INSTITUTO TECNOLGICO DE TEPIC

Departamento de ingeniera qumica y bioqumica

Ingeniera bioqumica

Materia: Laboratorio de anlisis de alimentos

PRACTICA 10: Anlisis microbiolgico de carnesInvestigacin de salmonella en alimentos
Docente: M.C Rosa Castro Martnez
Alumna: Mariana Gonzlez Larios
No control: 13401083
Fecha entrega: 13/Noviembre/2016

Contenido
Introduccin: ....................................................................................................................................... 3
Objetivos: ............................................................................................................................................ 4
Fundamentos: ................................................................................................................................... 4
Pre-enrriquesimiento y enriquecimiento:....................................................................................... 4
Agares selectivos: ............................................................................................................................ 4
Pruebas bioqumicas: .................................................................................................................. 5
Mesofilicos aerobios: ...................................................................................................................... 9
Reactivos, materiales y equipo: .......................................................................................................... 9
Metodologa: ..................................................................................................................................... 11
Enriquecimiento ............................................................................................................................ 11
Pre-enriquecimiento ..................................................................................................................... 11
Aislamiento ................................................................................................................................... 12
Pruebas bioqumicas ..................................................................................................................... 13
Pruebas bioqumicas confirmatorias............................................................................................. 15
Mesofilicos aerobios y coliformes: ................................................................................................ 16
Resultados: ........................................................................................................................................ 17
Pruebas bioqumicas: .................................................................................................................... 17
Mesofilicos aerobios: .................................................................................................................... 19
Resultados de Mesofilicos Aerobios y organismos coliformes: ................................................ 19
Crecimiento de salmonella en agares selectivos: ............................................................................. 19
Anlisis de resultados: ....................................................................................................................... 22
Conclusin: ...................................................................................................................................... 22
Bibliografa ........................................................................................................................................ 23

Introduccin:
Las bacterias del genero Salmonella son una de las bacterias patgenas ms importantes
que pueden

provocar enfermedades en el hombre por ingestin de alimentos

contaminados. Son causantes de la salmonelosis humana, que es la infeccin bacteriana

de origen alimenticio que se presenta con mayor frecuencia. Aproximadamente la tercera
parte de los alimentos implicados en los brotes de salmonelosis son carnes, productos
crnicos y productos derivados de las aves (huevos y ovoproductos), aunque no hay que
olvidar

otros

tales

como

la

leche

sus

derivados.

El gnero Salmonella pertenece a la familia enterobacteriaceae. Son bacilos Gramnegativos y su tamao oscila entre 1 y 3 m de longitud entre .5 y 7 m de dimetro.
Generalmente poseen flagelos peritricos que les dan movilidad. Son bacterias anaerobias
facultativas que fermentan la glucosa produciendo cido y gas. (Casi todas las especies
de salmonella producen sulfhidrico a partir de las protenas y son capaces de
descarboxilizar

algn

aminocido.

Su temperatura ptima de crecimiento es de unos 37C y la Aw mnima es

aproximadamente de .93. El intervalo de pH de crecimiento est comprendido entre los
valores de 4.1 y 9.0 multiplicndose, por lo tanto en los alimentos de baja acidez.
El gnero Salmonella spp. Puede causar diferentes sntomas clnicos que van desde
ligeras gastroenteritis a enfermedades sistmicas complicadas como la fiebre tifoidea, en
individuos susceptibles, algunas especies puede tornarse invasivas desencadenando
procesos ms complicados de fiebre entrica, 16 septicemia e infecciones localizadas.
Las gastroenteritis, son las enfermedades, ms frecuentes transmitidas por este agente
patgeno, al ser humano. La salmonelosis es una infeccin zoontica con diseminacin
global, siendo los roedores, animales domsticos y el proprio hombre, los principales
reservorios de Salmonella spp. La transmisin ocurre por la va fecal-oral, casi siempre a
travs del agua o alimentos contaminados. Adems de los reservorios animales
Salmonella spp. Puede establecerse y multiplicarse en el ambiente siempre que haya
condiciones que les favorezca. Varios son los alimentos relacionados con la salmonelosis,
la mayora de las veces esta resulta del consumo de productos crnicos, aunque hay

