1) Qual a diferena entre esterilizao e desinfeco?

Esterilizante o processo de destruio ou remoo de todas as

formas de vida microscpica de um objeto ou espcime. Desinfetante
uma substncia qumica que mata as formas vegetativas, mas no
necessariamente as formas esporuladas. O termo normalmente referese a substncias utilizadas em objetos inanimados. Germicida um
termo normalmente utilizado como sinnimo de desinfetante, mas
micro-organismos mortos por germicidas no so necessariamente
patognicos. Antissptico um composto qumico, usualmente aplicado
na superfcie do corpo humano, que previne a multiplicao dos microorganismos por morte ou inibio. Sanitizante: As normas de sade
pblica determinam que, em certos lugares, a populao microbiana
no deve exceder um nmero especfico mantendo-se em nveis
considerados seguros. Sanitizantes para equipamentos que entram em
contato com alimentos so amplamente utilizados na industria para
tratar superfcies.
2.1.

Modo de Ao dos Agentes Esterilizantes

Agentes esterilizantes podem ser classificados como agentes

fsicos ou qumicos. Esses agentes podem induzir, por diferentes
mecanismos, a formao de substncias qumicas letais no interior das
clulas e/ou alteraes em molculas essenciais para a manuteno e
sobrevivncia celular, levando morte do microrganismo.
A morte celular pode ser causada por uma ou mais leses. Na
clula viva normal existem inmeros alvos possveis de leso celular,
tais como: (a) enzimas, responsveis pelos processos metablicos; (b)
membrana citoplasmtica, que mantm a integridade do contedo
celular, controlando o transporte de substncias entre a clula e seu
meio externo, alm de ser tambm o local de algumas reaes
enzimticas; (c) parede celular, que proporciona rigidez e resistncia
mecnica

aos

microrganismos

participa

de

alguns

processos

fisiolgicos. Uma leso em qualquer um desses nveis pode desencadear

alteraes que levam morte celular. Alternativamente, um dano
irreversvel a um gene, responsvel pela codificao de alguma enzima
essencial, tambm pode levar morte celular.

2) Explique o processo de pasteurizao, diferindo os mtodos UHT,

HTST e LTLT. Cite uma aplicao para cada um dos 3?

3) O etanol muito utilizado na concentrao de 70% como agente

desinfetante. Qual a razo para a soluo de etanol ser utilizada
nesta concentrao?
O lcool 70% possui concentrao tima para o efeito bactericida,
j que a desnaturao das protenas do microrganismo torna-se mais
eficiente em presena de gua. A gua facilita a entrada do lcool, por
osmose, para o interior das bactrias ratardando a volatilizao do
lcool e permitindo maior tempo de contato. Nessa concentrao o
etanol destri bactrias vegetativas, porm esporos bacterianos podem
ser resistentes. Fungos e Vrus tambm so destrudos pelo lcool.
O lcool interrompe muitas funes essenciais bactria, embora
no estejam muito claras quais destas interrupes podem levar
morte celular. Os

possveis efeitos so: Destruio da membrana

celular externa por desidratao, afinal o lcool higroscpico e

hidroflico. As molculas de lcool penetram no citoplasma e, como
resultado,

precipitam

Coagulao de

as

enzimas

protenas

responsveis

devido
por

desnaturao.

atividades

celulares

essenciais. Quando se utiliza o lcool (etanol) 99,6% para desinfeco,

ocorre uma coagulao extremamente rpida, no havendo penetrao
no interior da clula e, portanto, no matando o micrbio. Essa atuao
ineficaz

ocorre

concentrao.

