LIGAMIENTO Y CARTOGRAFIA

EN BACTERIAS

Zoraida Fernndez 2009

Muchas bacterias desarrollaron resistencia a los

antibiticos
Reduccin de eficacia del tratamiento
Es el resultado de la accin de los genes localizados en los
plsmidos R, plsmidos circulares pequeos que pueden
transferirse por conjugacin
Los plsmidos evolucionaron desde los ltimos 50 aos
por el uso irracional de antibiticos
Se transfieren entre las bacterias en diversos entornos
naturales
Desde la ubre de una vaca infectada por E. coli a una
cepa humana de E. coli en una toalla de mano
Desde bacteria de porcino a otra de humano, por tabla
de picar carne contaminada

Gentica bacteriana
Carecen de membrana nuclear
Genoma haploide, mayormente circular de longitud de varios
millones de pares de bases
Algunos contienen cromosomas mltiples e incluso stos
pueden ser lineales
Pueden presentar plsmidos o pequeas molculas circulares
de DNA
Genes que no son esenciales para la funcin bacteriana
Pueden desempear papel importante en el ciclo de vida
en los hospedadores
Algunos estimulan el apareamiento entre bacterias. Otros
causan muerte a otras bacterias
Otros generan resistencia a los antibiticos en la bacteria

Los plsmidos constan de miles pares de bases de

longitud
Poseen su propio origen de replicacin, por lo que se
replica de manera independiente
La replicacin ocurre en una o dos direcciones hasta que se
copia el plsmido en su totalidad

Los episomas son plsmidos capaces de replicarse

libremente o integrados a los cromosomas bacterianos
Factor F (fertilidad) de E. coli es episoma que controla el
apareamiento y el intercambio gnico entre clulas
bacterianas

Replicacin del plsmido de manera independiente

Transferencia gentica en las bacterias

Proceso de transferencia de informacin
gentica desde una clula donadora a otra
receptora
Promovido por determinados tipos de
plsmidos, que portan genes cuyos productos
participan en el proceso
Requiere contactos directos entre ambas
clulas, con intervencin de pilus sexuales en
Gram negativos, y contacto ntimo en los Gram
positivos

Las bacterias estn prximas entre s y se

forma puente o conexin entre ellas
Un plsmido o una parte del cromosoma
bacteriano pasa de una clula (donante) a otra
(receptora)
Ocurre entrecruzamiento entre las secuencias
homlogas del DNA transferido y el
cromosoma de la clula receptora
El DNA slo se transfiere de la clula donante
a la receptora, sin intercambio recproco de
material gentico

conjugacin
Davis, 1950

108 clulas

Lederberg y Tatum, 1946

Las clulas donadoras presentan factor F o de

fertilidad
Dicho factor no es ms que el plsmido que se
transfiere en el proceso de conjugacin entre
clula donante y clula receptora
Al final del proceso, ambas clulas presentan
el factor F

El factor F, episoma
de E. coli

F+ X F -

Factor F+ y F Factor de fertilidad presente en la bacteria donante y ausente en

la bacteria receptora
Las bacterias que contienen F se conocen como F+ y las que
carecen de l se conocen como F El factor F contiene un origen de replicacin y cierto nmero de
genes requeridos para la conjugacin
Algunos de estos genes codifican los pili sexuales
(prolongaciones de M.C) que hacen contacto con la clula
receptora
El DNA se transfiere desde clula F+ a clula F En la mayora de los casos solo se transfieren los genes presentes
en el factor F
Una vez dentro de la clula receptora la cadena simple de DNA se
replica

Clulas Hfr

donadora

receptora

puente de
conjugacin

F+ pasa a Hfr

En las cepas Hfr (alta frecuencia) el factor F est

integrado al cromosoma bacteriano
Se comportan como clulas F+, forman pili sexuales y se
conjugan con las clulas F El factor F integrado se rompe y el extremo de la cadena
rota se mueve hacia F El factor F se une al cromosoma
La cantidad de cromosoma que se transfiere depende del
tiempo de conjugacin

1/1000 clulas F+
pasan a ser Hfr

Hfr: alta frecuencia de recombinacin (Cavalli-Sforza, 1950)

insercin de F: F+ pasa a Hfr

un nico
sobrecruzamiento!

