Laboratorio

Fitotoxicologia
Practica N4
TECNICAS DE RECUENTO DE MICROORGANISMO
Arias, J. 4105061; Avendao, J. 5110052; Reyes, R. 5120462; Jansasoy, C. 2110693
Ingeniera Agroindustrial1, Ingeniera Ambiental2, Zootecnia3.
Universidad Nacional De Colombia - Sede Palmira
Octubre 15 de 2013
Grupo 01
RESUMEN
En diversos estudios microbiolgicos (como anlisis de alimentos, de agua de bebida, de productos farmacuticos o del medioambiente
entre otros), se requiere conocer el nmero de microorganismos presentes en un material con objeto de determinar su calidad, as como
tener que comparar la cantidad de crecimiento de las bacterias en diversas condiciones, dichas poblaciones suelen ser muy grandes por lo
cual la mayora de los mtodos de cuantificacin se basan en mediciones directas e indirectas de muestras muy pequeas. El objetivo de la
prctica fue reconocer las metodologas ms utilizadas en microbiologa, para la cuantificacin directa e indirecta de microorganismos.
Los materiales y procedimientos utilizados fueron de acuerdo protocolo de la gua correspondiente, se tuvo como resultados que en la
siembra en superficie a diferentes diluciones la cantidad de unidades formadoras de colonias por mililitro fue superior a 1,6 X10 3 y en
siembra en profundidad a distintas diluciones se tuvieron en una de las diluciones el mismo resultado anterior y adems se presentaron
errores de procedimiento que no permitieron el conteo.
Palabras Claves: Crecimiento, Cuantificacin, Mtodos Directos e Indirectos
INTRODUCCION
El crecimiento de poblaciones microbianas puede medirse de
diferentes maneras. Algunos mtodos determinan el nmero de
clulas y otros la masa total de la poblacin, que a menudo es
directamente proporcional al nmero de clulas. La magnitud de
las poblaciones normalmente se registra como el nmero de clulas
que hay en un mililitro de lquido o en un gramo de material slido.
Como las poblaciones bacterianas suelen ser muy grandes la
mayora de los mtodos de cuantificacin se basan en mediciones
directas o indirectas de muestras muy pequeas; despus se
determina mediante clculos el tamao de la poblacin total.
(Tortora, 2007). El conteo directo es una observacin directa del
microorganismo en el cual se reconocen por separado cada una de
los individuos de una comunidad existente en una muestra. Por
otro lado, el conteo indirecto se define como la evidencia
presuntiva de microorganismos por medio de la bsqueda de
productos metablicos en ensayos cultivables (Madigan, 2003),
evaluando la oxido-reduccin de los metabolitos primarios o
secundarios utilizando reactivos que evidencian la presencia del
microbiana en la muestra. La eleccin de un mtodo de
seguimiento del cultivo en concreto depende de las caractersticas
del cultivo y del proceso (Aquiahuatl y Prez, 2004). El conteo
directo es ampliamente usado en estudios que necesitan datos en
cortos periodos de tiempo, mientras que el conteo indirecto es
usado para realizar anlisis relacionados con la actividad
metablica de los microorganismos, en ensayos que necesitan
medios selectivos o especficos para microorganismos (Garca,
2004).
El objetivo de la practica fue implementar los conocimientos
adquiridos en siembras, medios de cultivo y microscopia para
establecer cuantitativa y cualitativamente poblaciones micolgicas
y bacterianas diluidas por mtodos directos e indirectos.
MATERIALES
Para esta prctica se utilizaron, 4 tubos de ensayo, 3 cajas de Petri
vacas esterilizadas, 3 cajas de Petri con agar nutritivo, 4 pipetas de
1ml estriles, 1 asa bacteriolgica, 1 asa de vidrio o de hockey
estril, 1 mechero, 2 cmara de Neubauer, 1 cultivo en medio

