TRANSCRIPIA GENETIC

principii, etape, ARN polimeraze, promotori i terminatori, factori de transcripie

(NOTE DE CURS BM3/BM4)
- procesarea ARNm la eucariote (NOTE DE CURS BM4)
Att celulele procariote ct i cele eucariote posed mecanisme, pe de o parte comune, pe de alt
parte distincte, pentru reglarea expresiei genelor i a fluxului de informaie de la ADN la
proteine. Transcripia ADN, realizat de ARN polimeraze constituie prima etap, comun la
toate organismele. La celulele procariote, ribozomii se fixeaz pe molecula de ARNm, n curs de
sintez, i realizeaz traducerea imediat a informaiei n proteine, n citoplasm. Din contr, la
eucariote membrana celular separ locul n care se realizeaz transcripia de cel n care are loc
traducerea. Transcriptul primar, ARNm imatur, conine o succesiune de secvene netraduse,
numite introni, care vor fi eliminate prin procedeul de scindare a intronilor i sudare a exonilor
(splicing), n procesul de maturare a ARNm. n urma acestei etape, localizat n nucleu,
ARNm trece n citoplasm unde este tradus. Maturarea ARNm prin splicing confer celulei
eucariote posibilitatea diversificrii informaiei prin combinarea alternativ a exonilor, o alt
etap foarte important n dezvoltarea organismelor.
Expresia informaiei genetice coninut ntr-un segment de ADN este transcris n structura
diferitelor tipuri de ARN. Astfel, sinteza macromoleculelor de ARN direcionat de ADN i
realizat cu ajutorul unor enzime specialiazate, ARN polimeraze, poart denumirea de
transcripie. Acest proces se desfoar, att la procariote, ct i la eucariote n trei etape:
- inierea transcripiei;
- alungirea catenei ARN;
- terminarea transcripiei;

Transcripia la procariote
Inierea transcripiei la procariote (BM3, SLIDE 7) prezint urmtoarele caracteristici:
- ARN polimeraza iniiaz transcripia majoritii genelor la nivelul unei poziii unice
(promotor) situat n amonte de secvena codant;

- perechea de baze la nivelul creia se iniiaz transcripia este denumit situs de iniiere a
transcripiei sau Punct START;
-prin convenie, situl de iniiere a transcripiei de pe secvena ADN este desemnat cu poziia +1,
bazele situate n sensul transcripiei (downstream) sunt desemnate cu numere pozitive, iar cele
poziionate n sens opus (upstream) sunt desemnate cu numere negative;
- diferitele proteine (ARN polimeraze, activatori, represori) interacionedaz cu ADN la nivelul
promotorului sau n vecintatea acestuia pentru a regla iniierea transcripiei.
Interaciunile proteine ADN sunt frecvente n timpul transcripiei i au fost evideniate
experimental prin diferite tehnici (footprinting, gel-shift assays, etc.).
Interaciunile proteine-ADN identificate prin tehnica footprinting (SLIDE 8)
n figur sunt prezentate schematic etapele tehnicii footprinting cu DN-aza I, comun pentru
identificarea situsurilor de legare a proteinelor la ADN.
Un fragment de ADN care este marcat la unul din capete cu izotopul P32 (reprezentat n figura de
bilele roii), marcare similar celei prezente n metoda de secveniere Maxam i Gilbert. Poriuni
din prob sunt apoi digerate cu DN-aza I, n prezena i n absena unei proteine care se leag la o
secven specific din fragment. DN-aza I hidrolizeaz aleator legturile fosfodiester. La
concentraii sczute, DN-aza I este utilizat astfel nct fiecare molecul de ADN este clivat
numai o dat. n absena proteinelor care se leag la ADN, proba este clivat la toate poziiile
posibile ntre captul marcat i nemarcat al moleculei. Cele dou probe de ADN sunt apoi
separate de proteine, denaturate pentru desfacerea catenelor i supuse electroforezei. Gelul
rezultat este supus electroforezei i supus autoradiografiei pentru a detecta numai catenele
marcate i pentru a identifica fragmentele care se ntind de la captul marcat pn la locul de
aciune al DN-azei I. n dreapta se poate observa o autoradiogram unde sunt analizate dou
fragmente de ADN n absena i n prezena unor proteine de legare la ADN dup digestia cu
DN-aza I. Pentru proba digerat n prezena proteinelor de legare la ADN se observ lipsa a dou
benzi; acestea corespund regiunii protejate de digestie prin legarea proteinelor (spunem ca am
realizat un footprinting privind legarea acestei proteine). Aceast regiune de protecie poate fi
foarte uor aliniat cu secvena ADN dac se realizeaz o reacie de secveniere a produilor
iniiali i a celor care s-au obinut n urma proteciei furnizate de legarea proteinelor. Reaciile de
secveniere i fragmentele rezultazte n urma aciunii DN-azei sunt trecute pe acelai gel.

Identificarea interaciilor proteine-ADN prin tehnica gel-shift assays (SLIDE 9)

n figur sunt prezentate rezultatele obinute n urma unei determinri a mobilitii electroforetice
prin tehnica de ntrziere n gel pentru proteinele care se leag la ADN (EMSA
Electrophoretic Mobility Shift Assay). n acest exemplu, fracii ale unei coloane
cromatografice de schimb ionic au fost analizate pentru proteinele care se leag la regiunea
promotor a unei gene pentru ARNt de la EK. Un eantion al fraciei proteice este ncrcat pe o
coloan (ON) iar fraciile eluate de pe coloan la concentraii saline crescute (numerele fraciilor)
au fost incubate cu o sond (fragment de restricie) radiomarcat care include regiunea
promotoare; fiecare prob a fost apoi supus electroforezei ntr-un gel de poliacrilamid. Sondele
libere care nu se leag la proteine migreaz n fa. O protein prezent n fraciile 7 i 8 eluate
de pe coloan se leag la sond, formnd un complex ADN-protein care migreaz mult mai lent
dect sonda liber.
Evidenierea poziionrii ARN polimerazei la nivelul regiunii control a represorului lac
prin tehnica footprint (SLIDE 10)
n imagine este reprezentat un experiment de tip footprint a legrii ARN polimerazei i a
represorului lac la regiunea control al ADN lac. Deoarece DN-aza I cliveaz unele legturi
fosfodiester mai frecvent dect altele, densitatea benzilor n absena proteinelor (linia 3) nu este
la fel de uniform ca i din figura din slide-ul 8. Parantezele din dreapta indic regiunile ADN
protejate de digestia cu DN-aza I prin legarea ARN polimerazei (linia 4) sau a represorului
lac (linia 5). Liniile 1 i 2 arat produii celor dou reacii de secveniere Maxam i Gilbert: de
pe aceste linii, benzile din gel pot fi corelate cu secvena nucleotidic a regiunii de control lac.
Poziiile n secven sunt notate pe partea stng; capetele sgeilor indic direcia transcripiei.
La procariote exist o singur ARN polimeraz.
ARN polimeraza de la E.coli este o enzim solubil, cu MM 480 kD, constituit din
urmtoarele subuniti: , , , . Pentru a iniia transcripia, ARN polimeraza se fixeaz
specific la nivelul secvenelor promotorului (SLIDE 12). n imagine este reprezentarea
schematic modului de legare la ADN a formei majore a ARN polimerazei de la E. coli.
Prin convenie, situsul de iniiere a transcripiei este numerotat, n general, cu +1. Perechile de
baze care se extind n direcia transcripiei sunt numite downstream, n aval, fa de situsul de
iniiere a transcripiei; cele care sunt extinse n regiunea invers sunt considerate upstream sau
n amonte. Subunitatea 70 se leag la secvene specifice situate lng poziiile 10 la 35 ale

promotorului. Subunitile se leag strns la ADN din amonte, iar i sunt asociate
punctului de START.

Secvene promotor la procariote

Diferenele de la nivelul secvenelor promotorului E. coli afecteaz frecvena iniierii
transcripiei (SLIDE 13).
Figura reprezint Promotorii recunoscui de ctre ARN polimeraza (coninnd subunitatea 70)
de la E. coli.
La procariote exist mai multe secvene promotor, care nu sunt identice, dar prezint anumite
nucleotide conservate. Astfel au fost evideniate:
a) Secvenele unor promotori puternici cu spaii introduse pentru a maximiza omologia la
nivelul regiunii 10 la 35. Aceste secvene corespund catenei sens a promotorului, n condiiile
n care procesul de transcripie se realizeaz n direci 53 (de la stnga la dreapta). Bazele
care corespund secvenei consens din regiunea 35 la 10 sunt reprezentate n figura respectiv
prin colorare n galben. ase dintre secvene corespund secvenelor control ale genelor care
codific pentru ARN. Secvenele din structura regiunilor promotoare ale Lambda, T7 i fd, care
sunt prezente n genoame virale care sunt direct transcrise de ctre ARN polimeraza celulei
gazd.
b) Secvenele consens ale regiunilor 35 la 10, care sunt separate de 15-17 pb. Sunt descrise
mutaiile cunoscute ca descrescnd semnificativ frecvena transcripiei unui anumit numr de
promotori. n secvenele consens, frecvena cu care bazele indicate apar la fiecare poziie la
diferii promotori pentru 70 este indicat dup cum urmeaz: litere n rou: > 70%; litere boldite
negre: 50-70%; litere negre: 40-50%.
c) Secventele regiunilor 35 la 10 ale promotorului lac care sunt diferite de secvena consens n
patru poziii (reprezentate n albastru). Mutaiile down determin scderea expresiei
operonului lac. Cele dou mutaii up care cresc gradul de asemnare a regiunii 10 cu secvena
consens, cresc expresia operonului lac.
Transcripia de la nivelul unor promotori este iniiat de factorii sigma () alternativi
(SLIDE 20).
Transcripia majoritii promotorilor de la E. coli este demarat prin interacia promotorilor cu
ARN polimeraza care conine factorul 70. Transcripia anumitor grupe de gene este realizat de

ctre ARN polimeraze care conin una sau mai multe variante alternative de factori : 28, 32,
38 i 54, care recunosc secvene promotor consens diferite de cele recunoscute de 70. Att
28 i 32 prezint regiuni de omologie cu 70 i recunosc secvene situate tot n intervalul 35
la 10 (Tabel 10-1, Slide 20).
Un exemplu n ceea ce privete factorii sigma alternativi este reprezentat de activarea subunitii
54 a ARN polimerazei la nivelul promotorului glnA de ctre NtrC (Nitrogen regulatory
Protein) (SLIDE 21).
glnA este o gen care codific pentru enzima glutamin sintetaza care sintetizeaz glutamina
pornind de la acidul glutamic i amoniac. ARN polimeraza se leag la promotorul glnA, formnd
un complex unit (strns), nainte de activare. Ca rspuns la concentraiile mici de azot organic, o
protein kinaz numit NtrB fosforileaz proteina dimer NtrC, care apoi se leag la doi
enhanceri poziionai la 108 i 140 fa de situsul de START al transcripiei. Dimerii NtrC
fosforilai legai la enhanceri interacioneaz cu subunitatea 54 legat determinnd formarea
unei bucle la nivelul ADN implicat. Activitatea ATPazic a dimerilor NtrC stimuleaz ARN
polimeraz s desfac catenele la situsul de START, formnd un complex deschis i n acest
moment transcripia genei glnA poate s nceap.
Vizualizarea buclei ADN i a interaciilor ADN-NtrC i ADN-subunitate 54 a ARN
polimerazei a fost posibil prin micografie electronic (SLIDE 22).
a) Micrografie electronic a fragmentului de restricie ADN cu cei doi dimeri NtrC fosforilai
legai la regiunea enhancer lng unul din capetele subunitii sigma54 a polimerazei legat la
promotorul glnA lng cellat capt.
b) Micrografie electronic a aceluiai fragment demonstrnd legarea dimerilor NtrC i a
subunitii sigma54 a polimerazei unul cu altul cu formarea buclei de ADN ntre acetia.
Elongarea ARN de ctre ARN polimeraza (vezi CURS BM4, SLIDE 2)
n regiunea care va fi transcris, dublul helix este desfcut cu aproximativ un tur pentru a permite
catenei sens s formeze un scurt segment hibrid ADN/ARN dublu catenar cu captul 3 al ARN.
Cu ct ARN polimeraza avanseaz de-a lungul matriei ADN, acesta este despiralizat n faa
furcii de transcripie n deplasare i respiralizat n spatele acesteia, elibernd astfel ARN nou
sintetizat de catena matri (antisens).
Au fost propuse dou mecanisme de elongare:

a) O cale poate s fie urmat este aceea n care ARN polimeraza urmeaz deplasarea catenei
matri astfel nct transcriptul va rmne ataat la nivelul elicei duplexului;
b) O a doua posibilitate, mult mai plauzibil, este aceea c ARN se deplaseaz n linie dreapt, n
timp ce matria ADN se rotete dedesubtul su. n acest caz ARN nu se va rsuci n jurul ADN,
dar ADN va rmne suprarsucit n faa sa (luai n considerare plasarea degetului ntre catrenele
de ADN rsucit n acest model i mpingnd ctre dreapta). Modelul presupune c att capetele
AND, ct i ARN polimeraza sunt protejate de ataamente n interiorul celulei.

Reglarea transcripiei la procariote

Operonii reprezint un grup de gene localizate una lng cealalt. Toate genele din structura unui
operon sunt exprimate ca o singur unitate. Acest tip de aranjament este comun genoamelor
procariote i poate fi ilustrat la E. coli cu operonul lactozei care a fost descoperit n 1961 de ctre
Jacob i Monod. Acesta conine trei gene structurale (lacZ, lacY i lacA) implicate n
transformarea dizaharidului lactoz n unitile sale componente (glucoz i galactoz), o regiune
promotor, o regiune operator i o regiune reglator. Genele operonului lac sunt implicate n
utilizarea lactozei ca surs de energie de ctre E. coli. Deoarece, lactoza nu este o component
comun a mediul nconjurtor pentru E. coli, majoritatea timpului operonul nu este exprimat i
enzimele pentru utilizarea lactozei nu sunt sintetizate de bacterie. Astfel, n absena lactozei,
proteina represor se leag la regiunea operator i mpiedic legarea ARN polimerazei i
transcrierea genelor structurale ale operonului. Cnd lactoza devine disponibil se realizeaz
activarea operonului i cele trei gene sunt exprimate mpreun. Operonul lac reprezint un
exemplu clasic de reglare a expresiei genelor la bacterii.
Mutaiile la nivelul promotorului, la care se leag ARN polimeraza, sau la nivelul operatorului
acioneaz n cis; aceasta nseamn c ele afecteaz numai expresia genelor de pe aceeai
molecul de ADN n care apare mutaia. Mutaiile n secvena unui operator care scad legarea
unui represor au drept rezultat o transcripie constitutiv. Mutaiile n secvena promotorului,
care afecteaz afinitatea de legarea a ARN polimerazei, pot fie s scad (mutaie down), fie s
creasc (mutaie up) transcripia.
Majoritatea secvenelor operator la bacterii sunt scurte repetiii inversate (SLIDE 14). Secvena
operatorului lac reprezint o secven repetitiv inversat aproape perfect centrat n jurul unei
secvene GC situat n poziia 11. Secvena de 17 pb de pe catena sens care ncepe la 7 este
identic cu secvena de 17 pb situat pe catena antisens i ncepe la +28, cu excepia

nucleotidelor indicate n italic. Fiecare din aceste secvene repetitive este denumit jumtate de
situs operator (Figura SLIDE 14). Majoritatea represorilor bacterieni sunt structuri dimere care
conin elice care se insereaz n fosele majore adiacente ale ADN (SLIDE 15).
Controlul pozitiv/negativ al operonului lac de ctre cAMP-CAP (SLIDE 17, 18)
a) n absena lactozei, nu se formeaz ARNm lac deoarece represorul se leag la operatorul lac i
mpiedic trancripia;
b) n prezena glucozei i lactozei, represorul lac se leag la lactoz i sufer modificri
conformaionale i astfel nu se mai poate lega la operatorul lac. Totui, cAMP este sczut,
deoarece glucoza este prezent i atunci complexul cAMP-CAP nu se leag sitului CAP de pe
operator. Ca rezultat, ARN polimeraza nu se leag eficient la promotorul lac i este sintetizat
numai puin ARNm lac;
c) n prezena lactozei i n absena glucozei, apare transcripie maxim la nivelul operonului lac.
n aceast situaie, represorul lac nu se leag la operatorul lac, concentraia cAMP crete i
coplexul cAMP-CAP format se leag la situsul CAP, stimulnd legarea i iniierea de ctre ARN
polimeraz.
Legarea cooperativ a cAMP-CAP i a ARN polimerazei la regiunea de control a lac activeaz
transcripia genelor operonului lac. Prin propria structura, ARN polimeraza i cAMP-CAP
posed afiniti relative reduse pentru situsurile lor de legare la promotorul lac. Totui, interacia
dintre regiunile CAP i subunitatea alfa a ARN polimerazei formeaz un complex proteinprotein care se leag mult mai stabil la promotor dect fiecare dintre cele dou proteine singure.

Concluzii privind procesul de transcripie la procariote (SLIDE 24, 25)

-ARN polimerazele sunt proteine mari compuse din subuniti , i dou subuniti care
formeaz core polimeraza i o subunitate , din cteva alternative, care funcioneaz ca factor
de iniiere.
-Iniierea ncepe cnd subunitatea a moleculei de polimeraz se leag la secvena promotor,
formnd un complex unit. Polimeraza separ apoi catenele pe o distan de 12-13 pb la nivelul
situsului de START a transcripiei, formnd un complex deschis. Dup ce aproximativ 10
ribonucleotide au fost polimerizate, subunitatea este eliberat i core polimeraza continu
transcripia matriei.

-Puterea unui promotor se refer la ct de frecvent ARN polimeraza iniiaz transcripia

pornind de la acesta. Subunitatea 70, factorul major n iniiere la E. coli, interacioneaz cu
secvenele promotor situate n regiunea 10 la 35 fa de situsul de START;
- Represorii se leag la secvenele de ADN numite operatori, care se suprapun parial cu regiunea
promotoare la nivelul creia se leag ARN polimeraza. Legarea represorului interfer cu legarea
ARN polimerazei i cu iniierea transcripiei.
-Activatorii subunitii 70 a ARN polimerazei se leag, n general, la ADN pe partea opus a
helixului fa de polimeraz, n regiunea 20 la 50, sau chiar n amonte de ARN polimeraz, n
apropierea 60;
- Activatorul cAMP-CAP stimuleaz transcripia prin formarea unui complex cu ARN
polimeraza care prezint o mai mare afinitate pentru situsuri ADN specific dect proteinele
individuale. n plus fa de stimularea legrii polimerazei, activatorii pot stimula i formarea
complexului deschis i nceperea transcripiei;
- Muli represori bacterieni sunt dimeri. Fiecare monomer conine un -helix care se insereaz n
fosa major a operatorului ADN, astfel nct dimerul se leag la fose majore succesive.
Afinitatea mare de legare este rezultatul formrii multor legturi de hidrogen, ionice i van der
Waals dintre proteine i secvene ADN specific.
-Secvenele de ADN care leag proteinele reglatoare dimere sunt secvene repetitive inverse,
care reprezint fiecre jumtai de situsuri care leag un monomer.
- Operonii transcrii de ctre subunitatea sigma54 sunt reglate prin activatori care se leag la
secvene enhancer de aproximativ 100 pb n amonte de situsul de iniiere. Secvenele
enhancer care leag activatori inetracioneaz tranzitoriu cu ARN polimeraza legat la nivelul
promotorului, stimulnd formarea unui complex deschis i inierea transcripiei.