registros de casos relacionados con consumo de frutas y vegetales, muchas veces

contaminados por el ambiente y el agua de regar.
La Salmonella spp. Puede causar enfermedad con un nmero reducido de clulas, por lo
tanto es importante garantizar a su ausencia en alimentos listos para comer,
estableciendo reglas de higiene, sobre todo los manipuladores de alimentos.

Objetivos:

Conocer el fundamento de los medios de cultivo que se utilizan para el aislamiento

de salmonella a partir de alimentos

Identificar las colonias de Salmonella en los distintos medios selectivos de

alimentos

Aplicar la metodologa para el aislamiento de salmonella a partir de alimentos

Interpretar la presencia de salmonella en alimentos

Fundamentos:

Pre-enrriquesimiento y enriquecimiento:
Pre-enriquecimiento: es el paso donde la muestra es enriquecida en un medio nutritivo no
selectivo, que permite restaurar las clulas de Salmonella daadas a una condicin
fisiolgica estable.
Enriquecimiento selectivo: empleado con el propsito de incrementar las poblaciones de
Salmonella e inhibir otros organismos presentes en la muestra.

Agares selectivos:
Seleccin en medios slidos, en este paso se utilizan medios selectivos que restringen el
crecimiento de otros gneros diferentes a Salmonella y permite el reconocimiento visual
de colonias sospechosas.
Verde Brillante (VB):

Salmonella presenta colonias rojas o rosas que pueden ser transparentes rodeadas por
medio enrojecido; las bacterias fermentadoras de la lactosa dan colonias amarillas. En
este si se puede considerar positivo ya que las colonias presentan las caractersticas de
salmonella.
Salmonella Shigella Agar:
La diferenciacin de los organismos entricos se logra mediante la incorporacin de
lactosa en el medio. Los organismos que fermentan lactosa producen cido que, en
presencia del indicador rojo neutro, propicia la formacin de colonias de color rojo. Los
organismos no fermentadores de lactosa forman colonias incoloras. Este ltimo grupo
incluye la mayora de los patgenos intestinales, incluidos Salmonella y Shigella. El
tiosulfato sdico y el citrato frrico permiten la deteccin de produccin de cido
sulfhdrico, como lo demuestran las colonias con centros de color negro.
MacConkey Agar:
Las peptonas proporcionan los nutrientes. Cristal violeta inhibe las bacterias gram
positivas, en especial los enterococos y estafilococos. La diferenciacin de los
microorganismos entricos se logra mediante la combinacin de lactosa y el indicador de
pH rojo neutro. Se producen colonias incoloras o de color de rosa a rojo segn la
capacidad del aislado para fermentar carbohidratos.
Para salmonella el crecimiento de colonias va de incoloras a color beige.

Pruebas bioqumicas:
Este paso permite la identificacin gnerica de los cultivos de Salmonella y la eliminacin
de cultivos sospechosos falsos.
Agar Hiero Lisina (LIA):

Es un medio diferencial que permite identificar enterobacterias, siendo especialmente til

en la identificacin de Salmonella y Proteus. Con esta prueba se desea determinar si el
microorganismo posee la capacidad de descarboxilar o desaminar el aminocido lisina. El
medio

contiene

glucosa

(dextrosa)

que

es

rpidamente

fermentada

por

el

microorganismo, produciendo acidificacin que se representa por el cambio de color de

