Resumen

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1. Introduccin
Las enfermedades infecciosas emergentes (EIDs) constituyen algunos de los problemas ms
apremiantes que enfrenta la salud humana y de los animales domsticos, y la conservacin
de la biodiversidad ( Daszaket al. 2000 ). Estas enfermedades tienen implicaciones obvias
para el bienestar humano, y tambin causan enormes impactos econmicos, y en el
contexto de la conservacin, pueden conducir rpido de la poblacin disminuye, o incluso
extinciones ( Daszak et al 2000. ; Woolhouse y Gowtage-Sequeria 2005 ).Entre los
ejemplos recientes, que han recibido altos niveles de atencin, incluyen epidemias de la
enfermedad SARS ( Stadler et al. 2003 ), la invasin de virus del Nilo Occidental en las
Amricas ( Nashet al. 2001 ), la posibilidad de la aparicin de nueva pandemia de gripe
cepas ( Monto 2005 ), y el papel de la enfermedad fngica quitridiomicosis en las
declinaciones de anfibios a nivel mundial ( Daszak et al.1999 ). Los impulsores de la
aparicin de enfermedades son an poco conocidos. La globalizacin del comercio y los
viajes, junto con pinzamiento humana en los hbitats no perturbados, puede remover el
pasado restricciones sobre la distribucin geogrfica y las posibilidades de transmisin. Sin
embargo, si estos factores por s solos dan lugar a combinaciones husped-patgeno
novedosos, o si la evolucin de patgenos generalmente se requiere para el establecimiento
de nuevos hosts o por cambios en la virulencia, sigue siendo una pregunta sin respuesta
mayor ( Altizer et al. 2003 ). Para resolver esta cuestin tiene implicaciones importantes
para la vigilancia, la prediccin de consecuencias y la planificacin de respuestas a nuevas
EID.
Los poderosos mtodos estadsticos disponibles para el anlisis de la evolucin molecular
hacen posible la deteccin de las firmas de seleccin en las secuencias de ADN / ARN a
partir de las poblaciones de patgenos, pero que une dichas seales o polimorfismos
genticos especficos para el proceso de la aparicin de enfermedades es ms problemtica
( Yang et al . 2000 ; . Haydon et al 2001 ; . Woelk et al2001 ; Anishchenko et al 2006. ). En
lugar de simplemente la identificacin de sitios que pueden ser bajo seleccin, esto requiere
un enfoque de prueba de hiptesis donde la variacin en los sitios conocidos para ser
funcionalmente importantes en el proceso de infeccin o de virulencia, por ejemplo en los

residuos implicados en las interacciones con los receptores especficos de acogida (y por
tanto los tipos de clulas o especie), puede hacerse la prueba de asociacin con
interruptores de acogida o la modulacin de la virulencia. Hasta la fecha, esto se ha logrado
slo un nmero muy reducido de agentes patgenos, por lo general con claras
implicaciones para la salud humana, y la mayora representan slo casos individuales de
interruptores de acogida. Por ejemplo, la variacin en los residuos 226 y 228 de la protena
hemaglutinina (HA) de la gripe A en H2 y H3 serotipos es un determinante de la
especificidad del receptor, mientras que la variacin en los residuos 182 y 192 de HA en la
influenza H5N1 es probable que participen en la adaptacin de H5N1 a huspedes humanos
( Connor et al 1994. ; Yamada et al 2006. ); y Anishchenko et al. (2006) han identificado
una mutacin que permite que una cepa no virulenta equina del virus de la encefalitis
equina venezolana (VEEV, un patgeno humano zoontica) que circula en roedores para
infectar y amplificar en los caballos. Hay pocos ejemplos de tales slidos evolucin en
enfermedades de la fauna emergentes o de evolucin asociado con varios conmutadores
independientes para una gama de diferentes anfitriones por el mismo patgeno ( Altizer et
al. 2003 ). Los ejemplos mejor caracterizados incluyen la aparicin repentina de parvovirus
canino (CPV), que infecta a los perros domesticados, lobos y coyotes, en 1978 y su
posterior desarrollo en una pandemia global. CPV evolucion de parvovirus felino
(FPV; Hueffer y Parrish 2003 ) y el salto en una gama de huspedes canina fue facilitado
por sustituciones en la protena de la cpside FPV (por ejemplo, residuos de VP2 K93N y
D323N) que permiti CPV utilizar el receptor de transferrina canino para infectar canina
clulas husped ( Chang et al 1992. ; . Hueffer et al2003 ). Recientemente, una sustitucin
de aminocidos T249P en la helicasa NS3 de las cepas estadounidenses del Virus del Nilo
Occidental (VNO) se ha encontrado para modular una mayor virulencia del virus del Nilo
Occidental en los crvidos ( Brault et al. 2007 ). La diversificacin de los lentivirus de los
primates, probablemente, constituye el mejor ejemplo de adaptacin asociado con mltiples
eventos de emergencia independientes en distintas especies hospedadoras ( Hahn et
al. 2000 ). Existen otros ejemplos de la seleccin positiva y la adaptacin husped, por
ejemplo para la rabia ( Holmes et al. 2002 ), pero para la mayora de los casos an no se
han dilucidado los papeles funcionales especficos de los residuos implicados. Con el fin de
entender el papel ms amplio de la evolucin de patgenos en la aparicin de
enfermedades, se necesitan ms estudios sobre los patgenos que infectan a una gama
diversa de acogida, y que tienen la biologa molecular y celular bien caracterizada.
Virus del moquillo canino (CDV), un morbilivirus en la familia de los paramixovirus, tiene
una alta prevalencia en la poblacin canina mundo, causando una variedad de sntomas
incluyendo descarga nasal y conjuntival, congestin respiratoria, fiebre, inmunosupresin y
dao neurolgico. CDV plantea una importante amenaza para la conservacin de muchas
especies de carnvoros. Spillover derivados de la interaccin entre los perros domsticos o