Transcripia la eucariote
Controlul genelor eucariote: scop i principii generale (slide 26, 27)
-

spre deosebire de celulele bacteriene i eucariotele unicelulare, celulele organismelor

pluricelulare au relativ puine gene reglate reversibil de condiiile de mediu;

controlul genetic al organismelor pluricelulare este important pentru dezvoltare i

difereniere i, n general, nu este reversibil;

n interiorul unei celule bacteriene singulare, genele sunt reversibil induse i represate prin
control transcripional pentru a ajusta mainria enzimatic celular mediului nconjurtor
nutriional i fizic. Eucariotele monocelulare, cum sunt drojdiile, posed i ele multe gene care
controleaz rspunsul la variaia mediului (cum ar fi statusul nutriional, aportul de oxigen i
temperatura). Chiar n organele organismelor superioare, de exemplu, ficatul mamiferelor unele
gene pot rspunde reversibil la stimulii externi cum sunt noxele chimice. Totui, n general
celulele eucariotelor pluricelulare sunt protejate de influenele externe imediate; adic
majoritatea celulelor i desfoar activitatea ntr-un mediu constant. Probabil, din acest motiv
genele care rspund schimbrilor de mediu contrituie o fracie mult mai mic din numrul
celulelor unui organism multicelular dect n organismul unicelular. Cea mai importanta
caracteristic a controlului genetic la organismele multicelulare este exactitatea execuiei deciziei
precise de dezvoltare astfel nct gena necesar s fie activat ntr-o anumit celul la un anumit
moment din dezvoltarea organismului care conine un numr mare de tipuri celulare. n
majoritatea cazurilor o dat ce etapa de dezvoltare a fost depit de o celul, ea nu este
reversibil. Astfel, aceste decizii sunt fundamental diferite de inducia sau represia bacterian. n
executarea programului lor genetic, multe tipuri celulare diferite (ex. celulele din piele, celulele
rosii din snge, celule productoare de anticorpi, etc) marcheaz o cale ctre moartea celular
final. Profilele determinate ale controlului genetic care conduc la difereniere servesc
necesitile ntregului organism i nu supravieuirii individuale a celulei.
La eucariotele superioare reglarea multor gene se realizeaz prin controlul transcripiei.
Msurtorile directe ale ratelor de transcripie ale mai multor gene n diferite tipuri celulare au
artat c reglarea iniierii transcripiei este forma universal a controlului genetic att la
eucariote, ct i la bacterii.

Elementele reglatoare la eucariote (SLIDE 30)

- reprezint adesea mii de kilobaze n amonte sau n aval de START;
Principiile de baz care controleaz transcripia la procariote, exist i la eucariote:
transcripia este iniiat la nivelul unei regiuni specifice i este controlat de legarea
proteinelor trans-activatoare (factori de transcripie) la secvenele cis-activatoare din
structura ADN;

- elementele cis-activatoare sunt adesea mult mai departe de promotorul pe care l

regleaz, transcripia la nivelul unui singur promotor poate fi reglat prin legarea mai
multor factori de transcripie la elementele de control alternative;

secvenele care controleaz transcripia pot fi identificate prin analize de deleie n serie
la captul 5.

Genele procariote i eucariote sunt structurate dup aceeai logic de baz, dar cu diferene
importante n detaliile moleculare. O definiie sintetic a unei gene eucariote poate fi util pentru
a rezuma esena acestor diferene. Este general admis c o singur definiie dat genei eucariote
nu poate satisface pe toat lumea sau s corespund la toate exemplele. Cea pe care am adoptat-o
este rezultatul structurii moleculare a genelor care asigur o gam larg de funciuni n diverse
organism eucariote. Definiia ine cont de diferenele de localizare i de tipurile de secvene care
influeneaz expresia genelor. Aceasta presupune implicit c mutaiile fenotipice observabile
sunt rezultatul modificrilor la nivelul semnalelor de reglare dar i n secvenele codante.
Definim gena ca fiind o combinaie de segmente de ADN care, mpreun, constituie o unitate de
expresie, o unitate care determin formarea unui produs specific i funcional al genei i care
poate s fie o molecul de ARN sau un polipeptid. Segmentele de ADN care definesc gena
includ:
1. Unitatea de transcripie care este constituit dintr-un segment AND continuu care codific
pentru secvena transcriptului primar; acesta include:
a) secvena codant a ARN matur sau a proteinei produse,
b) intronii i
c) secvenele leader 5 i coad 3 prezente la nivelul ARNm matur ca i secvenele de separare
care sunt eliminate n timpul maturrii trannscripilor primary care codific pentru ARN.
2. Secvenele minimale necesare pentru iniierea corecte a transcripiei (promotorul) i pentru a
da natere extremitii 3 particulare din structura ARN matur.
3. Elementele secvenei care determin frecvena de iniiere a transcripiei; acestea cuprind
secvenele responsabile de inducerea i represia transcriiei i de specificitatea celular, tisular
i temporal a transcripiei. Aceste regiuni sunt foarte variate structural, ca poziie i ca funcie
pentru a putea purta un singur nume. Dintre acestea enumerm elementele activatoare
(enhancers) i elementele moderatoare (silencers), care sunt secvene ce influeneaz iniierea
transcripiei la distan, independent de localizarea lor n raport cu situsul de iniiere.

n aceast definiie a genei nu sunt incluse secvenele ADN care influeneaz configuraia unei
gene n cromatin i nici cele care codific proteine sau ARN care moduleaz expresia unei
anumite uniti de transcripie.

ARN Polimeraze la eucariote

La EK sinteza moleculelor de ARN este catalizat de 3 polimeraze (slide 33).
Experimental, cele trei ARN polimeraze de la eucariote au fost separate i identificate prin
cromatografie pe coloan (vezi figura slide 33). Un extract proteic din nucleii celulelor de
broasc a fost trecut pe o coloan de DEAE Sephadex, pe care proteinele ncrcate se absorb
diferit. Proteinele absorbite sunt eluate (curba albastr) cu o soluie cu concentraie de NaCl
crescnd. Fraciile care conin proteinele eluate sunt testate pentru capacitatea lor de a realiza
transcripia ADN (curba roie) n prezena a patru ribonucleotid-trifosfai. A fost msurat i
sinteza ARN de ctre fiecare fracie n prezena a 1 g/ml de -amanitin (curba bleu). La
aceast concentraie -amanitina inhib activitatea ARN polimerazei II, dar nu afecteaz pe cea a
ARN polimerazelor I i III (ARN polimeraza III este sensibil la 10 g/ml de amanitin, n
timp ce ARN polimeraza I este neafectat chiar i la concentraii mai mari).
Transcripia genelor din clasa I este realizat de ARN polimeraza I i reprezint jumtate din
activitatea de transcripie pentru majoritatea celulelor eucariote. Singurul produs al acestei
transcripii este un precursor de ARN ribozomic (pre-ARNr), care este transformat prin
clivare secvenial pentru a forma speciile de ARNr 5,8S, 18S i 28S (cel de al patrule tip de
ARNr 5S este codificat de ctre o gen din clasa III). Numrul de gene care codific pentru
ARNr variaz de la o sut la mai multe mii, n funcie de specie. Acestea sunt localizate pe unul
sau pe mai muli cromozomi specifici, n regiuni morfologice distincte numite organizatori
nucleolari. n timpul interfazei, aceste regiuni sunt ncorporate n nucleol, structur n care
moleculele de ARNr sunt transcrise activ, se transform pre-ARNr i se asambleaz ribozomii.
Contrar ARN polimerazelor II i III localizate n nucleoplasm, ARN polimeraza I este
asociat nucleolului i poate fi izolat de nucleosol. Numai ARN polimeraza I catalizeaz
transcripia grupului de gene ARNr. Specificitatea ARN polimerazei I pentru genele ARNr este
sugerat de insensibilitatea sintezei ARNr i de rezistena polimerazei I la -amanitin.
Transcripia genelor din clasa II este realizat de ARN polimeraza II. Genele din clasa II
codific pentru toate moleculele de ARNm citoplasmatic, moleculele ARN U din snRNP
(small nuclear ribonucleoproteine), cu excepia U6. Moleculele transcript ale genelor din clasa II

posed modificri caracteristice la extremitatea 5 (coif): 7-metil guanozin pentru ARNm i 2,

2, 7- trimetil guanozin pentru ARN U. n ambele cazuri, guanozina metilat a coifului este
legat de primul nucleotid transcris printr-o legtur trifosfat cu nucleotidele din poziiile lor 5.
Aproape toate moleculele de ARNm posed i o coad poliadenilat (poli A) caracteristic care
debuteaz la distane diferite dincolo de sfritul regiunii codante; coada poli A nu este codificat
de gena care a determinat obinerea transcriptului ci este adugat n urma unei reacii posttranscripionale. La drojdii i alte eucariote inferioare lungimea cozii poli A este de ordinul a 75
la 185 resturi. Moleculele de ARNm nuclear de la majoritatea vertebratelor au o coad poli A de
200 la 300 nucleotide, dar extensia poli A a moleculelor ARNm citoplasmatice este mai scurt i
caracteristic fiecrui tip de ARNm n parte. Din contr, multe molecule de ARNm care codific
histone sau ARN U sunt lipsite de aceast coad. Anumite molecule ARNm conin adenin N6metilate i toate moleculele ARN U au caracteristic un numr mare de resturi uracil modificate.
Aceste modificri sunt probabil realizate n timpul sau dup transcripie, funciile lor fiziologice
fiind necunoscute.
Transcripia genelor din clasa III este realizat de ARN polimeraza III. Produii genelor din
clasa III sunt molecule mici de ARN implicate n sinteza proteinelor (ARNt i ARNr 5S), n
transportul intercelular al proteinelor (ARN 7 SL) i n maturarea post-transcripional (ARN
U6). Genele din clasa III codific i multe alte molecule de ARN al cror rol fiziologic este
necunoscut (ARN 7SK, ARN Alu). Genoamele adenovirusurilor posed dou gene de clas III,
VA1 i VA2, ai cror produi de transcripie (de 157 i 140 nucleotide) deturneaz mainria de
transcripie a celulei infectate fcnd-o mai eficace pentru sinteza proteinelor necesare structurii
virale. Dou molecule mici de ARN, EBER I i EBER II (166 i 172 nucleotide) sunt i ele
produse de gene din clasa III ale genomului virusului Epstein-Barr.
Cele trei ARN polimerazele de la drojdii prezint patru subuniti centrale (core) care
exprim aceeai omologie cu subunitile , i subunitile de la E. coli (SLIDE 35).
Cea mai mare subunitate (L) de la ARN polimeraza II conine i domeniul C terminal (CTD).
ARN polimeraza I i III conin aceleai dou subuniti like- neidentice, n timp ce ARN
polimeraza II are dou copii a unei subuniti diferite like-. Toate trei polimerazele prezint alte
cinci subuniti comune (dou copii ale celei mai mari dintre acestea). n plus, fiecare polimeraz
din drojdie conine de la 4 la 7 subuniti mici unice.

ARN polimeraza II
Genele din clasa II sunt transcrise n nucleu de ctre ARN polimeraza II. Enzima a fost
izolat de la numeroase organism, printre care drojdiile din genul Physarum, Aspergilius,
Acanthamoeba, plantee superioare, insecte, Xenopus i mamifere. Compoziia n subuniti a
enzimelor din diferite organisme este foarte asemntoare. ARN polimeraza II este constituit
din 9-10 subuniti. Toate enzimele izolate de la diferite tipuri de oragnisme EK i analizate
conin dou subuniti mari: o subunitate de ~ 220 kD, care este cea mai mare polipeptid pe care
o regsim n structura celor trei tipuri de ARN polimeraze de la EK i o alta subunitate de ~140
kD. Trei subuniti mici ale ARN polimerazei II sunt comune cu cele ale ARN polimerazelor I i
III, celelalte patru sau cinci subuniti sunt specifice enzimei. Existena unei similitudini
structurale i chimice ntre cele dou subuniti mari la cele trei ARN polimeraze eucariote a fost
iniial pus pe seama reaciilor imunologice ncruciate pe care acestea le ddeau. n plus, cele
dou subuniti mari ale fiecreia dintre cele trei polimeraze eucariote posed secvene n
aminoacizi cu un nalt grad de asemnare cu secvenele subunitilor mari ale ARN polimerazei
de la E. coli.
Dintre cele trei ARN polimeraze, ARN polimeraza II este cea mai sensibil la -amanitin.
Toxina permite iniierea sintezei lanului de ARN, dar blocheaz elongarea acestuia. Situsul de
aciune al -amanitinei pare s fie situat la nivelul subunitii de 220 kD a ARN polimerazei II.
La Drosophila i la S. cerevisiae mutaiile care confer rezistena la amanitin sunt localizate n
gena care codific pentru subunitatea de 220 kD. Aceast subunitate mare este i subiectul
reaciilor de fosforilare i defosforilare la nivelul mai multor situsuri. Forma nalt fosforilat a
enzimei, gsit in vivo atunci cnd activitatea de transcripie este important, este considerabil
mai activ dect forma defosforilat a acesteia.
Domeniul carboxi-terminal al subunitii celei mai mari a ARN polimerazei II de la drojdii, de
la Drosophila i de la mamifere conine multiple repetiii n tandem ale hexapeptidului TyrSer-Pro-Thr-Ser-Pro-Ser. Numrul acestor copii este 26 la drojdie, respectiv la 52 la oarece.
Aceast secven repetitiv este unic i esenial pentru activitatea enzimei. Modificarea acestei
regiuni n gena de drojdie demonstreaz c subunitile care conin mai puin de 13 copii nu sunt
funcionale in vivo. Serinele i treoninele, abundente n aceast regiune, pot reprezenta situsurile
de fosforilare menionate mai sus, dar rolul precis al acestui heptamer nu este deplin elucidat
(slide 36).

Factorii de transcripie la eucariote

ARN polimeraza II, ca i celelalte ARN polimeraze necesit o serie de proteine adiionale pentru
a forma un complex de transcripie funcional. Multe sunt proteine care se fixeaz pe ADN i
recunosc una sau mai multe secvene care, par s constituie promotorul genei. Anumii factori
de transcripie reacioneaz prin intermediul interaciilor protein-protein cu ali factori de
transcripie i sunt capabili astfel s modifice astfel specificitatea i afinitatea acestora. Prin
interacii mutuale sau cu diferite secvene de ADN, diferiii factori de transcripie formeaz
ansamble proteice complexe care regleaz capacitatea ARN polimerazei II de a iniia
transcripia. Cea mai mare parte a complexelor reacioneaz pozitiv, crescnd frecvena
iniierilor, dar sunt cunoscute i altele care acioneaz negative, fiind deci represori. Exist chiar
i factori care stimuleaz transcripia unei gene, dar inhib transcripia altei gene. Muli dintre
aceti factori sunt specifici unui esut sau unor celule i nu reacioneaz dect n anumite stadii
de dezvoltare; acest lucru permite genelor s fie transcrise diferit n funcie de esut sau de timp.
ntr-un anumit sens, ARN polimeraza reprezint mainria de transcripie, iar interaciile
factorilor cu semnalele de reglare de pe ADN sau ntre ei, determin unde, cnd i cu ce
vitez va funciona aceast mainrie. Numrul de factori proteici care acionnd n trans sunt
implicai n sistemele de transcripie utilizate de ARN polimeraza II este mereu n cretere, cu
toate c nu toi au fost foarte bine caracterizai. Complexitatea factorilor de transcripie este att
de mare, nct anumii factori se leag la mai mult de o secven de ADN i anumite secvene de
ADN reprezint situsuri de fixare pentru mai multe tipuri de factori. n plus, anumite motive
organizate n tandem se suprapun, crend adesea situsuri de legtur suplimentare absente n
motivele individuale unde favorizeaz fixarea unui factor sau a altuia.
Concluzii (SLIDE 39)
-

principalul scop al controlului genetic n organismele multicelulare este realizarea

deciziilor precise de dezvoltare astfel nct gene particulare sunt exprimate n celule
particulare n timpul dezvoltrii i diferenierii celulare;

controlul transcripional este principalul sens al reglrii expresiei genice att la eucariote,
ct i la procariote;

n genoamele eucariote, elementele de control care acioneaz n cis i care regleaz

expresia de la nivelul promotorului sunt adesea localizate la multe kb deprtare de situsul

de START. n contrast, elementele de control bacterian sunt dispuse, n general, pe o

distan de 60 pb fa de promotorul pe care acetia l regleaz;
Eucariotele conin trei tipuri de ARN polimeraze nucleare. Toate trei conin dou subuniti mari
i dou subuniti mici care constituie structura central omolog cu subunitile , i ale
ARN polimerazei de la E. coli, ct i numeroase subuniti mai mici adiionale. Unele dintre
aceste subuniti mici sunt commune, iar altele sunt unice pentru fiecare polimeraz.
ARN polimeraza I sintetizeaz numai pre-ARNr, ARN polimeraza II sintetizeaz ARNm i unele
molecule mici de ARN nuclear care particip la splicingul ARNm, iar ARN polimeraza III
sintetizeaz ARNt, ARNr 5S i multe alte molecule relativ scurte i stabile de ARN.
O secven heptapeptidic, domeniul carboxi-terminal (CTD), din subunitatea cea mai mare a
ARN polimerazei II este fosforilat n timpul iniierii i rmne fosforilat ct timp enzima
transcrie matria. Similar cu ARN polimerazele bacteriene, ARN polimeraza II iniiaz, de
obicei, transcripia genelor la nivelul unor perechi de baze specifice sau baze vecine alternative
din ADN matri. Nucleotidul din 5 cruia i se adaug capionul la nivelul ARNm corespunde
nucleotidului de pe catena matri la care transcripia este iniiat.
Majoritatea genelor eucariote sunt reglate prin mai multe mecanisme de control (slide 44,
45)
a) Genele organismelor multicelulare conin att elementele proximale promotorului i
enhancerii (activatorii) ct i TATA box sau alte elemente promotoare. Ultimile poziioneaz
ARN polimeraza II pentru a iniia transcripia la situsul de START i influeneaz rata
transcripiei. Activatorii pot fi poziionai fie n amonte fie n aval i la o distan de aproximativ
50 kb fa de situsul de START al transcripiei. n unele cazuri, elementele din proximitatea
promotorului apar la fel de bine i n aval de situsul de START al transcripiei.
b) Majoritatea genelor de drojdii conin numai o regiune reglatoare, numit secvena activatoare
n amonte (Upstream Activating Sequence-UAS) i o TATA box, care este de aproximativ 90
pb n amonte de situsul de START.
Factoriii implicai n transcripie sunt identificai prin tehnici biochimice (SLIDE 46).
Ca i la E. coli, diferitele elemente transcripionale de control prezente la eucariote sunt situsuri
de legare a proteinelor reglatoare care acioneaz n trans. Expermental a fost realizat
identificarea, purificarea i determinarea structurii acestor factori de transcripie care sunt
activatori i represori ai genelor proteice care codific pentru proteine.

Dup identificarea elementelor reglatoare cu ajutorul analizelor mutaionale descrise anterior,

pasul urmtor l reprezint identificarea proteinelor care recunosc aceste structuri si se leag
specific la ele.
Figura prezentat pe slide evideniaz modul n care un extract proteic nuclear este supus mai
multor etape cromatografice i apoi unor analize de footprinting cu DN-aza I

sau de

intarziere n gel folosind fragmente de ADN care conin elementele reglatoare n cis deja
identificate. Exist probabilitatea ca fraciile care conin proteine ce se leag la elementele
reglatoare conin i un posibil factor de transcripie. O tehnic bun pentru etapa de purificare
final a factorilor de transcrpie o constituie un tip particular de cromatografie de afinitate
specific unei secvene de ADN. Ca un test final pentru a evalua capacitatea proteinelor izolate
de a stimula transcripia unei matrici care conine un situs corespunztor de legare a proteinei, se
realizeaz o reacie de transcripie in vitro.
O dat ce factorul de transcripie a fost izolat, secvena sa parial n aminoacizi poate fi
determinat i folosit pentru pentru clonarea genei sau a ADNc codificat de aceasta. Gena
izolat poate fi folosit apoi pentru a testa capacitatea proteinei codificate de a stimula
transcripia ntr-o reacie de transcripie in vitro.
In figura de pe slide-ul 46 sunt prezentate schematic etapele unui proces de purificare a
factorilor de transcripie.
a) Pentru purificarea unui factor de transcripie care se leag specific la un element reglator
din structura ADN sunt necesare mai multe etape cromatografice. Purificarea final este
obinut prin cromatografie de afinitate pe o coloan care este cuplat cu cu catene lungi
de ADN care conin mai multe copii al situsului de legare a factorului proteic. Un
preparat proteic parial purificat care conine factorul de transcripie este aplicat pe o
coloan cu o trie ionic sczut (100 mM KCl). Proteinele care nu se leag deloc la
situsurile specifice vor fi eluate cu tampoane cu salinitate sczut. Proteinele cu afinitate
sczut pentru situsul de legare sunt splate de pe coloan cu tampoane de salinitate
intermediar (300 mM KCl). n final, factorii proteici nalt purificai sunt eluai cu soluii
saline concentrate (1 M KCl);
b) Proteinele separate prin cromatografie pe coloan sunt testate pentru capacitatea lor de
legare la un element reglator identificat. n acest exemplu, testrile ADN footprinting

pentru proteinele separate prin cromatografie de schimb ionic indic c fraciile de interes
sunt 9-12. Aceste proteine pot fi testate si prin tehnica de ntrziere in gel.
Ulterior izolrii i purificrii factorilor de transcripie este realizat determinarea in vitro a
activitii factorilor de transcripie (SLIDE 47). Sistemul experimental testarea in vitro a
activitii factorilor de transcripie prezentat n imagine necesit prezena a dou plasmide. O
plasmid conine gena care codific pentru un posibil factor de transcripie- proteina X.
Cea de a doua plasmid conine o gen raportor i unul sau mai multe situsuri de legare a
proteinei X. Ambele plasmide sunt simultan introduse n celule gazd crora le lipsesc gena care
codific pentru proteina X i gena raportor i este msurat transcripia genei raportor; alternativ,
activitatea proteinelor codificate poate fi determinat. Dac transcripia genei raportor este mai
mare n prezena plasmidei care codific proteina X, nseamn c protein X este un activator;
dac transcripia este mai sczut, atunci este un proteina X joac rol de represor. Prin folosirea
unor plasmide care codific au factor de transcripie mutant sau care conine o rearanjare, pot fi
identificate domeniile importante ale proteinei.
Concluzii (SLIDE 63)
Expresia genelor eucariote care codific pentru proteine este reglat prin intervenia unor
elemente multiple care acioneaz sub forma unor regiuni de control n cis. Unele elemente de
control sunt localizate n apropierea situsului de START (elemente din proximitatea
promotorului), n timp ce altele sunt localizate la distan (activatori sau enhanceri).
Promotorii determin situsul de iniiere a transcripiei i legarea direct a ARN polimerazei II.
Au fost identificate trei tipuri de secvene promotor pentru ADN de la eucariote, dintre care,
TATA box reprezint tipul cel mai comun i este dominant pentru genele transcrise rapid.
Promotorii de tip iniiator sunt reprezentai cu o frecven sczut n anumite gene, n timp ce
insulele CpG sunt caracteristice genelor transcrise.
Elementele din proximitatea promotorului sunt localizate ntr-un interval de 200 pb fa de
situsul de START. Multe astfel de elemente, coninnd mai puin de 20 pb, pot fi utile n reglarea
unei gene particulare.
Activatorii, care au de obicei o lungime de aproximativ 100-200 pb, conin mai multe elemente
control de 8 la 20 pb. Acestea pot fi localizate de la 200 pb la 10 kb n amonte sau n aval de
promoter, n interiorul unui intron, sau n aval de exonul final al genei.

