DETERMINACION DE MOHOS Y LEVADURAS EN ALIMENTOS

OBJETIVO:
Realizar adecuadamente mediante el mtodo de cuenta en placa, el nmero de mohos y
levaduras viables presentes en productos alimenticios destinados al consumo humano.
Evaluar la calidad microbiolgica de un alimento, que sea factible de estar contaminado
con estos microorganismos, tomando como referencia la NOM-111-SSA1-1994.
Comprender el fundamento de todas las etapas del mtodo de deteccin y cuantificacin
de mohos y levaduras en alimentos.
GENERALIDADES:
Los hongos y las levaduras se encuentran ampliamente distribuidos en el ambiente,
pueden encontrarse como flora normal de un alimento, o como contaminantes en equipos
mal sanitizados. Ciertas especies de hongos y levaduras son tiles en la elaboracin de
algunos alimentos, sin embargo tambin pueden ser causantes de la descomposicin de
otros alimentos. Debido a su crecimiento lento y a su baja competitividad, los hongos y
levaduras se manifiestan en los alimentos donde el crecimiento bacteriano es menos
favorable. Estas condiciones pueden ser bajos niveles de pH, baja humedad, alto
contenido en sales o carbohidratos, baja temperatura de almacenamiento, la presencia de
antibiticos, o la exposicin del alimento a la irradiacin. Por lo tanto pueden ser un
problema potencial en alimentos lcteos fermentados, frutas, bebidas de frutas, especias,
oleaginosas, granos, cereales y sus derivados y alimentos de humedad intermedia como
las mermeladas, cajetas, especias, etc.
Los hongos y levaduras pueden utilizar ciertos sustratos como pectinas, carbohidratos
como polisacridos, cidos orgnicos, protenas y lpidos. Tambin pueden causar
problemas a travs de: (a) sntesis de metabolitos txicos (micotoxinas), (b) resistencia al
calor, congelamiento, antibiticos o irradiacin y (c) habilidad para alterar sustratos no
favorables permitiendo el crecimiento de bacterias patgenas. Pueden tambin causar
malos olores y sabores y la decoloracin de las superficies de alimentos.
NOTA
La Norma Oficial Mexicana utiliza nicamente el agar papa dextrosa para la deteccin y
cuantificacin de estos grupos de microorganismos. Sin embargo se sugiere para la
cuantificacin de las levaduras, la utilizacin del agar extracto de malta acidificado ya que
es un medio ms rico en nutrientes y adecuado para el desarrollo de este grupo
microbiano.
FUNDAMENTO
El mtodo se basa en inocular una cantidad conocida de muestra, en un medio de cultivo
especfico, aprovechando la capacidad de este grupo microbiano de utilizar como
nutrientes a los polisacridos que contiene el medio. La hidrlisis de estos compuestos se
efecta por enzimas que poseen estos microorganismos. La sobrevivencia de los hongos
y levaduras a pH cidos se pone de manifiesto al inocularlos en el medio de cultivo
acidificado a un pH de 3.5. As mismo, la acidificacin permite la eliminacin de la mayora
de las bacterias. Finalmente, las condiciones de aerobiosis y la incubacin a una
temperatura de 25 1 C da como resultado el crecimiento de colonias caractersticas
para este tipo de microorganismos.
MATERIAL:
Licuadora estril o mortero y pistilo
Mechero bunsen
Parrillas
de
agitacin
y
Varilla acodada
calentamiento

Frasco schot
Matraz Erlenmeyer 250 ml
Cajas de Petri
Portaobjetos, cubreobjetos,
Pipetas estriles de 1 ml y 10 ml
Bao Mara mantenida a 451C
Autoclave
Vortex
Incubadora
Contador de colonias
Microscopio ptico
Termmetro

Esptula
Tubos de ensayo con tapo de rosca

REACTIVOS:
Solucin salina o solucin de agua
peptonada de 0.1 a 0.02%
Medio de cultivo Papa Dextrosa
Agar y Agar extracto de malta
acidificado
Colorantes para tincin de Gram
Solucin colorante de lactofenol
azul de algodn.