lquido de bacterias, 1 cultivo en medio lquido de esporas, 1

microscopio binocular, 1 Vortex.
METODOS
Se extrajo bacteria del medio liquido previamente homogenizado,
donde su dilucin decimal inicial es de 10 0, se hizo la distribucin
de 1 ml con la pipeta, a un primer tubo con 9 ml de solucin
salina, y se homogenizo, este tubo posee una concentracin de 10 -1;
luego se tom 1ml del tubo de concentracin 10 -1, y se adiciono a
un segundo tubo con 9 ml de solucin salina y se homogenizo, este
tubo posee una concentracin de 102; luego se repiti el
procedimiento tomando 1 ml de la dilucin de 10 -2 y se adiciono a
un tercer tubo con 9 ml de solucin salina y se homogenizo, este
tubo posee una concentracin de 10-3.
Siembra en Profundidad.
Se tom de la dilucin 10-1 con una pipeta de 1mL de capacidad,
1ml y se coloc en una caja Petri estril vaca, la cual se agito un
poco para verter el inoculo por toda la caja. Este proceso se repiti
con las otras dos cajas pero utilizando para cada dilucin (10 -2,10-3)
una caja Petri correspondiente. Cuando estuvieron las tres cajas
sembradas se procedi a verter agar, fundido y mantenido a 45C
aproximadamente. Se homogeniz cada caja realizando
movimientos circulares y en ocho, hasta que el agar inicio su
polimerizacin.
Siembra en Superficie.
Se utilizaron tres cajas Petri con agar SPC, una caja para cada
dilucin de las cuales con la pipeta de 1 ml de capacidad, se tom
0.1ml de cada dilucin y se adiciono a su caja correspondiente
sobre la superficie del agar y con el asa de vidrio se homogenizo el
inoculo por toda la superficie del agar. De igual forma se procedi
con las otras dos diluciones.
Luego las cajas utilizadas tanto en siembra de profundidad como
siembra de superficie fueron incubadas a 372C. Transcurridas
24 horas se revisaron y se realiz el recuento de las colonias
visibles.

Recuento de cmara de Neubauer

Se mont la cmara de Neubauer en el microscopio, se localiz la

cuadricula para el conteo con el aumento de 40X, en el cual se
observ correctamente la cuadricula comprendiendo la distribucin
y las reas a contar. Se coloc el cubreobjetos de la cmara al
borde de la misma y cubriendo la cuadricula de conteo. Luego se
tom con una alcuota una pequea fraccin de la muestra
proporcionada por el tutor y se adiciono a la cmara la cual por
capilaridad absorbi la muestra. Posteriormente se observ que la
distribucin de las clulas fuera homognea, se sucedi a realizar
el conteo, registro de datos y clculo de concentracin de
clulas/ml.
Patrones de McFarland:
Se seleccion un patrn de McFarland No. 3 y de acuerdo a la
turbidez se adiciono una cantidad de bacteria con el asa
bacteriolgica al tubo con solucin salina, se homogenizo y se
adiciono ms bacteria hasta lograr la turbidez requerida del patrn
para ajustar la concentracin.

es siempre cierto porque las bacterias con frecuencia crecen unidas

en cadenas o como grumos. Por consiguiente, a menudo una
colonia no se produce como resultado de una nica bacteria sino de
segmentos cortos de una cadena o de un agregado bacteriano.
En el mtodo siembra superficial no suelen usarse volmenes
mayores de 0.1ml porque el exceso de lquido no se absorbe y
origina problemas en el recuento al favorecer la extensin y mezcla
de colonias. En cambio en el mtodo de siembra profundo se
pipetea conocido (normalmente 0.1-1.0ml) de cultivo en una placa
Petri estril sobre la que se aade el medio del agar fundido y se
mezcla todo bien con suaves movimientos de la placa sobre la
superficie de la mesa antes de dejar que se solidifique. Como la
muestra se mezcla con el medio fundido, se puede usar volmenes
de inoculo mayores que en mtodo se siembra de superficie sin
embargo, con este mtodo el organismo que se cuenta debe ser
capaz de resistir la temperatura del agar fundido a 45C.
En la cmara de Neubauer se observ que es un mtodo rpido
para el clculo de la poblacin de clulas, pero en la prctica no es
preciso para determinar el nmero de clulas vivas.