salvajes y especies silvestres ha llevado a muertes masivas de especies que van desde los
cnidos salvajes (perros salvajes africanos, Lycaon pictus, orejas de murcilago
zorro, megalotis Otocyon; . Carpenter et al 1998 ), felinos (leones, Panthera leo; Harder et
al 1996. ), hyaenids (hiena manchada, Crocuta Crocuta; Haas et al 1996. ), fcidos (foca
del Caspio, Phoca caspica;sello de Baikal, Phoca sibirica; Mamaev et al
1995. ; Kennedy et al 2000. ), mustlidos (negro-con base del hurn, Mustela
nigripes, Williams et al 1988. ), vivrridos (civeta de palma, Parguma larvata; .Machida et
al 1992 ), Ailtiridos (panda rojo, Ailurus fulgens) a cionidos (mapache, lotor del
Procyon;Lemberger et al., 2005 ). En muchos casos CDV es una amenaza directa a la
persistencia continuada de pequeas poblaciones de inters para la conservacin, despus
de haber extirpado la ltima poblacin silvestre remanente del hurn de patas negro en
1985 ( Williams et al 1988. ), y causando la mortalidad recurrente entre los perros salvajes
africanos ( Alexander & Appel 1994 ). Adems, CDV puede haber contribuido a la
extincin del tigre de Tasmania (Thylacinus cynocephalus) a principios del siglo XX
(Guiler 1961 ). Por lo tanto, CDV cumple el criterio de tener una amplia gama de
huspedes en el que es posible probar aparicin independiente repetida y para evaluar el
papel de los cambios evolutivos en tales eventos.
Morbilivirus tambin tienen el beneficio de tener celular bien caracterizada y la biologa
molecular, sobre todo basado en el trabajo sobre el virus del sarampin (MV) y CDV. Los
morbilivirus tienen una codificacin de ARN de sentido negativo genoma monocatenario
no segmentado seis protenas.Hemaglutinina (H) y de fusin (F) glucoprotenas forman la
envoltura del virus y son cruciales para la infeccin celular como adjunto a la sealizacin
molcula de activacin de los linfocitos (SLAM) y CD46 receptores celulares ( Tatsuo et
al. 2001 ). La protena H se une a uno o ms receptores resulta en la unin celular y la
activacin de la protena F por proteasas especficas de tejido que conducen a la infeccin
celular, por lo tanto, estas protenas tienen un papel clave en la determinacin de la gama de
huspedes y el tropismo ( Lamb y Kolakofsky 2001 ; Seki et al . 2003 ). Estas molculas
estn bien caracterizados para MV y CDV, con predicho estructuras terciarias disponibles,
incluyendo la identificacin de residuos funcionales clave. En particular, los sitios 530 y
548 de la protena hemaglutinina se han demostrado experimentalmente para determinar
tropismo clula husped in vitro ( Vongpunsawad et al 2004. ; von Messling et al
2005. ). El genoma se embala en un (RNP) la estructura de ribonucleoprotena compuesta
por la protena de la nucleocpside (N), la fosfoprotena (P) y ARN-polimerasa dependiente
de ARN (L).La protena de matriz (M) vincula la RNP para la envoltura del virus.
Estudios evolutivos anteriores de CDV se han centrado en gran medida de las relaciones
filogenticas entre las diferentes cepas, pero la falta de consenso, utilizando una variedad
de secuencias completas y parciales de diferentes genes, y una variedad de metodologas
filogenticas ( Hashimoto et al 2001. ;. Martella et al2006 , 2007 ). Estudios de

completa H secuencias de genes se han identificado siete distintos grupos geogrficamente

separados de CDV asla, pero algunas relaciones entre estos linajes siendo ambigua.Ningn
estudio ha tratado de investigar los patrones de seleccin o la recombinacin o cmo se
relacionan con los muchos casos de aparicin en huspedes no perro.
Aqu realizamos una amplia evolucin filogentica y anlisis moleculares utilizando
secuencias de longitud completa de todos los genes del CDV con el fin de determinar el
papel de la seleccin y recombinacin en la conformacin de la diversidad gentica
viral. Ponemos a prueba la hiptesis especfica que las adaptaciones moleculares en los
sitios de unin al receptor 530 y 548 del gen de la hemaglutinina, que tienen un papel
funcional en la determinacin de tropismo clula husped, estn asociados con incidentes
independientes de la propagacin de la CDV de los ejrcitos no perro. Esta hiptesis fue
confirmada para el residuo 530, y que, adems, identificar residuo 549 en la regin de
unin SLAM-como otro candidato fuerte, proporcionando evidencia convincente de que
repite la evolucin de patgenos en los sitios funcionales se asocia con mltiples incidentes,
independientes de aparicin de la enfermedad en una serie de novela anfitriones.
2. Material y mtodos
(A) Los conjuntos de datos

