1
1

Tubos de ensayo
Vasos de precipitados (250 mL)
Pipetas (1, 2 y 5 mL)
Tubos de centrfuga
Pinzas para tubo
Esptula
Pipeteador

Papel de aluminio
Balanzas
Bao mara
Centrfuga
Estufa de calentamiento
Pipeta Pasteur

Reactivos
Fosfato de sodio dibsico, 0.5mol/L (Na2HPO4)
Fosfato de sodio monobsico, 0.5mol/L (NaH2PO4)
Suspensin de levadura, 100 g/L en (Na 2HPO4)
Suspensin de levadura, 100 g/L en (NaH 2PO4)
Suspensin de levadura, 100 g/L en (H 2O)
Suspensin de levadura, 100 g/L en (H 2O)
Glucosa, 100 g/l
Sulfito de sodio
Hidrxido de sodio, 100 g/L
Hidrocloruro de 2, 4 dinitrofenilhidrazina (solucin saturada en cido clorhdrico
2M).
Reactivo de 2,4 dinitrofenilhidrazina (disolver 3 g de 2, 4 dinitrofenilhidrazina en 15
ml de H2SO4, esta solucin se aade con agitacin fuerte sobre una mezcla
previamente preparada de 20 ml de agua con 70 mL de etanol al 95%) frasco
gotero.
cido tricloroactico, 100g/L
Etanol.
Acido pirvico o piruvato de sodio al 1%
Benzaldehdo
Vanadato de amonio (300 mg/L) en frasco gotero
Solucin de oxina (8-hidroquinolina al 2.5% en cido actico al 6%) frasco gotero.
4

Reactivo de Schiff (Preparacin: un litro de reactivo se prepara mezclando 1g de

fusina (cloruro de p-rosamilina) en 500mL de agua destilada, 20 mL de solucin
acuosa y saturada de bisulfito de sodio, y 10 mL de HCl concentrado; llevar a
volumen (1L) con agua destilada. El reactivo debe ser transparente.)
IV. PROCEDIMIENTO
Procedimiento a cargo del auxiliar de laboratorio:
Tome dos tubos de ensayo y mrquelos como A y B. Pipetee 3 mL de glucosa en
cada uno. Agregue al tubo A 5 mL de suspensin de levadura en solucin de
Na2HPO4 alcalina (verifique con papel indicador que el pH aproximadamente 8) y
al tubo B 5 mL de suspensin de levadura en solucin de NaH 2PO4 cida
(verifique pH aproximadamente 4). Mezcle bien ambos tubos, protjalos con papel
de aluminio y pngalos a incubar a 37oC durante 2 das.
(1)Formacin de piruvato a partir de glucosa.
Al cabo de este tiempo agregar a cada uno de los tubos 2 mL de solucin de cido
tricloroactico, mezclar vigorosamente y centrifugar durante 10 minutos a 2500
rpm. Separar los sobrenadantes para la identificacin de piruvato.
a) Reconocimiento del piruvato con 2,4 dinitrofenilhidrazina.
Tome 2 mL de los sobrenadantes que se obtuvieron en (1), en tubos de ensayo.
Aada a cada tubo 1 mL de la solucin de 2,4 dinitrofenilhidrazina y mezcle
vigorosamente cada tubo. En dos tubos de ensayo limpios, saque 3 o 5 gotas de
las mezclas anteriores y adicineles a cada una 1 mL de NaOH, 10% y 2 mL de
agua destilada. Observe la formacin de un color rojo lo cual indica la presencia
de piruvato.
Repita el ensayo pero esta vez utilizando el reactivo puro de cido pirvico como
control positivo y agua como control negativo
(2)Formacin de acetaldehdo y etanol a partir de glucosa.
Procedimiento a cargo del auxiliar de laboratorio:
Tome dos tubos de ensayo y mrquelos como C y D. Adicione a cada uno de ellos
3 mL de glucosa y 5 mL de suspensin de levadura en agua. Al tubo D aada 0.5
g de sulfito de sodio. Mezcle ambos tubos vigorosamente y pngalos a incubar a
37oC durante 1 da, protjalos con papel de aluminio.
Aadir 2 mL de cido tricloroactico (ATA), mezclar y centrifugar durante 10
minutos a 2500 rpm y separe los sobrenadantes para el reconocimiento de etanol
y acetaldehdo.

a) Reconocimiento de acetaldehdo:
Tome dos tubos de ensayo, agregue a cada uno 0.5 mL del reactivo de Schiff, al
primero de ellos aada 100L (6 gotas) del sobrenadante del tubo C y al segundo
100L (6 gotas) del sobrenadante del tubo D. La aparicin de un color fucsia o
prpura es prueba positiva para aldehdos
Repita el procedimiento utilizando el reactivo de benzaldehdo
positivo y agua como patrn negativo

como patrn

b) Reconocimiento de etanol (Vanadato oxina).