Elementele din

proximitatea promotorului i activatorii sunt adesea specifici unui tip celular, funcionnd numai
tipuri celulare difereniate specific.
Factorii de transcripie, care stimuleaz sau reprim transcripia, se leag la elemente situate n
proximitatea promotorului i la enhancers (activatori) din structura ADN la eucariote;
Activatorii sunt n general proteine modulare, care conin un singur domeniu de legare i unul
sau mai multe domenii activatoare; diferitele domenii sunt adesea legate prin regiuni
polipeptidice flexibile. Acestea permit domeniilor diferiilor activatori s interacioneze chiar i
cnd domeniile de legare la ADN recunosc situsuri separate de zeci de perechi de baze;
Activatorii conin, n general, mai multe situsuri de legare pentru factorii de transcripie
grupate sub form de clustere. Legarea cooperativ a mai multor activatori la situsuri nvecinate
din structura unui activator formeaz un complex multi-proteic numit complex activator.
Asamblarea acestuia necesit adesea proteine mici care se leag la fosa minor a ADN i
determin curbarea rapid a secventei, permitnd proteinelor de pe fiecare parte a curburii s
interacioneze mult mai bine;
Majoritatea represorilor de la eucariote sunt proteine modulare. Similar cu activatorii, acetia
conin de obicei un singur domeniu de legare i unul sau mai multe domenii represoare, i pot
controla transcripia cnd sunt legai la situsuri situate la sute sau mii de baze fa de situsul de
START.
Domeniile de legare la ADN ale factorilor de transcripie de la eucariote exprim o
varietate de structuri. Printre cele mai comune motive structurale sunt homeodomeniile,
domeniile bazice fermoar de leucin (leucine zipper), HLH i diferite tipuri de degete
zinc (zinc finger).
n general una sau mai multe -elice din domeniul de legare la ADN interacioneaz cu fosa
major la nivelul unor situsuri de recunoatere. Capacitatea anumitor factori de transcripie de a
forma heterodimeri crete numrul de situsuri ADN pe care aceti factori le pot controla i
modalitile prin care le pot controla. Dei, anumite domenii de activare i de represare sunt
bogate n aminoacizi particulari, aceste domenii funcionale manifest o varietate de secvene de
aminoacizi i structuri proteice caracteristice diferiilor factori transcripie.
Complexul ARN polimerazic II de iniiere a transcripiei (SLIDE 64)
Iniierea de ctre Pol II necesit factori generali de transcripie, care poziioneaz Pol II la
nivelul situsului de iniiere i sunt necesari pentru transcrierea majoritii genelor transcrise

de ctre aceast polimeraz. Factorii generali de transcripie sunt structuri multimere i nalt
conservate.
Proteinele cuprinse n complexul ARN polimerazei II de iniiere a transcripiei se asambleaz
ntr-o ordine specific in vitro, dar majoritatea proteinelor se pot combina pentru a forma un
complex holoenzimatic in vivo.
Aa cum a fost precizat anterior, ARN polimeraza de la E. coli lipsit de subunitatea 70 nu
poate iniia transcripia. Totui, cnd core polimeraza este asociat cu subunitatea 70,
holoenzima rezutat poate iniia transcripia in vitro, pornind de la promotori puternici. Astfel,
subunitatea 70 funcioneaz ca un factor de iniiere care este absolut necesar pentru nceperea
transcripiei i care este eliberat de pe matri o dat ce s-a produs polimerizarea primilor
aproximativ 10 ribonucleotidtrifosfai.
Din contr, la EK, transcripia in vitro cu ARN polimeraza II purificat necesit adugarea unui
numr mare de factori de iniiere care sunt separai de complexul polimerazic n timpul
purificrii. Aceti factori de iniiere, care poziioneaz ARN polimeraza II la nivelul situsurilor
de iniiere a transcripiei, sunt numii factori generali de transcripie, deoarece se consider c
ei sunt necesari pentru transcripia majoritii genelor de ctre acest tip de polimeraz. Un
complex de iniiere a transcripiei conine ARN polimeraza i diferii factori generali implicai n
transcripie care se leag la regiunea promotoare.
Muli dintre factorii generali de transcripie necesari polimerazei II pentru iniierea transcripiei
de la nivelul majoritii promotorilor care conin o TATA box au fost izolai i caracterizai.
Aceste proteine au fost desemnate cu terminologia TFIIA, TFIIB, etc, majoritatea fiind proteine
multimere. TFIID este unul dintre cei mai mari factori avnd o mas molecular de aprox 750
kDa. Acesta conine o singur protein de aprox 38 kDa numita TATA box-binding protein
(TBP) i 11 factori asociai TBP numii TAF (TATA Asociated factors) care nu au fost foarte
bine caracterizai. Factori generali de transcripie cu activiti similare au fost izolai din celule
umane n cultur, ficat de obolan, embrioni de Drosophila i drojdii.
Genele care codific pentru aceste proteine la drojdii au fost secvenializate o dat cu
secvenializarea complet a genomului de drojdii ca i n cazul ADNc uman i a celui de la
Drosophila. n toate cazurile, factorii de transcripie echivaleni de la diferitele tipuri de eucariote
sunt foarte bine conservai. Dei factorii generali de transcripie permit polimerazei II s iniieze

transcripia in vitro la nivelul acelorai situsuri prezente in vivo, protein adiionale sunt necesare
pentru iniierea transcripiei in vivo.
Etapele procesului de asamblarea a complexului Pol II de iniiere a transcripiei in vitro
(SLIDE 65, 66)
n figur sunt prezentate schematic etapele asamblrii complexului de iniiere a transcripiei
pornind de la ARN polimeraza II i factori de transcripie izolai.
n momentul n care ntreg complexul de iniiere a fost asamblat, se produce separarea catenelor
ADN la situsul de START pentru a forma complexul deschis, proces care necesit hidroliza
ATP. Pe msur ce transcripia ncepe s se deruleze de la nivelul promotorului, domeniul CTD
al ARN Polimerazei II se fosforileaz i factorii generali de transcripie disociaz de complexul
de legare TBP de la nivelul promotorului. Numeroase alte proteine particip la iniierea
transcripiei in vivo.
n majoritatea studiilor biochimice asupra asamblrii complexului de iniiere al ARN Pol II,
cercettorii au folosit mai degrab TBP (TATA Binding Protein) dect complexul TFIID care
este format din multe subuniti i care este dificil de purificat. Legarea TBP i a altor factori
generali de transcripie la promotorii cu secvene consens TATA a fost analizat prin tehnica de
foot-printing cu DN-aza I i prin tehnica electroforetic de ntrziere n gel. Aceste studii
demonstreaz c complexul Pol II de iniiere este asamblat in vitro n conformitate cu secvena
de reacii determinat i prezentat n imagine.
In vitro, TBP este prima protein care se leag la promotorul TATA box. Toate proteinele
eucariote TBP analizate prezint domenii C-terminale foarte similar, de aproximativ 180 de
aminoacizi. Secvena genic care codific aceaste regiuni prezint o omologie de 80% de la
drojdii la om, majoritatea diferenelor fiind substituii conservative. Acestea conserv funciile
domeniului C-terminal, ca i ntreaga lungime a proteinei n urma transcripiei in vitro. Domeniul
N-terminal al TBP, care variaz foarte mult ca secven i lungime la diferite eucariote,
funcioneaz n transcripia genelor care codific pentru ARNsn.
Factorii de transcriptie generali se leaga secvential la ARN polimeraza II purificata (Pol II), la
nivelul secventei TATAbox pentru a forma complexul de pre-initiatiere. Hidroliza ATP
furnizeaza energia pentru desfacerea moleculelor de ADN la situsul de START prin legarea
subunitatii TFIIH. Initierea transcriptiei de catre Pol II conduce la formarea complexului deschis,
iar polimeraza se deplaseaza de la nivelul promotorului i domeniul CTD este fosforilat. In vitro,

factorii generali de transcripie (cu exceptia TBP) disociaz de complexul TBP si promotor, dar
nu se tie nc care dintre factori raman asociai cu regiunea promotoare pentru fiecare runda de
initiere a transcriptiei in vivo.
Concluzii (SLIDE 69)
ARN polimeraza II necesit mai muli factori generali de transcripie pentru a localiza clar
punctul de START la nivelul matriei ADN i a iniia transcripia. Dintre aceti factori, TFIID
care se leag la TATA-box prin intermediul TBP.
Transcripia genelor care codific pentru proteine este controlat de ctre ARN polimeraza II
care poate fi iniiat in vitro prin legarea secvenial a factorilor: TBP, care se leag la TATA
box; TFIIB; un complex Pol II i TFIIH; TFIIE i final TFIIH;
Activitile helicazice ale celor dou subuniti TFIIH separ catenele la nivelul situsului de
START la majoritatea promotorilor, un proces care necesit hidroliza ATP. Dup ce ARN
polimeraza II ncepe transcrierea dincolo de situsul de START, elementele CTD sunt fosforilate
de ctre o alt subunitate a TFIIH.
Iniierea de ctre Pol II in vivo necesit un complex multimediator multiproteic, care se asociaz
cu elementele CTD nefosforilate ale Pol II, formnd un mare complex holoenzimatic care
include i majoritatea factorilor de transcripie. Se crede c aceast holoenzim preasamblat se
leag la ADN promotor ntr-o singur etap in vivo.
Complexul de iniiere a transcripiei care se asambleaz la nivelul promotorilor in vivo poate
cuprinde 60-70 polipeptide, cu o mas total similar cu cea a unui ribozom.
Iniierea transcripiei realizat de Pol I i Pol III este analog celei realizat de Pol II
(SLIDE 92, 94, 95).
ARN polimeraza I (Pol I) este dedicat sintezei pre-ARNr, iar ARN polimeraza III (Pol III)
transcrie genele ARNt, genele ARNr 5S i genele care codific multe alte molecule de ARN
mici. Formarea complexelor de iniiere a transcripiei care implic Pol I i Pol III este similar n
unele privine cu asamblarea realizat n cazul Pol II. Totui, fiecare din cele trei ARN
polimeraze eucariote nucleare necesit factori de transcripie specifici (sau de iniiere) care
recunosc elemente de control diferite. Pe de alt parte, nici Pol I i nici Pol III nu necesit
hidroliza ATP pentru a iniia transcripia, n timp ce Pol II folosete energia rezultat din
hidroliza ATP.

Iniierea transcripiei de ctre Pol I

Genele umane pentru pre-ARNr prezint dou regiuni de control: un element core, care include
situsul de START i care este esenial pentru transcripie i un element de control din amonte UCE (upstream control element) de aproximativ 50 pb, care ncepe la aproximativ 100 pb fata
de situsul de START, i care stimuleaz transcripia in vitro de aproximativ 10 la 100 ori. Dou
proteine de legare la ADN asist Pol I pentru a iniia i transcrie corect genele pre-ARNr. Primul
dintre ele este factorul de legare din amonte UBF (Upstream Binding Factor), care se leag att
la UCE, ct i la poriunea din amonte a elementului core, chiar dac se consider c acestea au
n aparen o secven puin similar. Factorul de selectivitate I (SL1), o protein multimer se
leag i stabilizeaz complexul. Dup legarea subunitilor SL1, Pol I se leag i iniiaz
transcripia. Una dintre subunitile SL1 este similar TBP (TATA Binding Protein), protein cu
care joac rolul central n iniierea transcripiei de ctre Pol II (Fig. a), SLIDE 92).
Iniierea transcripiei de ctre Pol III
Spre deosebire de genele care codific pentru proteine i pre-ARNr, regiunile promotoare ale
genelor pentru ARNt i ARNr 5S sunt n ntregime n interiorul secvenei transcrise. Dou
astfel de elemente promotoare interne, numite box (cutia) A i box (cutia) B sunt prezente n
toate genele pentru ARNt. Aceste secvene nalt conservate nu funcioneaz numai ca promotori
dar codific i dou poriuni ale moleculelor de ARNt la eucariote care sunt necesare sintezei de
proteine. La nivelul genelor ARNr 5S se afl numai o regiune de control intern numit box
(cutia) C, care acioneaz ca un promotor. Factorii generali de transcripie necesari Pol III
pentru a iniia transcripia genelor pentru ARNt i ARNr 5S au fost bine caracterizai la S.
cerevisiae. Doi factori multimeri, THIIIC i TFIIIB particip att la iniierea ARNt i ARNr 5S
la drojdii. Asamblarea complexului de iniiere ale genelor ARNt ncepe prin legarea singular a
TFIIIC la cutia A i cutia B. Interacia factorului TFIIIC cu TFIIIB l direcioneaz pe acesta din
urm s se lege la secvene de aproximativ 30 pb situate n amonte de situsul de START al
transcripiei. Asamblarea complexului de iniiere a transcripiei genelor pentru ARNr 5S ncepe
prin legarea factorului de transcripie TFIIIA la cutia C. Apoi, TFIIIC se leag la TFIIIA i este
poziionat prin intermediul interaciilor protein-protein ntr-o poziie similar fa de situsul de
START ca i n cazul legrii TFIIIC la genele pentru ARNt. TFIIIB interacioneaz analog cu
TFIIIC i se leag apoi la o secven ADN situat la aproximativ 30 pb, asemeni legrii la gena
ARNt.

Jumtatea N-terminal a uneia dintre subunitile TFIIIB, numit BRF (TFIIB Related Factor),
este similar cu secvena TFIIB (un factor al Pol II). Similaritile sugereaz c BRF i TFIIB
realizeaz o funcie similar n iniiere, adic direcionarea polimerazei la situsul corect de
START. Legarea TFIIIB att la genele pentru ARNt ct i pentru ARNr 5S determin legarea Pol
III, iar aceasta poate iniia transcripia n prezena ribonucleotidtrifosfailor Subunitatea BRF a
TFIIIB interacioneaz specific cu una dintre subunitile polimerazice unice pentru Pol III,
aceasta fiind elementul specific important pentru iniierea procesului de transcripie de ctre Pol
III. Dup legarea TFIIIB, TFIIIC poate fi nlturat fr a afecta iniierea realizat de ctre Pol III.
Astfel, TFIIIC se poate considera c ca fiind un factor de asamblare critic legarea factorului de
iniiere TFIIIB.
Concluzii (SLIDE 96)
-iniierea transcripiei de ctre Pol I este dirijat de ctre un element promoter core, care se
suprapune cu situsul de start, i o regiune de control situat n amonte (UCE). Aceasta
polimeraza necesit doi factori de transcripie generali, SL1 i UBF;
-iniierea transcripiei de ctre ARN polimeraza III este cel mai adesea dirijat de ctre elemente
promotoare interne. Doi factori generali de transcripie sunt necesari pentru iniierea transcripiei
ARNt (TFIIIC i TFIIIB); un factor suplimentar (TFIIIA) este necesar pentru iniierea
transcripiei genelor ARNr 5S;
-iniierea transcripiei de ctre toate cele trei ARN polimeraze nucleare eucariote necesit un
factor de transcripie specific general care conine TBP ca subunitate;
-iniierea de ctre Pol I i Pol III nu necesit ATP, spre deosebire de iniierea realizat de Pol II
care depinde de hidroliza ATP.

NOTE DE CURS BM4

Terminarea transcripiei (SLIDE 6)

-

Exist mai multe mecanisme care regleaz terminarea transcripiei la bacterii i celulele
eucariote.

La bacterii principalele mecanisme implic ARN polimeraza, unul dintre mecanisme

necesitnd i factorul de terminare Rho.

La eucariote, mecanismele pentru terminarea transcripiei difer pentru cele trei tipuri de
ARN polimeraze.