Las secuencias se extraen de la base de datos GenBank. Los conjuntos de datos para el
anlisis de seleccin y recombinacin incluyen secuencias CDV adquiridos de los perros y
los host no perro. Los conjuntos de datos se construyeron para F (n = 13, 1782 bp), H (n =
73, 1812 bp), L (n = 9, 6552 bp), M (n = 11, 1005 bp), N (n = 12, 1569 bp) y P (n = 9,
1521 pb) genes (nmeros de acceso disponibles en el cuadro S1 en el material
complementario electrnico y figura 1 ) y comprende todas las secuencias de larga duracin
en distintos disposicin del pblico en el momento de la escritura. Las secuencias fueron
alineadas utilizando CLUSTAL X ( Thompson et al., 1997 ).
Figura 1
Relacin filogentica entre las cepas del CDV basado en H secuencias de genes y la
distribucin de los residuos de la protena H en sitios bajo seleccin positiva a travs de
linajes. PDV-1 cepas fueron utilizados como fuera del grupo y slo la topologa del rbol se
muestra para mayor claridad. ...

(B) Anlisis de Seleccin

Para investigar las presiones de seleccin en las secuencias de genes, el mtodo de mxima
probabilidad deYang et al. (2000) se llev a cabo. El mtodo calcula d N / d
cocientes S (valor ), teniendo en cuenta las relaciones filogenticas entre los taxones, y el
uso de codones y sesgos transicin / transversion para una serie de modelos ( Yang
1997 ). La promedios modelo el valor M0 entre 0 y 1 El modelo M1a de evolucin
neutral calcula la proporcin de sitios que se conservan ( = 0, p 0) y con neutralidad en
evolucin ( = 1, p 1). El modelo M2a extiende el modelo M1a mediante la incorporacin
de una tercera clase de sitios (p 2) que puede estimar > 1, por lo tanto, teniendo en cuenta
la seleccin positiva. El modelo M3 de seleccin positiva estima la relacin por tres
clases de sitios (p 0, p 1 y p 2). Un segundo modelo de evolucin neutral, el modelo M7,
calcula los valores de entre 0 y 1 para 10 categoras utilizando una distribucin discreta
(controlado por los parmetros p y q). El modelo M8 extiende el modelo M7 de la
evolucin neutro mediante la adicin de dos parmetros que estiman > 1 para una clase
adicional de los sitios, y por lo tanto tiene en cuenta la seleccin positiva. Comparacin de
los valores de probabilidad para los modelos anidados por pruebas de coeficiente de riesgo
(LRTs) determina si los modelos de seleccin positiva (M2a, M3 y M8) son
significativamente ms propensos que los modelos de evolucin neutral (M1a y M7). Los
mtodos bayesianos se utilizan para localizar sitios especficos que han> 1 con
probabilidades altas posteriores. El anlisis se llev a cabo utilizando el
programa CODEML del paquete PAML ( Yang 1997 ).
(C) anlisis de recombinacin

El programa SOMBRERO DE LD se utiliz para estimar la tasa de recombinacin

poblacin () y la tasa de mutacin de la poblacin ( de Waterson) utilizando un mtodo
de probabilidad compuesta de un conjunto de secuencias alineadas ( McVean et
al. 2002 ). Las estimaciones se basan en sitios biallicas donde la frecuencia de alelos fue
mayor que 0,1. La importancia de las tasas de recombinacin, se analiza una hiptesis nula
de ninguna recombinacin ( = 0) a travs de un enfoque basado en la permutacin de la
verosimilitud. Estimaciones relativas de la tasa de recombinacin poblacin son robustos a
violacines de los supuestos clave del modelo, como la presencia de la seleccin
( Richman et al 2003. ; Smith & Fearnhead 2005 ). (| Medidas alternativas de
recombinacin r 2 y | D ' Awadalla et al 1999. Tambin se evaluaron). Las pruebas de estas
medidas se basan en la correlacin de desequilibrio de ligamiento (LD) con la distancia
entre pares de sitios polimrficos, bajo la expectativa de que una disminucin significativa
en LD con la distancia significa que la recombinacin se ha producido dentro de una
poblacin ( McVeanet al. 2002 ). El programa GENECONV, v. 1.81 (Sawyer 1989 , 1999 ),
se utiliz para identificar eventos de conversin intragenic recombinacin / genes.

(D) El anlisis filogentico

Se identificaron los modelos ms apropiados de evolucin molecular para su uso en los

anlisis filogenticos utilizando el programa T ENERADOR M ODEL ( Keane et
al. 2006 ). rboles filogenticos para el gen H se construyeron utilizando mtodos de
probabilidad bayesiana y Mximo. Bayesiano rboles se obtuvieron
utilizando MRBAYES v. 3.1.1. ( Hulsenbeck y Ronquist 2001 ). Tres anlisis replicados se
llevaron a cabo durante un mnimo de 1 000 000 generaciones para garantizar la
convergencia de las cadenas de MCMC, con un 20% perodo de ablande aproximado
evaluado por la desviacin estndar entre las cadenas que caen por debajo de
0,05. Filogenias de mxima verosimilitud con el apoyo derivado de 1000 repeticiones de
arranque se construyeron en TREEFINDER ( Jobb et al. 2004 ).
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3. Resultados
(A) La deteccin de la seleccin