prpura a amarillo del medio. En las siguientes horas de incubacin, aquellos
microorganismos que producen rpidamente la descarboxilacin de la lisina, provocan
una subida del PH de cido a alcalino, virando el indicador de amarillo a prpura
nuevamente (prpura de bromocresol). En cambios aquellos capaces de desaminar la
lisina provocan un descenso del PH (cido), tornando un color rojo al medio. Adems se
puede detectar produccin de cido sulfhdrico que queda evidenciado por la formacin
de un precipitado negro en el fondo del tubo y de gas por la formacin de burbujas o
agrietamiento del agar.
Prueba del rojo de Metilo (RM-VP):
Conocer si el microorganismo tiene la capacidad de producir y mantener estables los
productos cidos de la fermentacin cido mixto de la glucosa (c. Actico, frmico,
lctico y succnico), y vencer la capacidad amortiguadora del sistema. El rojo metilo es el
indicador de pH utilizado para determinar la concentracin de iones hidrgeno despus de
la fermentacin de la glucosa. Se utiliza el medio de cultivo Caldo Rojo de Metilo/VogesProskauer (RM/VP).
Prueba de Voges-Proskauer (RM-VP):
La reaccin de V.P. se basa en la deteccin de acetona a partir de la fermentacin
butanodilica de la glucosa. A partir del cido pirvico, una bacteria puede seguir muchas
vas segn su sistema enzimtico, una de stas es la fermentacin butanodilica, cuyo
producto final es el 2,3 butanodiol, en que la acetona es el precursor. La prueba V.P. se
basa en la deteccin de ste ltimo. La acetona que se produce en la fermentacin,
cuando reacciona con el hidrxido de potasio (KOH al 40% p/v) es oxidada a diacetilo, el

que a su vez reacciona con los grupos guandicos de la arginina, que est presente en las
peptonas que constituyen el medio, dando una coloracin rojiza.
Prueba del citrato:
Determinar si un organismo es capaz de utilizar citrato como nica fuente de carbono.
Algunas bacterias pueden obtener energa empleando el citrato como nica fuente de
carbono. En las bacterias la utilizacin del citrato comprende un sistema enzimtico que
incluye, por una parte, la enzima citrato permeasa, que permite el paso del citrato a travs
de la membrana, y por otra, la enzima citrato liasa, que desdobla el citrato en acetato y
oxalacetato. El acetato es excretado y el oxalacetato es descarboxilado para generar
piruvato.

Hidrolisis de la urea:
Se determina la capacidad de un organismo de desdoblar la urea formando dos molculas
de amonaco por accin de la enzima ureasa.
La urea es una diamina del cido carbnico (carbamida), la hidrlisis de la urea es
catalizada por una enzima especfica la ureasa, para dar dos molculas de amonaco. En
solucin, la urea se hidroliza, dando carbonato de amonio como producto final. Esta
enzima est vinculada con la descomposicin de los compuestos orgnicos. La ureasa
rompe por hidrlisis el enlace entre el N2 y el C siendo el N2 disociado a amonaco.
SIM+AGAR:
Es un medio semislido destinado a verificar la movilidad, produccin de indol y de sulfuro
de hidrgeno en un mismo tubo.
El triptfano es un aminocido constituyente de muchas peptonas, y particularmente de la
triptena, que puede ser oxidado por algunas bacterias para formar indol. En el proceso
interviene un conjunto de enzimas llamadas triptofanasa. El indol producido se combina