Disolver 10 gotas del sobrenadante del tubo B en 1 mL de benceno, adicione 0.5
mL de solucin de vanadato de amonio y 2 o 3 gotas de solucin de oxina, mezcle
bien y deje reposar por 20 minutos. La formacin de un color rojo en la capa de
benceno es prueba positiva para el alcohol.
Disolver 10 gotas del sobrenadante del tubo C en 1 mL de benceno, adicione 0.5
mL de solucin de vanadato de amonio y 2 o 3 gotas de solucin de oxina, mezcle
bien y deje reposar por 20 minutos. La formacin de un color rojo en la capa de
benceno es prueba positiva para el alcohol.
Repita el procedimiento pero esta vez utilizando etanol como patrn

PREINFORME E INFORME. PRODUCCIN DE PIRUVATO ACETALDEHDO Y

ETANOL POR FERMENTACIN DE LA GLUCOSA CON LAS ENZIMAS DE LA
LEVADURA
PREINFORME
1.

Nombre____________________________

Grupo____

Consulta

a) Qu tipo de organismos son las levaduras? y explique de acuerdo con su

metabolismo si se consideran de caracter aerobio, anaerobio, o anaerobio
facultativo.

b) Describa brevemente dos procesos de fermentacin industrial en los que se

utilizan las levaduras, incluyendo ejemplos de especies de estos microorganismos.
2.
Nombre

Propiedades de los reactivos a usar en el laboratorio

Frmula

Aspecto

Peligrosidad*

Primeros auxilios

Indique la peligrosidad con el smbolo correspondiente: explosivo (E), comburente (O), inflamable
(F), extremadamente inflamable (F+), txico (T), muy txico (T+), corrosivo (C), nocivo (Xn),
irritante (Xi) y/o peligroso para el medio ambiente (N). Pictogramas SGA

3. Bibliografa (Normas APA)

4. Procedimiento
4.1 Formacin de piruvato a partir de glucosa y reconocimiento con 2,4
dinitrofenilhidrazina.
7

Resultado esperado _________________________________________________

_________________________________________________________________
__________________________________________________________________
4.2

Formacin de acetaldehdo y reconocimiento con reactivo de Schiff

Resultado esperado__________________________________________________
__________________________________________________________________
__________________________________________________________________
DIAGRAMA DE FLUJO

4.3 Formacin de etanol y reconocimiento con vanadato oxina

Resultado esperado__________________________________________________
__________________________________________________________________
__________________________________________________________________
DIAGRAMA DE FLUJO

INFORME
Debe contener:
8

Datos y observaciones debidamente tabulados para cada prueba, incluyendo los

controles, aclarando si la prueba es positiva o negativa.
Anlisis de las observaciones de la prctica con citas y usando la informacin de
su preinforme y gua de laboratorio:
Explique el propsito de agregar en cada tubo (A, B,C, o D) segn corresponda:
levadura, Na2HPO4, NaH2PO4, glucosa, 2,4-dinitrofenilhidrazina, sulfito de sodio,
Schiff, vanadato-oxina.
Realice la ecuacin de la reaccin qumica del acetaldehdo y piruvato con cada
reactivo de reconocimiento.
Para la ruta metablica de la fermentacin etanlica desde la glucosa hasta el
etanol, especifique hasta que reaccin pudo confirmar en cada tubo ( A,B,C y D)
debido a los reactivos de reconocimiento.
De acuerdo con la gua explique la importancia de detectar los intermediarios
metablicos.
Interprete por escrito y con ecuaciones qumicas los resultados que se obtuvieron
en cada tubo.
Redacte la bibliografa correspondiente en normas APA
VI. BIBLIOGRAFA
BOYER, Rodney. Conceptos de Bioqumica. Mxico: International Thomson
Editores, 2000.
CHAMPE, Pamela. C; HARVEY, Richard, A. y FERRIER, Denise. R. Bioqumica. 4
ed. Espaa: Lippincott, 2008.
DIAZ, Juan C y HICKS, Juan Jos. Bioqumica. 2 ed. Mxico: Interamericana,
McGraw Hill, 1995.
HICKS GOMEZ, Juan Jos. Bioqumica. 2 ed. Mxico: McGraw Hill
Interamericana, 2007.
MELO, Virginia y CUAMATZI, Oscar. Bioqumica de los procesos metablicos.
Espaa: Revert, 2006.
RODNEY, Boys. Conceptos de Bioqumica. Mxico: International Thomson
Editores, 2000.
PARS, Ramn y JUARZ, Antonio. Bioqumica de los Microorganismos. Espaa:
Revert, 1997.
VOET, Donald; VOET, Judith y PRATT, Charlotte. Fundamentos de Bioqumica. La
vida a nivel molecular. 2 ed. Mxico: Mdica Panamericana, 2007.