Para el gen CDV H, 73 secuencias CDV aisladas de los perros y los host no perro
(ver figura 1 ) se analizaron, con exclusin de la
vacuna sequences AF259552 , AF378705 , AB212966 and Z35493 .Probabilidad de
resultados fueron ms altas en los modelos de seleccin positiva (M2a, M3 y M8, Tabla S2
en el material complementario electrnico). 0,09% de los sitios tena un valor de 2,51, y
2,3% de los sitios tenan un valor de 1.886 para los modelos M3 y M8,
respectivamente. Esto sugiere que una pequea proporcin de residuos estn bajo la
influencia de la seleccin positiva. LRTs se realizaron entre modelos anidados de identificar
el modelo ms probable. El modelo M7 fue rechazada en favor del modelo M8 con alta
probabilidad ( 2 = 12,01, p = 0,0025), demostrando que la relacin observado es
significativamente mayor que 1 ( tabla 1 ). Bajo el modelo M8 de seleccin positiva, 10
residuos individuales se identificaron como bajo la influencia de la seleccin
positiva (> 1) por anlisis Bayesiano (Pginas 29 (Pr > 1 = 0.803), 178 (0.541),
180 (0.929) , 225 (0.608), 386 (0.552), 412 (0.669), 475(0.784), 530 (0.973), 549 (0.865) y
603 (0.868)). El soporte posterior Bayesiano para algunos sitios es relativamente baja
cuando se toma solo, pero el soporte para el sitio 530 y 549 de claves (que est tambin en
la regin de unin a SLAM) se encuentra entre las ms altas identificado. Sitio 548 no se
identific a los menores de la seleccin. Presentamos todos los sitios con > 1 como la
distribucin filogentica de estos sitios entre las cepas del CDV es informativo. Valores de
probabilidad posterior bayesiana para sitios con Pr0.75 se muestran en cursiva.

Tabla 1
Pruebas de coeficiente de riesgo (LRTs) entre los modelos para el anlisis de seleccin en
CDV. (LRTs se calculan tomando el doble de la diferencia entre los dos modelos de
evolucin codn y la comparacin con una distribucin de 2. P valores significativos (en
cursiva) indicar ...

Anlisis de larga duracin secuencias de genes para CDV F, L, M, N y P genes no revel

relaciones que fueron significativamente superiores a 1 basado en LRTs, y por lo tanto la
seleccin positiva no puede ser detectado en estos genes. Dentro del gen F, una minora de
los sitios (. Aprox 24%) fueron confirmados como evolucin neutral (donde = 1, el
cuadro S2 en el material complementario electrnico), una observacin apoyada por el
rechazo del modelo M0 de purificacin de seleccin por LRT (donde <1) a favor de los
modelos que incorporan la evolucin neutral ( tabla 1 ).
Para el gen H, se observaron las mayores puntuaciones de probabilidad en los modelos de
seleccin positiva (M2a, M3 y M8, el cuadro S2 en el material complementario
electrnico). Sin embargo, ninguno de estos modelos podra aceptarse en favor de modelos
anidados de la evolucin neutral ( tabla 1 ). Una alta proporcin de los sitios en este gen
son altamente conservadas (aprox. 98%) y probablemente est limitado por la depuracin

de seleccin (tabla S2 en el material complementario electrnico). LRTs sugieren que el

gen L est altamente conservada ( tabla 1 ), con una pequea proporcin (4.5 a 8.2%) de
evolucin de los sitios neutral (tabla S2 en el material complementario electrnico). La
seleccin positiva no fue significativa en el anlisis del gen N conjunto de datos, de nuevo
el modelo M0 fue rechazada en favor de los modelos de evolucin neutral ( tabla 1 ), y esto
sugiere que la mayora de los sitios se conservan (aprox 92%;. tabla S2 en el material
complementario electrnico). Anlisis del gen P no muestra ninguna seal significativa de
seleccin positiva ( tabla 1 ). El modelo M0 fue rechazada en favor de modelos
neutral. Una alta proporcin de los sitios se conservan y una proporcin de sitios podra
estar bajo dbil seleccin positiva (aproximadamente 72%). ( = 1,18341; tabla S2 en el
material complementario electrnico), pero esto no se puede confirmar que el modelo M8
no poda ser aceptado sobre el modelo M7.
(B) Deteccin de la recombinacin

Las estimaciones de la tasa de recombinacin poblacin () para los genes CDV variaron
desde 1,202 hasta 23,835 ( tabla 2 ). La seal ms fuerte de la recombinacin se identific
en el gen F ( tabla 2 ), los valores de = 23.835 y devolviendo | D | = -0,0516, ambos de los
cuales fueron significativamente diferentes de cero (p <0,01). Pruebas de permutacin
de r 2 arrojaron resultados significativos marginal (p = 0,049) para el gen L CDV, y un
resultado borderline similares fue devuelto para el gen N con el | D '| estadstica (p =
0,044). No hay pruebas estadsticas fueron significativamente diferentes de cero para los
genes H, M y P. TENECONV identific dos pares de secuencias recombinantes en el
gen F de perro asla ( AY964108 : AY964114 and AY964112 : AY964114 ), y ninguno
para el gen H. En el gen F, las secciones recombinantes ponen entre los nucletidos 907 y
1361 (aminocidos 302 a 453) del dominio de codificacin en ambos pares de secuencias
recombinantes.