devida

rpida

volatilizao

do

etanol

nessa

4) Qual o processos mais utilizado na indstria de bioprocessos

para a esterilizao, calor seco ou mido? Porqu?
Entre os agentes fsicos, o de uso mais frequente o calor mido,
fornecido por vapor de gua saturado. A facilidade de obteno, de
manuseio, sua eficcia e custo relativamente baixo explicam o uso
frequente. O vapor obtido em caldeiras e distribudo por dutos de ao
galvanizado ou ao inoxidvel, isolados termicamente. Pelas altas
temperaturas e presses nas caldeiras, o vapor considerado estril. No
entanto, em alguns casos mais crticos, utiliza-se filtrao em cartuchos
esterilizantes imediatamente antes da entrada do vapor no processo.
Tubulaes e biorreatores, vazios ou carregados com meio de cultura,
so usualmente esterilizados por calor mido.
Na ausncia de umidade, a transferncia de calor mais lenta e
os microrganismos apresentam maior resistncia inativao. Dessa
forma, os tempos de exposio ao calor devem ser muito maiores (cerca
de 3 a 4 horas), para garantir a eficincia da operao de assepsia.
O calor mido inativa as bactrias por desnaturao das
protenas e cidos nucleicos, enquanto o calor seco provoca a oxidao
destas. O vapor dgua tem maior poder de penetrao do que o ar,
tendo maior capacidade de rompimento das pontes de hidrognio.
Devido a isso, o calor mido pode ser considerado um processo mais
eficiente do que o calor seco.
5) Quais as condies (temperatura, presso e tempo) usuais
utilizadas na esterilizao por calor mido?
1. Calor Seco

Incinerao processo drstico de eliminao de microrganismos,

que destri o produto.

Ao

rubro

processo

incandescncia,
microrganismos.

onde

promovendo

os

materiais

so

levados

destruio

de

todos

os

Flambagem processo onde o material e submetido diretamente

ao fogo, seja seco ou embebido em lcool. Bastante utilizado na
desinfeco de alas de vidro.

Estufa esterilizante amplamente utilizado para vidrarias e outros

materiais, submetidos determinada temperatura.
Por meio da utilizao do bico de Bunsen, atravs do calor seco,

pode-se proceder a esterilizao mantendo-se a pea na chama at

tornar-se incandescente.
As bocas de frascos de vidro contendo os meios de cultura devem
sempre que destampados ser aquecidos na chama do Bunsen, por meio
da tcnica de flambagem, sem deixar que se tornem rubros.
A esterilizao por calor seco pode se dar ainda por exposio
prolongada numa estufa a 160oC por no mnimo 45 minutos, a 170oC
por 18 minutos ou 180oC por 7 minutos e meio. Este tipo de
esterilizao utilizada para vidrarias, metais, placas de Petri, etc., mas
no muito efetiva contra bactrias e fungos que produzam esporos
resistentes a secura.
2. Calor mido
2.1.

Esterilizao em Autoclave

A operao simples. Se o vapor gerado internamente, a

primeira providncia completar o nvel de gua at a marca indicada
pelo fabricante. Em seguida, o material ou equipamento a ser
esterilizado colocado na autoclave e a porta fechada. O vapor gerado
ocupa todo o espao interno e deve fluir para o exterior, por uma vlvula
de descarga, expulsando assim todo o ar contido na autoclave e nos
materiais (incluindo meios de cultura) e equipamentos presentes.
Aps a expulso do ar (150 a 30 minutos, em geral) a vlvula de
descarga fechada e a presso e temperatura interna devem subir at a
temperatura e presso de esterilizao (geralmente, 121 C e 1 atm).
Atingida a condio de esterilizao, o sistema de aquecimento ou a
entrada de vapor devem ser controlados para manter estveis a presso
e temperatura.

A etapa de resfriamento inicia-se com o desligamento do

aquecimento ou fechamento da entrada de vapor. A autoclave s deve
ser aberta aps a temperatura chegar prxima da ambiente, j que uma
despressurizao brusca pode provocar danos aos sensores colocados
no interior dos reatores, como sondas de pH e de oxignio dissolvido.

Endosporos e Esterilizao pelo Calor

Algumas

bactrias

produzem

clulas

altamente

resistentes,

denominadas endosporos. A resistncia que as clulas vegetaticvas e os

endospros de um mesmo organismo apresentam ao calor varia
consideravelmente. Nas condies fornecidas por uma autoclave os
endosporos podem requerer de 4 a 5 minutos para uma reduo
decimal enquanto clulas vegetativas para mesma reduo requerem
aproxidamente 1 minuto em temperatura mais baixa. Devido a essa
diferena, os procedimentos de esterilizao por calor devem ser
previamente planejados.
2.1.