con el aldehido del reactivo de Kovacs o de Erlich, para originar un compuesto de color
rojo. Las cepas mviles pueden apreciarse en este medio, por la turbidez que producen
alrededor de la puncin de siembra, mientras que aquellas cepas productoras de
sulfhdrico se distinguen por la formacin de un precipitado negro de sulfuro de hierro a
partir del tiosulfato siempre que el medio se mantenga a un pH mayor a 7.2.
TSI:
Medio universalmente empleado para la diferenciacin de enterobacterias, en base a la
fermentacin de glucosa, lactosa, sacarosa y a la produccin de cido sulfhdrico.
En el medio de cultivo, el extracto de carne y la pluripeptona, aportan los nutrientes
adecuados para el desarrollo bacteriano. La lactosa, sacarosa y glucosa son los hidratos
de carbono fermentables. El tiosulfato de sodio es el sustrato necesario para la
produccin de cido sulfhdrico, el sulfato de hierro y amonio, es la fuente de iones Fe3+ ,
los cuales se combinan con el cido sulfhdrico y producen sulfuro de hierro, de color
negro. El rojo de fenol es el indicador de pH, y el cloruro de sodio mantiene el balance
osmtico.
Por fermentacin de azcares, se producen cidos, que se detectan por medio del
indicador rojo de fenol, el cual vira al color amarillo en medio cido. El tiosulfato de sodio
se reduce a sulfuro de hidrgeno el que reacciona luego con una sal de hierro
proporcionando el tpico sulfuro de hierro de color negro.
Rojo fenol +Manitol:
Para la identificacin bioqumica de microorganismos basndose en su capacidad para
fermentar el manitol.
La peptona de casena proporciona los nutrientes necesarios para el desarrollo de los
microorganismos. El manitol es el carbohidrato fermentable, se manifiesta por un cambio
de color del indicador el rojo de fenol que vira de rojo a amarillo. La deteccin de gas se
observa por la formacin de vaco o burbuja en la campana de Durham. Los tubos con el

medio de cultivo se inoculan con cultivos puros de las bacterias a investigar. Incubar 24
48 h a 35C.

Mesofilicos aerobios:
La tcnica se basa en contar las unidades formadoras de colonias o UFC presentes en
un gramo o mililitro de muestra. Se considera que cada colonia que desarrolla en el medio
de cultivo de eleccin despus de un cierto tiempo de incubacin a la temperatura
adecuada, proviene de un microorganismo o de un agregado de ellos, de la muestra bajo
estudio; ese microorganismo o microorganismos son capaces de formar la colonia, es
decir una UFC. Para que las colonias puedan contarse de manera confiable, se hacen las
diluciones decimales necesarias de la muestra, antes de ponerla en el medio de cultivo; la
tcnica para realizar este procedimiento se describe en Preparacin y dilucin de
muestras de alimentos para su anlisis microbiolgico.

Reactivos, materiales y equipo:

Materiales

Reactivos

Equipo

1 Matraz
Erlenmeyer

Agua destilada

Estufa

34 Tubos de
ensayo
40 Cajas Petri

Alcohol

Olla para esterilizar

Agar Cuenta
Estndar
Agar Rojo violeta
bilis
Caldo Selenito
Caldo Tetrationato

Cuenta colonias

5 Pipetas de 1 ml
Cinta
1 Asa

Balanza analtica

Muestra utilizada

Papel estraza
Algodn
1 Pizeta
1 Esptula
2 Botellas de
dilucin
2 Mecheros
Material de
proteccin

Agar verde brillante

Agar Mc. Conkey
Agar Salmonella
Shigella
Agua peptonada
Caldo Urea
Medio Citrato de
Simmons
SIM + Agar
Medio TSI
Medio LIA
Caldo RMVP
Medio rojo fenol +
manitol
Lugol yodo yoduro
Hidrxido de potasio

Metodologa:

Pre-enriquecimiento

Pesar
de agua
peptonada y disolver
en 225ml de agua.

Pesar y agregar al agua

peptonada 25 gr de
muestra

Incubar de 18 a 24 horas a 35C

Enriquecimiento

Pesar 3.22g de caldo

selenito y 6.4g de
caldo
tetrationato.
Ambos disolverlos en
140ml de agua.

Inocular 1 ml del preenriquecimiento

en
cada tuvo.

Incubar de 18 a 24 horas a 43C

Aislamiento

Pesar:
12.2g de Salmonella,
11.6g verde brillante,
9.7g Mac conkey y
disolver en 200ml de
agua los 3 agares.

Dejar
solidificar
sembrar por asada.

Incubar de 18 a 24 horas a 43C

Pruebas bioqumicas

Pesar: citrato de
Simmons, SIM+agar,
TSI, LIA, Caldo RMVP,
caldo urea, rojo fenol
+ manitol (para todo
el grupo, calentar y
esterilizar
por
equipo).