Terminarea transcripiei ADNr

Deoarece transcripii pre-ARNr se termin n proximitatea sau exact la extremitatea 3 a
secvenei ARNr 28S, s-a crezut mai nti c aceast regiune coninea un teminator recunoscut de
ARN polimeraza I. Experienele ulterioare au demonstrat c transcripia in vitro a genelor care
codific ARNr continu dincolo de extremitatea 3 a ARNr 28S matur. La Xenopus, transcripia
se realizeaz dincolo de regiunea care conine separatorul intragenic i se termin la aproximativ
200 pb n amonte de centrul promotorului pre-ARNr 35S urmtor.
La drojdii, transcripii care ncep la nivelul centrului promotorului, se termin la nivelul
separatorului intergenic, dincolo de ARNr 5S i la 300 pb n amont de nceperea secvenei preARNr urmtor.
La ADNr de oarece, terminarea transcripiei are loc ntre 550 i 600 pb dincolo de extremitatea
3 a ADNr 28S. Semnalul de terminare a acestui sistem este o secven foarte conservat
poziionat pe catena sens (5-AGGTCGACCAATTANTCCG-3numit cutia Sal I) i
precedat, n general, de unul sau mai multe regiuni cu resturi pirimidinice, bogate n timin (T).
Se gsesc 8 regiuni de acest tip ntre perechile de baze 500 i 1 200 plecnd de la extremitatea 3
a ADNr 28S, dar n general terminarea se realizeaz n grupul T care precede cutia Sal I.
Secvena conservat de 18 pb poate ea nsi s determine terminarea, dar aceasta este mai
eficient i mai precis cnd cele 18 pb sunt precedate i urmate de regiuni bogate n T. Deleii
mici i inserii sau numai schimbarea unor perechi de baze la nivelul segmentului de 18 pb, la fel
ca i inversarea sa, duc la pierderea activitii sale de terminator. Se consider c un aranjament
destul de asemntor de secvene repetitive conservate (5- GGGTTGACCA-3) furnizeaz
probabil semnalul de terminare a pre-ARNr la om. Secvene repetitive conservate (5GACTTGC-3 precedate de grupri de T) exist n separatorii intergenici de la Xenopus,
terminarea realizndu-se cel mai adesea la nivelul secvenei repetitive care precede promotorul
situat la extremitatea 3 a regiunii separatoare.
Exist argumente indirecte care sugereaz c terminarea la nivelul acestor situsuri depinde de
fixarea unor proteine pe aceste situsuri specifice. Aceste indicaii au fost confirmate prin
demonstraia c unul sau mai muli factori proteici din extractul nuclear se fixeaz de secvena de
18 pb. n acest caz, fixarea proteinei la secvena de terminare a fost evideniat de protecia fa
de digestie cu endonucleaz III a unui fragment marcat la 5 i care coninea acest semnal.
Principiul acestei experiene este c digestia enzimatic a unui segment este oprit de proteina

legat. Trebuie s ne amintim c endonucleaza III diger ADN bicatenar pornind de la

extremitile 3. n aceste condiii vor rezulta fibre marcate n 5, care vor avea lungimea
determinat de locul n care digestia a fost blocat de proteina legat. Cum fiecare caten poate fi
marcat independent la captul su 5, se vor putea determina cele dou limite ale secvenei
blocate.
Cuplarea terminrii i iniierii transcripiei
O caracteristic original a secvenelor de terminare este c acestea sunt adeseori situate imediat
n amonte de promotorii genelor care codific pentru ARNr urmtor. O curiozitate o reprezint
faptul c eliminarea sau modificarea acestor secvene de terminare provoac o reducere marcant
a transcripiei care demareaz la poziia + 1 a urmtorului promotor. Iniial, s-a presupus c un
factor de terminare ar putea s reacioneze cu un factor de iniiere sau cu ARN polimeraza I, sau
c activarea ar putea fi rezultatul localizrii favorabile a enzimei la nivelul unor situsuri de
juxtapunere apropiate promotorului ADNr. O alt explicaie este c terminarea mpiedic
polimerazele ocupate cu transcrierea s se rup complet de complexele de transcripie care sunt
asamblate n imediata vecintate a urmtorului promotor.
Terminarea transcripiei de ctre ARN polimeraza III
Dac iniierea transcripiei de ctre ARN polimeraza III necesit secvene de reglare complexe i
mai multe proteine, terminarea nu necesit dect enzima i un grup de resturi dezoxiadenilate la
nivelul matricei. Terminarea se realizeaz perfect in vitro cu o ARN polimeraz III nalt
purificat i cu o matrice de ADN duplex. Experimental, au fost utilizate matrie de transcripie
formate din AND clonat special pentru a ncerca definirea semnalului de terminare. Aceste
experiene au demonstrat c terminarea depinde de existena unui numr de resturi
dezoxiadenilate grupate pe catenele matricei i de secvenele situate de o parte i de alta a acestui
grup. De exemplu, patru dezoxiadenozine nconjurate de dezoxitimidin nu determin terminarea
eficace, dar patru dezoxiadenozine flancate de o parte de CG i de cealalt parte de GC (5GCAAAACG-3), cum este cazul ADNr 5S din celulele somatic de Xenopus borealis, sunt un
semnal de terminare eficace. Mutaiile care modific numrul de resturi adenilate reduc
eficacitatea terminrii. Sinteza ARN se oprete la nivelul unui rest uridilat complementar unei
secvene deprtate i nici a unor secvene secundare. Dac extremitatea 3 a ADNr 5S este
eliminat din gena clonat, transcripia este continuat pn cnd polimeraza III ntlnete un
semnal adecvat n secvena flancant a vectorului. Dac o serie de dezoxiadenozine este inserat

la un situs incorect din structura matricei unei gene din clasa III, terminarea se realizeaz adesea
la acest situs modificat.
A fost propus o secvena ipotetic de baze care formeaz un terminator eficient la E. coli
(SLIDE 7).
Terminarea Rho-independent apare la nivelul unor secvene caracteristice ale ADN din E.
coli (SLIDE 8).
n figur este prezentat Secvena de terminare a operonului triptofanului trp, un situs Rho
independent.
Operonul triptofan, compus din cinci gene (A-E) este urmat de o secven de 36 pb la captul
creia este localizat secvena semnal de terminare transcripiei. Captul 3 al ARNm
corespunztor prezint o structur sub form de bucl bogat n GC care precede ultimele patru
resturi U, o trstur caracteristic a ARNm produs de gene cu situsuri de terminare Rho
independente. n general, situsurile de terminare bacteriene apar ntre operoni, dar nu ntre genele
structurale din interiorul unui operon. Din acest motiv, genele din interiorul unui operon pot fi
reglate coordonat, n timp ce genele din diferii operoni sunt reglate independent.
Terminarea prematur prin atenuare ajut la reglarea expresiei unor operoni bacterieni
(SLIDE 9).
Atenuarea furnizeaz un mecanism secundar de control a expresiei operonului Trp. Secvena
Leader (L) (reprezint situsul de legare a polipeptidei Leader), care este localizat ntre operator
(O) i prima gen structural (E) conine un situs atenuator de la nivelul cruia transcripia este
terminat n funcie de concentraia citosolic a triptofanului. n figura respectiv, AUG indic
codonii START pentru traducerea secvenei leader (rou) i a ARNm pentru trpE (negru).
Mecanismul de atenuare pentru transcripia operonului trp (SLIDE 10)
a) ARNm corespunztor secvenei leader este constituit din 140 de nucleotide i este mprit n
patru regiuni diferite care pot forma structure sub form de bucl, dar numai una dintr aceste
structuri poate determina atenuarea procesului de transcripie.
b) Translaia secvenei trp leader ncepe de la captul 5, imediat dup ce ARNm corespunztor
secvenei leader este sintetizat, n timp ce este realizat sinteza restului moleculei ARNm trp.
La concentraii crescute de triptofan, formarea buclei stem (ntre regiunile 3-4), urmat de o serie
de resturi de U n 3, determin terminarea transcripiei printr-un mecanism Rho-independent. La
concentraii sczute de triptofan, regiunea 3 este sechestrat n bucla stem format ntre regiunile

2-3 i nu se poate mperechea cu regiunea 4. n absena structurii sub form de bucl necesar
pentru terminare, transcripia secvenelor care codific pentru triptofan continu.
Situsurile pentru terminarea Rho dependent sunt prezente n unele gene ale fagului i ale E.
coli (SLIDE 11).
-

Factorul Rho factor este o protein hexamer care se leag specific la un segment de 70
80 baze al transcriptului ARN n formare.

Factorul Rho alunec apoi de-a lungul ARN n direcia 3 pn cnd acesta desface
hibridul ARN-ADN de la nivelul situsului activ al ARN polimerazei.

Dac transcripia este terminat sau dac nu depinde de factorul Rho; ARN Polimeraza
disociaz numai dac acest factor Rho este prezent la nivelul semnalelor stop dependente
de factorul rho.

Siturile Rho dependente nu posed secvene consens clare i mecanismul de terminare

Rho dependent este caracteristic numai ctorva operoni.

Cele 3 ARN polimerazele folosesc diferite mecanisme de terminare (SLIDE 12).

-

ARN polimeraza I realizeaz terminarea printr-un mecanism care necesit factori

specifici de terminare care se leag n aval de unitatea de transcripie.

ARN polimeraza II conine semnalul de terminare la nivelul unei regiuni de 0.5-2 kb

aparinnd situsului de adugare a cozii poli(A), iar terminarea este cuplat cu procesul
care prin care este realizat clivarea i poliadenilarea captul 3 al transcriptului.

Transcripia realizat de ctre ARN polimeraza III este terminat dup adugarea unei
serii de resturi U.

Transcripia genelor pre-ARNr de ctre ARN polimeraza I este terminat printr-un mecanism
care necesit un factor de terminare specific polimerazei. Aceast protein de legare la ADN se
poziioneaz n aval fa de unitatea de transcripie, diferit de modul de legare a factorului Rho
de la E. coli, care este un factor de terminare care se leag la ARN, o trstur a secvenelor
stop dependente de factorul rho fiind c acestea se gsesc n ARN nou sintetizat i nu n tiparul
ADN.
ARN polimeraza III purificat realizeaz terminarea dup polimerizarea unei serii de U; spre
deosebire de terminarea Rho independent de la bacterii, totui, terminarea realizat de ARN
polimeraza III nu necesit o structur secundar sub form de bucl stem situat n amonte n
structura transcriptului ARN.

La majoritatea genelor de la mamifere care codific pentru proteine, ARN polimeraza II poate
termina transcripia la situsuri multiple localizate la nivelul unei regiuni de 0,5-2 kb aparinnd
situsului de agugare a cozii poli(A). Experimentele cu gene mutante demonstreaz c
terminarea este cuplat cu procesul care prin care se realizeaz clivarea i poliadenilarea
transcriptul ARNm n formare, la nivelul unor secvene specifice asociate cu domeniul
fosforilat carboxil terminal (elementele/domeniul CTD) ale ARN polimerazei.
Acest complex de clivare/poliadenilare poate suprima terminarea, ct timp secvena care
semnalizeaz scindarea i poliadenilarea este transcris de ctre polimeraz. Studii pe mutanii
de drojdii indic c scindarea transcriptului n formare, mai mult dect poliadenilarea,
reprezint un eveniment critic care semnaleaz ARN polimerazei s termine transcripia.
Aa cum a fost prezentat anterior , terminarea transcripiei la bacterii poate fi reglat prin
atenuare i prin mecanisme de anti-terminare. Mecanisme analoge de control, care implic o
decizie ntre elongarea catenei i terminare apar la unele gene transcrise de ctre ARN
polimeraza II.
Un exemplu de reglare a transcripiei printr-un mechanism de anti-terminare este cel al
transcripiei genomului virusului HIV (SLIDE 14).
n figura de pe slide este prezentat complexul de anti-terminare compus din proteina HIV
Tat i alte proteine celulare eucariote. Elementul TAR al transcriptului HIV conine secvene
recunoscute de ctre proteina Tat i proteina celular ciclina T. Ciclina T activeaz i ajut
poziionarea protein kinazei Cdk9 lng substratul su, domeniul CTD al ARN polimerazei II i
astfel, transcripia virusului HIV este reglat printr-un mecanism de anti-terminare. Transcripia
genomului virusului imunodeficienei (HIV) de ctre ARN polimeraza II furnizeaz cel mai
bine neles exemplu de reglare a terminrii transcripiei la eucariote. Exprimarea eficient a
genelor HIV necesit a mic protein viral codificat de locusul tat. Celulele infectate cu
mutani tat- produc transcripi virali scuri care hibridizeaz cu fragmente de restricie care
conin regiuniule proximale promotorului ADN HIV, dar nu i cu fragmentele de restricie
poziionate n aval fa de promotor. n contrast, celulele infectate cu tipul slbatic HIV
sintetizeaz transcripi lungi care hibridizeaz cu fragmente de restricie corespunztoare
ntregii i singurei uniti de transcripie HIV. Astfel, proteina Tat funcioneaz ca un factor
anti-terminator, care permite ARN polimerazei II s citeasc de-a lungul unui bloc
transcripional, mai mult dect proteina N a fagului lambda.

Deoarece mecanismul de anti-terminare coordonat de proteina Tat este necesar pentru

replicarea HIV, nelegerea n viitoare a acestui mecanism de control poate oferi posibiliti de
determinare efectiv a unor terapii pentru rezolvarea sindromului de imunodeficient dobndit
(AIDS, Acquired ImmunoDeficiency sindrom).
Asemntor proteinei N, proteina Tat este o protein care se leag la o secven specific din
structura ARN. Ea se leag la o copie ARN a unei secvene numite TAR, care este localizat
lng captul 5 al transcriptului HIV. Secvena TAR conine dou situsuri de legare: unul care
interacioneaz cu Tat i unul care interacioneaz cu o protein celular numit ciclina T.
Asa cum se observ n figur, proteina Tat a virusului HIV i ciclina T celular se leaga
cooperativ la secvena TAR a ARN. Interacia ciclinei T cu o protein kinaz numit Cdks9
activeaz kinaza, al crei substrat este domeniul CTD al ARN polimerazei II. Studiile de
transcripie in vitro folosind inhibitori specifici ai Cdk9 sugereaz c moleculele de ARN
polimeraz II care iniiaz transcripia la nivelul promotorului HIV stopeaz procesul dup
transcrierea a aproximativ 50 de baze, numai dac CTD este hiperfosforilat de Cdk9. Legarea
cooperativ a ciclinei T i a proteinei Tat la secvena TAR de la captul 5 al transcriptului HIV
poziioneaz Cdk9, astfel nct aceasta poate fosforila domeniul CTD, prevenind astfel
terminarea i permitnd polimerazei s coninue elongarea lanului. De remarcat c, Spt5 una
dintre proteinele complexului ciclinei T-Cdk9, posed o regiune a secvenei de aminoacizi
omolog cu NusG, una dintre proteinele implicate n procesul de antiterminare dirijat de
proteina N al bacteriofagului . Aceast omologie sugereaz c exist similitudini n
mecanismul de reglare a elongrii de la bacterii la animale.

Note de curs BM4

PROCESAREA ARNm LA EUCARIOTE (SLIDE 15)
La puin timp dup iniierea transcripiei de ctre ARN polimeraza II la primul nucleotid al
primului exon al unei gene, la captul 5 al moleculei ARN n formare se adug 7-metilguanin.
Transcripia realizat de ctre ARN polimeraza II se termin la unul sau mai multe situsuri de
terminare situate n aval de situsul poli(A), care este localizat la captul 3 al exonului final.
Dup ce transcriptul primar este scindat la nivelul situsului poli(A), se adaug o prelungire
format din A. Coada poli(A) conine aproximativ 250 resturi la mamifere, 150 la insecte i 100

la drojdii. Pentru transcripii primari cu puini introni, poliadenilarea, clivarea i splicingul

urmeaz de obicei terminarea. Pentru genele mari, cu un numar mare de introni, intronii sunt
adesea nlturai din pre-ARNm n formare nainte ca transcripia genei s fie complet. De
reinut c capionul rmne n moleculele de ARNm mature.
Informaii suplimentare
Terminarea transcripiei i poliadenilarea
Transcripia a numeroase gene eucariote se continu dincolo de locul n care ARN este clivat
pentru a se forma extremitatea 3 a ARNm matur. Terminarea are loc la situsuri diferite care se
ntind pe sute sau chiar mii de perechi de baze ADN. Astfel, regiunea n care se oprete
transcripia -globinei la vertebrate este situat la mai mult de 1 kpb de situsul de poliadenilare.
La fel, transcripia primelor dou gene n tandem ale -globulinei de la mamifere se oprete n
regiunea de separare de aproximativ 2 kpb care separ cele dou gene. Un exemplu interesant
este furnizat de transcripia regiunii tardive a adenovirusurilor. n acest caz, transcripia
continu dincolo de cele cinci situsuri de poliadenilare, nainte de a se termina la captul ADN
viral.
Din contr, anumite gene eucariote par s aib un semnal autentic semnal de terminare a
transcripiei. De exemplu, n gena gastrinei umane, semnalul de terminare este situat la 193 pb
n aval de situsul de poliadenilare. Aceast secven, care dicteaz terminarea transcripiei, att
in vivo, ct i in vitro, este un segment bogat n T, cu urmtoarea secven: 5T9A2T5AT4AT4AT5-3. Transcripia unui ADN care posed aceast secven de-a lungul
catenei sale se termin exact n 5 fa de acest semnal. O secven similar, dar cu cteva
diferene, este prezent n amonte sau n aval de situsul de START la mai multe gene de
vertebrate. Se presupune c acesta este un semnal de terminare i anumite secvene bogate n T
din genele de drojdii, 5-CAATCTTG-3 i 5- T5ATA-3, amintesc de semnalele de terminare
dependente de rho dependente de la E. coli. Independent de prezena semnalelor specifice de
terminare, transcripia depete aproape ntotdeauna situsurile de poliadenilare. n consecin,
extremitile 3 poliadenilate trebuie s fie create prin clivare endonucleotidic, urmat de
polimerizarea de resturi adenilate la nivelul hidroxilului 3 astfel format.
Pentru determinarea situsului de clivare sunt necesare dou secvene situate la distan mic.
Una dintre acestea este cvasi-invariant, AATAAA i este localizat ntre 10 i 30 pb n amonte
de o secven CA situat n apropierea situsului de clivare-poliadenilare. nlocuirea lui T cu G

n AATAAA reduce puternic eficacitatea poliadenilrii, dar cele cteva extremiti formate sunt
poliadenilate. nlocuirea ultimului A din secven cu G la captul primei gene din tandemul
celor dou care codific pentru -globulinei reduce producerea normal a -globulinei. Aceast
experien, la fel ca i altele, indic necesitatea absolut a secvenei AATAAA. Totui,
deoarece secvena AATAAA exist i n regiunea codant a numeroase gene, unde nu exist
poliadenilare, este evident necesar o a dou secven pentru a provoca reaciile de clivare i de
poliadenilare. Localizarea acestui cel de-al doilea semnal a fost studiat examinnd efectul
deleiilor situate n vecintatea situsului de poliadenilare. Experienele demonstreaz c
secvena i poziia precis a acestui semnal variaz de la o gen la alta. n numeroase gene de
vertebrate semnalul cel mai probabil este un segment bogat n GT sau T, cu secvena 5YGTGTGYY (Y fiind o pirimidin), situat cam la 25 pb n aval de situsul de poliadenilare i
adesea urmat la o distan variabil de o scurt secven de T. n anumite circumstane
situsurile autentice de poliadenilare pot s nu fie efective. n maturarea ARNm tardiv al
adenovirusului de tip 2, un singur situs de poliadenilare din cinci poteniale este utilizat pentru
producerea fiecruia din transcripii primari. Abundena relativ a celor cinci clase de ARNm
tardiv la adenovirus reflect, n parte, frecvena cu care transcriptul primar este clivat i
poliadenilat la unul din situsurile sale caracteristice. n acest caz, abundena relativ a
moleculelor de ARNm produse plecnd de la transcriptul primar de modific n cursul infeciei,
indicnd c alegerea situsului de poliadenilare este controlat.
Un al doilea exemplu este cel de trecere de la producerea formei membranare la cea a formei
secretate n cazul imunoglobulinelor. Aceste dou forme difer printr-o regiune a lanurilor lor
grele. n acest caz poliadenilarea pre-ARNm declanat de prima pereche de semnale, cea care
este folosit pentru formarea ARNm care codific forma secretat, este suprimat; molecula de
ARNm este clivat conform semnalelor urmtoare, producnd un pre-ARNm care poate fi
maturat pentru a da natere ARNm care codific forma membranar, deci trecerea de la forma
membranar la forma secretat rezult din utilizarea reglrii difereniate a reaciei de
poliadenilare. Fenomenul i modalitile sale de control nu sunt deplin elucidate.
Secvena AATAAA a fost identificat ca avnd rol i n terminarea transcripiei. Aceast
secven situat la extremitatea 3 a secvenei codante a -globinei majore de oarece este
necesar pentru terminarea care se realizeaz la o distan de aproximativ 1,5 kb de situsul de
poliadenilare. n plus, aceleai deleii i modificri care blocheaz poliadenilarea corect reduc

i eficacitatea cu care se realizeaz terminarea transcripiei n aval. Aceasta sugereaz c

recunoaterea situsului de poliadenilare trebuie s se realizeze nainte de terminarea
transcripiei la secvena adecvat situat n aval.
Ipoteza potrivit creia complexul de transcripie nu achiziioneaz capacitatea de a realiza
terminarea transcripiei dect dup ce a realizat transcrierea semnalului de poliadenilare
constituie o modalitate interesant de a asocia poliadenilarea i terminarea. Ea poate fi valabil
n cazul n care complexul de transcripie ar conine un factor care ar putea mpiedica
terminrile inoportune n timpul transcripiei matricei i l-ar pierde pe acesta la trecerea peste
semnalul de poliadenilare. Dac lucrurile s-ar petrece astfel, complexul de transcripie lipsit de
acest factor s-ar putea desprinde de matrice la nivelul secvenei bogate n T pe care o ntlnete
n continuare.
Acest model a fost propus ca urmare a studiilor realizate in vitro cu ARN polimeraz II
purificat, care demonstreaz c transcripia mai multor tipuri de matrice ADN se termin
frecvent la nivelul secvenelor bogate n T prezente n gen. Este posibil ca procesul de clivare
a transcriptului la semnalul de poliadenilare s permit unei ARN nucleaze sau unei proteine de
tip rho s se fixeze la polimeraz i s induc terminarea la nivelul secvenei bogate n T
prezente n aval. Clivarea i poliadenilarea se pot realiza n diferite tipuri de extracte celulare,
singura condiie fiind ca acestea s posede moleculele ARN substrat purttoare de semnale
adecvate.
Studiile realizate in vitro cu astfel de sisteme au clarificat diferite aspecte ale acestor
reacii. Astfel, clivarea i poliadenilarea se pot realiza independent una de cealalt. n prezena
unor analogi ai ATP (de exemplu cordicepina, care este 3 dezoxiadenozin trifosfat), clivarea se
realizeaz la situsul exact, dar nu este urmat de poliadenilare. Poliadenilarea se poate realiza la
nivelul radicalului OH din extremitatea 3 terminal, care este precedat de o secven
AAUAA. Fracionarea unui extract de celule HeLa care au capacitate de clivare i de
poliadenilare a unui substrat ARN furnizeaz multiple fracii proteice care, mpreun,
catalizeaz aceste dou reacii. Una dintre componente este o poli A polimeraz, o alt fracie
conine una sau mai multe particule ribonucleoproteice nucleare mici (snRNP small nuclear
ribonucleic particles), iar cea de a treia este o protein (64 kD) care se leag la o regiune care
conine secvena AAUAAA. Aceti trei factori sunt necesari pentru a asigura cuplarea clivrii
cu poliadenilarea, n condiiile n care poli A polimeraza singur poate realiza poliadenilarea