RESULTADOS
En la tabla 1 se muestran los resultados de la cuantificacin de
unidades formadoras de colonia en diferentes siembras
Tabla 1: Mtodos de Cuantificacin de Unidades Formadoras de
Colonia
SIEMBRA

DILUCIN
10-4

RESULTADOS
>1,6*103

UFC/mL

SUPERFICIAL
10-3

>1,6*103
UFC/mL

10-2

>1,6*103
UFC/mL
Error en el
procedimiento por
escurrimiento del
agar.

-3

10
PROFUNDA

1264 UFC/mL
10-2
>1,6*103 UFC/mL
10-1
En el recuento en la cmara de Neubauer se tomaron los datos
promedio de las 25 cuadriculas, se procedi a hacer el clculo
correspondiente para cuantificar el nmero de clulas/ml:
6

3 x 25 x 50 x 1000 = 3750000 3.8x10 clulas/ml.

En el patrn de McFarland el tubo que se escogi fue con una
escala de 3.5; con una poblacin de 9,0x10 8 UFC/mL que es
correspondiente a su turbidez.

CONCLUSIONES
La realizacin de diluciones permite variar la concentracin de
microorganismos y de esta forma poder obtener un estimativo del
nmero de Unidades Formadoras de Colonia (UFC) que podemos
encontrar en determinadas muestras.
En el mtodo de cmara de Neubauer no se distinguen clulas
muertas y vivas, las clulas pequeas son difciles de contar al
microscopio ms que todo cuando el medio no es 100% puro o sin
partculas.
La correcta siembra es de vital importancia para el microorganismo
debido a que de esto depende su crecimiento y el anlisis de
recuento del cultivo. Para que la medida sea correcta desde el
punto de vista estadstico, es necesario contar ms de 300 UFC.
BIBLIOGRAFIA
Aquiahuatl Ramos, M.A., y Prez Chabela, M.L. 2004. Manual de
Practicas de Laboratorio de Microbiologa General. Universidad
Autnoma
Metropolitana,
unidad
Iztapatapa,
Mxico,
Departamento de Biotecnologa. 47-49p.
Garca-Cortes, V. Introduccin a la microbiologa. 2004 Editorial:
EUNED. Costa Rica. 112P
Madigan, M.T.; Martinko, J.M.; y Parker, J. 2003. Brock: Biologa
de los Microorganismos, Editorial Prentice Hall Hispanoamrica
S.A. 10 Ed. Madrid. 166p
Tortora, Gerard, J, .Berdell, R. 2007, Introduccin a la
microbiologa. Buenos Aires. Ed. Mdica Panamericana. 9a
edicin. 178p

DISCUSION

CONSULTA
1. Explique brevemente el proceso mediante el cual se realiza el
recuento de microorganismos por la tcnica de tubos mltiples (o
tcnica del nmero ms probable-NMP).

La ventaja de la tcnica de recuentros en placa es que mide el

nmero de clulas viables. Su desventaja es que requiere bastante
tiempo, por lo general 24 horas o ms, para que se formen colonias
visibles. El recuento en placa se basa en la suposicin de que cada
bacteria crece y se divide para producir una sola colonia. Esto no

En el mtodo de los tubos mltiples, se siembran o inoculan

volmenes parciales de una muestra de agua en una serie de tubos
que contienen un medio de caldo de cultivo adecuado. Despus de
un periodo de incubacin especifico a una temperatura dada, cada

tubo que muestra formacin de gas es considerado como

presuntivamente positivo, ya que esto indica la posible presencia
de bacterias coliformes; sin embargo, como tambin otros
organismos pueden producir gas, es aconsejable una subsecuente
prueba de confirmacin. A las dos se les conoce como prueba
presuntiva y prueba confirmativa
2. Defina el termino inoculo.
Es la Cantidad o Nmero de Grmenes infectantes
que son introducidos accidental o voluntariamente en

los tejidos vivos o en medios de cultivos especiales

No son necesariamente patgenos puesto que
tambin pueden ser de tipo simbitico.