En la clula receptora se replica la cadena de

DNA donante y se produce entrecruzamiento.
Clulas F- casi nunca pasan a F+

Frecuencia de transferencia
de material gentico en conjugacin
F+ X F+ o F+ X Hfr: no hay contacto

F+ X F=> genera un F+ (1/5) y baja recombinacin (1/107)

Clulas F
Factor F se escinde del cromosoma, una
pequea cantidad de genes puede eliminarse
junto con l
Ej: bacterias Flac
Pueden conjugarse con clulas F- dado que
poseen el plsmido F con toda la informacin
gentica

Hfr (1/103) X F=> receptora F- y alta tasa de recombinacin (1/104)

F X F-

Mapeo de los genes mediante conjugacin interrumpida

La conjugacin entre Hfr y F- permite trazar el
mapa de genes bacterianos
La transferencia completa requiere de 100 minutos
Se interrumpe conjugacin antes de ese tiempo y slo
una parte del cromosoma pasar al receptor
recombinandose con la clula
Los genes pasan en una secuencia definida,
comenzando por el factor F integrado
Las distancias se expresan como porcentaje de
recombinacin, pero en los mapas bacterianos
construidos con conjugacin interrumpida la unidad
basica de distancia es el minuto

Cepa Hfr A: A+, B+, C+, D+, F-, G--); cepa F-: A--, B--, C--, D--,
F+, G+.
Mezclamos ambas cepas.
A distintos tiempos extraemos
alcuotas, y las agitamos
fuertemente (deshacer parejas
en conjugacin): "cruces
interrumpidos.
Cada alcuota se siembra en
medio mnimo suplementado con
requerimientos para los A, B, C y
D. (crecer slo cepa receptora)
Se anota la frecuencia de
aparicin de cada alelo silvestre,
y los resultados se representan
en funcin del tiempo al que se
extrajo e interrumpio las
muestras del cruce conjugativo

Transferencia direccional y mapeo

gradiente de transferencia

El factor F en Hfr1 est ubicado entre

los genes leu y azi
La transferencia gnica seguir
direccin contraria a agujas del reloj:

leu thr thi his gal lac

pro azi

porcentaje
mximo

En la cepa Hfr5
thi- thr leu azi pro lac
gal his
La distancia relativa en tiempo entre
cualquier par de genes en ambas cepas
es constante

La secuencia u orden en que los marcadores

son transferidos por Hfr, permite construir
mapa gentico circular
Los mapas explican el por qu marcadores
ubicados en extremos opuestos del orden de
transmisin de un Hfr, estan ligados en otros
Hfr
Durante aos se pens que el tiempo mximo
de transferencia era de 90 min, pero en 1976
fue corregido a 100 min

mapa circular (Jacob y Wollman, 1957)

orden relativo de genes siempre igual

Sexduccin
Consiste en el transporte de material gentico
desde una clula a otra por medio de plsmidos
F'. Se distingue de cruces F+ x F-- y Hfr x F-en:
El plsmido F' transfiere regiones cromosmicas
discretas a altas frecuencias (cercanas al 100%);
A diferencia de los cruces Hfr x F--, el receptor se
convierte en frtil.

merodiploide o merocigoto
o diploide parcial

Se obtienen F secundarias
Se produce una recombinacin entre
segmentos cromosmicos (procedentes de la
clula donadora) portados por el F' y
marcadores cromosmicos homlogos de la
cepa receptora.
Se origina una cepa parecida a las Hfr pero que
no se ha producido por recombinaciones a
travs de las IS: merodiploide por
recombinacin, pero no por sustitucin

Regulacin gentica de la conjugacin

La regulacin negativa se produce por la accin de
los genes finO y finP.
El complejo TraY + TraZ acta como endonucleasa
cortando la secuencia de F
El gen traJ es un activador de la transcripcin del complejo
TraY + TraZ

El gen finP solapa con el gen traJ y especifica un

RNA antisentido que, ayudado por la protena FinO,
bloquea la traduccin del RNAm de traJ, impidiendo
la sntesis de la protena TraJ y, como consecuencia,
la expresin del opern de transferencia

 La transformacin tiene lugar cuando una bacteria

capta el DNA presente en el medio en cual se
desarrolla.