unei catene de ARN clivat corect. Cu toate c mecanismul nu este pe deplin elucidat se poate
considera c snRNP U11 mpreun cu proteina 64 kD i probabil cu alte snRNP pot forma un
complex n imediata vecintate a secvenei AAUAAA care asigur clivarea ARN i permit o
poliadenilare corespunztoare. Implicarea snRNP se bazeaz pe descoperirea unor fragmente
care conin secvena AAUAAA n imunoprecipitatele obinute cu anticorpi anti-snRNP i pe
inhibarea poliadenilrii in vitro, realizat de aceti anticorpi. Rolul snRNP n poliadenilare este
complementar n maturarea ARN: U7 snRNP este implicat n crearea extremitilor 3 ale
ARNm de histone, U3 snRNP n producerea extremitii corecte a ARNr 28S i U1, U2, U5 I
U4/U6 n maturarea pre-ARNm.
Cum genelor de la drojdii i probabil de la celelalte eucariote inferioare le lipsesc semnalul
canonic de poliadenilare, AAUAAA, formarea cozii poli A poate fi cuplat cu terminarea
transcrierii. Secvene ca 5-T5ATAT, care favorizeaz terminarea, pot fi utile n crearea
extremitii 3 necesare poliadenilrii. Formarea extremitii 3 poate fi i rezultatul clivrii
endonucleotidice a unui trancript mai lung, urmat de poliadenilarea realizat de poli A
polimeraza. Nu s-a stabilit nc dac la drojdii intervin particulele ribonucleoproteice de tip
snRNP.
Procesarea post-transcripional. Formarea coifului ARNm de la eucariote (SLIDE 16)
n imagine este prezentat structura cap a ARNm la eucariote. Pot rezulta mai multe tipuri de
strucuri cap - cap 0, cap 1 sau cap 2, n funcie de poziiile care sunt metilate.
Captul 5 al ARNm nou format prezint o grupare trifosfat. Iniial, un rest fosfat este
ndeprtat prin hidroliz. ntr-o etap urmtoare captul 5 al restului difosfat atac grupare
atomul de P din poziia al GTP, formndu-se o legtur 5-5 trifosfat, iar restul de G este
metilat la N7 de ctre enzima guanin 7-metil transferaza, rezultnd o structura de tip cap 0.
Dac gruprile 2-OH ale primelor dou nucleotide care se succed structurii cap sunt metilate
enzimatic n prezena S-adenozil metioninei (SAM) i sub aciunea enzimei 2-O-metil
transferaza, rezult cap 1 si, respectiv cap 2.
Informatii suplimentare
Coiful
n afar de o excepie cunoscut (ARNm de la picornavirus) toate moleculele de ARNm de la
eucariote, celulare i virale, posed un coif la extremitatea 5. Coifurile transcripilor nucleari i
citoplasmatici ai polimerazei II sunt asociate cu proteine care se leag specific. Pentru moment

rolurile acestor proteine i ale coifului nu sunt deplin clarificate. S-a stabilit totui c structura
coif interacioneaz specific cu factorii de iniiere n asamblarea complexului de traducere.
Formarea coifului la extremitatea 5 a transcripilor polimerazei II are loc imediat dup iniiere,
chiar i moleculele de ARN cele mai scurte posednd acest coif.
Unul dintre substratele enzimei care realizeaz adugarea coifului, i anume guanin 7 metil
transferaza este GTP; cellalt este extremitatea difosfat creat prin eliminarea fosfatului
terminal al trifosfatului primului nucleotid al ARN n formare. n reacia de adugare a coifului,
fosfatul terminal al pre-ARNm este nlocuit cu gruparea guanil a GTP i este eliminat PPi.
Restul de guanidin adugat este metilat n poziia 7 a ciclului purinei de ctre guanin-7-metil
transferaza; gruprile -OH din poziia 2 ale primelor dou nucleotide sunt apoi metilate de
ctre 2-O-metil transferaza. Gruparea 7-metil-GTP nu poate constitui substrat pentru reacia de
adugare a coifului.
Reaciile de iniiere ale procesului de adugare a coifului realizate de ctre polimeraza II sunt
probabil cuplate obligatoriu deoarece transcripii nucleari formai de ctre ARN polimeraza III,
care posed o extremitate trifosfat (ex. ARN U6, ARNr 5S i pre-ARNt), nu sufer procesul de
adugare a coifului.
Rolul coifurilor n timpul transcripiei i maturrii transcripilor primari n ARNm nu este clar.
De exemplu, rezultatele obinute privind implicarea coifului n maturare sunt contradictorii.
Este posibil ca coiful s aib un rol n formarea complexelor nucleare de ribonucleoproteine
(nRNP), n care moleculele de pre-ARNm sunt sechestrate n timpul transportului ARNm n
afara nucleului sau n asamblarea particulelor ribonucleoproteice citoplasmatice (cRNP). Exist
indicaii care sugereaz c structurile de tip coif i proteinele asociate acestora asigur protecia
moleculelor de ARNm de o degradare care ar putea s demareze la extremitatea 5.
Mai bine stabilit este necesitatea coifului pentru ataarea ARNm la ribozomi nainte de
demararea traducerii. Unul dintre factorii de iniiere, eIF-4 E, este un factor de recunoatere
specific coifului n timpul asocierii subunitii 40S a ribozomului la extremitatea 5 a ARNm.
Se consider c eliminarea coifului unei molecule de ARNm mpiedic traducerea sa in vivo.
Prin experimente in vitro s-a dovedit c moleculele de ARNm care nu posed coif pot fi totui
traduse. Singura excepie cunoscut de la aceast exigen este ARN genomic de la
picornavirus (de ex. virusul poliomielitic) care funcioneaz ca ARNm pentru toate proteinele
codificate de virus. n plus, n celulele infectate de ctre virusul poliomielitic se oprete sinteza

proteinelor gazdei deoarece o protein viral inactiveaz proteinelen celulare prin legare la
nivelul coifului.
Captul 5 -cap este adugat moleculei de ARNm n formare dup iniierea transcripiei
de ctre ARN polimeraza II (SLIDE 17).
n figura de pe slide sunt prezentate reaciile prin care este realizat adugarea coifului la
transcripii ARNm n formare. Primele dou reacii sunt catalizate de o enzim responsabil de
adugareacoifului care se asociaz cu domeniul CTD al ARN polimerazei II la scurt timp dup
iniierea transcripiei. Dou metil-transferaze diferite catalizeaz reaciile 3 i 4. S-adenozil
metionina (SAM) este sursa de grupri metil (-CH3) pentru cele dou etape de metilare
ulterioare; restul guanilat (G) este metilat primul, apoi hidroxilul din poziia 2 al primului sau
al primelor dou nucleotide (N) din transcript.
Moleculele de pre-ARNm sunt scindate la situsuri specifice 3 i rapid poliadenilate
(SLIDE 21).
A fost propus un model de clivare i poliadenilare a ARNm n celulele de mamifere conform
cruia un factor specific de poliadenilare i clivare (CPSF) se leag la o regiune ce conine
semnalul de poliadenilare AAUAAA situat n amonte de situsul de poliadenilare. Un factor
proteic CStF interacioneaz att cu o secven din aval bogat n GU sau U, ct i cu CPSF
legat formnd o bucl n ARN; legarea ulterioar a factorilor CFI i CFII ajut stabilizarea
complexului. Legarea poli(A) polimerazei (PAP) stimuleaz clivarea la nivelul situsului
poli(A), care este de obicei poziionat la 10-35 nucleotide n 3 fa de semnalul de
poliadenilare. Factorii de clivare sunt eliberai, ca i produsul de clivare din aval care este rapid
degradat. Legarea PAP determin adaugare a aproximativ 12 resturi A la o rat sczut la
gruparea hidroxil 3 generat prin reacia de clivare. Legarea proteinei de legare PABII (PoliA
Binding protein) la coada poli(A) iniial scurt accelereaz rata de adugare catalizat de PAP.
Dup adugarea a 200-250 resturi, PABII semnalizeaz oprirea polimerizrii.
Etapa final de maturare: intronii sunt nlturai, iar exonii sunt sudai mpreun (SLIDE
22).
Informatii suplimentare
Secvenele codante ale genelor eucariote (exonii) sunt frecvent ntrerupi de ctre regiuni
necodante (intronii). Aceast descoperire curioas a ridicat numeroase ntrebri fundamentale:
unde, cnd i cum au aprut intronii la nivelul genelor i care este rolul lor n evoluie?; cum

transcripii primari ai acestor gene mozaic sunt transformai n molecule ARN mature, lipsite de
introni? care este influena procesului de excizie-sudare (episaj) asupra reglrii expresiei
genelor?; care este funcia, dac exist vreuna, a intronilor n multitudinea operaiilor care
afecteaz genoamele contemporane; sunt intronii vestigii ale evoluiei genelor i au vreun rol n
viaa organismelor contemporane?
Roberts i Sharp au obinut premiul Nobel pentru Fiziologie i Medicin n 1993, pentru
descoperirea structurii discontinue a genelor.
Frecvena intronilor
Frecvena genelor n mozaic variaz foarte mult n funcie de speciile eucariote. Acetia sunt
foarte frecveni la vegetale i la animale i la virusurile care le infecteaz. Intronii sunt mult mai
rari n genele nevertebratelor (ex. Drosophila, nematodele i ariciul de mare). Totui, mai multe
gene care guverneaz morfogeneza la Drosophila prezint aranjamente complexe de introni i
exoni. Cea mai mare parte a genelor S. cerevisiae sunt lipsite de introni (genele pentru actin i
pentru alte cteva molecule de ARNt reprezentnd excepii), dar genele n mozaic sunt mult
mai numeroase la o specie nrudit numit Schizosaccharomyces pombe. Cu toate c intronii
sunt rari n genele nucleare, ei sunt mult frecveni n genele mitocondriale ale acestei drojdii.
La descoperirea lor s-a crezut c genele mozaic sunt o caracteristic proprie genelor eucariote.
Evidenierea lor n gena timidilat sintetazei bacteriofagului T4 a demonstrat c aceast idee era
fals. De atunci, au mai fost descoperii introni i n gena care codific ARNtSer i n gena
pentru ARNr de la archeobacterii, etc. Acum nu mai este surprinztor c cercetri mult mai
avansate evideniaz ali introni n genele procariotelor. Au fost descoperii introni i la anumite
bacterii.
Intronii exist n genele nucleare care codific pentru ARNm, ARNr (numai n genele lungi
pentru ARNr de la eucariotele inferioare) i pentru un grup de gene care codific ARNt. De
asemenea, intronii sunt frecveni n genele mitocondriale i din cloroplaste, care codific pentru
moleculele ARN mesager, ribozomic i de transfer din aceste organite. Totui, n genele
mamiferelor unde prezena intronilor este o regul, exist i excepii. Cea mai mare parte a
genelor pentru histone nu conin introni, ca i cele dou familii de gene care codific pentru
interferon i , n timp ce gena pentru interferon conine foarte muli. Nu se cunosc nc
exemple privind prezena intronilor n genele pentru ARNr 5S i 5,8S i nici pentru ARN U,
7SL i 7SK.

Diferite tipuri de introni

Toi intronii sunt transcrii ca pri integrante ale moleculelor precursoare de ARN i sunt apoi
eliminai printr-un proces de tiere-legare numit excizie-sudare (episaj). Structura i
mecanismele de alipire stau la baza clasificrii diferitelor tipuri de introni.
Splicing-ul se produce la nivelul unor secvene conservate, scurte (SLIDE 25)
Au fost identificate secvenele consens din jurul situsurilor de splicing 5 i 3 din
structura pre-ARNm de la vertebrate. Cu toate c bazele 5(GU) i 3(AG) sunt aproape
invariabile n structura intronului, totui bazele care le flancheaz pe acestea sunt prezente la
frecvene mai mari dect cele ateptate n cazul unei distribuii aleatoare. O regiune bogat n
pirimidin situat n apropierea captului 3 al intronului este prezent n majoritatea cazurilor.
Punctul de ramificare adenozinic, de asemenea invariant este format de obicei de 20 la 50 baze
n direcia 3. Regiunea central a intronului, care poate fi cuprins ntre 40 pb i 50 kb lungime
nu este necesar procesului de splicing.
Informatii suplimentare - Intronii genelor nucleare pentru ARNm
Intronii genelor nucleare care codific pentru proteine, primii care au fost descoperii, au o
mrime de la 10 pb la 10kpb. Intronii genelor omologe de la diferite specii de vertebrate pot s
difere prin lungime i secven asemeni intronilor din genele nenrudite. Caracteristicile cele
mai comune ale intronilor sunt secvenele din 5 (secvene situate n amonte sau donatoare) i
n 3 (n aval sau acceptoare), adic jonciunile exon-intron sau situsurile de excizie-sudare.
Secvenele nucleotidice ale fiecrei jonciuni exon-intron sunt conservate remarcabil n aproape
toate genele nucleare pentru ARNm la aproape toate speciile studiate. Secvena care flancheaz
cel mai frecvent situsul de sudare din 5 este CRG (unde R reprezint o purin), cea care
formeaz captul din 3 fiind adesea reprezentat de un singur G. Cele mai mari variaii se
ntlnesc n secvenele care nconjoar intronii, ns mutaii la nivelul acestor situsuri nu
mpiedic niciodat episajul, chiar dac exist cazuri n care poate fi afectat viteza. Structurile
cele mai puin variabile se gsesc n intron. Primele dou nucleotide ale extremitii 5 ale
intronului n ARN sunt aproape ntotdeauna GU (GC n cazuri excepionale); urmtoarele cinci
nucleotide nu sunt invariabile, cu toate c secvena AGAGU pare s fie consensus. Modificrile
nucleotidelor G sau U prezente la nivelul jonciunii mpiedic, n general, realizarea episajului,

n timp ce modificrile poziiilor adiacente afecteaz diferit episajul. Cele ase nucleotide de la
extremitatea 5 a intronului sunt suficiente pentru situsul de episaj. Chiar i jonciunile criptice,
care nu sunt folosite dect rar sau cnd situsurile dominante sunt pierdute sau modificate,
posed secvena GU la extremitatea 5 a fragmentului care trebuie eliminat. Captul 3 al
intronului se termin invariabil prin AG, foarte adesea precedat, n intronii de mamifere, de o
secven bogat n pirimidin (YnNYAG). i n acest caz mutaiile care nlocuiesc invariabilele
A sau G printr-o alt baz mpiedic episajul acestei jonciuni.
Un rest A apropiat de extremitatea 3 a intronului este un participant esenial la episajul
moleculelor pre-ARNm. n intronii mamiferelor, poziia acestui A nu este invariabil deoarece
poate fi utilizat orice A dintre nucleotidele situate n poziiile 18 - 37 n amonte de situsul de
episaj. Totui, mutaii la nivelul secvenei vecine acestui A utilizat provoac o important
diminuare a eficacitii episajului in vitro; astfel, cu toate c nucleotidul A esenial nu apare
ntr-un context invariant, secvena vecin influeneaz folosirea sa. Din contr, n cazul
moleculelor de pre-ARN nucleare de la drojdie, restul A este furnizat de un heptanucleotid, 5UACUAAC-3, situat ntre nucleotidele 6 i 59 n amonte de situsul de episaj.
Prezena secvenelor consensus ale situsurilor de excizie-episaj nu semnific ntotdeauna c
intronul poate fi excizat. n anumite cazuri, una sau dou secvene ale acestui situs sunt situate
n exoni i n introni n locuri unde nu se produce n mod normal procesul de excizie-episaj.
Totui, astfel de situsuri criptice pot funciona n anumite circumstane (ex., cnd situsurile
autentice sunt modificate sau absente).
Ocazional, intronii posed mai mult de o jonciune 5 sau 3, permind procese de excizieepisaj alternative. De exemplu, ntr-o regiune precoce a SV40 apar doi introni care au
amndoi acelai situs 3, dar jonciunile 5 sunt diferite. Rezultatul acestor procese de episaj
alternativ duc la formarea a dou molecule de ARNm plecnd de la acelai transcript primar.
n anumite circumstane, alegerea episajului este reglat n timp n funcie de esut. Adesea,
situsuri de episaj exist, dar nu sunt folosite. Astfel, genoamele retrovirale provin din transcripi
de ADN proviral care nu au suferit excizie-episaj, dar producerea de ARNm care codific
pentru anumite proteine virale necesit excizie. n acest caz, acelai transcript poate suferi o
modificare prin excizie-episaj sau nu.

Cum s-a menionat anterior, intronii pot conine alte elemente genetice, cum sunt elementele
activatoare (enhancers) ale altor gene, semnale de replicare i de mpachetare a cromozomului
sau secvene necesare asamblrii pre-ARNm n particulele ribonucleoproteice (RNP).
Etapele procesului de producere a ARNm matur (SLIDE 26)
n figur este prezentat secvena etapelor de producere a ARNm eucariot pentru gena
ovalbuminei de la pui.
n urma transcripiei, transcriptului primar i se adaug capul i coada poliA. Intronii sunt
apoi excizai i exonii sudai mpreun pentru a forma structura ARNm matur.
Informatii suplimentare
Splicingul intronilor moleculelor pre-ANRm nucleare
Studiul mecanismelor de splicing n cazul pre-ARNm nuclear a fost facilitate de existena
genelor mozaic clonate i, n particular, a formelor modificate natural sau deliberat ale acestor
gene. Substrate special preparate, prin fuziune controlat de exoni i introni, au ajutat mult la
identificarea structurilor necesare pentru un splicing fide
Caracteristici generale
Splicingul moleculelor de pre-ARNm nuclear are loc n nucleu, n acelai timp cu transcripia
pentru anumite gene sau dup transcripie pentru altele. Exist indicaii care sugereaz c
adugarea coifului la extremitatea 5 a transcriptului are implicaii asupra procesului de
maturare. Din punct de vedere conceptual i practic este foarte important s se cunoasc cum
o molecul pre-ARNm care conine mai muli introni poate fi maturat, astfel nct exonii
vecini s poat fi asociai corect. Deoarece se tie c situsul 5 al unui intron poate fi clivat n
acelai timp cu situsul 3 al altuia, este foarte important s se neleag cum, n cursul unei
reacii normale, acest lucru poate fi evitat pentru a se putea realiza un splicing alternativ.
Mecanismul de splicing presupune dou reacii de transesterificare (SLIDE 28)
n prima reacie, legtura ester dintre gruparea 5-fosfat a intronului i oxigenul din 3 al
exonului 1 este schimbat pentru o legtur ester cu oxigenul 2 al restului A de ramificare. n
cea de a doua reacie, legtura ester dintre fosforul din 5 al exonului 2 i oxigenul 3 al
intronului este schimbat pentru o legtur cu oxigenul 3 al exonului 1, elibernd intronul sub
forma unei structuri in laso i resudnd cei doi exoni. Sgeile arat unde atomii de oxigen
din gruprile hidroxil activare reacioneaz cu atomii de fosfor.

Secvena reaciilor de transesterificare implicate n unirea exonilor (SLIDE 29) este prezentat
n figura de slide n cazul unei molecule de pre-ARNm:
1) Gruparea 2-OH a unui intron specific A atac nucleofil gruparea 5-fosfat de la
captul 5 al captului intronilor pentru a ajunge la o structur sub form de laso;
2) Gruparea 3-OH eliberat formeaz o legtur 3-5-fosfodiester cu restul terminal
5 a exonului 3, determinnd astfel unirea celor doi exoni i eliberarea intronului sub
form de laso.
Moleculele de small nuclear RNAs (snRNAs) asist reacia de splicing (SLIDE 30)
n figura este prezentat Diagrama interaciilor dintre pre-ARNm, U1ARNsn i U2ARNsn n
procesul de splicing timpuriu.
-

Regiunea 5 a U1ARNsn prezint o secven complementr iniial cu cea a captului 5 al

intronului i captul 3 al exonului din 5 al pre-ARNm (situsul de scindare).

U2ARNsn formeaz perechi de baze cu o secven care include punctul de ramificare A,

dei acest rest nu este mperecheat.