Dejar
solidificar
SIM+agar
verticalmente y LIA,
TSI, citaro de simons,
inclinados.

Sembrar por asada.

Incubar 24 horas a 35C

Agregar los sig. Indicadores:

SIM + Reactivo de kovac (5
gotas).
RM + Rojo de metilo (3 gotas).
VP + -Naftol (10 gotas) +KOH
40% (5 gotas).

Mtodo A con pre-enriquecimiento

Mtodo B sin pre-enriquecimiento

Incubar 18-24 hrs. A 35 2

C

Incubar 18-24 hrs. A 35 2

C

Incubar 43C

c) Aislamiento en medios
de cultivo diferenciales

Incubar 43C
18-24 h

18-24 h
Agar verde Brillante o
sulfito de Bismuto

Agar XLD o Salmonella

Shigella

Incubar

24 2 h/ 35
2C

Pruebas bioqumicas

De las cajas anteriores cada quien tomo

una con crecimiento de salmonella positivo

Javier:
Agar: salmonella
shigella
Caldo: selenito
Pretratamiento

Jairo:
Agar: Mc Conkey
Caldo: selenito
Pretratamiento

Monse:
Agar: salmonella
shigella
Caldo: selenito
Pretratamiento

Mariana:
Agar: Salmonella
Shuigella
Caldo: selenito
Sin pretratamiento

Cada persona realizo las

siguientes pruebas bioqumicas

Citrato de
Simmons
-Inclinado
estra

SIM+
agar
Picadura

5 gotas
de
reactivo
de
Kovac

TSI

LIA

-Inclinado
estra

-Asada

Caldo
RM-VP 1

Caldo
RM-VP 2

Caldo
urea

-Asada

-Asada

-Asada

RM+3
gotas de
rojo de
metilo

VP + Naftol(10
gotas )+
KOH 40% (5
gotas)

Rojo fenol
+ manitol
-Asada

Mesofilicos aerobios y coliformes:

Mesolticos aerobios: Agar cuenta estndar

Organismos coliformes: Agar rojo violeta bilis

10-1

Muestra: Salchicha viva

1ml

10-2

1ml

1ml

10-4

Resultados:
Pruebas bioqumicas:
Medio

Monse

Mariana

Javier

Jairo

Imagen

Citrato de
Simmons

Azul

Azul

Azul

Azul

SIM+ Agar

Aro negro
Verde oliva +SH2

Aro negro
Verde oliva +SH2

Aro negro
Verde oliva +SH2

Aro negro
Verde oliva +SH2

TSI

Positivo
(+)

Positivo
(+)

Positivo
(+)

Positivo
(+)

LIA

Crecimiento(+)
Cambio de color (-)

Crecimiento(+)
Cambio de color (-)

Crecimiento(+)
Cambio de color (-)

Crecimiento(+)
Cambio de color (-)

Caldo RMVP
+ KOH
+Naftol

Solo se form un
aro negro
(-)

Solo se form un
aro negro
(-)

Solo se form un aro

negro
(-)

Solo se form un aro

negro
(-)

Caldo RMVP
+Rojo de
metilo

Coloracin roja
(+)

Coloracin roja
(+)

Coloracin roja
(+)

Coloracin roja
(+)

Caldo urea

Coloracin naranja
(-)

Coloracin rosa
(+)

Coloracin rosa
(+)

Coloracin rosa
(+)

Rojo fenol
+Manitol

Coloracin amarilla
(+)

Coloracin amarilla
(+)

Coloracin amarilla
(+)

Coloracin amarilla
(+)

62.5%

75%

75%

75%

Mesofilicos aerobios:
Caja
A

-1
210 + extendida

-2
3700

incontable

3 extensiones
6600 colonias

-3
Extensin en
toda la caja
3 Extensiones
3000 Colonias

Resultados de Mesofilicos Aerobios y organismos coliformes:

Unidades formadoras de colonias de
155000 UFC/gr
dilucin a la -4 para mesofilicos aerobios:
Negativo
Unidades formadoras de colonias de
organismos coliformes

Crecimiento de salmonella en agares selectivos:

Medio selectivo
Agar salmonella
con
pretratamiento
del caldo
selenito

Agar Mc.Conkey
con
pretratamiento
del caldo
selenito

-4
1 extensin
110000 Colonias
2 Extensiones
200000 Colonias

Agar verde billis

con
pretratamiento
caldo selenito

Agar salmonella
con
pretratamiento
del caldo
tetrationato

Agar Mc.Conkey
con
pretratamiento
del caldo
tetrationato

Agar verde bilis

con
pretratamiento
del caldo
tetrationato

Salmonella sin
pretratamiento
del caldo
selenito

Agar Mc.Conkey
sin
pretratamiento
con caldo
selenito

Agar verde billis

sin
pretratamiento
con caldo
selenito

Agar salmonella
sin pretrataiento
con caldo
tetrationato

Agar Mc.Conkey
sin
pretratamiento
con caldo
tetrationato

Agar verde billis

sin
pretratamiento
con caldo
tetrationato

Anlisis de resultados:
Especificacin

de

la

NMX-F-065-1984.

ALIMENTOS.

SALCHICHAS.

ESPECIFICACIONES. FOODS. SAUSAGE. SPECIFICATIONS. NORMAS MEXICANAS.

DIRECCIN GENERAL DE NORMAS.

De acuerdo a los resultados obtenidos en las pruebas bioqumicas, la bibliografa reporta

que entre el 80 y 90% se considera positiva la presencia de Salmonella en la muestra. Se
puede considerar que la muestra analizada est muy cerca de ser positiva ya que
presenta un 75% de probabilidad de que la muestra est contaminada con Salmonella.
Este 75% de probabilidad se debe principalmente a que la salchicha es rica en grasa y
protena, siendo la grasa el principal factor que ayuda a la proliferacin de salmonella.
As mismo hay otros factores que ayudan al desarrollo de este microorganismo como es
el caso de la Aw y el pH, ya que el pH y la Aw de la salchicha se encuentran dentro de los
rangos ptimos de crecimiento para la salmonella.
En cuanto al anlisis de mesofilicos aerobios, se puede observar que la salchicha se
encuentra dentro de los parmetros establecidos por la Norma oficial determinando as
que no hubo contaminacin superficial.
Para organismos coliformes tambin se encuentra dentro de los parmetros establecidos
por la norma ya que el no hubo crecimiento de microorganismos.

Conclusin:
Con la practica anterior se pudo conocer el fundamento de los medios de cultivo utilizados
para el aislamiento, ya que cada medio de cultivo permita nicamente el crecimiento de

salmonella, siendo posible identificar las colonias de acuerdo a la forma nica en que se
presentan las colonias en cada medio selectivo, con esta metodologa se pudo aislar la
salmonella e interpretar su presencia en la muestra analizada.
Este anlisis realizado a la muestra de salchicha tambin nos permiti darnos cuenta que
la presencia de este microorganismo no siempre es debida a una mala higiene de la
empresa productora, sino que el propio producto cuneta con caractersticas propias que
ayudan al desarrollo del microorganismo como lo es el contenido de grasa de la salchicha
y la alta Aw, factores que ayudan a que el microorganismo se desarrolle de manera
natural.

Bibliografa
Camacho, A. M. (2009). Cuenta en placa de bacterias. Facultad de Qumica, UNAM. Mxico., 10.
NORMAS, N.-F.-0.-1. A. (1984). COLPOS. Recuperado el 13 de NOVIEMBRE de 2016, de COLPOS:
http://www.colpos.mx/bancodenormas/nmexicanas/NMX-F-065-1984.PDF
UNAM. (2003). Mtodo para la determinacin de Salmonella spp. en alimentos. Norma Oficial
Mexicana para la deteccion del genero Salmonella, 24.