Tabla 2
Anlisis de recombinacin en CDV. (Clculo de 4 N e r (), las puntuaciones de correlacin
de r 2 y | D '| contra la distancia, y la permutacin pruebas para evaluar si cada estadstica
fue significativamente diferente de cero se realizaron en el paquete ...LDHAT.
(C) El anlisis filogentico de las secuencias de CDV H y distribucin de los sitios de
genes bajo seleccin positiva

Con el fin de mapear la distribucin filogentica de los sitios identificados como estar bajo
la seleccin positiva en el gen H, hemos reconstruido las relaciones filogenticas entre las
cepas CDV sobre la base de la alineacin de nucletidos de secuencias de genes
completos H ( figura 1 ). Bayesiano posterior probabilidades y los valores de mxima
verosimilitud de arranque dentro de clados continentales no se muestran para mayor
claridad de la figura, pero fueron consistentemente alta.
Nuestro anlisis identifica los mismos clados geogrficos para CDV aislados que han sido
reportados previamente ( Hashimoto et al 2001. ;. Martella et al 2006 , 2007 ). Sin
embargo, la topologa derivada en nuestro anlisis, enraizada con el virus del moquillo
Focino (PDV-1) de las cepas, tiene el apoyo valores consistentemente ms altos que los
estudios anteriores y coloca el clado basal rtico similar a la clado Asia-2.
Mapeo de la distribucin de las sustituciones en los sitios identificados para estar bajo la
influencia de la seleccin positiva en la filogenia mostraron que la mayora de las
sustituciones de aminocidos se concentraron en no perro aislamientos de acogida ( figura
1 ). En particular, las sustituciones en los sitios 530 y 549 se presentan predominantemente
en CDV aislamientos obtenidos de especies huspedes nuevos, lo que indica que la

propagacin de la CDV en estos hosts no perro se asocia con la evolucin en estos

sitios. Seis diferentes residuos (D, E, G, N, R y S) se observan en el residuo 530 de la
protena CDV H ( figura 1 ). La mayora de los CDV aislados de perros (46/52) tienen ya
sea 530G o 530E, 530E, donde se distribuye en todos los de Asia y 2 aislados. 530G se
observa en los aislados europeos Asia-1 y, al igual que toda la Amrica-2 del clster
excluyendo dos mapache aislamientos ( figura 1 ). De 21 huspedes no perro, 9 (especies
hospedantes: mapache, hurn, visn, Mustela vison, zorro rojo, Vulpes vulpes, panda rojo y
sello Baikal) tener sustituciones de E / G530 a R, D o N residuos. Esto proporciona apoyo
adicional junto con la evidencia experimental de que el sitio 530 podra ser importante en la
determinacin de tropismo de acogida ( Seki et al. 2003 ).
Doce huspedes no perros no tienen una sustitucin de E / G530. Sin embargo, 7 de estos
12 aislamientos (especies husped: leopardo negro y leopardo Panthera pardus, hurn y
mapache) tienen Y549H sustitucin, que se identific a estar bajo la influencia de la
seleccin y mapas positivo a un dominio de unin al receptor ( figura 1 ). Por otra parte, la
sustitucin Y549H slo se observa en tres secuencias de vacunas. Adems, un mapache
aislar y el zorro colorado aislar tienen sustituciones en ambos 530 y 549 sitios ( figura
1 ). Las sustituciones en posiciones de residuos 29, 178 y 603 tambin podran estar
asociados con interruptores de acogida, aunque la fuerza de la evidencia de su participacin
es ms dbil que los residuos 530 y 549 ( figura 1 ). E29D se observa en cuatro
aislamientos no perro y un aislamiento de acogida perro. 178S slo se observa en la noperro aislamientos. Por ltimo, las sustituciones de H / S603 se observan en un aislado
perro, dos mapache asla, uno de leopardo negro y un aislamiento de leopardo. Los cambios
en los residuos 180, 225, 386, 412 y 475 no muestran ninguna asociacin para acoger
especificidad.
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4. Discusin
Se evalu la funcin de la evolucin en la conduccin de los interruptores de acogida y la
aparicin de la CDV, uno de los patgenos ms importantes de carnvoros, en especies
husped no perro. CDV es un candidato ideal para el estudio de la funcin de la evolucin
de patgenos en los interruptores de acogida, no slo porque se infecta una gama de
huspedes diversa y es una importante amenaza para los carnvoros silvestres de inters
para la conservacin ( Mamaev et al 1995. ; Harder et al 1996. ; Kennedy . et
al 2000 ;. Cleaveland et al 2006 ), sino tambin porque su biologa molecular y celular
estn bien caracterizados con estructuras terciarias predijo para las molculas de virus
clave. Esto permite un enfoque de prueba de hiptesis para ser utilizado en pruebas de la
evolucin en los residuos especficos de virus con una funcin conocida se puede

evaluar. Utilizando enfoques evolucin filogentica y moleculares, hemos probado la