Spliceozomul este un complex ribonucleoproteic compus din multe molecule de snRNPs

(SLIDE 31).
Informatii suplimentare
Asamblarea spliceozomilor
Deoarece splicingul are loc la nivelul spliceozomilor, apare necesitatea cunoaterii structurii,
asamblrii i mecanismelor de aciune ale acestora. Particulele de splicing izolate dintr-un
amestec de reacie n care clivarea n 3 a fost inhibat, sunt de form elipsoidal i cu
dimensiuni de 25 x 50 nm. n particular, intronul este asociat fiecruia dintre snRNP U1, U2,
U4/U6 i U5. Spliceozomii funcionali conin i alte proteine i n particular pe cele care sunt
implicate n legarea snRNP la intele lor care sunt normal fixate pe structura pre-ARNm
nuclear.
O secven minimal a exonului este necesar legrii snRNP la intron. Dup schema actual de
asamblare a spliceozomilor, se leag primele particulele snRNP U1 la extremitatea 5, chiar
dac exist sau nu situsuri funcionale pentru fixarea ntr-o etap ulterioar a snRNP U2 i U5;
dar aceast singur legtur este insuficient pentru a provoca clivarea situsului din 5. Legarea
snRNP U1 este apoi urmat de asocierea snRNP U2. Legarea particulelor U5 i U4/U6,
necesit ATP.

Legarea snRNP U2 la situsul su de pe intron se bazeaz pe mperecherea de baze, n timp ce

ncorporarea complexului snRNP U4/U6 i U5 n spliceozom depinde de interaciile dintre
snRNP.
O schem asemntoare este valabil pentru asamblarea particulelor de splicing pentru preARNm de la drojdii. Dup sudarea exonilor evoluia spliceozomului este incert, dar snRNP
sau sub-ansamble ale acestora sunt probabil reciclate atunci cnd ARN intronic este degradat.
Ciclul de aciune la nivelul spliceozomului (SLIDE 32)
Particulele de tip RNPsn implicate n splicing (U1, U2, U4, U5 i U6) sunt asociate cu preARNm i ntre ele ntr-o anumit ordine secvenial n scopul formrii spliceozomului. Acest
complex ribonucleoproteic catalizeaz apoi cele dou reacii de transesterificare care au ca
rezultat splicingul (sudarea) exonilor i eliberarea intronului sub forma unei structuri laso.
Cu toate c pentru reaciile de transesterificare nu este necesar hidroliza ATP, se consider c
acesta este necesar pentru a furniza energia necesar rearanjamentele structurii care apar n
timpul ciclului. De reinut c proteinele snRNP din structura spliceozomului sunt distincte
fa de RNPhn discutate anterior. La eucariotele superioare asocierea U2ARNsn cu pre-ARNm
este asistat de o protein RNPhn numit U2AF, care se leag o regiune baogat n pirimidin
situat lng situsul 3 de splicing. De asemenea U2AF acioneaz probabil i cu alte proteine
necesare pentru splicing prin intermediul unui domeniu care conine repetiii dipeptidice serinarginin (motivul SR).
Auto-splicing-ul intronilor de grup II furnizeaz indicia pentru evoluia snRNPs
(SLIDE 33)
In figura sunt prezentate diagrame schematice care compar structurile secundare de autosplicing ale intronilor de grup II (a) i UARNsn prezent n spliceozomi (b).
Similitudinile acestor structuri sugereaz c structurile ARNsn evolueaz din introni de grup II,
cu aceste ARNsn care acioneaz n trans i este funcional analog cu domeniile
corespunztoare intronilor de grup II.
Informatii suplimentare
Splicing autacatalitic sau catalizat de spliceozomi
Rezultatul final al splicingului intronilor din grupa II i a pre-ARNm este acelai: intronul
eliberat sub form de laso i cei doi exoni vecini unii ntre ei. n plus, mecanismul reaciilor
celor dou procese este asemntor. n cele dou cazuri, gruparea OH din poziia 2 a

intronului servete drept centru nucleofil pentru realizarea clivrii situsului 5 gruparea OH
din poziia 5 a exonului situat n amonte este centrul nucleofil care cliveaz situsul 3 pentru a
forma legtura exon-exon. Diferena cheie este c anumii introni din grupa II sunt automaturai
in vitro, n timp ce splicingul pre-ARNm nucleari necesit o mainrie elaborat format din
mai multe snRNP i protein accesorii. Totui, anumii introni din grupa II necesit maturaze
pentru reacia in vitro cu toate c nucleotidele i centrele catalitice implicate n cele dou
procese sunt aceleai. Presupunnd c splicingul autocatalitic necesit o repliere foarte
specific a ARN, maturazele ar fi necesare pentru stabilirea i stabilizarea unei structuri care
permite transesterificri secveniale adecvate. Astfel, singura diferen ntre cele dou
mecanisme ar fi maniera n care intronul achiziioneaz conformaia sa cataliticactiv.
Aceleai condiii sunt valabile pentru splicingul catalizat de ctre particule snRNP. Este posibil
ca snRNP i factorii asociai s creeze un eafodaj pe care intronul s poat fi corect pliat,
astfel nct cele dou jonciuni i punctul de ramificare s fie juxtapuse i active. n acest sens,
implicarea spliceozomilor n splicingul moleculelor de pre-ARNm nuclear este analog celei a
maturazei pentru intronii din grupa II. Ne putem ntreba de ce replierea pre-ARNm nucleari
necesit un astfel de complex n timp ce numai maturaza este suficient pentru anumii introni
din grupa II. Rspunsul se poate gsi n complexitatea maturrii care trebuie s se realizeze.
Intronii mitocondriali din grupa II se aseamn, fiecare posednd mai multe secvene foarte
conservate. Una sau dou proteine sunt probabil suficiente pentru a realiza i a menine
conformaia activ a intronilor. Problema este evident mult mai complex pentru moleculele de
pre-ARNm nuclear, dat fiind diversitatea de mrime i de secven a acestora i, deci, i
numrul de introni. O singur protein nu ar putea determina adoptarea unei conformaii active
pentru toi intronii. Particulele snRNP, foarte conservate po interaciona specific cu dou sau
trei secvene conservate prezente n toi intronii, pot interaciona ntre ele i pot impune o
conformaie care favorizeaz cele dou transesterificri catalizate de ctre ARN.
Alt tip de auto-splicing
Intronii din grupa II din structura moleculelor de pre-ARNm mitocondriale de la drojdii posed
i ei secvene conservate i structuri secundare definite, dar acestea sunt distincte de cele
caracteristice intronilor grupei I. i intronii din grupa II sunt supui procesului de auto-splicing,
dar exist puine informaii cu privire la structurile secundare i teriare ale acestor substrate, i

privind detaliile moleculare ale reaciei de maturare. Sunt clare dou puncte ale acestui
mecanism: 1) contrar reaciilor de automaturare pe care le suport intronii din grupa I,
maturarea intronilor din grupa II nu necesit un nucleotid iniiator i 2) produsul de reacie are
o structur de laso.
Ca i n cazul intronilor din grupa I, procesul de auto-splicing implic dou etape de
transesterificare, una n urma clivrii la nivelul situsului 5, i cealalt pentru clivajul situsului
3 i legarea celor doi exoni. Totui, diferena fundamental const n natura atacului nucleofil:
guanozina pentru intronii din grupa I i gruparea OH din poziia 2 aparinnd unui nucleotid
al intronului n cazul intronilor din grupa II. Structura n laso rezult din realizarea unei noi
legturi 2-5 fosfodiesterice n mijlocul secvenei ARN.
Structura tridimensional a intronului, spontan sau facilitat de protein asociate, trebuie s
aduc gruparea OH din poziia 2 a lasoului n apropierea situsului de splicing 5 i s activeze
transesterificarea. Alegerea legturii internucleotidice care este clivat depinde probabil de
secvenele, specifice grupei II, GUGCG prezent la extremitatea 5 i secvena YAU prezen
la extremitatea 3 a intronului. Acest mecanism se aseamn cu cel folosit la maturarea
moleculelor pre-ARNm nuclear. Necesitatea particulelor ribonucleoproteice care acioneaz n
trans pentru realizarea splicingului intronilor din pre-ARNm este datorat faptului c procesul,
n acest caz, este mult mai complex i specific diferitelor tipuri de pliere a diferitelor specii de
pre-ARNm, necesare asigurrii splicingului corect la nivelul jonciunilor exon-intron.
Auto-splicing-ul intronilor de grup 1 - ARN catalitic (SLIDE 35)
In intronii din grupul I, un cofactor guanozinic (G) care nu face parte din catena ARN se
asociaz cu situsul activ. Gruparea OH din poziia 3al acestei guanozine particip la o reacie
de transesterificare cu gruparea fosfat de la captul 5 al intronului. Aceast reacie este analog
cu cea care implic gruparea OH din poziia 2 a situsului de ramificare A din intronii de grup
I i din intronii pre-ARNm matisai n spliceozomi.
Transesterificarea urmtoare care leag capetele 5 i 3 ale celor doi exoni este similar n
toate cele trei mecanisme de splicing . De reinut c intronul de grup I se elibereaz sub forma
unei structuri lineare spre deosebire de produii ramificai din celelalte dou cazuri.
Autosplicingul intronilor din grupa I.
Splicingul intronului pre-ARNr de la Tetrahymena, care reprezint prototipul grupei I, se
realizeaz printr-o serie de transesterificri concertate n cursul crora fosfoesterii sunt

schimbai fr hidroliz intermediar. Cu excepia etapei de iniiere, favorizat de prezena

guanozinei libere sau a nucleotidelor sale, toate grupele reactive implicate n transesterificare
sunt coninute n secvena intronului. n plus, specificitatea de schimb a legturilor este o
consecin a organizrii tridimensionale a intronului, rezultat din mperecherea ntre secvene
distante dar conservate ale intronului.
Prima etap a splicingului este legarea guanozinei la o secven a intronului.
Perechea de electroni liberi ai gruprii OH din poziia 3 ai guanozinei poate provoca un atac
nucleofil asupra fosfatului jonciunii exon-intron 5 (-UpA-) provocnd clivarea acestui situs.
Radicalul OH din poziia 3 creat la situsul de clivare (extremitatea 5 a exonului)
reacioneaz cu gruparea fosfat din poziia 3 al jonciunii, provocnd legarea celor doi exoni i
eliberarea intronului linear, de 413 nucleotide. Segmentul de intron linear suport apoi alte
dou transesterificri intramoleculare i hidrolize, cu eliberarea mai nti a 15 nucleotide i apoi
formarea intronului final prin eliberarea altor 4 nucleotide. Trebuie s reinem c reaciei
globale nu i este asociat nici o modificare net de energie: fiecare rupere a unei legturi
fosfodiester fiind compensat prin formarea concomitent a unei alte legturi fosfodiester.
Guanozina sau unul dintre derivaii ei 5 fosforilai este specific iniierii reaciei de splicing.
Modificarea gruprilor OH din poziia 2 sau 3 sau a potenialului de mperechere a
guanozinei cu un rest de citozin modific capacitatea de iniiere a splicingului. Evident,
mperecherea guanozinei cu un rest complementar al intronului este important pentru
poziionarea corect a radicalului OH din poziia 3 al guanozinei i pentru reacia sa cu
gruparea fosfat din poziia 5 a jonciunii. Cele dou jonciuni exon-intron sunt probabil
apropiate una de alta pentru a permite legarea celor doi exoni dup clivarea iniial realizat de
guanin. Acest proces este uurat de replierea intronului astfel nct cele dou jonciuni s se
poat suprapune, probabil, n vecintatea situsului de legtur al guanozinei. O posibilitate este
ca, n intron, o anumit secven s fie capabil s se mperecheze cu o secven a exonului
situat la fiecare jonciune. Prezena unei astfel de secvene ghid intern ar permite reacia
gruprii hidroxil 3, creat prin clivarea jonciunii exon-intron 5 de ctre guanozin, cu fosfatul
3 al situsului de splicing pentru a forma produsul matisat. Restul G care termin intronul i
nucleotidele adiacente acestuia determin situsul de splicing 3. Modificrile conformaionale
n intronul linear eliberat se presupune c faciliteaz circularizarea i eliberarea de mici
oligonucleotide.

Mecanismul de autosplicing evideniat pentru gena ARNr de la Tetrahymena este aplicabil i

altor introni din grupa I. Acetia posed cu toii 4 secvene conservate (A, B, 9L i 2) i alte
dou secvene neconservate 9R i 9R Aceste 6 elemente apar ntotdeauna n aceeai ordine: 59R-A-B-9L-9R-2-3. n plus, cea mai mare parte a intronilor din grupa I posed i o secven
care poate servi drept ghid intern. Mutaii care mpiedic splicingul au fost evideniate i
caracterizate la drojdii i ciuperci. Astfel de mutaii modific n general posibilitatea
mperecherii bazelor. Astfel, de exemplu, inactivarea splicingului determinat de modificarea
secvenelor 9R sau 9R este reversibil prin schimbri compensatorii n alt secven.
Splicingul in vitro al anumitor introni din grupa I aparinnd genelor mitocondriale de drojdie
pentru pre-ARNm depinde de aceleai secvene conservate similar celor care sunt necesare
splicingului pre-ARNr de la Tetrahymena, produii de reacie fiind analogi. Totui, aceste
molecule de pre-ARNm nu sufer procesul de auto-splicing in vitro. Splicingul acestor introni
depinde de proteine, care acioneaz n trans, codificate de aceleai gene sau de gene nrudite,
de ctre secvene de lectur deschise constituite din exoni i introni. Aceste proteine, maturaze,
nu sunt prezente dect pentru o perioad scurt de timp i par s favorizeze replierea intronului
din structura pre-ARNm ntr-o conformaie care permite splicingul. Aceasta explic de ce
mutaiile non-sens sau alunecarea fazei de lectur n secvena exonului care codific pentru
maturaz, mpiedic splicingul intronului respective, ca i pe cel al intronilor din grupa I
caracteristici altor gene mitocondriale. Acest model explic i de ce mutaiile supresoare sau
care conin o alunecare de faz, care readuc la normal producerea maturazei restabilesc i
splicingul corect. Plierea corect a anumitor introni din grupa I este spontan i stabil in vitro
n timp alii necesit proteine pentru formarea i/sau stabilizarea structurii active autocatalitic.
Exist i posibilitatea ca diverse interacii proteine-proteine s aib rol n pliere.
Splicingul n trans
Reaciile de splicing trecute n revist pn n prezent sunt intramoleculare i sunt deci reacii n
cis. Se pune problema existenei unor procese de splicing intermolecular, deci despre care
putem considera c se desfoar n trans. Mai specific, se pune problema dac doi exoni situai
pe molecule de ARN separate se pot asocia cu eliminarea concomitent a intronilor pe care i
conin. Existena acestui proces de splicing intermolecular a fost demonstrat in vitro utiliznd
substrate ARN special preparate. S-a stabilit c splicingul in trans este o etap esenial n

producerea celular a tuturor moleculelor de ARNm la Trypanosoma i a trei dintre cele patru
tipuri de ARNm rezultate n urma transcrierii genelor actinei de la C. elegans.
Primul exemplu de splicing in trans n care erau implicate uniti transcripionale situate pe
cromozomi diferii a fost descris n cazul proto-oncogenei c-myb (Vellard et al, Oncogene,
1991). n fiecare caz, situsurile de clivare sunt de tip clasic, GU la jonciunea 5 i AG n
poziia 3, produsul eliminat fiind i el o structur ramificat (laso).
Formarea ARNm al actinei funcionale i a multor alte molecule de ARNm de la C. elegans se
realizeaz prin splicing in trans (trans-splicing). n cazul actinei, coiful i primele 22 nucleotide
ale ARNm provin dintr-un transcript de 100 nucleotide obinut plecnd de la ADNr 5S situat pe
un cromozom diferit.
Exemplul cel mai bine studiat de splicing in trans este cel de formare a ARNm de la
Trypanosoma. Toate moleculele de ARNm de la Tryponosoma conin n 5o secven identic,
de 35 nucleotide, netradus, care preced o secven codant ntrerupt. Aceti mini-exoni 5
provin de la extremitatea 5 a unui ARN de 137 nucleotide transcris plecnd de la sute de copii
n tandem ale unui segment de ADN de 137 pb. Un splicing in trans asociaz mini-exonul 5 de
35 nucleotide cu un ARN al crui exon codific pentru o protein cu un alt ARN formnd o
molecul de ARN ramificat. n etapa urmtoare, situsul de maturare 3 este clivat i cei doi
exoni sunt reunii. Segmentul ramificat, coninnd secvenele intronilor de la dou molecule
de ARN separate, este apoi scindat de o enzim care realizeaz deramificarea, rezultatul fiind
separarea intronilor care erau asociai celor dou molecule de ARN.
n exemplul analizat mai sus trebuie remarcat: 1) secvena situat imediat n aval de miniexonul de la Trypanosoma este conform cu secvena consens 5(GUAUGA);
2) jonciunea intronului asociat cu exonul codant este analog secvenei 3 a situsurilor de
excizie ([C/Un NNAG) 3) un nucleotid al intronului reprezint punctul de ramificare, sugernd
c mecanismele de splicing in trans i in cis sunt analoge.
Concluzii (SLIDE 41)
-

Precursorii ARNm de la eucariote sunt procesai prin adugarea structurii cap, scindare
n 3 i poliadenilare, nlturarea intronilor i sudarea exonilor (splicing) nainte de
transportul ARNm n citoplasm unde urmeaz a fi tradus de ctre ribozomi.

Structura cap este adugat la captul 5 al pre-ARNm, n formare, de ctre o enzima

specific care este asociat cu domeniul CTD fosforilat al ARN polimerazei II, la puin
timp dup iniierea transcripiei.

Transcripii pre-ARNm, n formare, sunt asociai cu o clas de proteine de legare a ARN

numite hnRNP.

La majoritatea genelor care codific pentru proteine, un semnal de poliadenilare

conservat (AAUAAA) este situat la 10-30 nucleotide n amonte de situsul poli(A) unde
apare clivarea i poliadenilarea. Un complex multiproteic care include poli(A) polimeraza
(PAP) realizeaz scindarea i poliadenilarea pre-ARNm. O protein nuclear de legare la
poli(A), PABII, stimuleaz adugarea de resturi A de ctre PAP i operete procesul
odat ce coada poli(A) atinge 200-250 resturi.

Splicingul ARN este realizat de ctre un complex ribonucleo-proteic, numit

spliceozom, care este asamblat prin interaciile a cinci particule RNPsn diferite, ntre
ele, i de asemenea cu pre-ARNm. Spliceozomul catalizeaz dou reacii de
transesterificare care sudeaz exonii i nltur intronul sub forma unei structuri in laso,
care este ulterior degradat.

Intronii autocatalitici de grup II, care au fost evideniai n genele cloroplastelor i

mitocondriilor de la plante i fungi, prezint o structur secundar nalt conservat, care
este necesar pentru auto-splicing. Se consider c particulele RNPsn din spliceozomi c
au o structur secundat similar cu cea a intronilor de grup II.