Esterilizao de Reatores Vazios

A esterilizao de reatores vazios consiste em injetar vapor

diretamente em seu interior e promover inicialmente a expulso de todo
o ar presente. Aps a expulso do ar, o reator fechado e injeta-se vapor
at que a temperatura e presso internas sejam adequadas, comumente
121 C e 1 atm. A partir desse momento, e por todo o tempo de
esterilizao, novas injees s so necessrias para manter constantes
a presso e temperatura.
Terminada a esterilizao, a entrada de vapor fechada e ar
esterilizado deve ser injetado, para evitar que o resfriamento e a
conseqente condensao do vapor presente no interior do reator gere
vcuo, o que poderia provocar danos ao equipamento ou promover a
entrada de ar externo contaminado, por eventuais pequenas fissuras
em soldas, vazamentos em vlvulas, etc. Aps o resfriamento e
estabilizao da presso interna, o meio de cultura esterilizado
externamente, por esterilizao contnua ou no, pode ser carregado e a
utilizao do tanque ser iniciada.
2.2.

Esterilizao de Reatores com Meio de Cultura

A esterilizao de reatores como meio de cultura (esterilizao

descontnua) feita em trs etapas. Durante todo o processo de
esterilizao, uma agitao mnima deve ser fornecida ao meio de
cultura.
Inicialmente, circula-se vapor pela serpentina ou camisa at que a
temperatura do meio de cultura seja maior que 96 a 97C. Durante essa
etapa, a cabea do tanque deve receber vapor fluente para expulso do
ar de seu interior. Ao mesmo tempo, as vlvulas, filtros e tubulaes de
entrada e sada do reator tambm so esterilizadas por vapor fluente.
Na etapa seguinte, injeta-se vapor diretamente no meio de cultura
at que este atinja 100C. A partir desse momento, o reator
completamente fechado e a injeo de vapor continua at que a
temperatura e presso internas sejam adequadas (por exemplo 121 C e
1 atm). Atingido esse patamar, a injeo direta de vapor pode ser
cortada e o controle de temperatura e presso mantidos atravs da
serpentina ou camisa pelo tempo necessrio.
O resfriamento feito pela circulao de gua fria na serpentina
ou camisa. Quando a temperatura atingir a marca dos 100C, deve-se
injetar ar esterilizado no tanque para evitar formao de vcuo pela
condensao do vapor presente. A injeo direta de vapor provoca um
aumento no volume de meio de cultura de cerca de 10 a 15%, em
funo da condensao. Por essa razo, o meio de cultura deve ser
preparado concentrado, tendo em vista sua posterior diluio pelo
condensado.
O tempo de esterilizao funo das condies do prprio reator
e do processo. Se um reator usado sempre com o mesmo
microrganismo, e se o reator estiver em bom estado, 20 a 40 minutos a
121 C e 1 atm devem ser suficientes para sua esterilizao. Se for um
reator multipropsito, utilizado com bactrias ou fungos formadores de
esporos altamente resistentes ao calor, ele deve passar por assepsia
qumica antes da esterilizao por vapor. Nesse caso, a manuteno a
121 C e 1 atm deve se estender por um tempo que pode ser maior que
60 minutos, desde que no prejudique o meio de cultura.
6) Como executada a esterilizao de um sistema de fermentao
em que os componentes do meio so termossensveis?

O calor corresponde a uma forma eficaz de descontaminao da

maioria dos lquidos, podendo ser utilizado at mesmo no tratamento de
gases. Entretanto, gases e lquidos sensveis ao calor devem ser tratados
por outros mtodos. A filtrao um mtodo que promove a
descontaminao ou at mesmo a esterilizao sem a exposio ao calor
desnaturante. O lquido ou o gs passa atravs de um filtro contendo
poros de dimenses muito pequenas e que impedem a passagem de
micro-organismos. A seleo de filtros para esterilizao deve levar em
considerao a variao de tamanho dos contaminantes a serem
excludos.
1. Filtros de Profundidade
Um filtro de profundidade uma lmina ou camada fibrosa
sobrepostas que retm as partculas na rede de fibras presente ao longo
da espessura da estrutura. Como o material de filtrao arranjado
aleatoriamente em uma camada espessa, os filtros de profundidade
resistem obstruo, sendo frequentemente utilizados como pr-filtro
na remoo de partculas maiores presentes em suspenses lquidas.
Tambm