hiptesis especfica de que la adaptacin molecular en los residuos 530 y 548 de la protena
hemaglutinina CDV, que estn involucrados en tropismo receptor, se asocia con los
interruptores de acogida y la propagacin de CDV a los hosts no perro. Se encontr que el
sitio 530 es de hecho bajo una fuerte seleccin positiva, junto con el sitio 549, otro residuo
en la regin de unin al receptor SLAM, pero no sitio 548. La gran mayora de las
sustituciones de aminocidos en estos sitios mapa para CDV aislamientos derivan de no
anfitriones perro, lo que indica que la adaptacin en estos sitios de unin al receptor se
asocia con la propagacin de la CDV de los perros a los ejrcitos no perro. El estudio
proporciona evidencia convincente de la evolucin de patgenos conducir mltiples
emergencias independientes de enfermedad en nuevos anfitriones, y sugiere que la
evolucin de patgenos es probable que sea un conductor en general importante de la
propagacin de enfermedades a rangos de hospedantes nuevos junto a otros pilotos
humanos mediada.
Nuestro anlisis revela seales de la seleccin y recombinacin de diferentes genes de la
poblacin mundial CDV. Anlisis del gen CDV H revela tanto que la relacin global es
significativamente mayor que 1 bajo el modelo M8 (p = 0,0025), y que un pequeo nmero
de residuos especficos son importantes en la evolucin adaptativa de CDV a travs de la
seleccin positiva, debido a sus interacciones con receptores celulares o con el sistema
inmune del husped.
La evidencia experimental de los estudios de unin al receptor in vitro muestra que los
residuos 527, 528, 529 y 552, conservados entre todas morbilivirus, son cruciales para la
fusin dependiente SLAM CDV (von Messling et al. 2005 ). Los residuos 526, 547 y 548
tambin son importantes en la fusin SLAM dependiente eficiente. Estos grupos se
encuentran en -hoja 5 de la estructura terciaria de protenas H predicho, y se predice que
sea accesible para la interaccin del receptor ( Figura 2 ; von Messling et al
2005. ). Previamente se ha determinado que la mutacin de sitio de 530, adems de la
sustitucin en el sitio 548, de la protena H era crtico en la adaptacin de CDV de clulas
Vero a las clulas de tit B en cultivo, lo que significa la adaptacin de la fusin CD46dependiente Slam- fusin dependiente ( Seki et al. 2003 )

Figura 2
Protena CDV H predijo estructura terciaria ( von Messling et al.2005 ). Los residuos 527,
528, 529 y 552 (requerido para la fusin SLAM-dependiente y conservada entre todos los
morbilivirus), as como restos 526, 547 y 548 (tambin importante en la fusin SLAMdependiente)
Residuo 530 (Pr > 1 = 0.969) fue identificado por nuestro anlisis como estar bajo la
influencia de la seleccin positiva. No hay seal de seleccin positiva se detect en el lugar
548, lo que sugiere que este residuo no es un factor determinante del tropismo en la
naturaleza; Sin embargo, la seleccin positiva se detect en el sitio 549. residuos 530 y 549
ambos caen en dominios de unin a receptores situados en la hlice -hoja 5 de la molcula
de hemaglutinina ( figura 2 ). Esta evidencia indica que la adaptacin molecular de los
residuos 530 y 549 puede cambiar la afinidad de la interaccin entre la protena CDV H y
SLAM en diferentes especies husped, y apoya nuestra hiptesis de que la adaptacin
molecular en los dominios de unin al receptor se asocia con incidentes independientes de
propagacin de CDV a hosts no perro. MV H residuos 534 y 553 (correspondiente a los
sitios CDV 530 y 549) no estn bajo la influencia de la seleccin positiva ( Woelk et
al. 2002 ). Adems de las interacciones de los receptores, los eptopos de clulas B (BCES)
y eptopos de clulas T (ECT) tambin son reportados para localizar a la protena CDV H, y
la regin antignica de la protena H se ha informado que han cambiado en los ltimos
campo CDV aislamientos ( Orvell et al 1985. ; . Iwatsuki et al 2000 ). Sin embargo, las
conclusiones respecto a los residuos CDV H bajo la influencia de la seleccin inmune no se
pueden sacar en este momento como metodologas de prediccin actualmente slo
describen eptopos humanos y de ratn.
Se determin la distribucin filogentica de sustituciones en todos los sitios identificados
para estar bajo la influencia de la seleccin positiva ( figura 1 ). Sorprendentemente, del
husped 21 no perro aislamientos 9 tienen un / G530D / sustitucin N / R E, 8 tienen una
sustitucin Y549H y 2 tienen sustituciones en ambas posiciones de residuos ( figura
1 ). Adems, las secuencias de genes H parciales de CDV aislados de la epidemia del ao

2000 en focas del Caspio contienen ambas sustituciones E / G530N y Y549H (datos no
mostrados-Barrett y Banyard 2007, datos no publicados). El anlisis filogentico (no
mostrado) indica que estas secuencias forman un solo racimo que diverge despus de la
America-clado 1, pero basal para el clado Arctic-similares. Como no se trataba de
secuencias de longitud completa, no se incluyeron en el anlisis completo.
Las sustituciones en los residuos 530 y 549 estn asociados con CDV aislado de especies
huspedes nuevos, ya la luz de nuestro anlisis, tales sustituciones tambin se pueden
observar directamente en las infecciones experimentales. En un estudio anterior de von
Messling et al. (2003) , CDV cepa 5804 se pas experimentalmente a travs de los hurones
que producen la cepa adaptada hurn 5804P ( AY386316 ) que diferan de la cepa parental
5804 perro ( AY396315 ) en los residuos 106 y 549 de la protena hemaglutinina. Esto
proporciona una fuerte evidencia experimental para un papel funcional de residuo 549 en
los conmutadores de acogida. Un anlisis ms detallado de la funcin de los residuos 530 y
549 mediante la manipulacin de secuencias virales e infecciones experimentales
proporcionara ms informacin sobre los mecanismos que determinan el tropismo de
acogida para este virus. En los anlisis generales que combinan filogentico, evolucin
molecular y enfoques experimentales es probable que sean rutas productivas para la
investigacin de la base evolutiva de los interruptores de acogida en muchos patgenos
virales.
Estadsticamente no se detect evidencia significativa para la seleccin positiva en los
anlisis de los genesF, L, M, N y P. Estos anlisis sugieren que una proporcin de los sitios
en estos genes se conservan, y que una pequea proporcin de los sitios estn
evolucionando neutral. En particular, el anlisis de la L y Mgenes sugieren que una alta
proporcin de los sitios se conservan, y es probable que estar sujeta a la purificacin de
seleccin, como se identifica anteriormente en el virus del sarampin y los genes M
L (Woelk et al. 2002 ). La alta conservacin de la secuencia identificada en el L y las
protenas M podra ser debido a papeles cruciales en la transcripcin y la replicacin viral,
y la formacin ltica, respectivamente (Lamb y Kolakofsky 2001 ). La falta de seal de
seleccin a partir del gen CDV F es sorprendente cuando los estudios anteriores
identificaron la seleccin inmune en el gen F y MV mapeadas residuos seleccionados para
BCES y ECT, pero podra ser debido al pequeo nmero de secuencias de longitud
completa de genes actualmente disponibles para el anlisis (Muller et al. 1993 , 1996 ; van
Binnendijk et al 1993. ; . Woelk et al 2002 ). La recombinacin tambin podra ser un
factor de confusin, pero esto es ms probable que genere una falsa seal de seleccin
( Anisimova et al. 2003 ). Nuestros anlisis sugieren que los genes N y P CDV no estn
bajo la influencia de la seleccin positiva, a pesar de sus interacciones conocidas con la
respuesta inmune del husped ( Tipold et al 1999. ; Yoshida et al 1999. ; Gotoh et al
2001. ; Palosaari et al . 2003 ; . Shaffer et al 2003 ; Kerdiles et al 2006. ). La disponibilidad