Majoritatea transcripiei i procesarea ARN din nucleii celulelor eucariote se realizeaz la

nivelul unui numr limitat de domenii. O reea proteic fibroas din interiotul nulcleului
formeaz o matrice nuclear. Aceasta poate servi la organizarea unor centre de
transcripie i procesare a ARN.
Procesarea ARNr i ARNt

Genele pre-ARNr sunt similare la toate eucariotele (SLIDE 66).

n figur este prezentat Structura general a unitilor transcripionale pre-ARNr. Cele trei
regiuni codante din structura acestor uniti codific pentru ARNr 18S, 5,8S i 28 S prezente n
ribozomii eucariotelor superioare sau a echivalenilor lor de la alte specii. Ordinea acestor trei
regiuni codante n genom este ntotdeauna n direcia 5-3. Variaiile de lungime ale regiunilor

spacer transcrise (tan) sunt responsabile de diferena major de lungime a unitilor de

transcripie de la diferite organisme.
Moleculele de snoRNA (small nucleolar RNAs) asist procesarea ARNr i asamblarea
subunitilor ribozomale (SLIDE 68).
n figura este prezentat procesarea pre-ARNr i asamblarea ribozomilor la eucariote, fiind
evideniai intermediarii majori i timpul necesar pentru diferitelor etape de procesare a preARNr la eucariotele superioare.
a) Proteinele ribozomale i nucleolare asociate cu pre-ARNr 45S imediat dup sinteza sa,
formeaz o molecul pre-RNP de 80S. Sinteza ARNr 5S apare n afara nucleolului. De reinut c
ARNr constituie aprope 2/3 din masa subunitilor ribozomale i proteinele asociate numai 1/3.
b) Calea de procesare a transcriptului primar pre-ARNr de 6,6 kb (35S) la Saccharomices
cerevisiae. Regiunile spacer transcrise (tan) care sunt nlturate n timpul procesrii, separ
regiunile corespunztoare formelor mature de ARNr 18S, 5,8S i 25S.
Moleculele de pre-ARNt sufer scindare i modificarea bazelor (SLIDE 69).
Procesarea pre-ARNt pentru tirozin implic patru tipuri de modificri. Un intron de 14
nucleotide din bucla anticodon este ndeprtat prin splicing. O secven de 16 nucleotide de la
captul 5 este clivat de ctre RNaza P. Resturile U de la captul 3 sunt nlocuite de ctre
secvena CCA care se gsete n toate moleculele de ARNt mature. Numeroase baze din bucla
stem sunt transformate n baze modificate caracteristice (D=dihidrouridin; =pseudouridin).
Nu toate moleculele de ARNt conin introni care sunt matisai n timpul procesrii, dar sufer
celelalte tipuri de modificri.
Splicing-ul moleculelor pre-ARNt difer de celelalte mecanisme de splicing
(SLIDE70).
Molecula de pre-ARNt este clivat n dou locuri, de o parte i de alta a intronului, exciznd
astfel intronul. Mecanismul de clivare genereaz un fosfomonoester 2-3 ciclic la captul 3 al
exonului din 5. Reacia de jonciune dintre doi exoni este o reacie n multe etape care necesit
participarea a doi nucleozid trifosfai: GTP, care contribuie cu gruparea fosfat pentru jonciunea
3-5 din molecula final ARNt i o molecul ATP care formeaz un intermediar ligaz-AMP
activat. Gruparea fosfat din poziia 2 a exonului 5 este nlturat n etapa final.
Informatii suplimentare
Splicingul ARNt

Modul n care sunt eliminai intronii moleculelor de ARNt a fost cel mai bine studiat i neles la
drojdii, dar anumite informaii au fost oferite n urma studiului altor eucariote inferioare i
plante. Toate enzimele implicate sunt cunoscute i purificate i toi intermediarii sunt
caracterizai. O endonucleaz specific pentru ARNt taie pre-ARNt la nivelul jonciunii 5 a
intronului, formnd un 2, 3-fosfodiester ciclic la extremitatea regiunii 5 a ARNt. Aceeai
enzim taie jonciunea celuilalt intron producnd o grupare 5 OH la extremitatea prii 3 a
ARNt. Fosfodiesterul ciclic este apoi deschis de ctre o fosfodiesteraz ciclic pentru a forma un
2 fosfomonoester. Dup fosforilarea extremitii sale 5 -OH, exonul 3 este adenilat de ctre o
ligaz specific pentru ARNt; aceast ultim reacie este identic cu cea catalizat de ctre ADN
ligaze. Legarea celor dou jumti de molecule prin intermediul extremitilor lor activate
creeaz o legtur neobinuit 2 fosfat, 3, 5 fosfodiester. Eliminarea fosfatului din 2, de ctre
o fosfataz duce la formarea ARN matur. De reinut c gruparea fosfat a noii legturi diester
provine din ATP. Aceasta este o caracteristic care distinge maturarea ARNt de la drojdii de cea
de la vertebrate.
n aceast serie de reacii, clivarea endonucleazic iniial determin formarea de extremiti 5 OH i 3 fosfomonoester, acesta din urm fiind convertit n 2, 3 fosfodiester de ctre o ciclaz
ATP dependent. O ligaz specific pentru ARNt unete apoi cele dou jumti fr a necesita
activarea extremitilor.
Fracionarea sistemului de splicing de la drojdii a dus la obinerea unor preparate nalt purificate
a dou enzime. Una catalizeaz clivarea endonucleotidic la nivelul jonciunilor intronului, iar
cealalt posed, la nivelul unei singure polipeptide, activitatea fosfodiesterazic, kinazic, de
adenilare i ligazic. Cele dou enzime sunt foarte specifice pentru reaciile de splicing ale
ARNt; ele acioneaz totui fr a face distincie asupra tuturor intronilor ARNt i unesc oricare
dou fragmente de ARNt. Astfel au putut fi construite molecule de ARN hibride foarte
interesante, formate din dou jumti de molecule de la ARNt diferii.
Concluzii (SLIDE 72)
-

Asemeni moleculelor pre-ARNm, transcripii primari produi din genele pentru ARNr i
ARNt sufer procesri extensive.

Sinteza unui precursorului pre-ARNr (45S n eucariotele superioare) de ctre ARN

polimeraza I i procesarea acestuia apare n nucleol; clivarea, digestia exonucleotidic, i
modificarea bazelor pre-ARNr 45S conduce la molecule mature 28S, 18S i 5,8S ARNr,

care se asociat cu proteinele ribozomale n subunitile ribozomale. O serie de snoARN

(small nucleolar RNA) particip la procesarea ARNr.
-

ARNr 5S, care este sintetizat n nucleoplasm de ctre ARN polimeraza III, nu este
produs extensiv naintea asamblrii cu alte molecule de ARNr i proteine pentru a forma
subunitatea ribozomal;

Primele molecule de ARNr catalitic (ribozime) descoperite au fost intronii de grup I din
ARNr de la Tetrahymena. Auto-splicingul intronilor de grup I i II, i splicingul preARNm la nivelul spliceozomilor se realizeaz prin intermediul a dou reacii de
transesterificare;

Transcripia genelor ARNt de ctre ARN polimeraza III i procesarea transcripilor

primari apare n nucleoplasm. n toate moleculele de pre-ARNt, secvena captului 5
este ndeprtat de RN-aza P, o ribonucleoprotein care conin un ARN catalitic; CCA
este adugat la captul 3; o serie de baze interne sunt modificate;

Unele molecule de pre-ARNt conin un intron scurt n interiorul buclei anticodon. Acesta
este nlturat de enzime printr-un mecanism distinct de mecanismul de splicing al preARNm i auto-splicingul intronilor.

TRADUCEREA (NOTE DE CURS BM5)

- Caracteristici i etape
- Codul genetic
Produii transcripiei (ARNt, ARNr i ARNm) particip toi la transferul informaiei genetice n
proteine, dar numai ARNm este depozitarul informaiei. Termenul de traducere desemneaz
ansamblul mecanismelor care transform informaia secvenei ARNm n proteine. Transferul
informaiei de la secvena nucleotidic la secvena proteic presupune existena unui sistem de
codificare ntre cele dou tipuri de secvene, numit cod genetic. Ribozomii i ARNt sunt
celelalte dou componente implicate puternic n mecanismul de traducere. Pe lng acestea,
intervin mai multe zeci de alte proteine i molecule diferite (aminoacil-ARNt transferazele,
nucleozid trifosfaii (ATPi GTP), proteinele de iniiere (IF), de alungire (EF) i de oprire (RF).
Codul genetic
Codul genetic gireaz corespondena ntre secvena nucleotidica a unui ARNm i secvena
aminoacizilor unei proteine. Secvenele nucleotidice sunt citite secvenial sub forma de triplete.
Fiecare triplet este numit codon i nu exist suprapunere n lectura codonilor succesivi. Un
nucleotid care a servit pentru lectura unui codon nu poate servi pentru lectura altui codon. Astfel,
primul codon al unei secvene este foarte important deoarece el definete cadrul de lectur
pentru restul secvenei. Deoarece nu exista suprapunere, sunt posibile doar trei cadre de lectura.
n funcie de cadrul de lectura secvena n aminoacizi va fi diferita. Descifrarea codului genetic a
fost realizat n urma experimentelor in vitro cu polinucleotide de sintez. Nirenberg i Matthaei
(1961) au sintetizat poliribonucleotide, cum este de exemplu poli U i au furnizat condiiile
necesare pentru traducerea lor. Polipeptida obinut este polifenilalanina. Aceeai experien,
repetat cu polimeri de A i C a determinta sinteza polipeptidelor poliLys i polyPro, AAA i
CCC codific respectiv pentru lizin i prolin. Ceilali codoni au fost elucidai prin traducerea
poliribonucleotidelor cu secvene dinucleotidice sau trinucleotidice alternative. De exemplu, un
poliAC poart doi codoni posibili ACA i CAC indiferent de cadrul de lectur adoptat.
Traducerea sa furnizeaz un amestec echimolecular de histidin i de treonin. Identificarea
codonilor acestor aminoacizi a fost realizat printr-o alt experien. Este vorba de sinteza unui
polimer format din A i din C n rapoarte molare de 5:1. n acest polimer codonul AAA va fi cel

mai reprezentat statistic, iar codonul CCC cel mai puin reprezentat. Amestecurile codonilor
(A)2C (AAC, ACA i CAA) vor fi mult mai frecvente dect A(C)2 (CCA, CAC i ACC). Analiza
compoziiei n aminoacizi a produilor de traducere indic c numai histidina poate fi codificat
de A(C2), rezultnd astfel c CAC codific histidina i ACA treonina.
n alte experiene, au fost utilizai, ntr-un sistem de traducere, polimeri formai din trei sau patru
nucleotide. Un polimer format din trei nucleotide ([UUG]n de exemplu) furnizeaz trei tipuri de
peptide: poliLeu, poliCys i poliVal, n funcie de cadrul de lectur utilizat. Un polimer format
din patru ([UUAC]n de exemplu) furnizeaz un tetrapeptid Leu-Leu-Thr-Tyr. n final, aceste
experiene i altele au permis stabilirea n ntregime a codului genetic.
Iniierea traducerii utilizeaz adesea codonul AUG i uneori codonii GUG i UUG. Aminoacidul
ncorporat este n toate cazurile Met (sau formil-Met la bacterii). Aceeai codoni codific pentru
Met, Val i Leu cnd nu sunt folosii ca semnal pentru nceperea traducerii.
ncheierea (terminarea) traducerii se realizeaz cnd ribozomul ntlnete unul dintre codonii
non sense (UAA, UAG, UGA) indicai n tabel prin Stop (Tabel 4.2, SLIDE 13).
Aminoacizii sunt desemnai prin trei litere i respectiv o liter de cod. tiind c codonii sunt
triplete i c exist patru baze n structura ARN (G, A, U, C), sunt posibile teoretic 43 adic 64
de triplete diferite. 61 dintre acestea au sens, adic codific pentru aminoacizi i trei sunt numii
non sens (fr sens) (UAA,UGA, UAG) deoarece nu exist ARNt care s posede anticodoni
complementari. Aceti codoni fr sens sau Stop, sunt codonii care marcheaz terminarea
sintezei proteice. Acelai aminoacid poate s fie codificat de mai muli codoni diferii (Tabel 4.2,
SLIDE 13). Astfel, histidina este codificata de doi codoni, CAU i CAC, iar arginina de codonii:
CGU, CGC, CGA, CGC, AGA i AGG. n medie, unui aminoacid i corespund trei codoni. Din
aceast cauz codul genetic este numit degenerat sau redundant. Codul genetic este n acelai
timp numit universal deoarece aminoacizii au aceeai codoni indiferent de sistemul biologic care
asigur traducerea. Totui exist cteva excepii ale codului universal, mai ales n cazul sintezei
proteice mitocondriale. Codul genetic folosit n mitocondriile animale i ale fungilor este diferit
de codul standard folosit de toate genele procariote i eucariote; de remarcat c acest cod difer
chiar i pentru mitocondrii de la specii diferite. Cum a aprut acest fenomen n cursul evoluiei
este misterios. De exemplu, UGA, este n mod normal un codon STOP, dar este citit ca triptofan
n mitocondriile umane i de fungi; totui n mitocondriile plantelor UGA este nc un codon

STOP. AGA i AGG, codonii nucleari standard pentru arginin codific de asemenea pentru
arginin n mitocondriile fungilor i plantelor, dar reprezint codoni STOP pentru ADNmt de la
mamifere i pentru serin la ADNmt de la Drosophila. Mitocondriile plantelor par s utilizeze
codul genetic standard. Totui, comparaiile secvenelor n aminoacizi ale proteinelor
mitocondriale de la plante cu secvena nucleotidic a ADNmt sugereaz c CGG poate codifica
fie pentru arginin (aminoacidul standard) sau triptofan. Aceast nespecificitate aparent a
codului mitocondrial este explicat prin editarea transcripilor ARN mitocondriali, care pot
transforma resturile de citozin n uracil. Dac o secven CGG este editat n UGG, codonul
specific triptofanul, aminoacidul standard pentru UGG, n timp ce codonii CGG care nu sunt
editai codific pentru arginin. Astfel sistemul de translaie n mitocondriile plantelor utilizeaz
codul genetic standard.
Moleculele de ARNt izoacceptoare
Aminoacizii nu au afinitate specific pentru ARNm. Ei se ataeaz matricelor de ARNm prin
intermediarul adaptatorilor, moleculele de ARN de transfer (ARNt). Moleculele de ARNt sunt
molecule de mrime mic (masa lor este de aproximativ 25 000, 75 de baze). Ele prezint
particularitatea de a fi modificate dup sintez. Astfel, anumite baze sunt metilate, altele
transformate n baze rare (cum sunt dihidrouridina, inozina), etc. Moleculele de ARNt adopt o
configuraie spaial compact n form de L inversat. Din comoditate, structura este frecvent
reprezentat depliat sub forma unei frunze de trefl cu patru tije formate din baze mperecheate
prin legturi de hidrogen i trei regiuni n form de bucl (limburile frunzei) ne-mperecheate
(SLIDE 15). Extremitatea 5 a ARNt este tot timpul ocupat de ctre G, n timp ce extremitatea
3OH se termin prin secvena CCA a crei funciune 3OH a adenozinei este esterificat cu
gruparea COOH a aminoacidului. Bucla anticodonului poart o secven de trei baze, ncadrat
n 3de o purin i n 5 de un U. Aceasta recunoate i hibridizeaz codonul complementar
existent pe ARNm. Astfel, exist o coresponden specific ntre aminoacidul fixat la ARNt i
anticodon. Anumite molecule de ARNt conin nucleotidul inozin (nucleotid a crui baz azotata
este hipoxantina). Inozina poate forma legturi de hidrogen cu U, C i A. n concluzie, acelai
ARNt se poate mperechea cu trei codoni diferii care corespund aceluiai aminoacid (SLIDE 16,
17).
nainte de a participa la traducerea ARNm, moleculele de ARNt fixeaz aminoacidul
corespunztor anticodonului lor (SLIDE 18). Fiecare aminoacid este mai nti activat, n

prezen de ATP, de ctre enzima aminoacil ARNt sintetaza care catalizeaz ntr-o prim etap
formarea aminoacil-AMP:
Aminoacid + ATP

Aminoacil ARNt sintetaza

[Aminoacil-AMP] - Enzim + PPi

Enzima rmne legat de complexul aminoacil-AMP pn la ntlnirea unui ARNt specific

aminoacidului. n a dou etap, aminoacidul este transferat pe extremitatea 3OH a ARNt i
formeaz un aminoacil-ARNt numit i ARNt ncrcat:
[Aminoacil-AMP]-Enzima + ARNt Aminoacil-ARNt + AMP + Enzim (SLIDE 18).
Asamblarea proteinelor se realizeaz plecnd de la aceti aminoacil-ARNt. n funcie de
aminoacidul transportat, aminoacil-ARNt va fi numit alanilARNtAla (sau Ala-ARNtAla), Glicil
ARNtGly(sau Gly-ARNtGly), etc.
Evidenierea relaiilor codon: anticodon: aminoacid transportat de ARNt a fost realizat n urma
experienelor lui Nirenberg i Leder (1964). Ribozomii incubai cu ARNm poliU i PheARNtPhe fixeaz cei doi acizi nucleici. Dac Phe-ARNtPhe este nlocuit de ctre un alt
aminoacil-ARNt, nu are loc fixare de ctre ribozomi. Deci, Phe-ARNtPhe recunoate specific
codonul UUU graie anticodonului su. Prin modificarea secvenei ARNm, a fost posibil
determinarea speciilor (moleculelor) de ARNt care recunosc diferiii codoni. Deci, ntr-o celul
se gsesc douzeci de aminoacizi diferii care sunt transportai de aproximativ aizeci de
molecule de ARNt la ncrcarea crora particip acelai numr de ARNt sintetaze
corespunztoare. n consecin, anumii codoni pot fi recunoscui de mai muli ARNt care
transport acelai aminoacid, ARNt izoacceptori, n timp ce alii, codonii Stop, nu sunt
recunoscui de nici unul.
Ribozomii (SLIDE 19, 20)
Dup ncrcarea cu aminoacidul corespunztor, ARNt se combin cu ribozomii pentru a asigura
sinteza proteic. Ribozomii, particulele citoplasmatice constituite dintr-o subunitate mare i o
subunitate mic, ambele formate din ARNr i proteine, au compoziii diferite la procariote i la
eucariote. Ribozomii sunt constitueni majori n celul. Colibacilul conine aproximativ 15000
ribozomi, reprezentnd aproximativ 25% din masa uscat a celulei. Comparaia secvenelor
proteinelor ribozomale de la mai multe organisme relev o foarte mare conservare n cursul
evoluiei. Moleculele de ARNr sunt i ele la fel de bine conservate.
Cele dou subuniti ribozomale sunt adesea libere i nu se asociaz dect n momentul traducerii
ARNm. Funcia principal a ribozomilor este de a orienta corect ansamblul aminoacil-ARNt n

raport cu ARNm cu scopul de a crea legturile peptidice. Mai muli ribozomi pot ncepe
traducerea succesiv a aceleiai molecule de ARNm, ei gsindu-se astfel legai sub forma unui
irag de mrgele care constituie un polizom sau un poliribozom.
Sinteza proteic (SLIDE 21)
Traducerea ARNm n proteine se realizeaz ntotdeauna n sensul 5-3. La procariote, traducerea
ncepe chiar nainte de terminarea transcripiei. La eucariote, transcripia se realizeaz n nucleu,
n timp ce traducerea are loc n citoplasm. Deci, moleculele de ARNm sunt transcrise i apoi
maturate n nucleu. Ele migreaz apoi n citoplasm pentru a fi traduse n proteine.
Traducerea poate fi mprit n trei etape eseniale: demararea sau iniierea, alungirea sau
elongarea i oprirea sau terminarea.
Demararea sau iniierea (SLIDE 21, 22)
Iniierea traducerii corespunde legrii ribozomului la ARNm, cutrii codonului de iniiere
(orientrii dup codonul de iniiere) i fixarea primului aminoacil-ARNt. Demararea sintezei
proteice la bacterii ncepe deci cu formarea unui complex ntre subunitatea mic, 30S, primul
aminoacil-ARNt i o molecul de ARNm. Subunitatea mare, 50S, se leag la acest complex
pentru a forma ribozomul 70S funcional. n cursul sintezei tuturor peptidelor bacteriene, primul
aminoacid ncorporat este N-formil-metionina (metionin modificat care posed o grupare
formil fixat de radicalul amino-terminal), al crui codon principal este AUG, adesea GUG.
Datorit faptului c gruparea amino a formil-Met (fMet) este blocat, un astfel de aminoacid nu
poate fi inserat dect la nceputul catenei polipeptidice.
Factorii denumii de iniiere (IF pentru Initiation Factors) necesari sunt proteinele IF1, IF2 i
IF3 (la eucariote au fost evideniai cinci astfel de factori). Aceti factori se fixeaz la subunitatea
30S n timpul primei etape de iniiere, iar GTP legat la IF2 este elementul stabilizator al acestei
fixri. n acest stadiu, factorul IF3 mpiedic asocierea subunitilor 30S i 50S.
Cea de a dou etap este asocierea fMet-ARNtfMet i a ARNm la ansamblul IF-30S-GTP.
Asocierea presupune intervenia unei secvene mici din structura ARNm, AGGAGGU, numit
situs de fixare la ribozom sau rbs (ribosome binding site) sau secven Shine-Dalgarno
complementar unei secvene prezent n structura ARNr care particip astfel direct la iniiere,
selecionnd situsul de demarare a traducerii: codonul AUG iniiator este definit prin hibridizarea
dintre secvena rbs i o secven apropiat de extremitatea 3 a ARNr 16S.