so

empregados

na

esterilizao

do

ar

em

processos

industriais. O filtro utilizado em sistemas de aquecimento e refrigerao

domsticos utilizam um filtro de profunidade simples que retm poiras,
esporos e alrgenos.
2. Membranas Filtrantes
As membranas filtrantes so o tipo mais comum de filtros
utilizados

para

esterilizao

de

lquidos

em

laboratrios

de

microbiologia. So compostas por polmeros que suportam altas tenses

como celulose ou polissulfona. A filtrao realizada com auxlio de
equipamentos que foram a passagem do lquido at um recipiente
coletor estril.
Alm da esterilizao, as membranas so utilizadas para separar
diferentes

tipos

microbianas,

por

de

micro-organismos

exemplo,

membranas de poros menores.

separao

para
de

coletar
vrus

amostras

utilizando-se

7) Como se pode realizar a esterilizao de meios gasosos (ex.: Ar

de processo)?

8)

Cite

dois

agentes

qumicos

utilizados

em

processos

de

esterilizao e qual o seu mecanismo de ao sobre as clulas

vivas?
1. Desinfeco:

Compostos iodados
um combinado de iodo e um agente solubilizante, ou carreador.
O exemplo de soluo mais usada a polivinilpirrolidona iodada,

que mantm as propriedades desinfetantes do iodo sem caractersticas

txicas ou irritantes. O composto iodado penetra a parede celular dos
micro-organismos, rompendo a estrutura e a sntese das protenas e do
cido nucleico. bactericida e virucida, mas necessita de contato
prolongado para eliminar os esporos bacterianos.

Fenis
Em

altas

protoplasmtico,

concentraes,
penetrando

os

fenis

rompendo

agem
a

como

parede

veneno

celular

por

precipitao de protenas. Em baixas concentraes, causa morte

celular

por

inativao

dos

sistemas

enzimticos

essenciais

manuteno da integridade da parede celular. So usados para

desinfeco

de

ambiente

hospitalar,

incluindo

superfcies

de

laboratrios e artigos mdicos-cirrgicos no crticos.

2. Esterilizao:

Formaldedo
usado como desinfetante ou esterilizante nas formas gasosa ou

lquida. comumente encontrado como formalina, sendo esta sua

diluio aquosa a 37%. A formalina bactericida potente, fungicida,
agindo tambm contra vrus, bacilos da tuberculose e esporos
bacterianos. Tem seu uso limitado por se tratar de composto
cancergeno. Age alcalinizando determinados grupos das protenas e
das purinas.

Glutaraldedos
Dialdedo saturado largamente aceito como desinfetante de alto

nvel e quimio-esterilizador. Sua soluo aquosa necessita de pH

alcalino para eliminar esporos bacterianos. Age alterando os cidos
desoxirribonucleico e ribonucleico, bem como a sntese proteica dos
micro-organismos. mais comumente usado como desinfetante de alto
nvel para equipamento mdico, como endoscpios, transdutores,
equipamento de anestesia e de terapia respiratria e de hemodilise.

xido de Etileno
Apesar de ser inflamvel mesmo em baixas concentraes,

misturas de xido de etileno com dixido de carbono e Freon resolve

esses problemas de segurana mantendo a atividade microbicida do
xido de etileno, que mata tanto clulas vegetativas quanto os
endsporos bacterianos.
O xido de etileno inativa enzimas e outras protenas que tm
tomos de hidrognio lbeis como em grupos sulfidrilas atravs de um
reao denominada alquilao no qual a estrutura do xido de etileno
se rompe e se insere entre os tomos de enxofre e hidrognio do grupo
sulfidrila.
Uma caracterstica importante do xido de etileno seu poder de
penetrao atravessando o interior de grandes pacotes cotendo objetos,

porm existe a necessidade de vrias horas de exposio para ser

eficiente.

