PROTOCOLO DE EXTRACCIN DE ADN DE PALMA DE ACEITE (CENIPALMA)

1. Recolectar 8 g de tejido foliar joven y fresco. Si debido a razones logsticas no se puede

procesar el material el mismo da de la recoleccin, ni tampoco se cuenta con nitrgeno
lquido o hielo seco para almacenarlo, se puede mantener humedecido a temperatura
ambiente por no ms de tres das. Sin embargo, el tejido foliar se puede almacenar a -80C
por tiempo indefinido.

2. Pulverizar el tejido con nitrgeno lquido.

La homogeneizacin, puede ser mecnica o qumica, consiste en romper las uniones entre
las clulas para facilitar la interaccin con las soluciones de lisis que ayudan a liberar el
material gentico.
Nitrgeno lquido
Este procedimiento consiste en macerar la muestra con nitrgeno lquido, en un mortero de
porcelana, hasta obtener un polvo muy fino. El nitrgeno lquido, congela de inmediato la

muestra y evita que se formen cristales en el interior de la clula que rompen la estructura
celular e inicie el proceso de degradacin. Este procedimiento, se puede utilizar en tejido
fresco o congelado, por ejemplo semillas, plntulas, tejidos fibrosos o viscosos y hongos. Es
importante considerar que si la muestra ya est congelada, se deber disgregar con
nitrgeno lquido para evitar la degradacin del ADN por accin de las DNasas.
3. Aadir 8 ml de solucin de extraccin. Dicha solucin contiene: 150 mM de Tris-HCl, pH
8,0; para neutralizar la carga de las perlas. El ADN se separa de las perlas y transfiere a otro
tubo, mientras que las perlas continan siendo retenidas por el magneto 15 mM de EDTA,
pH 8,0; 1 M de cloruro de sodio; 1% (peso/volumen) de CTAB; 1% (peso/volumen) de PVP3600 y 5% (volumen/ volumen) de -mercaptoetanol. Las funciones de cada reactivo en la
solucin se presentan en la Tabla 3.

4. Incubar a 65C en bao Mara durante 30 min. Mezclar el tubo delicadamente cada 10
minutos. Este paso permite desnaturalizar (destruir) las enzimas y dems protenas
presentes en el tejido foliar pulverizado.
5. Centrifugar a 2.000 x g, durante 15 min. Este paso remueve todos los residuos slidos de
la preparacin.
6. Transferir la fase acuosa superior (sobrenadante) a un tubo limpio y aadir medio volumen
(4 ml) de fenol. Agitar suavemente. En este paso se siguen destruyendo las protenas
(debido a la presencia del fenol).
7. Centrifugar a 2.000 x g, durante 20 min. La misma explicacin del paso 5
8. Transferir el sobrenadante a un tubo limpio y aadir medio volumen (4 ml) de cloroformo:
octanol. Explicacin de la tabla 3
9. Incubar la mezcla con agitacin, durante una hora, a temperatura ambiente.
10. Centrifugar a 2.000 x g, durante 20 min. La misma explicacin del paso 5
11. Transferir el sobrenadante a un tubo limpio y aadir 1/10 del volumen (aprox. 0,8 ml) de
acetato de sodio 3M, pH 5,2, fro (-20C) y 6/ 10 del volumen (aprox. 5 ml) de isopropanol
fro (-20C).
12. Incubar a -20C durante dos das.
13. Despus de la incubacin, centrifugar a 2.000 xg, durante 30 min a temperatura
ambiente.
14. Desechar el lquido teniendo cuidado de no perturbar el botn de ADN que se forma al
fondo del tubo.
15. Aadir 2 ml de etanol al 70%. Esto ayuda a retirar las sales que se precipitaron junto con
el ADN.
16. Centrifugar a 2.000 xg, durante 3 min a temperatura ambiente.
17. Dejar secar el botn de ADN a temperatura ambiente.
18. Aadir 0,5 ml de agua destilada estril y resuspender el botn de ADN agitando
suavemente.
19. Aadir 0,1 ml de una solucin de ARNasa de 0,1 mg/ml. Incubar durante una hora a
37C.
20. Almacenar el ADN extrado a 4C si se va a utilizar en menos de tres das.
Alternativamente, el almacenamiento por largos perodos puede realizarse a -20C.
Una parte de la muestra se puede almacenar a 4 C para los anlisis inmediatos y el
material restante a -20 C o -80 C, para una preservacin por varios meses. En este ltimo
caso es conveniente que el ADN se conserve en soluciones con baja concentracin de sales
(low TE) para inhibir la accin de DNasas contaminantes.
Con la aplicacin de este protocolo, se considera una buena extraccin aquella que presenta
niveles muy bajos de agentes contaminantes y permite obtener alrededor de 80 mg de ADN

por cada gramo de tejido foliar utilizado. Una muestra de ADN con estas caractersticas
puede almacenarse durante varios aos a bajas temperaturas sin perder sus caractersticas
fisicoqumicas ni biolgicas.

Es parte de un archivo adicional que encontr pero si no quieres leerlo todo.

Separacin de protenas y lpidos
En esta etapa se separa el ADN de las protenas y lpidos mediante solventes orgnicos y
ciclos de centrifugacin (Figura 2.1A). Se utiliza la fuerte tendencia hidroflica de los grupos
fosfato para separarlos en medios acuosos, mientras que las protenas y los lpidos se
separan en solventes orgnicos (Sambrook et al. 1989). La fase acuosa y la orgnica se
separan por centrifugacin lo que permite aislar al ADN. Los solventes que se usan
frecuentemente son el fenol, el cloroformo y el alcohol isoamlico (Stulnig y Amberger 1994).
Estos reactivos contaminan fcilmente el ADN, por lo que se debe evitar acarrearlos en el
proceso de purificacin.
Precipitacin del ADN
Despus de que son eliminados los lpidos y las protenas, se recupera el ADN. Para ello, se
adiciona etanol y soluciones con altas concentraciones de iones de sodio o amonio que se
unen a los grupos fosfato, esta mezcla reduce las fuerzas repulsivas entre las cadenas y
permite que el ADN se pliegue sobre s mismo hacindolo insoluble (Figura 2.1B). Un paso
de centrifugacin permite que el ADN permanezca en el fondo del tubo mientras que el
etanol es desechado. Los restos de etanol se eliminan con un lavado con etanol al 70% y el
remanente se elimina por evaporacin.
Redisolucin del ADN
Una vez que se ha eliminado el etanol, el paso siguiente es hidratar el ADN para mantenerlo
en solucin (Figura 2.1C). En el caso de emplear agua, el pH debe ser de 7 para permitir la
redisolucin completa del ADN y evitar una hidrlisis cida
(http://www.massey.ac.nz/~wwbioch/DNA/hydDNA/framset.htm, consultado en agosto del
2010). Cuando se utiliza una solucin amortiguadora, es preferible utilizar una solucin de
Tris-HCl a 10mM y EDTA a 0.1M a un pH de 8.0 (low TE) para almacenar el material.
Cuando se est disolviendo el ADN es importante evitar el pipeteo y la agitacin agresiva
pues se pueden fragmentar molculas de alto peso molecular. Una opcin que evita la
fragmentacin consiste en incubar a 55 C el ADN, 1 a 2 horas con agitacin suave.