Eliberarea IF3 permite asocierea celor dou subuniti, hidroliza GTP i eliberarea altor doi
factori de iniiere. Complexul obinut este numit complex de iniiere 70S.
La eucariote, ribozomii recunosc coiful (capionul) metilat graie unor factori numii proteine de
fixare a coifului (cap binding protein). Acetia alunec apoi de-a lungul ARNm plecnd de la
extremitatea 5 pn la ntlnirea primului codon AUG iniiator. Factorii adiionali de iniiere
favorizeaz, n aceast etap, desfacerea structurilor secundare susceptibile de oprirea procesului.
Alungirea sau elongarea (SLIDE 24)
Elongarea implic formarea unei legturi peptidice ntre aminoacizi i deplasarea ribozomului
de-a lungul ARNm. Lectura ARNm ncepe de la extremitatea 5 i se realizeaz n direcia 5-3.
Fiecare ribozom posed dou situsuri de fixare a ARNt. Acestea sunt situsurile P (Peptidil) i A
(Aminoacil). Fixarea ribozomului la ARNm se realizeaz astfel nct fMet-ARNfMet s fie
poziionat n situsul P pentru a se putea mperechea cu codonul AUG de pe ARNm. Situsul A
disponibil poate astfel primi aminoacil-ARNt al crui anticodon corespunde celui de al doilea
codon din structura ARNm. O legtur peptidic se stabilete ntre gruparea COOH al primului
aminoacid i gruparea NH2 a celui de al doilea graie enzimei numit peptidil-transferaz,
component a subunitii 50S. Formarea legturii peptidice transfer gruparea COOH a
aminoacidului din situsul P gruprii amino a aminoacidului care se gsete n situsul A. Astfel,
extremitatea COOH a catenei n formare se termin ntotdeauna cu o molecul de ARNt. Lanul
peptidic este sintetizat ncepnd de la extremitatea NH2 ctre extremitatea COOH. n urma
formrii legturii peptidice ARNtfMet descarc aminoacidul si prsete situsul P. La momentul
rsepectiv, dipeptida se gsete legat la ARNt ncrcat cu cel de-al doilea aminoacid i este
poziionat n situsul A. n continuare, acest peptidil-ARNt se deplaseaz n situsul P prin
micarea relativ a ARNm cu o lungime de trei baze. n acest moment situsul A liber poate primi
un nou aminoacil-ARNt. O dat ajuns n situsul A, o alt legtur peptidic asociaz aminoacidul
cu cel care l precede n situsul P. Elongarea catenei se realizeaz prin repetarea acestor micri.
Alungirea catenei polipeptidice necesit dou molecule de GTP care sunt hidrolizate pentru
fiecare aminoacid adugat.
Factorii de elongare (EF pentru Elongation Factors) sunt i acetia indispensabili. EF-Tu
reacioneaz cu GTP i ARNt ncrcat pentru a forma complexul aminoacil-ARNt-GTP-EF-Tu
care plaseaz aminoacil-ARNt n situsul A de pe ribozom folosind energia eliberat prin
hidroliza GTP n GDP. Deplasarea peptidil-ARNt din situsul A n situsul P este dependent de

factorul de elongare G (EF-G) numit i translocaz. EF-G reacioneaz prin asocierea GTP la
ribozom. Acesta permite translocarea i eliberarea ARNt din situsul P. Reutilizarea acestui factor
de elongare necesit de asemenea hidroliza unei molecule de GTP n GDP i Pi.
Mecanismele de alungire (elongare) a catenei polipeptidice la eucariote s-au dovedit similare cu
participarea factorilor de elongare eEF-1 i EF2 care au roluri similare cu EF-Tu, EF-Ts i EF-G.
Oprirea sau terminarea (SLIDE 24)
Terminarea implic detectarea codonului de oprire, ruperea legturii ester dintre ultimul ARNt i
catena polipeptidic i eliberarea acesteia.
Sunt necesare dou condiii:
- prezena unui codon care specific (codific) oprirea elongrii;
- intervenia unui factor de disociere (RF sau Release Factor) capabil s recunoasc semnalul de
terminare a catenei i s favorizeze ruperea legturii cu ARNt i eliberarea catenei.
n componena codului genetic exist trei codoni de oprire recunoscui (citii) de proteine
specifice care la E. coli sunt RF1 (recunoate UAG i UAA) i RF2 (recunoate UGA i UAA).
Acetia favorizeaz interacia catenei n formare cu o molecul de ap i eliberarea lanului.
Cnd mrimea unei catene polipeptidice atinge douzeci i cinci de aminoacizi, codonul de
iniiere AUG de pe ARNm este complet liber i se poate iniia o nou demarare. Fenomenul se
reproduce de mai multe ori pn cnd ARNm este acoperit de ribozomi distanai ntre ei prin
aproximativ douzeci i cinci de nucleotide. Aceast unitate de traducere mare, numit
poliribozom sau polizom, permite celulei reproducerea mai multor copii ale unei proteine
plecnd de la o molecul de ARNm. Dac ARNm este policistronic i dac al doilea codon de
iniiere nu este situate (poziionat) prea departe de primul codon de oprire (de terminare),
ribozomul se deplaseaz alunecnd i se leag la codonul de iniiere al cistronului urmtor.
La eucariote, nu exist reiniiere a sintezei proteice dup ntlnirea codonului de terminare.

Traducerea informaiei genetice la eucariote

Sinteza proteica sau traducerea este activitatea de sintez cea mai complex din celul. n timp ce
sinteza altor molecule celulare este rezultatul unor reacii enzimatice relativ directe, asamblarea
unei proteine necesit prezena tuturor moleculelor de ARNt i a tuturor aminoacizilor
corespunztori ataai la acetia, de ribozomi, de molecule de ARNm, de mai multe proteine cu
funcii diverse, de cationic i de GTP. Aceast complexitate nu trebuie s ne mire dac inem
cont c sinteza proteic necesit incorporarea a peste 20 aminoacizi n funcie de o secven

precis dictat de un mesaj codificat scris ntr-o limb care folosete simboluri diferite. Procesul
de traducere de la eucariote seamn remarcabil cu cel de la procariote. Principal diferen este
c n celula eucariot traducerea implic un mare numr de factori proteici solubili
(neribozomici).
Iniierea (SLIDE 25)
Etapele fundamentale de iniiere a traducerii depind de ataarea corect a ribozomului la o
secven bine determinat din structura ARNm pentru ca mesajul s poat fi citit ntr-un cadru de
lectur corect. Aceasta se realizeaz deoarece ribozomul ncepe traducerea la nivelul unui situs
specific de pe structura mesagerului numit codon de iniiere. ARNm nu se fixeaz la ribozomii
constituii (ntregi). Acesta se unete la cele dou subuniti n momente diferite. Prima etap
esenial este unirea subunitii ribozomale mici la prima (sau la una din primele) secvene AUG
ale mesajului care funcioneaz ca un codon de iniiere. Care este modalitatea prin care
subunitatea mic alege codonul AUG iniial i nu un alt codon intern. Aa cum am artat
anterior, procariotele posed o secven specific de nucleotide numit Shine-Dalgarno care este
complementar cu o secven nucleotidic apropiat de extremitatea 3 a ARN ribozomal 16S
din subunitatea mic.
ARNr _ _ACCUCCUUUA3
ARNm _ _ GGAGGA_ _ _5
Recunoaterea codonului de iniiere AUG este consecina unei interacii ntre aceste secvene
complementare de pe ARNm i de pe ARNr cnd subunitatea mic recunoate mai nti
extremitatea 5 a mesajului , care poart un capion de metilguanozin. Dup aceast subunitatea
mic baleiaz secvena ARNm pn cnd ntlnete o secven de nucleotide (de obicei 5CCACCAUGC-3) care aproximativ 90% din moleculele de ARNm eucariot, tripletul AUG este
codonul de iniiere. Dac inem cont de atribuirea codonilor putem spune c AUG este mai mult
dect un codon de iniiere: este singurul codon pentru metionin. De fapt metionina este
ntotdeauna primul aminoacid incorporat la extremitatea amino a catenei polipeptidice n formare
(la procariote metionina din poziia 1 poart ntotdeauna o grupare formil). n cea mai mare parte
a cazurilor metionina (sau formil-metionina) este ulterior nlturat enzimatic, cu toate c
metionina rmne aminoacidul terminal n aproximativ 50% din catenele polipeptidice mature.
Celulele posed dou molecule de ARNt pentru metionin: una este folosit pentru iniierea
sintezei proteice (ARNtiMet), iar cealalt (reprezentat de ARNtMet) intervine n incorporarea

resturilor de metionin n interiorul polipeptidului. Trebuie s reinem c mitocondriile i

cloroplastele celulelor eucariote folosesc N-formil-metionin n locul metioninei pentru a iniia
traducerea, ceea ce d cele mai bune argumente n favoarea originii procariote a acestor organite.
Mai multe dintre etapele de iniiere necesit prezena unor proteine solubile numite factori de
iniiere (reprezentate de IF la procariote i de eIF la eucariote). De exemplu, la eucariote, se
consider c eIF4E se ataeaz coifului la extremitatea 5 a mesagerului i nltur regiunile
bicatenare care interfer cu deplasarea ribozomului n cutarea codonului de iniiere. n plus, pe
lng factorii proteici este necesar i prezena GTP pentru a realiza o iniiere reuit. O
molecul de GTP se unete cu ARNtiMet nainte de cuplarea sa cu subunitatea ribozomal mic.
Imediat ce ARNt iniiator este ataat, subunitile mari care se anexeaz complexului, factorii
solubili sunt eliberai i GTP este hidrolizat. Hidroliza GTP poate fi cauza unei modificri a
conformaiei ribozomului necesar iniierii traducerii. Fiecare ribozom posed dou situsuri de
asociere a moleculelor de ARNt. Aceste dou situsuri, situsul A (aminoacil) i a situsului P
(peptidil) joaca roluri diferite n traducere. Aminoacil-ARNt intr n complexul ribozom-ARNm
la nivelul situsului A, n timp ce la nivelul situsului P, ARNt livreaz aminoacizi catenei
polipeptidice n cretere. De fapt ARNt de iniiere (ARNtiMet) apare mai nti la nivelul P al
ribozomului.

Elongarea
O dat ce ARNt de iniiere este plasat n situsul P, ribozomul este gata pentru fixarea celui de al
doilea aminoacil-ARNt n situsul A vacant, prima etap de elongare (etapa 1). nainte ca cel de al
doilea aminoacil-ARNt sau c urmtorii s se poat uni efectiv la situsul A de pe ARNm, acesta
trebuie s se combine cu unul dintre factorii proteici de elongare (aceti factori de elongare
particulari sunt numii Tu la procariote i eEF1 la eucariote) unii cu GTP. Cu toate c orice
complex aminoacil-ARNt-Tu-GTP poate intra n situsul A, va fi blocat la nivelul ARNm printr-o
specific numai cel al crui anticodon este complementar codonului de pe ARNm situat n situsul
A. Imediat ce complexul aminoacil-ARNt-Tu-GTP adecvat recunoate codonul de pe ARNm,
GTP este hidrolizat i se elibereaz complexul Tu-GDP. Complexul ARNt-Tu-GTP este
regenerat. Cea de a doua etap a ciclului de elongare este formarea unei legturi peptidice ntre
aminoacizii ataai la cele dou molecule de ARNt. Reacia se realizeaz prin transferarea
metioninei (sau a N-formil metioninei) de pe ARNt iniiator din situsul P pe aminoacidul ataat

la ARNt care este complementar celui de al doilea codon prezent n situsul A. Reacia este
catalizat de ctre peptidil transferaz, element au subunitii mari a ribozomului. Mult timp s-a
considerat c peptidil-transferaza era una dintre proteinele ribozomului. Mai trziu, cnd
capacitatea catalitic a ARN a devenit evident, atenia s-a ndreptat ctre ARN ribozomal ca
fiind posibilul catalizator al legturii peptidice. n ultimul s-a demonstrate c activitatea peptidiltransferazic este efectiv localizat pe molecula mare de ARN ribozomal din subunitatea mare a
ribozomului. Cu alte cuvinte, peptidil transferaza este o ribozim. Formarea primei legturi
peptidice las o extremitate a moleculei de ARNt n situsul A nc ataat la codonul su
complementar de pe ARNm n timp ce cealalt extremitate este ataat la o dipeptid. ARNt
prezent n situsul P nu mai posed acum un aminoacid ataat. Cea de a treia etap a ciclului de
elongare implic eliberarea ARNt nencrcat prezent n situsul P i deplasarea ribozomului cu
trei nucleotide (un codon) de-a lungul ARNm n direcia 3. Aceast ultim etap, numit
translocare, este nsoit de deplasarea ARNt-dipeptidei, nc unit prin legturi de hidrogen la
al doilea codon al ARNm, n situsul P al ribozomului. Translocarea necesit un factor de
elongare numit G la procariote i eEF2 la eucariote i hidroliza GTP. Pentru fiecare ciclu de
elongare sunt hidrolizate cel puin dou molecule de GTP, una (sau mai multe) n timpul seleciei
aminoacil-ARNt i una n timpul translocrii. ndat ce peptidil-ARNt se deplaseaz n situsul P,
situsul A este din nou disponibil unui nou aminoacil-ARNt al crui anticodon este complementar
cu al treilea codon. Cnd cel de al treilea ARNt ncrcat este asociat la ARNm n situsul A,
dipeptida legat de molecula de ARNt prezent n situsul P este transferat aminoacidului ARNt
din situsul A. ARNt din situsul P este din nou eliberat de aminoacid. Formarea unei noi legturi
peptidice este urmat de eliberarea ARNt din situsul P i de translocarea ribozomului ctre cel de
al patrulea codon, i ciclul este gata s renceap.
PRECIZIA TRADUCERII
Interacia ntre tripletele din structura ARNm i ARNt nu este una foarte puternic pentru a
asigura ea nsi precizia bine cunoscut a sintezei proteice (mai puin de un aminoacid din
10000 este incorect incorporat). Au fost propuse mai multeipoteze care s explice frecvena
foarte sczut a erorilor. O ipotez sugereaz c numai codonii i anticodonii complementari sunt
capabili s se insereze la nivelul fosei formate de ctre ARN ribozomal. Legtura peptidic se
poate forma numai n cazul n care fosa mare este ocupat. O alt ipotez pune accent pe
intervalul apparent care separ unirea complexului ARNt-Tu-GTP la ARNm i momentul n care

aminoacidul este adugat catenei polipeptidice n cretere. Cu ct codonul i anticodonul

neadecvat (necomplementari) sunt mai mult n contact, cu att este mai ipotez face apel la faptul
c hidroliza GTP poate asigura fidelitatea traducerii. Cu toate c pn n prezent se presupunea
c pentru fiecare ciclu de elongare se realizeaz hidroliza a dou molecule de GTP exist din ce
n ce mai multe argument n sprijinul ideii c numrul real de molecule de GTP hidrolizate este
mult mai mare (cel puin trei). Este posibil ca energia suplimentar s fie folosit pentru
eliberarea moleculelor de ARNm ce nu sunt bine mperecheate. Streptomicina, care este unul
dintre cele mai prescrise antibiotice acioneaz unindu-se selectiv la subunitatea ribozomal mic
a celulelor bacteriene provocnd o lectur eronat a anumitor codoni ai ARNm, crescnd sinteza
proteinelor aberante. Acest antibiotic nu acioneaz asupra ribozomilor de la eucariote si deci nu
are effect asupra traducerii din celulele gazd. Se pare c streptomicina se unete cu proteina
ribozomal numit S12 care intervine care intervine ntr-un fel sau n altul n controlul preciziei
interaciei dintre moleculele de ARNt specifice i complexul ribozom-ARNm. Rezistena
bacteriilor la streptomicin se poate explica prin modificri la nivelul proteinelor ribozomale i
n particular la nivelul S12. Multe antibiotic acioneaz interacionnd cu diferite etape ale
sintezei proteice n celulele bacteriene (tabel).
Eu, Pro: celule eucariote, procariote; G, P: subunitatea mare sau mic; R: recunoatere; P:
transferul polipeptidului; T: translocare; I: iniiere;
Terminarea
Cum s-a remarcat anterior trei din cei 64 codoni (de trei nucleotide) poteniali sunt codoni stop
ale cror funcie este semnalizarea opririi asamblrii polipeptidelor. Deci, nu exist anticodoni n
structura ARNt care s fie complementare codonilor stop. Cnd ribozomul ajunge la unul dintre
aceti codoni, UAA; UAG sau UGA, semnalul oprete orice nou elongare i elibereaz
polipeptidul asociat ultimului ARNt. Terminarea necesit prezena factorilor de eliberare care
reacioneaz direct cu codonii stop; bacteriile posed doi factori de eliberare (RF1 care
recunoate UAA i UAG i RF2 care recunoate UGA) n timp ce celule eucariote nu au dect un
eRF. Factorul de eliberare poart un GTP legat care este apoi hidrolizat. Imediat ce traducerea se
oprete, legtura polipeptidei la ARNt este scindat i factorul de eliberare, ca i ARNt dezacilat,
sunt eliberai de pe ribozom. Hidroliza legturii ntre polipeptid i ultimul ARNt poate fi
realizat de ctre aceeai regiune a ARNr care este responsabil de formarea legturii peptidice
n timpul elongrii. Imediat ce se realizeaz terminarea, ribozomul se separ de mesager i se

disociaz n subuniti pn la iniierea unui nou ciclu de traducere. Cum cei trei codoni de
terminare pot fi uor obinui prin modificarea bazelor plecnd de la ali codoni, ne-am putea
atepta la apariia unor mutaii care dau codoni stop la interiorul unei gene. Aceste mutaii ar
putea provoca o terminare prematur a catenei polipeptidice n cretere. Mutaiile de acest tip sau
mutaiile non-sens, au fost studiate timp de ani de zile i se tie c acestea sunt responsabile de
diferite maladii ereditare la om. Mutaiile non-sens antreneaz de obicei formele de maladii
ereditare cele mai severe deoarece se realizeaz numai sinteza unei poriuni a proteinei i aceasta
este ntotdeauna nefuncional. Terminarea prematur a creterii catenei poate fi determinat i
de adugarea unui antibiotic, cum este puromicina. Aceast molecul seamn cu extremitatea 3
a unui ARNt ncrcat i poate intra n situsul A al ribozomului (figura). Cnd aceasta se plaseaz
la acest nivel, polipeptida din situsul P este transferat puromicinei din situsul A cu formarea
unei legturi covalente. Transferul catenei polipeptidice n formare, pe puromicin determin
formarea unui capion la extremitatea carboxil, astfel nct ali aminoacizi nu se mai pot ataa
complexului peptidil-puromicin, iar acesta se desprinde de pe ribozom.
Formarea de poliribozomi
Dac observm la microscopul electronic o molecul de ARNm n curs de traducere vedem
ntotdeauna un anumit numr de ribozomi ataai de-a lungul fragmentului de ARNm. Acest
complex format din ribozomi i ARNm numit poliribozomi. Mai nti, toi ribozomii se
asambleaz din subunitile lor la nivelul situsului de iniiere, apoi ei se deplaseaz de la acest
punct ctre extremitatea 3 a ARNm pn cnd ating codonul de terminare. Imediat ce primul
ribozomi se afl la o distan destul de mare de codonul de iniiere, un al doilea ribozom se
ataeaz la ARNm i demareaz o alt activitate de traducere. Traducerea simultan a aceluiai
ARNm de mai muli ribozomi crete puternic viteza de sintez a proteinelor celulare.
Chiar dac procesele se aseamn ele sunt difereniate la eucariote si la procariote deoarece la
eucariote procesul de transcripie i cel de traducere sunt compartimentate i se desfoar fiind
separate n citoplasm i n nucleu. n celulele bacteriene, sinteza proteic debuteaz la nivelul
moleculelor de ARNm chiar nainte de terminarea transcripiei acestora. Sinteza unei molecule
de ARNm progreseaz n acelai sens ca i deplasarea ribozomilor care traduc mesajul, adic n
direcia 5- 3. n concluzie, o molecul de ARNm la procariote va fi tradus pentru traducere
imediat ce extremitatea sa 5 este disponibil pentru fixarea ribozomilor. n figur este
reprezentat filamentul de ADN pe care transcripia este n curs. Se pot observa molecule de

ARNm din ce n ce mai lungi la nivelul crora sunt ataai ribozomi pentru a forma
poliribozomii. Catenele proteinelor n formare nu sunt vizibile n micrografiile realizate n cazul
traducerii unor proteine normale dar se pot observa la nivelul singurului poliribozom izolat dintro celul a glandelor sericigene de la viermele de mtase. Proteina de mtase n curs de sintez
este vizibil din cauza mrimi sale i a maturii sale fibroase. Posibilitatea vizualizrii
transcripiei i traducerii, oferit de Oscar Miller de la Ridge National Laboratory, a constituit o
etap n vizualizarea unui proces care pn n acel moment numai n termeni biochimici.