TECNICA.
1. Preparacin de diluyente. Usar soluciones isotnicas, soluciones salinas o soluciones
de agua peptonada de 0.1 a 0.02%, la seleccin depende de la sensibilidad del grupo
de microorganismos que se desee determinar. Esterilizando tubos con 9 ml con la
solucin disponible, junto con los medios de cultivo.
2. Procedimiento. El proceso de homogenizar y diluir las muestras debe ser rpido, el
objetivo es tener las clulas microbianas presentes en una solucin homognea del
alimento. El procedimiento es el siguiente:
a) Picar y mezclar la muestra en la moledora o licuadora. El tamao de muestra
recomendado es entre 300 y 500 g derivados de un muestreo primario en el punto
donde se encuentra el alimento seguido de un submuestreo en el laboratorio de 30
a 50 g.
b) Pesar higinicamente entre 10 0.1 y 50 0.5 g de muestra. Pasar la muestra al
vaso de licuadora estril.
c) Agregar 90 ml de diluyente a 10 g de muestra o bien 450 ml de diluyente a 50 g
demuestra.
d) Licuar durante 30 segundos a alta velocidad dejar reposar 2 a 3 minutos.
3. Diluciones: Preparar una serie de 4 tubos con 9 ml de diluyente, mantener los tubos
fros y etiquetados con una etiqueta que exprese la dilucin 10 -2, 10-3, 10-4 y 10-5,
proceder de la forma siguiente.
a) Tomar 1 ml de la dilucin 10-1, verterlo en tubo etiquetado con 10-2, agita con vigor.
b) Tomar 1 ml de la dilucin 10-2, verterlo en tubo etiquetado con 10-3, agitar
vigorosamente.
c) Tomar 1 ml de la dilucin 10 -3, verterlo en tubo etiquetado con 10 -4, agitar de
manera vigorosa.
d) Iniciar el proceso de sembrado.
Tcnica

4. Transferir 1 ml, de la (dilucin 1:10) a cada una de tres cajas de petri estriles.
5. Inocular 1 ml de la suspensin del segundo tubo (dilucin 1:100) a otras tres cajas de
petri estriles y
6. 1 ml a tres cajas de petri (dilucin 1:1000) en el caso de que la muestra este muy
contaminada.
7. Verter de 15 a 20 ml de agar extracto de malta acidificado y 50 mg/ml de oxitetraciclina
o gentamicina o Papa Dextrosa Agar acidificado a pH 5 con cido tartrico
8. Mezclar cuidadosamente el medio con seis movimientos de derecha a izquierda, seis
en el sentido de las manecillas del reloj, seis en sentido contrario y seis de atrs hacia

adelante, sobre una superficie lisa, teniendo cuidado de no humedecer con el medio la
tapa de la caja de Petri. Permitir que la mezcla en las cajas Petri solidifique, dejndolas
reposar sobre una superficie horizontal fra.
9. Incubar a 25 - 26C durante 3 das sin destapar, efectuar el recuento presuntivo de las
colonias de hongos desarrolladas, si ste ya se hiciera muy evidente sobre las placas. En
caso contrario prolongar hasta 5 das la incubacin y entonces proceder el recuento final
de cada colonia. Si al cabo de 5 das el desarrollo extensivo no permite el recuento de las
colonias reportar l numero obtenido a los 3 das haciendo notar el informe este periodo
de incubacin.
a) Contar las placas que presenten entre 10 y 150 colonias.
b) Multiplicar la cifra obtenida por la inversa de la dilucin correspondiente y reportar
como No. de UFC/g de muestra.
10. Realizar una tincin hmeda para mohos con colorante de lactofenol azul de algodn,
para un examen microscpico y una posible identificacin de los mohos que se hayan
seleccionado.
a) Realizar una tincin de Gram para la observacin microscpica de las levaduras
obtenidas.
11. Reportar las observaciones macroscpicas y microscpicas de los diferentes tipos de
colonias de mohos y levaduras obtenidas durante el anlisis. Si es posible reportar el o los
gneros probables.
Extensin en superficie Depositar sobre la superficie de una placa con PDA 500 l de
una determinada dilucin del cultivo de microorganismos problema y extenderlo con
ayuda del cayado, previamente esterilizado, en todas las direcciones hasta que est
completamente seco. Incubar la placa, en posicin invertida, a la temperatura deseada 25
C (durante 24, 48 72 horas) segn el tipo de alimento, segn el tipo de microorganismo.
a) La posicin invertida evitar que el agua de condensacin se deposite sobre la
superficie del medio, dificultando la obtencin de colonias aisladas. Es una tcnica
usada para el aislamiento de colonias, que permite igualmente el recuento de
bacterias viables en la muestra, si conocemos exactamente el volumen de muestra
sembrado.