TRANSFORMACIN
BACTERIANA

Despus de la transformacin es posible la recombinacin

entre los genes introducidos y los del cromosoma
bacteriano

Experimentos de transformacin
bacteriana de Griffith (1928)
Bacteria
Diplococcus
pneumoniae
Cepas RII (rugosa)
avirulentos
Cepas SIII (lisa)
virulentos

 La transformacin requiere de:

Captacin del DNA desde el medio que rodea a la
bacteria
Incorporacin del DNA al cromosoma bacteriano o a
un plsmido

Puede producirse de manera natural, cuando la

bacteria se degrada y libera fragmentos de DNA al
medio
Las bacterias que captan el DNA son llamadas
competentes
La competencia se ve influenciada por el estadio de
crecimiento, la concentracin de DNA disponible y la
composicin del medio

TRANSFORMACION: Estos trozos de DNA extracelulares se incorporan a una

bacteria viva siempre y cuando sta se encuentre en un estado competente
fisiolgicamente.
Receptores de
superficie

DNA TRANSFORMANTE

DNA TRANSFORMANTE

E. COLI. Tamao suficiente para incorporar activamente distintos genes

al cromosoma de la clula receptora
A diferencia de la conjugacin, el DNA transformante es de doble
cadena. Una se cadena se degrada por la accin de endonucleasas en la
clula receptora y la otra se alinea con la regin complementaria. QUE
PASA CON LA CADENA DEL CROMOSOMA DE LA CELULA
RECEPTORA?

El DNA que capta la clula competente no

requiere ser de origen bacteriano
Casi cualquier tipo de DNA puede transferirse a
bacterias competentes

Etapas de transformacin:
En la medida que el DNA ingresa en la clula una de
las cadenas se hidroliza,
La otra cadena se mueve a travs de la membrana y se
aparea con regin homloga (y se integra al
cromosoma)
En esta integracin ocurre entrecruzamiento
El DNA monocatenario restante se degrada por accin
de enzimas bacterianos

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 Existen tcnicas de laboratorio que incrementan la

frecuencia de transformacin (aumentan
permeabilidad de membranas bacterianas)
Tratamiento con cloruro de Calcio
Shock trmico
Campo elctrico

Tambin se han desarrollado cepas bacterianas

que son ms competentes que las silvestres
Otra estrategia es utilizar concentraciones elevadas
de DNA

La transformacin tambin se utiliza para mapear el

genoma bacteriano, sobre todo en especies que no sufren
conjugacin o transduccin
El mapeo requiere:
Dos cepas bacterianas que posean varios rasgos genticos
diferentes
La cepa receptora puede ser a- b- c- (auxtrofa para tres
nutrientes)
La cepa donante ser prototrofa con alelos a+b+c+
El DNA de la cepa donadora se asla y purifica
La cepa receptora se trata para aumentar su competencia
El DNA de la cepa donante se agrega al medio
Los fragmentos del DNA donante ingresan en la clula
receptora

Los DNA de ambas clulas sufren recombinacin

El mapa gentico se traza mediante la observacin de
la frecuencia en la cual dos o ms genes se transfieren
juntos (cotransformantes)
Cuando el DNA se fragmenta durante el
aislamiento, los genes que se encuentran
fsicamente prximos en el cromosoma tienen
mayor probabilidad de estar presentes en el mismo
fragmento de DNA y ser transferidos juntos
(ejemplo de genes a+b+)
Una vez dentro de la clula el DNA se incorpora en el
cromosoma bacteriano