9) Cite e explique 1 situao em que a esterilizao atravs dos

raios ultravioletas so utilizadas? Diga, tambm, que faixa de
comprimentos de onda e letal s clulas microbianas.
A radiao UV absorvida por muitas substncias celulares, mas
de modo mais significativo pelos cidos nucleicos, onde geralmente
ocorrem as leses. O seu efeito letal proporcional dose de radiao
aplicada. A regio do espectro de UV com ao esterilizante de 220 a
300 nm, muitas vezes chamada de regio "abitica".
Existe urna relao entre os comprimentos de onda germicidas e
aqueles

absorvidos

Compostos

corno

por cidos
as

purinas

nucleicos ou
e

pirimidinas,

seus

constituintes.

absorvem

UV

aproximadamente 260 nm, bem prximo da radiao mais efetiva que

253,7 nm. Os aminocidos aromticos, corno o triptofano, fenilalanina
e tirosina, absorvem UV a 280 nm. Dentre os componentes dos cidos
nucleicos, os fosfatos de acares no absorvem significativamente UV
acima de 220 nm.
10) Quais so os tipos de radiaes ionizantes utilizadas em
processos de esterilizao?
As radiaes ionizantes eletromagnticas so principalmente alfa
(), beta (), gama (), raios X, raios catdicos, alm de prtons,

nutrons e eltrons de alta energia. Esse tipo de radiao pode causar

uma

grande

variedade

de

efeitos

fsicos

bioqumicas

em

microrganismos. O principal alvo que leva perda de viabilidade a

molcula de DNA.
11) Explique como, no processo de esterilizao, as radiaes
ionizantes agem sobre as clulas vivas.
1. Ionizantes
Radiaes eletrnicas como os raios gama e X possuem energia o
suficiente para causar a ionizao de molculas rompoendo-as em
tomos ou grupos de tomos. Na radiao ionizante, um tomo emite
eltrons de alta energia, que ionizam sua molcula. O eltron ejetado e
absorvido por outro tomo, criando uma cadeia de ionizaes na
substncia irradiada.
Uma radiao deste tipo produz eltrons e radicais livres que so
altamente reativos que alteram ou degradam compostos celulares como
DNA e protenas. Como consequncia as clulas irradiadas podem sofre
mutaes ou serem levadas morte. A morte celular resulta da
formao de uma cadeia de ionizao numa poro significativa do
DNA. Geralmente, a sensibilidade dos diferentes organismos a radiaes
ionizantes varia com o volume de DNA. Em geral, formas multicelulares
so mais sensveis radiao ionizante do que organismos unicelulares,
Alm de serem microbicidas, os raios gama e X tm a vantagem
de serem capazes de penetrar em pacotes e produtos e esterilizar seus
interiores.
2. No-Ionizantes
A radiao ultravioleta ao invs de ionizar uma molcula excita os
eltrons resultando em molculas que reagem diferentemente das
molculas no irradiadas. A luz UV absorvida por muitos compostos
intracelulares sendo o DNA a macromolcula que sofre maior avaria.
A ao esterilizante da radiao ultravioleta ocorre primeiramente
pela produo de ligaes cruzadas entre pirimidinas adjacentes na
mesma

fita

de

DNA)

formando

dmeros.

Essa

reao

ocorre

principalmente entre resduos de timina, formando dmeros de timina,

levando perda da integridade do DNA bacteriano. Essas ligaes
podem causar erro de leitura do cdigo gentico e a menos que esses
dmeros sejam removidos, dependendo do nvel da leso, por enzimas
especficas de reparo intracelular, a replicao do DNA pode ser inibida,
alterada causando mortes ou mutaes.
A esterilizao feita simplesmente expondo os materiais
radiao em ambiente fechado, pelo tempo adequado (vrias horas).
Como a capacidade de penetrao da radiao ultravioleta muito
baixa, apenas a superfcie do material exposto e o ar ao redor so
esterilizados.
12) Cite pelo menos 3 segmentos industriais em que as radiaes
ionizantes so utilizadas em processos de esterilizao.