de CDV secuencias de genes aislados a partir de una gama ms amplia de especies husped
aumentara el poder del anlisis y permitir una evaluacin ms detallada de las presiones de
seleccin que actan sobre el CDV F, N y P genes. El presente trabajo evalu todos los de
larga duracin secuencias de genes H a disposicin del pblico en el momento de la
escritura. Sin embargo, hay CDV aislados de epizootias en los ejrcitos no perro para los
que no se dispone de la secuencia que abarca la regin de unin SLAM-, o la longitud
completa del gen F, lo que sera muy informativo para evaluar en el futuro. De especial
inters sera cepas de los leones del Serengeti y focas del Caspio ( Roelke-Parker et al
1996. ; Carpenter et al., 1998 ;Kennedy et al 2000. ).
Estudios anteriores han revelado la importancia de la recombinacin en la conformacin de
la diversidad de virus ARN y identificado que los actos de recombinacin en los niveles
inferiores en los virus de ARN monocatenario de sentido negativo en comparacin con
otros virus de ARN ( Worobey y Holmes 1999 ;McVean et al 2002. ; et
al Chare . 2003 ; Schierup et al 2005. ). En nuestro estudio, aunque hay evidencia de
recombinacin en el gen F, en el que dos pruebas de permutacin alternativas arrojaron
estimaciones de recombinacin que fueron significativamente diferentes de 0 y dos pares de
secuencias recombinantes se identificaron en perro aislamientos, los resultados para otros
genes deben ser tratados con precaucin. Para los genes L y N, los resultados
marginalmente significativos pueden ser errores de tipo I. La recombinacin no se detect
en un ensayo de sitio informativo de CDV F secuencias de genes en un estudio anterior
(Chare et al. 2003 ). En teora, la variacin en el gen F proporcionada por recombinacin
podra cambiar las interacciones entre proteasas especficas de tejido de acogida y la
protena F, influyendo as en el tropismo ( Lamb & Kolakofsky 2001 ). Sin embargo, los
segmentos recombinantes identificados por el anlisisENECONV G no se asignan a las
regiones con un papel conocido en la especificidad del hospedador.Alternativamente, la
recombinacin podra ser impulsado por la seleccin inmune, pero de nuevo sin el
conocimiento de los eptopos generados a partir de este gen esta debe permanecer como la
especulacin en este momento. Nuestra estimacin gen H (6,00) es ligeramente inferior a
las estimaciones previas en el gen MV H (7,2 a 15,8; Chare et al 2003. ; Schierup et al
2005. ). La razn subyacente detrs de los bajos niveles aparentes de recombinacin en los
paramixovirus no se entiende actualmente. La plantilla paramixovirus para la replicacin
permanece a la 'la regla de las seis ", que dicta que cada monmero nucleocpside est
estrechamente asociada con seis nucletidos por enlaces hidrfobos. Aunque esto evita la
presencia de ARN viral desnudo, tambin plantea la cuestin de cmo se produce el
reconocimiento de plantilla con el fin de permitir la recombinacin tenga lugar,
posiblemente ofrecer una explicacin para los bajos niveles aparentes de recombinacin en
virus de ARN de sentido negativo ( Egelman et al. 1989 ).Nuestro anlisis detecta niveles
ms elevados de recombinacin en la glicoprotena genes; esto podra aumentar la variacin