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Tres Puntos en Transformacin:

tambin es posible ordenar genes o
marcadores o loci, al igual que se
lleva a cabo en eucariontes,
mediante el estudio semejante al del
Problema de los Tres Puntos.
Supongamos una bacteria receptora
auxotrofa para a, b y c (a- b-c-) y un
ADN transformante o exgeno
prottrofo
para
los
mismos
marcadores (a+ b+c+). En el caso
de que los tres marcadores estn
ligados, podemos considerar cuatro
posibles regiones en las que puede
darse entrecruzamiento: I, II, III y IV.
Las
bacterias
transformadas
descendientes, como se puede
observar en la figura siguiente
pueden ser de siete clases distintas

La transduccin ocurre cuando virus bacterianos

(bacterifagos) transportan el DNA de una bacteria a la
otra. Una vez en el interior de la bacteria puede darse la
recombinacin.

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LOS BACTERIOFAGOS

VIRUS
Un virus es un agente
gentico que posee un
cido nuclico que puede
ser ADN o ARN, rodeado
de una envuelta de
protena.
Contienen toda la
informacin necesaria
para su ciclo reproductor;
Necesitan a otras clulas
vivas de las que utilizan
orgnulos y molculas.

Virus que infectan bacterias

Genomas pequeos y facilmente reproducibles
Tienen dos ciclos de vida alternativos:
Ciclo ltico y ciclo lisognico
Los fagos virulentos se producen por ciclo ltico
Los fagos atemperados pueden producir cualquiera de los dos
ciclos
En el ciclo lisognico se genera profago, inactivo que se
replica junto con la clula
Cmo es posible que la molcula de DNA del virus no sea afectada por la
digestin de la DNasa viral que degrada el cromosoma bacteriano?.
Porque est protegido dado que sus residuos de citosina estn hidroxilados y
metilados, son 5-hidroximetilcitosina, por ello la enzima no lo degrada pues no
lo reconoce.
Antes de darse el ensamblaje del DNA viral e incluso la replicacin del DNA viral,
ocurre recombinacin entre el DNA viral y el de la bacteria.

VIRUS QUE INFECTAN BACTERIAS O

BACTERIOFAGOS

Estructura contrctil

Con regiones terminales que

reconocen la superficie de la
bacteria a infectar. Ejm T4 y
E. coli

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Mapeo de genes en fagos

Se siguen las mismas reglas que se aplican en
clulas eucariotas y bacterianas
Experimentos de Hershey y Rotman
Fagos T2: cepa h+r- (lisan E. coli B y producen placa
grande y de bordes definidos); cepa h-r+ (lisan E. coli B
y B/2 y producen placas pequeas y de bordes difusos)
Recombinaron cepa h+r- con h-r+ e infectaron clulas
B de E. coli
Se analiz la progenie viral: con genotipo parental y
recombinante

En la transduccin se utilizan
fagos para mapear genes
bacterianos
Transduccin generalizada:
se transfiere cualquiera de los
genes de la bacteria que
infectan.

FR= placas recombinantes x 100

Total de placas
FR= 12/100 x 100= 24%
Distancia entre genes h y r = 24

La transduccin es un fenmeno raro, por tanto, no todos los

fagos son capaces de transducir

Experimentos de Lederberg y
Zinder (1952)
Demostraron que la presencia
de un bacteriofago fue
suficiente para actuar como
agente de transferencia
Fagos transductores que
envuelven cromosoma
bacteriano y no, genoma viral
Produccin de bacterias
transductantes

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En la transduccin
especializada se transfieren
solo los genes cercanos a
determinados sitios del
cromosoma bacteriano
Este proceso requiere de
bacterifagos lisognicos
Los profagos pueden
escindirse del cromosoma
bacteriano de manera imperfecta
y transportar una porcin del
genoma bacteriano
El fago inyectar dicho
genoma en otra clula
bacteriana

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