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HIBRIDOMAS Y ANTICUERPOS
MONOCLONALES
MSc. Adriana Paredes Arredondo
adriana.paredes.a@upch.pe
Modulo II Inmunotecnologa
17/05/2016
Activacin clonal
Respuesta
Monoclonal
Respuesta
Monoclonal
Antgeno
(multiepitopes)
Respuesta
Monoclonal
Respuesta
Monoclonal
Respuesta
Policlonal
Desventajas
Altos costos de produccin
Equipamiento adecuado
Entrenamiento especializado
17/05/2016
Etapas en el desarrollo de un
anticuerpo monoclonal
1. Inmunizacin
2. Fusin (generacin de hibridomas)
3. Seleccin de hibridomas
4. Seleccin de clonas especficas
5. Produccin de los AcMo
6. Purificacin y caracterizacin de los AcMo
Generacin de linfocitos B
productores de Ac especficos
Seleccin del
Antgeno
Da 1
Inmunizacin
Da 21
Da 35
Da 26
Da 38
Fusin
Control
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Generacin de hibridomas
Antgeno
Seleccionado
2. Fusin
Cel de mieloma
SP2/0
Cel plasmticas
del bazo
+
1
4 5
7 8
9 10 11 12
A
B
C
D
E
F
G
H
1. Inmunizacin
3. Seleccin de los
Hibridomas con
suplemento HAT
Generacin de hibridomas
4. Crecimiento de los hibridomas
9 10 11 12
A
B
C
D
E
F
G
H
1 2
A 12
B
C
D
E
F
G
H
7. Expansin, congelamiento
y caracterizacin
9 10 11
6. Clonamiento
17/05/2016
Generacin de hibridomas
Generacin de hibridomas
17/05/2016
Investigacin
Bsica
Inmunoterapia
17/05/2016
Conjugacin de anticuerpos
Enzimas
Enzimainmunoensayos
Radioisotopos
Radioinmunoensayos
Fluorocromos
Inmunofluorescencia
Nanochips
Biosensores
Biotina
AmplificacinEstreptavidina
Oro Coloidal
Inmunoprecipitacin
PURIFICACIN DE
ANTICUERPOS Y ANTIGENOS
MSc. Adriana Paredes Arredondo
adriana.paredes.a@upch.pe
Modulo II Inmunotecnologa
17/05/2016
1. Purificacin de
Anticuerpos
Purificacin de anticuerpos:
precipitacin con compuestos qumicos
17/05/2016
Purificacin de anticuerpos:
cromatografa de afinidad con protena A/G agarosa
Protena a ser
purificada:
Anticuerpo
Ligando:
Proteina A
Fracciones colectadas
Fracciones
colectadas
Medicin de
protenas
a 280 nm
17/05/2016
Especie
Humano
Ratn
Rata
Conejo
Tipo de Ig
Protena A
Protena G
IgG1
fuerte
fuerte
IgG2
fuerte
fuerte
IgG3
no se une
fuerte
IgG4
fuerte
fuerte
IgG1
dbil
fuerte
IgG2a
fuerte
fuerte
IgG2b
media
media
IgG3
dbil
media
IgG1
no se une
fuerte
IgG2a
no se une
fuerte
IgG2b
no se une
fuerte
IgG2c
dbil
fuerte
IgG
fuerte
dbil
Produccion de Ac en biorreactores
Adaptacin de los
hibridomas al medio
qumicamente
definido
7mo da de
cultivo
Inoculo inicial
1.5 x 106 cel/ml
Tomar
alcuotas a los
2, 5 y 7 das.
Evaluar
viabilidad,
concentracin
de protenas,
funcionalidad
de los Ac.
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Concentracin de Proteinas
(mg/ml)
Rendimiento de la produccin de Ac
en biorreactores
7
6
5.84
5
4
3
2
1.84
0.74
0.18
0
0
5
7
Tiempo (das)
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2. Purificacin de
protenas
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Caractersticas de la protena a
considerar para la purificacin
1. Peso molecular
2. Carga inica
3. Hidrofobicidad
4. Unin especfica a ligandos
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Sephadex,
agarosa,
poliacrilamida,
etc
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Intercambio aninico
Cromatografa de afinidad
Se basa en la afinidad biolgica
especifica de cada protena hacia un
ligando en particular, como por ejm.
Protena Ligando
Enzima Sustrato
Receptor Hormona
Anticuerpo Antgeno
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Particulas magneticas
Ventajas
Capacidad de explotar sus propiedades bioqumicas
(nicas).
Se evitan varios pasos de purificacin que con otras
tcnicas clsicas .
Normalmente se obtienen altos rendimientos y alta
actividad especifica .
Se pueden separar protenas, enzimas, anticuerpos,
membranas, receptores, vitaminas, antgenos incluso
clulas enteras
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