en las protenas que son determinantes de tropismo celular y se someten a los anticuerpos
neutralizantes, un beneficio evidente para una poblacin de virus ( Orvell et al
1985. ; Lamb & Kolakofsky 2001 ; . Hirama et al 2002 ).
Pocos estudios han detectado sustituciones en sitios funcionales especficos en protenas
patgenas que median la adaptacin molecular de un patgeno a diferentes especies
husped. Con el fin de la influenza aviar A para saltar anfitriones a los seres humanos, que
debe adaptarse el uso de la forma aviar (SA2,3Gal) a la forma humana (SA2,6Gal) del
receptor de cido silico (SA). Variacin en HA residuos 226 y 228 en H2 y H3 serotipos
mucho tiempo han sido conocidos por estar asociados con la especificidad del receptor host
( Connor et al. 1994 ). Ms recientemente, las sustituciones N182L y Q192R del virus
H5N1 de la gripe HA molcula fueron identificados para convertir tiene que reconocer
SA2,6Gal lugar de SA2,3Gal ( Yamada et al. 2006 ). Aunque la mutacin en estos sitios
puede no solo ser suficiente para causar una pandemia total, que se pueden seleccionar en
las primeras fases de la infeccin humana y sirven como buenos indicadores para la
evaluacin de la capacidad de campo H5N1 aviar aislados de replicarse en los humanos. El
potencial del H5N1 para adaptarse a los seres humanos y emerger como una cepa
pandmica se puede medir por la vigilancia de los sitios 182 y 192 en las poblaciones de los
aislamientos de campo de aves ( Yamada et al. 2006 ). En el caso de CDV, si la evidencia
experimental confirma el papel influyente de los sitios 530 y 549 de la protena H CDV en
la adaptacin molecular de CDV en nuevos anfitriones, a continuacin, la vigilancia de
estos sitios sera una tcnica informativa para evaluar el potencial de la CDV para difundir
a las poblaciones de fauna nuevos. Esto podra llegar a ser una herramienta valiosa para la
lucha contra una enfermedad infecciosa que ya ha sido asociado con la disminucin de las
poblaciones de carnvoros silvestres, y el impacto de los cuales es probable que aumente en
el futuro.
Nuestro anlisis muestra que la evolucin de patgenos juega un papel crucial en el
establecimiento de CDV en especie husped carnvoro novedosos. Nuestros hallazgos
constituyen uno de slo un pequeo nmero de casos en los que se repite aparicin
independiente de un patgeno en nuevos hosts se asocia con la evolucin del patgeno en
los residuos funcionales clave que determinan la especificidad del
hospedador. Probablemente el mejor ejemplo proviene de otra lentivirus (que son tambin
los virus de ARN y que incluyen la del simio (SIV) y (virus) de la inmunodeficiencia
humana VIH) en los primates africanos. Aqu, mltiples especies de saltos por diferentes
virus SIV se han documentado, con evidencia de infeccin en al menos 26 especies,
asociada con polimorfismos en las regiones de bucle V2 y V3 del gen env, que estn
implicados en las interacciones con los receptores de acogida y determinan el tropismo
celular ( Hahn et al. 2000 ). Variacin adaptativa tambin ha sido implicado en especies
salta de lentivirus felinos ( Poss et al. 2006 ). Together with other examples such as avian

influenza and canine parvovirus, these present a growing body of evidence for the general
importance of pathogen evolution in disease emergence, and in the case of host switches by
viruses, that subtle adaptations in receptor-binding regions which determine host cell
tropism may be an important step for establishment in new hosts. Of course other
functional adaptation may also be important for, or arise after establishment in new hosts
( Webby et al. 2004 ), as evidenced by the substitutions which modulate virulence in the
VEEV and WNV examples.La relativa rareza de estos ejemplos hasta ahora probablemente
refleja la falta de datos de la secuencia de los aislados virales de mltiples especies
anfitriones e informacin detallada acerca de la biologa celular y la estructura de las
protenas virales que impiden el acercamiento de probar la hiptesis tomado aqu y en los
otros estudios resaltados. Los desafos futuros son aumentar nuestra comprensin de cmo
estos procesos evolutivos interactan con las nuevas presiones de seleccin sobre
patgenos derivados de los conductores humanos tales como la globalizacin, la
intensificacin de la agricultura y de impacto en nuevos hbitats, para promover la
aparicin de enfermedades. La unificacin de la identificacin de la adaptacin funcional
con estimaciones moleculares de la poca de los hechos la aparicin de enfermedades y la
vinculacin de stos a los cambios conocidos en los conductores humanos probablemente
ofrecer una forma productiva hacia adelante.
CDV belongs to the genus Morbillivirus , other members of which have also caused mass
mortalities among wildlife and livestock. The introduction of rinderpest virus to East Africa
in the 1880s caused mortality levels of up to 90% among wild bovid populations such as
buffalo Syncerus caffer , lesser kuduTragelaphus imberbis and eland Taurotragus
oryx ( Plowright 1982 ; Kock et al. 1999 ), and PDV has emerged in harbour seals, Phoca
vitulina and grey seals, Halichoerus grypus of Europe causing mass mortalities
( Harkonen et al. 2006 ). Evaluacin del papel de los residuos de genes ortlogos H de 530
y 549, en otros morbilivirus, en adaptacin a nuevos anfitriones molecular indicara si los
mismos mecanismos evolutivos operan en los conmutadores de acogida de los miembros
del gnero Morbillivirus.Estos sitios y sitios similares en otros ARN virus implicados en la
unin al receptor pueden ser objetivos potenciales para terapias antivirales. This research
shows how combining molecular evolutionary and phylogenetic analysis with findings on
the functional and structural properties of pathogen proteins can yield important insights
into the process of disease emergence, and could prove crucial in accurately predicting the
impact of and planning response to disease emergence.
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Agradecimientos
We thank Roberto Cattaneo for providing the predicted tertiary structure of the
CDV H protein, and Tom Barrett and Ashley Banyard of the Institute for Animal Health,

Pirbright, UK, for giving us access to their unpublished sequence for the H gene of the
Capsian seal CDV isolate. Dos rbitros annimos aportaron valiosos comentarios que
ayudaron a mejorar el manuscrito original. AJM was supported by a BBSRC PhD
studentship.